CN111426820A - 用于肺结核的横向流色谱分析方法 - Google Patents

用于肺结核的横向流色谱分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于评估哺乳动物的TB状况的横向流色谱分析法，称之为TB‑KIT，无论受影响的器官或身体部位如何，都使用红细胞溶血产物作为样品。通过使用来自结核分枝杆菌复合物的实验室培养物的提纯的蛋白质提取物在动物中制备所使用的一抗。缀合的一抗包含目前在许多品种中可用的指示剂染料。在将样品添加到测试条之后，分枝杆菌的分析物附着在缀合抗体上，从而形成沿着横向流测定膜迁移的复合物。最终，复合物接触膜结合的抗体，从而形成抗体缀合分析物抗体夹心，并且产生如图3的可检测的信号。基于样品中分析物的浓度，可以区分疾病、潜在感染、免疫和易感性。因此，在半定量方法中，使用不同的稀释度来诊断疾病的发生/状态。

Description

用于肺结核的横向流色谱分析方法
技术领域
本发明为人和动物实验室套件。本发明涉及用于肺结核(TB)的横向流色谱分析方法；具体是用于测定血红细胞(溶血产物)细胞质中结核分枝杆菌复合物的抗原浓度的横向流色谱分析法(LFCA)；本发明将之被称为TB-KIT。
背景技术
准确的诊断和随访是治疗疾病的非常重要的步骤。如果临床医生可以找到好的实验室检测试剂盒，实验室调查就是重要工具。通常，当临床医生已达到适当的鉴别诊断时，调查才帮得上忙。生物变异和不敏感的实验室方法会使临床医生感到困惑，尤其是当他们安排了与原始病症不是适当相关的实验室检测时。
在过去，临床医生通常依靠他们的诊断和治疗经验。目前，临床医生更多地依靠调查来达成诊断并开出正确的药物。实际上，许多因素(例如滥用抗生素)已经影响了临床实践。这表明找到能够高效地帮助临床人员的容易且简单的测试的重要性。
LFCA是具有许多优点的简单测试。它很简单，并且可以用于患者即时护理(POC)。医疗保健行业正在通过着重于改善患者结果的举措进行改革。这些变化的主要推动力之一是通过更多地获得和使用的诊断和监测解决方案的POC技术的普及。在资源有限的环境中，医疗保健基础设施薄弱，并且获得优质且及时的医疗服务是一个挑战。
参考文献：
1、Rafea，M和Serhiy Souchelnytskyi.(2012年)。重新发现红血细胞：揭示其动态抗原库及其在健康和疾病中的作用。发表于书籍：“血液细胞-血液学研究概述”，TerryE.Moschandreou编辑，ISBN 978-953-51-0753-8，并发表于：2012年9月21日，CC BY 3.0许可证。可以从以下链接下载：
http://www.intechopen.com/books/blood-cell-an-overview-of-studies-in-hematology/rediscovering-red-blood-cells-revealing-their-dynamic-antigens-store-and-its-role-in-health-and-dise。
2、WO/2012/059112，基于新发现的红血细胞功能开发医疗产品。PCT/EG20101000041
发明内容
本发明的目的是为了提供用于肺结核(TB)的横向流色谱分析方法，以解决现有技术的上述技术问题。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
一种用于测量红细胞溶血产物中与结核分枝杆菌复合物有关的分析物浓度的方法，称为TB-KIT。
所述的TB-KIT是使用稀释的红细胞溶血产物作为样品来评估哺乳动物中的TB状况的横向流色谱分析法，其步骤如下：
(1)用抗凝剂收集血液；
(2)丢弃血浆和白膜层；
(3)用裂解缓冲液(pH正常的低等渗溶液)稀释红细胞，并且红细胞最终会破裂；
(4)将稀释的破裂红细胞(稀释的溶血产物)添加到TB-KIT的样品垫上。
所述的TB-KIT可以用于通过连续稀释溶血产物半定量地或通过使用合适的读取器定量地测量溶血产物中分析物的浓度。
所述的TB-KIT能够以相同的方式使用，无论受影响的器官或身体部位如何，包括：中枢神经系统、皮肤、软组织、眼睛、肺、胸膜、肝、肾脏、肠子、关节和骨头。
所述的TB-KIT能够用于基于红细胞溶血产物中分析物的浓度来诊断TB。
所述的TB-KIT能够用于。基于红细胞溶血产物中分析物的浓度来诊断TB潜伏感染。
所述的TB-KIT能够用于根据红细胞溶血产物中分析物的浓度来诊断哺乳动物是否已经接种TB或已经暴露于结核分枝杆菌复合杆菌。
所述的TB-KIT能够用于基于红细胞溶血产物中分析物的浓度来诊断TB状况。
本发明所述的TB-KIT与其他LFCA存在三方面的不同：首先并且最重要的不同是使用一抗来对抗来自针肺结核分枝杆菌复合物(MTC)培养物的纯化蛋白粗提取物(PrE)。第二个不同是使用血液红细胞溶血产物(BEH)作为样品。第三个不同是将抗原浓度与疾病状态联系起来。
传统上，横向流测试条(LFTS)由样品垫、缀合垫、硝酸纤维素膜和吸收剂垫组成。
TB-KIT使用两种类型的抗体：
a.抗PrE的多克隆一抗(1ryAbs)
b.b.抗laryabs的多克隆二抗(2ryAbs)
c.缀合垫包含缀合的1ryAbs(C-1ryAbs)。1ryAbs与胶体金、不同类型的珠子或颗粒缀合。
C-1ryAbs的重要性在于当困在测试线和控制线上时它们可以发出信号。
