BRPI0922798B1 - Dispositivo e kit para diagnosticar tuberculose - Google Patents

Abstract

MÉTODO E DISPOSITIVO PARA DIAGNOSTICAR TUBERCULOSE. Descreve-se um rápido método para diagnosticar tuberculose (TB) em um indivíduo. São usados anticorpos para detectar a presença de biomarcadores específicos, tal como citocinas ou quimiocinas, e em particular, IFN-gama ou IP-10, em uma amostra não estimulada do indivíduo. Um indicador é usado para indicar a ligação dos anticorpos aos biomarcadores, indicando que o paciente tem tuberculose extrapulmonar ativa. O método pode ser executado usando uma tira de teste contendo anticorpos e indicador e no qual a amostra está localizada, usando um ensaio ELISA, ou usando citometria de fluxo, um bioanalisador, um biossensor de guia de onda ou espectroscopia de Raman amplificada por superfície. Os resultados podem estar disponíveis dentro de alguns minutos a algumas horas, dependendo do tipo de dispositivo de teste usado. O método pode detectar tuberculose extrapulmonar e pode distinguir entre tuberculose ativa ou latente. Um kit incluindo anticorpos, um indicador cromatográfico e instruções para uso é também descrito.

Description

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a um método para diagnóstico de tuberculose ativa (TB).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A tuberculose é a maior causa de morte por doença infecciosa no mundo de mulheres em idade reprodutiva e a principal causa de morte entre pessoas com HIV/AIDS. Ela é causada por micobactérias, geralmente Mycobacterium tuberculosis em humanos, e acredita-se que um terço da população mundial esteja infectada com M. tuberculosis. A maior parte das infecções em humanos resulta em uma infecção latente assintomática (LTBI), mas algumas infecções latentes eventualmente progridem para a doença ativa, que, se não tratada, mata mais da metade de suas vítimas.

Quando a doença se torna ativa, 75% a 85% dos casos são TB pulmonar. Nos outros 15% a 25% dos casos ativos, a infecção se move a partir dos pulmões, causando tuberculose extrapulmonar (EPTB). Os sítios de infecção extrapulmonar incluem a pleura (em tuberculose pleural), o sistema nervoso central e o espaço subaracnoide (em meningite), os nódulos linfáticos periféricos do sistema linfático, o sistema geniturinário (em tuberculose urogenital), o espaço pericardial, a cavidade abdominal, e ossos e juntas (em doença de Pott). A TB ativa é particularmente comum na África e Ásia, e causa mortalidade substancial, morbidez e regressão econômica em comunidades afetadas.

Um método comum para diagnosticar a infecção por tuberculose é o Teste Tuberculínico (TST), que é uma medida composta de imunidade mediada por célula na resposta ao estímulo por antígeno de tuberculose (PPD). Entretanto, leva de 2 a 3 dias antes dos resultados poderem ser obtidos e frequentemente fornece resultados falso-positivos ou falso- negativos. Esse teste também não distingue infecção latente de doença ativa, o que é importante no cenário clínico.

Mais recentemente, dois ensaios que detectam a liberação de interferon gama (IFN-y) em resposta a proteínas específicas de micobactérias foram desenvolvidos e comercializados: QuantiFERON-TB Gold In-tube (ensaio ELISA) e T-SPOT,TB, (ensaio ELISPOT). Esses ensaios de liberação de interferon gama (IGRAs) são baseados na capacidade dos antígenos de M. tuberculosis por alvo antigênico precocemente secretado (ESAT-6) e proteínas do filtrado de cultura 10 (CFP-10) para estimular a produção em linfócitos hospedeiros de interferon gama. Os linfócitos do sangue de um paciente são cultivados com os antígenos e incubados por 16 a 24 horas. Se o paciente foi exposto à tuberculose antes, os linfócitos T produzem interferon gama em resposta. Ambos os testes são testes de sangue, apesar de que um usa sangue integral, enquanto que o outro usa células mononucleares de sangue periférico. A distinção entre os testes é que o QuantiFERON-TB Gold quantifica a quantidade total de interferon gama no sobrenadante quando o sangue integral é exposto aos antígenos, enquanto o T-SPOT.TB conta o número de linfócitos T ativados produzindo interferon gama pela enumeração do número de manchas dentro de uma cavidade ELISPOT. Os testes consomem tempo (eles levam aproximadamente 2 dias a partir da coleta da amostra até a aquisição de um resultado) e e trabalho intensivo, exigindo o uso de um laboratório e instrumentos complexos. Ademais, eles não distinguem tuberculose ativa de tuberculose latente. A avaliação clínica e os testes adicionais, tal como cultura de sangue ou fluido da área suspeita de estar infectada, são exigidos para distinguir tuberculose ativa de infecção por TB latente.

