CN115605752A - 快速细胞内测定 - Google Patents
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Abstract
本发明旨在提供通过直接测量细胞内的生物标记物(细胞内检测)快速且容易地监测健康和诊断疾病的方法及装置。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年12月20日提交的美国临时专利申请号62/951,949的优先权，其内容在此引用并且全部内容通过引用并入本文。本文提及的任何出版物或专利文献的全部公开内容通过引用完全并入。
技术领域
除其他事项外，本申请尤其涉及用于快速细胞内测定的方法和/或装置及其在检测样品中的生物标记物和/或诊断测试健康疾患中的应用。
背景技术
非常需要快速、灵敏地监测健康和诊断疾病。现今使用的许多种方法都涉及检测样品中的无细胞(cell-free)生物标记物。
发明内容
本发明旨在提供通过直接测量细胞内的生物标记物(细胞内检测)快速且容易地监测健康和诊断疾病的方法和装置。本发明的另一个方面是提供使用细胞内的生物标记物来测量血液中无细胞生物标记物的数量的装置和方法。
本发明提供了快速且容易地(例如，在60秒或更短时间内，在一个简单的步骤中)检测样品中细胞内的生物标记物的装置和方法，以及在监测和诊断健康状况中的应用。检测探针包含蛋白检测剂或核酸检测探针。
另一个目的是快速细胞内测定以检测样品中的生物标记物和/或诊断测试健康疾患。
根据本发明，即时细胞内单细胞测定(INSA)提供与含有至少一个细胞的样品的一步化学接触，包括60秒或更短的孵育、成像、分析以及报告所检测的细胞内生物标记物(诸如核酸和蛋白)的存在和数量，该生物标记物直接来自新鲜粗生物样品，诸如针活检样品、全血、尿液、痰、唾液、拭子样品(巴氏涂片)和类似样品。INSA程序在诊断疾病方面具有优势，例如具有已建立的或可发现的细胞内诊断生物标记物的疾病，例如：传染病；恶性疾病；自身免疫性疾病；代谢疾病；以及遗传性基因失调。下面的列表提供了样品来源(例如，体液)或样品提取方法、疾病类别以及疾病和病症的示例，其中公开的INSA方法可用于根据公开的方法进行诊断。
本公开的一个方面是提供用于容易且快速地对细胞内的生物标记物进行染色的装置和方法，其通过利用一对可相互移动的板来操作组织样品和/或少量染色液来，减少样品/染色液的厚度，使样品与染色试剂接触等——所有这些都对细胞染色有益(简化并加速染色，无需冲洗，节省试剂)。
本公开的另一方面是提供容易且快速的细胞内染色，其通过在一个或两个板上涂敷染色试剂，当接触液体样品和/或染色液时，染色试剂溶解并扩散到样品和/或染色液中，无需专业培训即可轻松处理染色试剂。
本公开的另一个方面是确保样品均匀地接近染色试剂，其通过利用板和多个具有均匀高度的垫片，迫使样品和/或染色液形成具有均匀厚度的薄膜，从而使得染色试剂在样品上方大面积的扩散距离相同。
本公开的另一方面是提供用于容易且快速的细胞内染色和成像的系统，其通过将用于染色的成对的板与移动通信装置进行组合，该移动通信装置适于获取和分析由板染色的细胞的图像。可选地，移动通信被配置为将成像数据和/或分析结果发送至远程位置，以便存储和/或专业人员或软件进一步分析和解读。
附图说明
以下描述的附图(如果有的话)仅用于说明目的。在一些图中，附图是按比例绘制的，而在其他图中，则附图未按比例绘制。为清楚起见，一些元件在图中示出时被放大。附图并非旨在限制本公开的范围。
图1A和图1B示出了示例性细胞内检测实施例的示意图。示意图A说明了该方法：诸如核酸和蛋白的细胞内生物标记物位于目标细胞内。使特异性探针进入细胞内之后，该特异性探针与细胞内生物标记物之间形成可检测的复合物，该复合物可被检测或成像。示意图B说明上述方法发生在包含两个板的样品保持器内，其中细胞、生物标记物和探针被夹在两个板之间以形成薄层。
图1C示出了Alexa488-IL-6 60-mer寡核苷酸探针与全血的即时细胞内单细胞杂交(INSH)的示例结果。
图2示出了Alexa 647-B2M(管家基因)60-mer寡核苷酸探针与全血的即时细胞内单细胞杂交(INSH)的示例结果。
图3示出了白细胞中IL-6表达的INSH结果，示出了LPS诱导的剂量依赖性模式。
图4示出了与INSH中的阴性对照GFP(绿色荧光蛋白)相比的基础IL-6表达(mRNA)。
图5示出了LPS诱导下白细胞(WBC)中IL-6mRNA表达(INSH)和蛋白产生(ELISA)的比较。
图6A和图6B示出了来自健康供体的指尖血液的白细胞的INSH miRNA染色结果。
图7A和图7B示出了来自健康供体的指尖血液的白细胞染色的INSH AF647-Let-7a-5p和AF647-miR150-5p结果。
图8示出了新鲜人全血中LPS刺激的白细胞的即时细胞内单细胞免疫测定(ISIM)AF647-抗-IL6染色。
图9示出了即时细胞内单细胞免疫测定(ISIM)IL-6染色的实验结果以及与ELISA血浆IL-6水平的总荧光强度相关性。
图10示出了新鲜人全血中白细胞IL-6和Lamin A/C的ISIM双染色实验结果。
图11示出了人全血中LPS刺激的白细胞的ISIM AF647-抗-IFN-γ染色的实验结果。
图12示出了示例性细胞内检测实施例的示意图A和B。
示例性实施例的详细说明
以下详细说明以示例而非限制的方式说明了本发明的某些实施例。如果有的话，本文使用的章节标题和任何副标题仅用于组织目的，而不应被解读为以任何方式限制所描述的主题。章节标题和/或副标题下的内容不限于章节标题和/或副标题，而是适用于本发明的整篇说明。
定义
术语“染色剂”、“染色制剂”及类似术语通常是指含有以下组分的材料或混合物：该组分可与诸如分子或病毒之类的细胞内靶标相互作用或反应以形成细胞内反应产物，并且可以实现或增强例如与确定靶标存在及定量细胞内存在的靶标的量有关的检测、显影、成像、定量及类似描述词。
术语“Q卡(Q-Card)”和“QMAX卡(QMAX Card)”可以互换。
“探针”及类似术语是指可以与诸如分子或病毒之类的细胞内靶标相互作用或反应的组分(参见上面的“染色剂”定义)。
“细胞内(intra-cellular)”、“细胞内(intracellular)”及类似术语是指“在细胞内(within a cell)”或“在细胞内(inside a cell)”。
“细胞外(extra-cellular)”、“细胞外(extracellular)”及类似术语是指“在细胞外”或“不在细胞内”。