2ryAbs作为控制线与硝酸纤维素膜(NCM)结合，使得2ryAbs可以捕获C-1ryAbs并发出信号。该信号的重要性在于确保测试条的质量。
1ryAbs作为测试线与NCM结合，使得1ryAbs可以捕获由C-1ryAbs分析物形成的复合物并发出信号。根据这一信号，可以使用LFCA的专用读取器半定量或定量地解释结果。
样品是用具有正常pH的裂解缓冲液稀释的溶血红细胞。
该方法的主要原理是从样品垫到缀合垫的溶液的色谱流，其中样品分析物与C-1ryAbs混合并形成分析物C-1ryAbs复合物，然后流到硝酸纤维素膜，最后到达吸附垫。
测定形式是取决于在缀合垫、测试线和控制线上发生的抗原-抗体反应的免疫测定。
分析过程取决于用于构造横向流测试条的微流体特性。这些特性影响测试的质量。
因此，被检测到的分析物是PrE。分析物的浓度代表以下方面的临床用途和/或预期用途：
a)诊断；
b)预后；
c)治疗监测；
d)治愈的检测。
该产品已使用以下统计显著性人数进行了评估：
1.男/女
2.婴儿/青少年/成人
3.正常/患者
4.另外，使用了许多不同浓度的PrE来建立标准曲线。
从实用的角度来看，TB-KIT相对于其他方法的优点在于：
1.成本低
2.比任何其他用于TB诊断的LFCA可靠
3.通常，免疫测定法可移植到其他技术中。4.出结果时间少于30分钟。
5.精度：无假阳性或假阴性。
6.精确且敏感：它可以区分疾病、潜在疾病、非免疫疾病和免疫疾病。
在现场或现场协议(Field Protocol)中使用方法：
1.用任何抗凝剂收集血液
2.在5100μl裂解缓冲液中取20μl血液(1：256)
3.从稀释的溶血产物中使用100μl并添加到横向流盒中
4.15-30分钟后读取结果
5.如果出现测试线信号，则受试者(患者或动物)患有TB
请注意，根据实施方式，诊断稀释度(1：256)可以变化。
在实验室或临床实验室协议(Laboratory Protocol)中使用方法：
1.用任何抗凝剂收集血液
2.在620μl裂解液中取20μl血液(1:32)
3.使用自旋过滤器(50K MW)并使用500ul溶血产物去除血红蛋白。遵循自旋过滤器的协议
4.从过滤的溶血产物取30μl，并添加到横向流盒中
5.在5至15分钟后使用LFCA读取器进行读取
6.使用标准曲线解释结果
7.标准曲线取决于1ryAbs的质量，即对PrE的亲和度
附图说明
图1示出了横向流测试条的侧视图。它具有由背衬材料支撑的四个部件。背衬材料具有用于固定那些部件的粘合剂。即，这些部件是：样品垫、缀合垫、硝酸纤维素膜(NSM)和吸附垫。因此，它具有三种类型的抗体，这些抗体是：与染料缀合并位于缀合垫上的一抗；位于硝酸纤维素膜(NCM)上的测试线的一抗；和位于NCM的控制线上的二抗。
图中，1、样品垫(sample pad)；2、缀合垫(conjugate pad)；3、硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)；4、吸收垫(adsorbent pad)；5、缀合一抗(conjugatedprimary abs)；6、测试线抗体(test line abs)；7、控制线抗体(control line abs)。
图2示出了在施加样品之前的横向流测试条的俯视图。它证实了测试条在施加样品之前或在样品流到缀合垫之前看起来的样子。因此，它描述了三种抗体的状态。
图中，预试条(pre-run strip)；血液溶血产物稀释样品(blood hemolysatediluted sample)；样品垫(sample pad)；缀合垫(conjugate pad)；吸收垫(adsorbentpad)。
图3示出了在施加阳性样品之后的横向流测试条的俯视图。它证实了阳性样品的信号。在阳性样品时，有两个信号，一个在测试线上，另一个在控制线上。因此，它描述了抗体如何一起反应。在测试线中，一抗附着于已经附着在缀合抗体上的分析物。实际上，抗体和分析物形成固定在测试线上的夹心。类似地，在控制线中，缀合抗体被二抗捕获，无论是否附着或未附着在分析物上。
图4示出了在施加阴性样品之后的横向流测试条的俯视图。它证实了阴性样品将导致控制线上的一个信号，该信号确保测试条的有效性。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式进一步阐述本发明的技术特点。
TB-KIT可提供快速的TB诊断结果，从而允许及时启动适当的治疗和/或促进护理和转诊的联系。所需的POC设备仅仅是离心机和LFCA读取器以及其他实验室设施，例如移液器。实际上，它足以简单而能够在基层医疗水平使用。
在没有实验室基础设施的远程环境中，TB-KIT可用作诊断的定性方法，即仅阳性或阴性。
有很多用于诊断TB的实验室方法和非实验室方法。许多参考文献回顾了这些方法。目前，最可靠的一种方法是GeneXpert，该方法是通过检测生物样品(例如痰、胸腔积液等)存在TB细胞并且测试对利福平药物的耐药性来诊断TB的TB分子测试。下表将TB-KIT与所有其他方法进行了比较。
表1：描述了TB-KIT与使用特定标准的所有其他方法之间的区别。
Figure BDA0002274464500000061
TB-KIT基于红细胞动态抗原库(EDAS)的发现(Rafea and Souchelnytskyi，2012)和(Rafea，WO/2012/059112)。