A TB extrapulmonar é difícil de diagnosticar. A cultura é somente útil em uma minoria dos casos. À medida que somente pequenos números de bactérias estão geralmente presentes em uma amostra, cultivar esse organismo de crescimento lento no laboratório leva um tempo relativamente longo (aproximadamente 4 a 6 semanas), e nem sempre é bem sucedido. Atrasos nessa duração são inaceitáveis, à medida que pelos pacientes que são diagnosticados com TB ativa, eles podem ter morrido ou ter sofrido incapacidades severas, tal como danos no cérebro no caso de meningite tuberculosa.

O desenvolvimento de um rápido e não dispendioso teste de diagnóstico para tuberculose ativa seria assim muito valioso, particularmente no mundo em desenvolvimento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com uma primeira modalidade da invenção, é fornecido um método para diagnosticar tuberculose em um indivíduo, que compreende as etapas de: (i) fornecer uma amostra de fluido de um indivíduo; (ii) contatar a amostra de fluido com um anticorpo de um biomarcador para tuberculose, sem estimular a amostra de fluido com um antígeno; e (iii) detectar se ou não o anticorpo se liga a um biomarcador da amostra.

A ligação do anticorpo a um biomarcador pode ser indicativa de que o indivíduo tem tuberculose, e mais particularmente, tuberculose ativa. A tuberculose pode ser tubérculo extrapulmonar.

O biomarcador pode ser uma citocina, tal como IFN-gama, ou uma quimiocina, tal como IP-10. O anticorpo pode ser um anticorpo anti-IFN gama ou um anticorpo anti-IP-10, ou uma combinação desses, para desse modo detectar se IFN-gama e/ou IP-10 estão presentes na amostra.

Um anticorpo de captura que é capaz de se ligar ao anticorpo antibiomarcador ou ao biomarcador pode também ser usado no método.

O anticorpo ou anticorpo de captura pode ser um anticorpo monoclonal. O anticorpo pode ser complexado a uma partícula, tal como ouro coloidal.

Um indicador pode ser usado para indicar a ligação do anticorpo ao biomarcador. O indicador pode ser um indicador cromatográfico, fluorescente, óptico, ligado à enzima ou radiomarcado.

O método pode ser um imunoensaio à beira do leito e, por exemplo, o anticorpo e indicador podem estar localizados em um ensaio com tira de teste no qual a amostra pode estar localizada. Alternativamente, ou em adição ao ensaio com tira de teste, o método pode ser executado em um laboratório usando um ensaio ELISA, citometria de fluxo, um bioanalisador, um biossensor de guia de onda ou SERS.

Tipicamente, o método pode ser executado dentro de aproximadamente 5 horas, mais preferencialmente, dentro de aproximadamente 3 horas e ainda mais preferencialmente dentro de aproximadamente 10 minutos.

De acordo com uma segunda modalidade da invenção, é fornecido um dispositivo de teste para diagnosticar tuberculose em uma amostra de fluido não estimulada de um indivíduo, compreendendo: (i) um anticorpo capaz de se ligar a um biomarcador de tuberculose; e (ii) um indicador que indica quando o anticorpo se liga ao biomarcador.

O dispositivo de teste pode ser um dispositivo de tira de teste no qual a amostra de fluido do indivíduo é localizada ou uma placa de ensaio ELISA com cavidades nas quais a amostra de fluido de um único indivíduo pode ser localizada. Alternativamente, o dispositivo de teste pode ser configurado para uso em um citômetro de fluxo, um bioanalisador, um biossensor de guia de onda ou um espectrômetro SERS.