“疾病”、“病症”及类似术语是指，例如，与具有一个或多个细胞的细胞或生物体的正常结构或功能状态相比的任何有害偏差，通常与某些体征和症状相关并且性质不同于物理性损伤。患病细胞或生物体通常表现出指示其异常状态的体征或症状。疾病和病症可以互换使用。
术语“细胞内生物标记物”是指在细胞内的生物标记物。
术语“无细胞生物标记物”是指在样品中但位于样品中的细胞之外的生物标记物。
术语“无细胞生物标记物”和“游离生物标记物”可以互换。
“血浆”是指含有凝血剂的血液流体。血浆是血液中的透明淡黄色液体部分。血浆中含有凝血因子和水。
术语“血清”是指血液凝固后的液体部分。血清是不含凝血因子的血液中的水液体(即血清＝血浆-凝血因子)。血清含有蛋白，如白蛋白和球蛋白。
术语“X板”是用于Qmax卡的顶板，具有两个可相对的板。
术语“M板”是底板或基板，通常具有柱或间隔件，用于具有两个可相对的板的Qmax卡。
术语“INSA”是即时细胞内单细胞测定的首字母缩略词。
术语“INSH”是即时细胞内单细胞杂交的首字母缩略词。
术语“ISIM”是即时细胞内单细胞免疫测定的首字母缩略词。
术语“INSA”是即时细胞内单细胞测定的首字母缩略词。
术语“ELISA”是酶联免疫吸附测定的首字母缩略词。
术语“FISH”是荧光原位杂交的首字母缩略词。
术语“CMV”是巨细胞病毒的首字母缩略词。
术语“LPS”是脂多糖的首字母缩略词。
术语“IFN”是干扰素的首字母缩略词。
术语“PPD”是纯化蛋白衍生物的首字母缩略词。
术语“HIV”是人免疫缺陷病毒的首字母缩略词。
术语“HPV”是人乳头瘤病毒的首字母缩略词。
术语“HBV”是乙型肝炎病毒的首字母缩略词。
术语“IL4”、“IL-4”及类似缩略词是白细胞介素4的首字母缩略词。IL-4是诱导幼稚辅助T细胞(Th0细胞)分化为Th2细胞的细胞因子。当被IL-4激活时，Th2细胞随后在正反馈回路中产生附加的IL-4。
术语“细胞内染色”是指使用检测探针对细胞内的生物标记物进行染色，检测探针最初位于细胞外，然后被引入细胞内。在某些实施例中，检测探针对细胞内的生物标记物是特异性的。
术语“染色溶液”和“染色液”可以互换。
术语第一板和第二板的“内表面”是在闭合构造中彼此面对的表面。
1.即时细胞内单细胞测定(INSA)
根据本发明，即时细胞内单细胞测定(INSA)提供与含有至少一个细胞的样品的一步化学接触，包括60秒或更短的孵育、成像、分析以及报告所检测的细胞内生物标记物(诸如核酸和蛋白质)的存在和数量，该生物标记物直接来自新鲜粗生物样品，诸如针活检样品、全血、尿液、痰、唾液、拭子样品(巴氏涂片)和类似样品。INSA程序在诊断疾病方面具有优势，例如具有已建立的或可发现的细胞内诊断生物标记物的疾病，例如：传染病；恶性疾病；自身免疫性疾病；代谢疾病；以及遗传性基因失调。下面的列表提供了样品来源(例如，体液)或样品提取方法、疾病类别以及疾病和病症的示例，其中公开的INSA方法可用于根据公开的方法进行诊断。
一种进行细胞内单细胞测定的方法，包含：
(a)具有第一板和第二板，每个板在其表面上具有样品接触区域，其中样品接触表面与包含细胞的样品接触，该细胞在细胞内含有或可能含有分析物，
(b)具有检测探针，该检测探针特异性结合所述分析物；
(d)将样品和检测探针以及光学增强剂夹在两块板的两个样品接触区域之间，形成厚度为200微米(um)或更小的薄层；以及
(e)使用成像器对薄层进行成像，以检测具有结合至检测探针的分析物的细胞；
其中，薄层样品厚度被配置使得：对于样品中给定浓度的细胞，每个单独的细胞在成像中基本上不与其他细胞重叠；
其中，薄层的厚度、检测探针在样品中的浓度或光学增强剂在样品中的浓度被配置为在成像步骤(e)中使薄层中具有结合的检测探针的位置可与没有结合的检测探针的位置区分开，其中该结合的检测探针是与细胞中的分析物结合的检测探针。
在一些实施例中，两个板可相对于彼此移动，并且间隔件位于板之间以调节板之间的间距。
一种细胞内单细胞测定装置，包含：
(a)第一板和第二板，每个板在其表面上具有样品接触区域，其中样品接触表面与包含细胞的样品接触，该细胞在细胞内含有或可能含有分析物；
(b)检测探针，该检测探针特异性结合所述分析物；
其中，第一板和第二板中的样品接触区域彼此面对并且将样品和检测探针夹在中间，其中薄层具有200微米(um)或更小的厚度；以及
(c)成像器，其对薄层进行成像，以检测特异性结合分析物的检测探针；
其中，薄层样品厚度被配置使得：对于样品中给定浓度的细胞，每个单独的细胞在成像中基本上不与其他细胞重叠；
其中，薄层的厚度、检测探针在样品中的浓度或光学增强剂在样品中的浓度被配置为在成像步骤(c)中使薄层中具有结合的检测探针的位置可与没有结合的检测探针的位置区分开，其中该结合的检测探针是与细胞中的分析物结合的检测探针。
在一些实施例中，检测探针涂敷在板的样品接触区域中的至少一个上。
在一些实施例中，分析物包含蛋白或核酸(例如，DNA/RNA)或组合。
在一些实施例中，所述方法和所述装置还包含帮助探针穿透进入细胞的透化试剂。
一种使用细胞内细胞学采集和分析样品的方法，包含：
获得可相对于彼此移动的第一板和第二板；
将样品的一部分沉积在第一板的内表面上；
具有用于对细胞进行染色和渗透的试剂；
将两块板合在一起以形成闭合构造，其中，第一板和第二板的两个内表面彼此面对，并且板之间的间距由板之间的间隔件调节，并且至少一部分染色溶液位于样品与第二板的内表面之间；
具有成像器；以及
对样品进行成像以便分析。
受试者包含人或动物。
在一些实施例中，试剂是染色试剂和细胞透化试剂。在一些实施例中，试剂为溶液形式并与样品混合。在一些实施例中，试剂涂敷于以下中的任一者上并干燥：(i)第一板的表面和/或样品的顶部，(ii)第二板的内表面，或(iii)两者。
在一些实施例中，通过成像进行的分析是细胞分析。
在一些实施例中，间隔件固定在一个或两个板上。在一些实施例中，间隔件在染色溶液内部。
在一些实施例中，样品在滴到板上之前与染色溶液混合。
在一些实施例中，染色溶液包含溶液中的染色剂(对细胞/组织进行染色的物质)。在一些实施例中，染色溶液不包含溶液中的染色染料，但被配置为将涂敷在其中一个板上的染色剂输送到细胞/组织中。在一些实施例中，染色溶液包含溶液中的染色剂(对细胞/组织进行染色的物质)，并且被配置为将涂敷在其中一个板上的染色剂输送到细胞/组织中。
在一些实施例中，间隔件的高度被配置为使染色的细胞和/或组织通过成像装置可见，而无需冲洗掉第二板与样品之间的染色溶液。
在一些实施例中，间隔件的高度被配置为使染色的细胞和/或组织在板达到闭合构造后无需打开板即通过成像装置可见。