Claims (8)

1.一种用于测量红细胞溶血产物中与结核分枝杆菌复合物有关的分析物浓度的方法，称为TB-KIT。
2.根据权利要求1所述的TB-KIT，其特征在于：所述的TB-KIT是使用稀释的红细胞溶血产物作为样品来评估哺乳动物中的TB状况的横向流色谱分析法，其步骤如下：
(1)用抗凝剂收集血液；
(2)丢弃血浆和白膜层；
(3)用裂解缓冲液(pH正常的低等渗溶液)稀释红细胞，并且红细胞最终会破裂；
(4)将稀释的破裂红细胞(稀释的溶血产物)添加到TB-KIT的样品垫上。
3.根据权利要求1所述的TB-KIT，其特征在于：所述的TB-KIT可以用于通过连续稀释溶血产物半定量地或通过使用合适的读取器定量地测量溶血产物中分析物的浓度。
4.根据权利要求1所述的TB-KIT，其特征在于：所述的TB-KIT能够以相同的方式使用，无论受影响的器官或身体部位如何；包括：中枢神经系统、皮肤、软组织、眼睛、肺、胸膜、肝、肾脏、肠子、关节和骨头。
5.根据权利要求1所述的TB-KIT，其特征在于：所述的TB-KIT能够用于基于红细胞溶血产物中分析物的浓度来诊断TB。
6.根据权利要求1所述的TB-KIT，其特征在于：所述的TB-KIT能够用于基于红细胞溶血产物中分析物的浓度来诊断TB潜伏感染。
7.根据权利要求1所述的TB-KIT，其特征在于：所述的TB-KIT能够用于根据红细胞溶血产物中分析物的浓度来诊断哺乳动物是否已经接种TB或已经暴露于结核分枝杆菌复合杆菌。
8.根据权利要求1所述的TB-KIT，其特征在于：所述的TB-KIT能够用于基于红细胞溶血产物中分析物的浓度来诊断TB状况。
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