De acordo com uma terceira modalidade da invenção, é fornecido um kit para diagnosticar tuberculose em uma amostra não estimulada de um indivíduo, compreendendo: (i) um anticorpo que é capaz de se ligar a um marcador de tuberculose; e (ii) um indicador que indica quando o anticorpo se ligou ao biomarcador.

O kit pode ainda incluir instruções para executar o método descrito acima. O kit pode também incluir um anticorpo de captura.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A FIG. 1 mostra diagramas de dispersão (painel esquerdo) e a área sob o ROC (painel direito) de níveis de IP-10 em 74 pacientes com TB pleural contra controle sem TB. Em um ponto de corte de 4035 pg/ml (linha sólida no painel à esquerda), a sensibilidade foi 100% e NPV foi 100%. A área sob a curva ROC foi 0,82.

A FIG. 2 mostra diagramas de dispersão (painel esquerdo) e a área sob o ROC (painel direito) de IFN-gama não estimulado, usando fluido pleural de 74 pacientes consecutivamente recrutados com TB e efusões não TB. Em um ponto de corte de 0,31 IU/I, a sensibilidade, especificidade, PPV e NPV (95% Cl) de IFN-gama não estimulado, foi 97% (85 a 99); 100% (81 a 100); 100% (90 a 100) e 94% (73 a 99), respectivamente. A precisão foi 98% (90 a 100) e a área sob a curva ROC foi 0,99.

A FIG. 3 mostra níveis de IFN-y não estimulado em fluido cérebro-espinhal obtido de 140 suspeitos de meningite TB. Esses dados mostram os excelentes resultados de desempenho de interferon gama não estimulado como um marcador de diagnóstico de TB no fluido cérebro-espinhal.

A FIG. 4 mostra o princípio de tecnologia de teste de fluxo lateral usando microesferas pigmentadas que migram ao longo da tira e, se o biomarcador de interesse está presente, se ligam a uma linha de detecção, que muda de cor (anticorpo 1 = anticorpo se liga às microesferas no lado à esquerda dos painéis A e B; anticorpo 2 = anticorpo na segunda coluna de anticorpos da esquerda nos painéis A, B e C e se ligando ao antígeno no painel D; anticorpo 3 é a última coluna de anticorpos (a mais à direita) dos painéis A a D). A FIG. 5 mostra um exemplo de um aparelho de tira de teste que poderia ser usado na invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A invenção fornece um método rápido para diagnosticar tuberculose (TB) em uma amostra de fluido não estimulada de um indivíduo. Diferente de outros métodos comercialmente disponíveis, o presente método pode distinguir entre tuberculose ativa e latente, o que é importante para determinar o tratamento do indivíduo. O método pode também detectar tuberculose extrapulmonar. De forma muito importante, o método pode também fornecer resultados dentro de uma questão de minutos, diferente de outros testes, que precisam incubar a amostra por mais de 12 horas.

A tuberculose ativa é o estado da doença onde o fluido ou tecido biológico é positivo por baciloscopia ou cultura para M. tuberculosis, ou M. tuberculosis é detectável por um teste de amplificação de ácido nucleico, em um indivíduo com características clínicas e radiológicas de doença ativa; os sintomas constitucionais estão frequentemente presentes. A infecção de tuberculose latente é potencialmente viável, M. tuberculosis está presente em tecidos humanos, mas o indivíduo é assintomático, e sem características clinico-radiológicas de doença ativa.

Como mencionado anteriormente, os testes disponíveis para detectar tuberculose têm pouca sensibilidade e consomem tempo e trabalho intensivo. O diagnóstico rápido e preciso de doença é importante no cenário clínico. E também benéfico ter um método de diagnóstico que possa ser usado facilmente e à beira do leito, tal como em uma sala de consulta, enfermaria de hospital ou em uma residência.