在一些实施例中，在不冲洗掉第二板与样品之间的染色溶液的情况下，对样品进行染色，并且在将板闭合成闭合构造之后，在30秒或更短、60秒或更短、120秒或更短、300秒或更短、600秒或更短、或两者之间的任何一个范围内，通过成像器进行成像。
在一些优选实施例中，在不冲洗掉第二板与样品之间的染色溶液的情况下，对样品进行染色，并且在将板闭合成闭合构造之后，在30秒或更短、60秒或更短、120秒或更短、或两者之间的任何一个范围内，通过成像器进行成像。
在一些优选实施例中，在不冲洗掉第二板与样品之间的染色溶液的情况下，对样品进行染色，并且在将板闭合成闭合构造之后，在30秒或更短、60秒或更短、或两者之间的范围内，通过成像器进行成像。
在一些实施例中，间隔件的高度为0.2um(微米)或更小、0.5um或更小、1um或更小、3um或更小、5um或更小、10um或更小、20um或更小、30um或更小、40um或更小、50um或更小、或两者之间的任何一个范围。
在一些优选实施例中，间隔件高度为3um或更小。在一些优选实施例中，10um或更小。在一些优选实施例中，20um或更小。在一些优选实施例中，30um或更小。
在一些优选实施例中，在板处于闭合构造之后，染色溶液具有等于或小于亚噪声(sub-noise)厚度的厚度。
术语“亚噪声厚度”(SNT)是指样品或染色溶液的厚度，与样品或染色溶液中的噪声低于来自特定结合的光学标签的厚度相比，该厚度更薄，使光学标签对成像器可见。制作小于SNT的染色溶液将无需冲洗掉未结合的光学标签。
术语“检测剂”和“检测探针”可以互换。
2.用于诊断疾病的即时细胞内单细胞测定(INSA)
在一些实施例中，本发明提供：
一种用于确定含有至少一个细胞的样品中指示疾病的一种或多种细胞内生物标记物的存在和数量的方法，包含：
如果存在目标细胞内生物标记物，则使含有至少一个细胞的样品与用于目标细胞内生物标记物的细胞内染色制剂接触，以在闭合的Q卡内形成细胞内反应产物；
用成像器对细胞内反应产物进行成像，以生成细胞内反应产物的图像；
分析图像，以生成对细胞内反应产物的分析，以确定一种或多种细胞内生物标记物的存在和数量；以及
通过将在该方法中测量的所述一种或多种细胞内生物标记物的确定的存在和数量与相关生物标记物及疾病组合的数据库相关联，生成至少一种疾病诊断。
细胞内染色制剂包含蛋白检测探针、核酸检测探针(例如RNA、DNA)、细胞透化试剂、固定试剂或任何组合。
一种用于将第一细胞中测量的细胞内生物标记物与测量的患病第二细胞或具有该患病第二细胞的生物体相关联的方法，包含：
使含有至少一个细胞的样品与细胞内染色制剂接触，以在闭合的Q卡内形成细胞内反应产物；
用成像器对细胞内反应产物进行成像，以生成细胞内反应产物的图像；
分析图像，以生成对细胞内反应产物的分析，以确定测量的细胞内生物标记物的存在和数量；以及
通过将该测量的细胞内生物标记物的确定的存在和数量与相关生物标记物及疾病组合的数据库相关联，生成至少一种疾病诊断。
在一个或多个实施例中，本发明提供例如：
一种用于确定含有至少一个细胞的样品中指示疾病的一种或多种细胞内生物标记物的存在和数量的方法，包含：
如果存在目标细胞内生物标记物，则使含有至少一个细胞的样品与用于目标细胞内生物标记物的细胞内染色制剂接触，以在闭合的Q卡内形成细胞内反应产物；
用成像器对细胞内反应产物进行成像，以生成细胞内反应产物的图像；
分析图像，以生成对细胞内反应产物的分析，以确定一种或多种细胞内生物标记物的存在和数量；以及
通过将在该方法中测量的所述一种或多种细胞内生物标记物的确定的存在和数量与相关生物标记物及疾病组合的数据库相关联，生成至少一种疾病诊断。
一种用于将第一细胞中测量的细胞内生物标记物与测量的患病第二细胞或具有该患病第二细胞的生物体相关联的方法，包含：
使含有至少一个细胞的样品与细胞内染色制剂接触，以在闭合的Q卡内形成细胞内反应产物；
用成像器对细胞内反应产物进行成像，以生成细胞内反应产物的图像；
分析图像，以生成对细胞内反应产物的分析，以确定测量的细胞内生物标记物的存在和数量；以及
通过将该测量的细胞内生物标记物的确定的存在和数量与相关生物标记物及疾病组合的数据库相关联，生成至少一种疾病诊断。
示例-A
使用INSA进行结核病检测
一种用于检测受试者是否患有结核病的方法，包含：
a.从受试者处获取样品(例如痰、拭子等)；
b.直接在样品中检测结核菌或受试者细胞(例如血细胞、上皮细胞)，其中该检测包含对细菌和/或细胞进行染色；其中该染色包含细胞内测定以对细胞内的TB特异性蛋白或TB特异性核酸进行染色；其中，在一些实施例中，对细菌进行染色。
在一些实施例中，在步骤(b)中使用QMAX卡。在一些实施例中，在步骤(b)中使用智能手机。
在一些实施例中，步骤b包括以下步骤：
a.将样品放在QMAX卡上并将卡闭合；
b.在不冲洗的情况下，观察结核菌和/或受试者细胞的染色。
示例-B
使用INSA进行流感检测
一种用于检测对象是否患有流感的方法，包含：
a.从受试者处获取样品(例如鼻分泌物、鼻拭子等)；
b.直接在样品中检测流感病毒或受试者细胞(例如血细胞、上皮细胞)，其中该检测包含对流感病毒和/或细胞进行染色；其中该染色包含细胞内测定以对细胞内的流感病毒特异性蛋白或流感病毒特异性核酸进行染色；其中，在一些实施例中，使用INSA对流感病毒进行染色。
在一些实施例中，在步骤(b)中使用QMAX卡。在一些实施例中，在步骤(b)中使用智能手机。
在一些实施例中，步骤b包含以下步骤：
a.将样品放在QMAX卡上并将卡闭合；
b.在不冲洗的情况下，观察流感病毒和/或受试者细胞的染色。
3.使用INSA对样品中的无细胞生物标记物进行定量
本发明的其他方面包括但不限于：
使用INSH检测未稀释全血中细胞内(例如白细胞内)的mRNA。
使用即时细胞内单细胞测定(ISIM)来检测全血细胞内的细胞因子、以及转化为全血细胞外的游离细胞因子的细胞因子。
通过INSH和ISIM检测其他示例性生物标记物以识别细菌感染和病毒感染。
一种用于对全血中无细胞生物标记物进行定量的方法，包含：
(a)具有血液样品，该血液样品含有或可能含有无细胞生物标记物；
(b)通过特异性细胞内蛋白免疫检测，对全血细胞内的生物标记物进行检测和定量；
(c)对含有生物标记物的细胞进行检测和计数；
(d)通过将每个细胞中检测到的生物标记物的信号(在步骤(b)中进行检测和定量)乘以含有生物标记物的细胞总数(在步骤(c)中进行检测和计数)来计算总信号；以及
(e)将总信号与全血中游离生物标记物的浓度相关联。
在一些实施例中，全血是未稀释的。
在一些实施例中，细胞被放置在两个板之间。
一种用于INSH图像分析的示例性方法，包含：