A presente invenção utiliza anticorpos para detectar a presença de biomarcadores específicos, tal como citocinas ou quimiocinas, e em particular, interferon-gama ou IP- 10, em uma amostra não estimulada de um paciente (isto é, a amostra não é estimulada (ou processada) com antígenos). Geralmente, um indicador cromatográfico mudará de cor na ligação dos anticorpos aos biomarcadores, indicando que o paciente tem tuberculose extrapulmonar ativa. Entretanto, o biomarcador de interesse pode também ser detectado por outras tecnologias ópticas, biológicas moleculares, microfluídicas ou nanotecnologias, ou similares (por exemplo, SERS (espectroscopia de Raman amplificada por superfície) ou biossensores de guia de onda (tal como um biossensor de guia de onda fendido)).

O biomarcador é detectado no próprio fluido biológico e o estímulo de antígeno de um dia para o outro, se exigido com outros métodos, não é necessário.

A amostra pode ser fluido do espaço pleural, do espaço pericardial, da cavidade abdominal ou espaço subaracnoide, ou plasma ou soro de uma amostra de sangue, saliva ou urina. Mais particularmente, a amostra pode ser fluido de efusão pleural. Diferente dos testes comercialmente disponíveis, a amostra preferencialmente não é uma amostra de sangue.

A amostra pode ser aplicada a uma tira similar ao tipo geralmente usado em testes de gravidez e outros testes de análise de urina, a tira incluindo anticorpos biomarcadores e um indicador cromatográfíco para detectar a ligação de interferon- gama e/ou IP-10 aos anticorpos.

A tira pode incluir anticorpos para IFN-gama ou IP-10, ou tanto IFN-gama quanto IP-10. Incluir ambos esses biomarcadores tornará o teste menos provável de retornar um resultado falso-positivo ou falso-negativo, à medida que interferon-gama é um bom marcador de inclusão e IP-10 é um bom marcador de exclusão.

Os resultados desse teste de tira podem estar disponíveis dentro de alguns minutos (tal como 2 a 3 minutos) de aplicação da amostra à tira.

Alternativa ou adicionalmente, um imunoensaio (por exemplo, ELISA), citometria de fluxo ou um bioanalisador pode ser usado. Um kit incluindo ao menos anticorpos, um indicador cromatográfíco e instruções para uso poderia também ser fornecido.

Enquanto essa tira de teste será suficiente para algum tipo de TB extrapulmonar, por exemplo, TB pleural, em alguns tipos de tuberculose difíceis de diagnosticar, tal como meningite TB, o teste de tira descrito acima pode ser combinado com um imunoensaio, tal como um ensaio ELISA, para assegurar que um diagnóstico preciso seja feito.

As placas de ensaio ELISA para IFN-gama comercialmente disponíveis estão disponíveis com os anticorpos apropriados e um dispositivo de indicação adequado. As placas têm 96 cavidades e são capazes de testar 24 amostras por vez. Como cada placa custa entre ~US$ 300 e US$ 500, usar uma placa para testar somente uma amostra por vez é muito dispendioso em um cenário mundial em desenvolvimento, e assim particularmente não adequada para a presente invenção. Para a presente invenção, as placas de ensaio ELISA para IFN-gama para conduzir um ensaio de uma única amostra serão fornecidas. Por exemplo, a placa de ensaio poderia ter somente 8 cavidades (4 padrões, 1 controle positivo, 1 controle negativo, 2 cavidades de amostra). Os resultados desse ensaio poderiam estar disponíveis dentro de duas a três horas.

Várias novas ferramentas e biomarcadores para diagnosticar efusões de TB pleural foram avaliadas pelo requerente, incluindo ensaios de célula T, detecção de antígeno LAM, PCR, IP-10, IFN-gama, ADA, baciloscopia, cultura e biopsia pleural. A prova preliminar de estudos de controle de caso sugeriu que os ensaios de célula T podem ser úteis. Entretanto, quando avaliado em um cenário clínico, eles tiveram um resultado pobre. IP-10 foi promissor, mas ainda perdeu 1 em 5 indivíduos com TB e sobrediagnosticou 1 em 5; em contraste, em um ponto de corte mais alto, IP-10 teve um valor preditivo 100% negativo (indicando que ele é um excelente teste de exclusão para efusão de TB pleural (FIG. 1)). Entretanto, o discriminador mais preciso foi IFN-gama não estimulado, que teve uma sensibilidade e especificidade aproximando-se de 100% (FIG. 2). O IFN-gama é assim um marcador muito preciso para efusão de TB pleural.