a.具有全血样品，该全血样品含有或可能含有生物标记物；
b.对标注的RNA检测剂进行特异性细胞内RNA杂交检测，以特异性地杂交与生物标记物相关的RNA，其中该检测包含使用成像器(例如显微镜)进行成像；
c.通过图像软件打开显微镜图像。
d.从图像和背景信号(噪声)中获取每个细胞的平均荧光信号；
e.使用公式计算信号(S)与噪声(N)比：(S-N)/N对于每个图像(T)，每个测定条件9-20个图像，
f.使用B2M管家基因作为内部对照。对B2M图像进行与目标基因相同的分析(C)
g.通过取信号与其自身B2M内部对照的比率来标准化生物标记物的RNA信号并报告为T/C；
h.将标准化信号与全血中的无细胞生物标记物浓度相关联。
使用ISIM对细胞内蛋白表达水平进行定量的示例，包含
a.具有全血样品，该全血样品含有或可能含有生物标记物；
b.对标注的蛋白检测剂进行特异性细胞内蛋白免疫检测，以特异性地结合生物标记物，其中该检测包含使用成像器(例如显微镜)进行成像；
c.使用ISIM对细胞内蛋白染色1分钟后，(例如，使用iPhone或显微镜拍摄9-20个明场和相应的荧光图像)；
d.然后使用具有以下所列参数的软件对图像进行分析和报告：包含
血液样品包含全血、未稀释的全血、稀释的全血或白细胞。
Nt：图中细胞的总数
Np：阳性染色细胞数
％Np/Nt：Np占Nt的百分比
Fn：每个图中细胞的荧光强度
MF：来自阳性染色细胞的阳性荧光强度平均值
TF：通过将MF乘以％Np/Nt得到的总阳性荧光强度。
3)基于生物标记物的生物学诊断特征，四个级别的结果代表细胞内蛋白水平的数量：
A.％Np/Nt，当阳性百分比对诊断至关重要时；
B.Fn，当任何阳性染色细胞中的蛋白水平对诊断至关重要时；
C.MF和TF，当阳性百分比和荧光强度对诊断至关重要时。
D.所有参数，当所有参数对诊断至关重要时。
用于鉴定细菌感染和病毒感染的示例性生物标记物
图12示出了示例性细胞内检测实施例的示意图A和B。
示意图A说明了具有细胞核(122)和正常水平的细胞因子如IL-6(130)的健康白细胞(WBC)(120)的先前感染。WBC被一种病原(未示出)感染(130)，该病原会导致增殖或产生升高水平或异常水平的IL-6(132)。受感染的WBC将IL-6分泌(134)到细胞外，进入受感染WBC周围的血浆或血清中。IL-6的增殖和分泌可以发生的时间接近或几乎同时发生。在本发明中，将探针(“P”；135)分子添加(144)到含有感染的WBC的样品中，以接触细胞内IL-6并在探针与IL-6目标生物标记物之间形成细胞内可检测的复合物或反应产物(“Po”；136)。通过成像器检测细胞内复合物(“Po”)以生成图像。通过软件对图像进行分析，以确定IL-6细胞内生物标记物的存在和数量。将IL-6细胞内生物标记物的确定的存在和数量与细胞外生物标记物及疾病组合的数据库相关，诸如相关联的IL-4和IL-6细胞外生物标记物及细菌感染疾病(参见示例1)。诱导的细胞内IL-6的数量与血浆或血清IL-6水平呈正相关。
图12中的示意图B说明了健康细胞(150)的先前病毒感染，例如CD4、T细胞、淋巴细胞，其具有细胞核(151)和正常水平的IL-6(130)。健康细胞(150)被病毒颗粒感染(162)。病毒感染可以在核内(152)或核外(153)复制(164)，以产生升高水平或异常水平或疾病水平的病毒颗粒(154)。在本发明中，将病毒特异性探针(“C”；155)添加(166)到含有感染细胞的样品中，以接触细胞内病毒颗粒并在病毒特异性探针与细胞内及核内目标生物标记物之间形成可检测的复合物(“C*”；156)(参见示例3)。
参考附图，图1C示出了Alexa488-IL-6 60-mer寡核苷酸探针与全血的即时细胞内单细胞杂交(INSH)的示例结果。新鲜全血用LPS刺激5小时，并与Alexa488标记的IL-6寡核苷酸探针在INSH(即时细胞内单细胞杂交)中杂交，以检测IL-6mRNA表达，并在490nm激发下通过荧光显微镜成像。图像中的红色圆圈表示明亮视图中的白细胞(上图)。荧光视图图像示出了IL-6阳性细胞的荧光信号(光点；下图)。
图2示出了Alexa 647-B2M(管家基因)60-mer寡核苷酸探针与全血的即时细胞内单细胞杂交(INSH)的示例结果。新鲜全血用LPS刺激5小时，并在INSH中与Alexa647标记的IL-6寡核苷酸探针杂交，以检测B2M mRNA表达，并在650nm激发下通过荧光显微镜成像。明亮视图中的红色圆圈示出了白细胞(上图)。荧光视图图像示出了B2M阳性细胞的荧光信号(光点；下图)。
图3示出了白细胞中IL-6表达的INSH结果，该INSH结果示出了LPS诱导的剂量依赖性模式。左图示出了LPS剂量依赖性IL-6表达的绘图曲线。右图示出了左图中相同数据的柱形图表示。IL-6的信噪比通过B2M内部对照进行标准化。
图4示出了与INSH中的阴性对照GFP(绿色荧光蛋白)相比的基础IL-6表达(mRNA)。IL-6mRNA的基础水平显著高于阴性对照GFP的信号，表明IL-6在没有LPS刺激情况下在白细胞中表达。
图5示出了LPS诱导下白细胞(WBC)中IL-6mRNA表达(INSH)与蛋白产生(ELISA)的比较。左图示出了通过ELISA检测到的剂量依赖性LPS诱导的IL-6蛋白产生。右图示出了LPS诱导的IL-6mRNA表达(INSH)与IL-6蛋白产生(ELISA)的比较。IL-6INSH和ELISA数据相关性良好。R2值为0.9025。
图6A和图6B示出了来自健康供体的指尖血液的白细胞的INSH miRNA染色结果。图6A示出了来自健康人供体的指尖血液的白细胞INSH miRNA染色的代表性图像。上图示出了使用670nm滤光器拍摄的荧光图像。下图示出了荧光图像的相应明场图像。从左至右：AF647-加扰(scramble)对照探针；AF647-Mir-16-5p；以及AF647-Let7-5p miRNA探针对白细胞的染色结果，由圆圈(红色)指示。这些miRNA探针来自Thermo Fisher Scientific。图6B示出了来自图6A中所示的每种情况的荧光强度柱形图，并使用Image J软件进行了分析。收集数据并将其列于表(下)中，并以柱形图(上)的形式呈现。
图7A和图7B示出了对来自健康供体的指尖血液的白细胞进行染色的INSH AF647-Let-7a-5p和AF647-miR150-5p结果。图7A示出了来自健康供体的指尖血液的粒细胞和单核细胞圆圈(红色)和淋巴细胞圆圈(蓝色)中Let-7a-5p和miR150-5p的INSH染色的代表性图像。AF647-Let-7a-5p主要为染色的粒细胞/单核细胞；AF647-miR150-5p主要为染色的淋巴细胞。图7B示出了来自图7A中所示的每种情况的荧光强度，并使用Image J软件进行了分析。收集数据并将其列于表(下)中，并以柱形图(上)的形式呈现。AF647-Let-7a-5p在粒细胞/单核细胞中的表达显著更高(左柱)。然而，AF647-miR150-5p在淋巴细胞中的表达显著更高(左柱)。
图8显示新鲜人全血中LPS刺激的白细胞的即时细胞内单细胞免疫测定(ISIM)AF647-抗-IL6染色。新鲜人全血与不同浓度的LPS在37℃孵育16小时后，LPS刺激的全血中的白细胞用AF647-抗-IL6抗体染色。上图中示出了代表性荧光图像(670nm)，下图中示出了与荧光图像对应的明场图像。白细胞以圆圈(红色)指示。
图9示出了即时细胞内单细胞免疫测定(ISIM)IL-6染色的实验结果以及与ELISA血浆IL-6水平的总荧光强度相关性。使用Image J软件分析LPS刺激实验中所有图像的荧光强度和IL-6(+)细胞百分比(如图2中的代表性图像所示)。ISIM总荧光乘以荧光强度和IL-6(+)细胞的百分比，如列表(下)所示。将来自图2中实验的一半LPS刺激的血液离心，收集血浆用于可溶性IL-6水平的ELISA分析，如列表(下)所示。通过ELISA测定的ISIM总荧光和可溶性IL-6水平绘制在图表中(上)。这两个参数存在显著的线性相关性(R2＝0.9464)。
图10示出了新鲜人全血中白细胞IL-6和核纤层蛋白A/C的ISIM双染色实验结果。新鲜全血与AF647-抗-IL6(左图)和AF488-抗-核纤层蛋白A/C(中图)共同染色。AF647-抗-IL6荧光图像是使用670nm滤光片拍摄的(左图)；AF488-核纤层蛋白A/C荧光图像是使用495nm滤光器(中图)拍摄的；并且相应的明场图像显示在右图中。白细胞以非周期性空心圆圈(红色)表示。周期性圆圈是样品Q卡中的间隔件。
图11示出了人全血中LPS刺激的白细胞的ISIM AF647-抗-IFN-γ染色的实验结果。新鲜人全血与不同浓度的LPS在37℃孵育16小时后，LPS刺激的全血中的白细胞用AF647-抗IIFN-γ抗体染色。上图中示出了代表性荧光图像，下图是相应荧光图像的明场图像。白细胞以非周期性空心圆圈(红色)表示。周期性圆圈是样品Q卡中的间隔件。
在某些实施例中，机器学习用于分析在INSA中捕获的图像。在某些实施例中，机器学习包含使用间隔件和/或监测由图像连同样品一起捕获的样品中的标记。
示例-C
新鲜全血中mRNA的INSH
材料：
1.获取新鲜全血样品
2.定制执行INSH荧光标记寡核苷酸探针，并由Integrated DNA technology制造
2.1.IL-6Alexa488 60-mer寡核苷酸探针：
5’Alex488N/TCTGCAGGAACTGGATCAGGACTTTTGTACTCATCTGCACAGCTCTGGCTTGTTCCTCAC[SEQ.ID#1]
2.2.B2M Alexa647 60-mer寡核苷酸探针：
5’Alexa647N/ATCTTCAAACCTCCATGATGCTGCTTACATGTCTCGATCCCACTTAACTATCTTGGGCT[SEQ.ID#2]
2.3GFP Cy5 60-mer寡核苷酸探针：
5’Cy5N/ATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGC[SEQ.ID#3]
3.甲酰胺(Sigma，货号F9037)
4.Zwittergent 3-14去垢剂(EMD Millipore，货号693017)
5.脂多糖(LPS，Sigma，货号L-4391)
方法
1.Q卡制备：处理X板(顶板)：
1.1.用1M NaOH在50℃处理1小时，然后用1x PBS简单冲洗两次
1.2.在室温下用4％BSA涂敷2小时，然后用水简单冲洗两次
1.3.在纸巾上干燥
2.在BSA涂敷的X板上刮涂杂交溶液：
2.1.杂交溶液的制备：
2x SSC、1x Denhardt溶液、50mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)、3％甲酰胺、12mg/mlZwittergent和1um荧光标记的寡核苷酸探针
2.2.刮涂：将5微升杂交溶液沉积在X板上，用刮刀将杂交溶液在整个板上来回涂抹一次
2.3.刮涂的板风干30分钟即可使用
3.LPS(来自大肠杆菌的脂多糖)刺激细胞因子释放：
3.1.将新鲜全血样品与等体积的细胞培养基RPMI(Roswell Park MemorialInstitute(RPMI)1640培养基)混合
3.2.加入LPS至指定浓度，样品在37℃持续旋转孵育5小时
4.INSH：
4.1.用杂交溶液刮涂X板(顶板)，室温干燥。
4.2.将3.5微升新鲜血液样品沉积在基板(M板底座)上
4.3.将预涂的X板放在基板(底板)上的血样上并压在一起以将卡闭合。基板或M板具有10uM的柱或间隔件高度。
4.4.闭合的卡室温孵育2分钟，然后用显微镜成像
示例-D
新鲜全血中的INSH miRNA(60秒钟内)
材料：
1.新鲜人全血。
2.Q卡：5um或10um柱高度。
3.Alexa Fluor标记的miRNA探针，1uM原液浓度。所有探针均来自Thermo FisherScientific。
4.FISH杂交缓冲液来自BioSearch Technologies。
程序：将5微升全血与5微升杂交缓冲液和0.5微升Alexa Fluor标记的miRNA探针在Q卡底部混合。闭合Q卡并在室温孵育约1分钟，然后立即使用具有Q卡适配器或荧光显微镜的iPhone观察。观察包括成像、记录和分析图像以由相关的生物标记物及疾病数据库生成疾病诊断。
示例-E
新鲜全血中的即时细胞内单细胞测定(ISIM)细胞因子
材料：
1.新鲜人全血。
2.Q卡：5um或10um柱高度。
3.抗体，0.6mg/ml抗体，在PBS中。
3.1来自R&D Systems的抗人IL-6和抗人IFN-γ
3.2来自Thermo Fisher Scientific的AF647标记试剂盒
3.3来自Cell Signaling的AF488-抗-核纤层蛋白A/C
4.染色溶液：60％乙醇、5％Zwittergent 3-14、1％Tween-20
程序：
1.将2微升全血与4微升染色溶液及0.5微升抗体在Q卡底板上混合；
2.闭合Q卡，室温孵育约1分钟，立即准备好使用荧光显微镜或iPhone适配相机进行观察。观察包括成像、记录和分析图像以由相关的生物标记物及疾病数据库生成疾病诊断。
3.QMAX卡的示例