A invenção é ainda descrita pelo seguinte exemplo. Este exemplo, entretanto, não é para ser interpretado como limitante ou do espírito ou do escopo da invenção.

Exemplo

A FIG. 3 mostra níveis de IFN-y não estimulado em fluido cérebro-espinhal obtido de 140 suspeitos de meningite TB. Os dados indicam que quando usado em conjunto com outros resultados de teste pronta e rapidamente disponíveis (por exemplo, testes de aglutinação em látex para detecção de criptococos e mancha de Gram), IFN-y não estimulado tem uma sensibilidade e especificidade aproximando-se de 95%.

A FIG. 4 fornece um resumo de como um teste adequado funcionaria. Um teste de tira (FIG. 5) é fornecido tendo um carreador de membrana de nitrocelulase com uma solução conjugada de ouro coloidal (um indicador cromatográfíco) complexado a um anticorpo anti-IFN-gama, e possivelmente também anticorpos anti-IP-10, e uma faixa de anticorpos de captura, envoltos em um invólucro plástico.

Uma pequena quantidade de uma amostra de um paciente, por exemplo, fluido aspirado de um compartimento do corpo específico, tal como o espaço pleural, é localizada na tira de teste.

Se as citocinas IFN-gama (e possivelmente também biomarcadores/quimiocinas IP-10) estão presentes na amostra não estimulada do paciente, elas se ligarão a anticorpos anti-IFN-gama e anti-IP-10, respectivamente, na membrana de nitrocelulase, e esses complexos migrarão para a faixa de anticorpos de captura. Isso funcionará similarmente para outros biomarcadores. Mediante ligação, o indicador cromatográfíco mudará de cor, significando em um teste positivo para tuberculose.

Assim, o requerente desenvolveu um método para diagnosticar tuberculose que é capaz de fornecer um resultado consideravelmente mais rápido do que os métodos de diagnóstico atuais. O método é também dispendioso e capaz de distinguir entre tuberculose latente e ativa. Ademais, é um teste à beira do leito, e não necessariamente tem que ser executado por um técnico versado ou em um laboratório.

Claims (10)

1. Dispositivo de teste de fluxo lateral para detectar interferon gama (IFN-y) em uma amostra de fluido de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) um anticorpo anti-IFN-gama capaz de se ligar a IFN- gama presente na amostra; e (ii) um indicador que indica quando o anticorpo anti-IFN- gama se liga ao IFN-gama, em que a amostra de fluido não é processada e não é estimulada com antígenos, e ainda em que a ligação do anticorpo anti-IFN- gama ao IFN-gama é indicativo de que o sujeito tem tuberculose extrapulmonar ativa.

2. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um anticorpo de captura.

3. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo anticorpo de captura ser capaz de se ligar ao IFN-gama ou ao anticorpo anti-IFN-gama.

4. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-IFN-gama e/ou anticorpo de captura é um anticorpo monoclonal.

5. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o indicador é um indicador cromatográfico, óptico, fluorescente ou marcado com rádio.

6. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o indicador é um indicador de ouro coloidal e o anticorpo é ligado a uma partícula de ouro.

7. Kit para diagnosticar tuberculose extrapulmonar em uma amostra não processada e não estimulada de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) um dispositivo de teste de fluxo lateral, conforme definido na reivindicação 1. (ii) um anticorpo anti-IFN-gama capaz de se ligar a IFN- gama presente na amostra; e (iii) um indicador que indica quando o anticorpo anti-IFN- gama se liga ao IFN-gama, em que a ligação do anticorpo anti-IFN-gama ao IFN- gama é indicativo de que o sujeito tem tuberculose extrapulmonar ativa.

8. Kit, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que inclui adicionalmente instruções para executar.

9. Kit, de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um anticorpo de captura.

10. Kit, de acordo com qualquer umas das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de teste de fluxo lateral é um dispositivo de teste de tira no qual a amostra de fluido do indivíduo é localizada.

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