在一些实施例中，第一板和第二板通过铰链连接。
在一些实施例中，染色溶液的体积为2uL(微升)或更小、2uL或更小、5uL或更小、10uL或更小、15uL或更小、20uL或更小、30uL或更小、50uL或更小、100uL或更小、或两者之间的任何一个范围。
在一些优选的实施例中，染色溶液的体积为2uL(微升)或更小、2uL或更小、5uL或更小、10uL或更小、15uL或更小、20uL或更小、30uL或更小、或两者之间的任何一个范围。
在一些优选的实施例中，染色溶液的体积为2uL(微升)或更小、2uL或更小、5uL或更小、10uL或更小、15uL或更小、或两者中的任何一个之间的范围。
4.INSA适用疾病的示例
即时细胞内单细胞测定(INSA)提供与含有至少一个细胞的样品的一步化学接触，包括60秒或更短的孵育、成像、分析以及报告所检测的细胞内生物标记物(诸如核酸和蛋白质)的存在和数量，该生物标记物直接来自新鲜粗生物样品，诸如针活检样品、全血、尿液、痰、唾液、拭子样品(巴氏涂片)和类似样品。INSA程序在诊断疾病方面具有优势，例如具有已建立的或可发现的细胞内诊断生物标记物的疾病，例如：传染病；恶性疾病；自身免疫性疾病；代谢疾病；以及遗传性基因失调。下面的列表提供了样品来源(例如，体液)或样品提取方法、疾病类别以及疾病和病症的示例，其中公开的INSA方法可用于根据公开的方法进行诊断。
下面给出了一些INSA生物标记物和/或过程。
全血样品中的INSA生物标记物：
尿液样品：
拭子样品中的生物标记物：
以下八个示例是被测试的实验，作为本发明实施例的一部分。
示例1
白细胞中IL-4和IL-6的共染色以及新鲜人全血中的白细胞计数可区分细菌感染和病毒感染。该实验示例说明了即时细胞内单细胞免疫测定(ISIM)，它是一种简单的测定，可以完成涉及例如IL-4和IL-6染色和定量的血液测试。该方法可以区分例如细菌感染和病毒感染。血液中IL-4和IL-6的增加是早期细菌感染的重要生物标记物。血液中增加的IL-6显示出50％至64.3％的敏感性和82.8％至97.1％的特异性。血液中增加的IL-4显示出100％的敏感性和76.5％的细菌感染特异性。白细胞中IL-4和IL-6的共染色可显著提高区分细菌感染与其他病原体的敏感性和特异性。
采样：
将一滴全血沉积到Q卡上。
染色和成像：
将血液与染色溶液混合，该染色溶液包括PBS、Zwittgent 3-14、乙醇和AF488-抗-IL-4和AF647-抗-IL6抗体。
闭合Q卡并在室温用染色溶液孵育血液样品少于1分钟。
使用带有适配器或荧光显微镜的iPhone对闭合的Q卡中的白细胞进行成像。
实验结果：IL-4水平高于9pg/ml或IL-6水平高于0.15pg/ml至<74.5ng/ml、总WBC计数增加以及高粒细胞、或两者都是对于细菌感染而言重要的生物标记物。
示例2
对来自新鲜人全血的白细胞中的IFN-γ和IL-2进行共染色以确定活动性肺结核(TB)感染。IFN-γ和IL-2的不同特征是分枝杆菌负荷和结核病临床状态的免疫学标记物。受试者工作特征曲线(ROC)分析显示，纯化蛋白衍生物(PPD)特异性IFN-γ/IL-2双阳性T细胞的频率低于56％是活动性结核病的准确标记物(特异性100％，敏感性70％)，与非活跃状态得以有效区分。
采样：将一滴全血沉积到Q卡上。
染色和成像：
将血液与染色溶液混合，该染色溶液包括PBS、Zwittergent 3-14、乙醇和抗体AF488-抗-IFN-γ、AF647-抗-IL2和AF590-抗-CD16。
闭合Q卡并在室温用染色溶液孵育血液样品少于1分钟。
使用带有适配器或荧光显微镜的iPhone对闭合的Q卡中的白细胞进行成像。
实验结果：低于56％的IFN-γ/IL-2双阳性CD16(-)单核细胞表明存在活动性肺结核(TB)感染。
示例3
来自新鲜人全血的白细胞中的HIV Gag p24抗原染色以诊断HIV感染。HIV血清阳性个体外周血中检测到的HIV p24抗原阳性细胞百分比与临床分期高度相关，与T4细胞总数呈负相关。外周血单个核细胞中p24的检测与T4细胞总数的结合是确定HIV血清反应阳性个体疾病进展的重要生物标记物。
采样：将一滴全血沉积到Q卡上。
染色和成像：
将血液与染色溶液混合，该染色溶液包括PBS、Zwittergent 3-14、乙醇和抗体AF488-抗-p24和AF647-抗-CD4。
闭合Q卡并在室温用染色溶液孵育血液样品少于1分钟。
使用带有适配器或荧光显微镜的iPhone对闭合的Q卡中的白细胞进行成像。
实验结果：p24(+)单核细胞高于4％，和/或CD4(+)细胞减少，可诊断为HIV血清阳性血样。
示例4
来自新鲜人全血的白细胞中的INSH HIV RNA Gag-pol序列染色，以诊断HIV感染。
采样和预印染色：将一滴全血沉积到Q卡上。包含在Q卡顶板(X板)上的印制/涂敷干燥染色材料(AF488-HIV RNA Gag-pol探针和AF647-加扰对照探针)。
成像：
闭合Q卡并在室温孵育微量实施例中的血液样品少于1分钟。
使用带有适配器或荧光显微镜的iPhone对闭合的Q卡中的白细胞进行成像。
实验结果：HIV RNA Gap pol探针(+)单个核细胞的百分比高于0.01％可诊断为HIV血清阳性血样。
示例5
来自新鲜人全血的白细胞中的HBsAg和HBcAg染色以诊断乙型肝炎(HBV)感染。
采样：将一滴全血沉积到Q卡上。
染色和成像：
将血液与染色溶液混合，该染色溶液包括PBS、Zwittergent 3-14、乙醇和抗体AF488-抗-HBsAg和AF647-抗-HBcAg。
闭合Q卡并在室温用染色溶液孵育血液样品少于1分钟。
使用带有适配器或荧光显微镜的iPhone对闭合的Q卡中的白细胞进行成像。
实验结果：HBsAg和HBcAg(+)外周血单个核细胞(PBMCs)高于5％可诊断为HBV阳性患者样品。
示例6
液基宫颈细胞学标本中的INSH HPV E6/E7 mRNA用于诊断HPV感染。
采样和染色：
将液基宫颈细胞学标本放在Q卡的底板上，Q卡的顶板上带有干燥印制/涂敷HPVE6/E7 mRNA探针(X板)；
闭合Q卡，将标本样品与染色溶液在室温孵育少于1分钟；
使用带有适配器或荧光显微镜的iPhone对闭合的Q卡中的白细胞进行成像、记录和分析。
实验结果：观察HPV E6/E7 mRNA(+)上皮细胞可诊断为HPV感染。
示例7
液基宫颈细胞学标本中的ISIM HPV E6/E7蛋白用于诊断HPV感染
采样和染色：
1.将液基宫颈细胞学标本与染色溶液混合，该染色溶液包括PBS、Zwittergent 3-14、乙醇和AF488-抗HPV E6/E7抗体；
2.闭合Q卡，将血液样品与染色溶液在室温孵育少于1分钟；
3.使用带有适配器或荧光显微镜的iPhone对闭合的Q卡中的白细胞进行成像、记录和分析。
实验结果：HPV E6/E7蛋白(+)上皮细胞百分比高于2％可诊断为HPV阳性标本。
示例8
外周多形核白细胞(PMNLs)中ISIM CMV特异性早期抗原(pp65)染色以诊断CMV感染。
采样：重复示例1的采样步骤1至3。
染色和成像：
将血液与染色溶液混合，该染色溶液包括PBS、Zwittgent3-14、乙醇和AF488-抗-pp65抗体；
闭合Q卡，将血液样品与染色溶液在室温孵育少于1分钟；以及
使用带有适配器或荧光显微镜的iPhone对闭合的Q卡中的白细胞进行成像、记录和分析。
实验结果：pp65(+)外周血单个核细胞(PBMCs)高于5％可诊断为CMV阳性患者样品。
示例9
INSH Sars-cov-2特异性mRNA探针染色鼻咽上皮细胞以诊断COVID-19
人SARS-CoV-2的基因组与人SARS-CoV-1的基因组相似度为88％，与人MERS相似度为29％，与蝙蝠冠状病毒RaTG13相似度为99％，如图1所示。为了使用iMOST特异性诊断COVID-19，我设计了11个列出的探针，其靶向SARS-COV-2的Orf1ab、Orf3和刺突mRNA。
Orf1ab 5289-5349
tagagcaggtggattaaacttcaactctatttgttggagtgttaacaatgcagtggcaag
Orf1ab 6262-6322
caactggttttgtgctccaaagacaacgtatacaccaggtatttggtttatacgtggctt
Orf1ab 6702-6762
agtacaaacacggtttaaacaccgtgtaactatgttagtagttgtactaacaactttgtt
Orf1ab 20344–20404
ggtgattccttaaaacgtttagctagtccaatcagtagatgtaaaccacctaactgacta
Orf1ab 1550-1607
ttgtcattaagaccttcggaaccttctccaacaacacctgtatggttacaacctatgtta
Orf3a 25687-25746
ttatactctgcaagaagtagactaaagcataaagatagagaaaaggggcttcaaggccag
Orf3a 25409-25469
tgaaggagtagcatccttgatttcaccttgcttcaaagttacagttccaattgtgaagat
Spike 21750-21756
cctcttagtaccattggtcccagagacatgtatagcatggaaccaa
Spike 21995-22053
ttcgcactagaataaactctgaactcactttccatccaacttttgttgtttttgtggta
Spike 22276-22336
ccaacctgaagaagaatcaccaggagtcaaataacttctatgtaaagcaagtaaagtttg
Spike 22291-22349
cagcaccagctgtccaacctgaagaagaatcaccaggagtcaaataacttctatgtaaa
采样和染色：
在干净的离心管中将鼻咽细胞学拭子与100ul生理盐水混合。
将3-10ul鼻咽盐水混合物添加到Q卡的底板上，Q卡的顶板(X板)上带有干燥印制/涂敷Sars-cov-2特异性mRNA探针；
闭合Q卡，将标本样品与染色溶液在室温孵育少于1分钟；以及
使用带有适配器或荧光显微镜的iPhone对闭合的Q卡中的鼻咽上皮细胞进行成像、记录和分析。
实验结果：观察Sars-cov-2mRNA(+)上皮细胞可诊断为COVID-19。
示例10
鼻咽上皮细胞ISIM Sars-cov-2特异性抗体染色诊断COVID-19
采样和染色：
将鼻咽细胞学拭子与染色溶液混合，该染色溶液例如包括PBS、Zwittgent 3-14、乙醇和AF488-抗-刺突或AF488-抗-核衣壳蛋白抗体；
闭合Q卡，将标本样品与染色溶液在室温孵育(在一些实施例中，在室温孵育少于1分钟)；以及
使用带有适配器或荧光显微镜的iPhone对闭合的Q卡中的鼻咽上皮细胞进行成像、记录和分析。
实验结果：观察AF488-抗-刺突(+)或AF488-抗-核衣壳蛋白(+)上皮细胞可诊断为COVID-19。
生物标记物
表1至表3提供了可根据本发明检测的生物标记物及其相关疾病或病症的列表。
除非另有说明，如附表中所列的生物标记物可以是例如蛋白或核酸(例如，mRNA)生物标记物。除非另有说明，否则诊断可与样品中生物标记物水平的升高或降低相关联。
表1：诊断标记物
表2：诊断标记物
以下表3提供了可以使用所公开的方法进行检测和定量并与相关疾病或健康状况相关联的生物标记物的列表。
表3：诊断生物标记物
在一些情况下，要使用本方法检测的生物标记物是与疾病或健康状况相关联的微小RNA(miRNA)生物标记物。以下表7提供了可以使用本方法进行检测的miRNA生物标记物的列表。
表7：诊断miRNA标记物
*括号中的miRNA标记物被下调
在一些实施例中，通过直接压印板或对板进行注塑，将间隔件固定在板上。
在一些实施例中，板和间隔件的材料选自聚苯乙烯、PMMA、PC、COC、COP和其他塑料。
在一些实施例中，间隔件之间的距离在1um至200um的范围内。
在一些实施例中，间隔件之间的距离在200um至1000um的范围内。
在一些实施例中，调节均匀厚度层的间隔件具有至少1％的填充因子，其中填充因子是接触均匀厚度层的间隔件面积与接触均匀厚度层的总板面积的比率。
在一些实施例中，对于调节均匀厚度层的间隔件，间隔件的杨氏模量乘以间隔件的填充因子等于或大于10MPa，其中填充因子是接触均匀厚度层的间隔件面积与接触均匀厚度层的总板面积的比率。
在一些实施例中，对于柔性板，柔性板的厚度乘以柔性板的杨氏模量在60至750GPa-um的范围内。
在一些实施例中，对于柔性板，间隔件间距(ISD)的四次方除以柔性板的厚度(h)和柔性板的杨氏模量(E)，ISD4/(hE)，等于或小于106um3/GPa。
在一些实施例中，一个或两个板在板的表面上或内部包含位置标记，其提供板的位置信息。
在一些实施例中，一个或两个板在板的表面上或内部包含刻度标记，其提供样品和/或板的结构的横向尺寸的信息。
在一些实施例中，一个或两个板在板的表面上或内部包含有助于样品成像的成像标记。
在一些实施例中，间隔件用作位置标记、刻度标记、成像标记或其任何组合。
在一些实施例中，均匀厚度层的平均厚度约等于样品中分析物的最小尺寸。
在一些实施例中，间隔件之间的距离在1um至50um的范围内。
在一些实施例中，间隔件之间的距离在50um至120um的范围内。
在一些实施例中，间隔件之间的距离在120um至200um的范围内。
在一些实施例中，间隔件之间的距离基本上是周期性的。
在一些实施例中，间隔件是具有选自圆形、多边形、圆形、正方形、矩形、卵形、椭圆形及其任意组合的横截面形状的柱。
在一些实施例中，间隔件具有柱形并且具有基本上平坦的顶表面，其中，对于每个间隔件，间隔件的横向尺寸与其高度的比率为至少1。
在一些实施例中，对于每个间隔件，间隔件的横向尺寸与其高度的比率为至少1。
在一些实施例中，其中间隔件的最小横向尺寸小于或基本上等于样品中分析物的最小尺寸。
在一些实施例中，间隔件的最小横向尺寸在0.5um至100um的范围内。
在一些实施例中，间隔件的最小横向尺寸在0.5um至10um的范围内。
在一些实施例中，间隔件具有至少100/mm2的密度。
在一些实施例中，间隔件具有至少1000/mm2的密度。
在一些实施例中，至少一个板是透明的。
在一些实施例中，至少一个板由柔性聚合物制成。
在一些实施例中，对于压缩板的压力，间隔件是不可压缩的和/或独立地只有一个板是柔性的。
在一些实施例中，柔性板的厚度在10um至200um的范围内。
在一些实施例中，变化小于30％。
在一些实施例中，变化小于10％。
在一些实施例中，变化小于5％。
在一些实施例中，收集板和盖板被连接并且被配置为通过折叠板而从开放构造变为闭合构造。
在一些实施例中，收集板和盖板通过铰链连接，并且被配置为通过沿铰链折叠板而从开放构造改变为闭合构造。
在一些实施例中，收集板和盖板通过作为单独材料的铰链连接至板，并且被配置为通过沿铰链折叠板而从开放构造改变为闭合构造。
Claims (23)
1.一种用于确定含有至少一个细胞的样品中的一种或多种指示疾病的细胞内生物标记物的存在和数量的方法，包含：
如果存在目标细胞内生物标记物，则使所述含有至少一个细胞的样品与用于所述目标细胞内生物标记物的细胞内染色制剂接触，以在闭合的Q卡内形成细胞内反应产物；
用成像器对所述细胞内反应产物进行成像，以生成所述细胞内反应产物的图像；
分析所述图像，以生成对所述细胞内反应产物的分析，以确定所述一种或多种细胞内生物标记物的存在和数量；以及
通过将在所述方法中测量的所述一种或多种细胞内生物标记物的确定的存在和数量与相关生物标记物及疾病组合的数据库相关联，生成至少一种疾病诊断。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述相关生物标记物及疾病组合的数据库基于病毒反应性生物标记物和患病细胞的细胞外测量浓度。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞内染色制剂包含：细胞内染色试剂，所述细胞内染色试剂含有抗体探针分子[例如，AF488-抗-IL-4和AF647-抗-IL6抗体]和/或寡核苷酸探针分子[例如，IL-6Alexa488 60-mer寡核苷酸探针，SEQ.ID#1]；缓冲液；以及细胞透化剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述相关生物标记物及疾病组合的数据库基于病毒生物标记物和患病细胞的细胞外测量浓度。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞内染色制剂包含：细胞内染色试剂，所述细胞内染色试剂含有病毒探针分子[例如，p24蛋白或p24 mRNA]；缓冲液；以及细胞透化剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞内染色制剂包含荧光标签的寡核苷酸探针。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，至少一种疾病诊断选自：血癌、传染病、自身免疫病、原发性免疫缺陷(PID)、遗传病、良性泌尿道疾病或病症、泌尿道癌或恶性疾病。
8.根据权利要求1所述的方法，还包含利用通信装置远程报告所述至少一种疾病诊断。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞内染色制剂包含：细胞内染色试剂，所述细胞内染色试剂含有探针分子；缓冲液；以及细胞透化剂。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品包含单个细胞。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品包含全血。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，至少一种细胞包含白细胞、红细胞、粒细胞或其组合。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，使所述样品与所述制剂接触并且在单个步骤中完成与所述生物标记物产生的化学相互作用。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，至少以下之一：
使所述样品与所述染色制剂接触；
所述染色制剂与所述生物标记物产生化学相互作用或孵育；
成像；或者
分析所述图像在60秒或更短时间内完成。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，使所述样品与所述制剂接触并且在单个步骤中完成与所述生物标记物产生的化学相互作用。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，至少以下之一：
使所述样品与所述染色制剂接触；
所述染色制剂与所述生物标记物产生化学相互作用或孵育；
成像；或者
在60秒或更短时间内完成分析所述图像。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品是选自以下的新鲜粗生物样品：针刺活检、全血、尿液、痰、唾液、拭子样品(例如，巴氏涂片)、汗液、呼吸、母乳、胆汁或来自病理过程的结果(诸如水疱或囊液)。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标细胞内生物标记物的存在指示至少一种疾病的存在。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标细胞内生物标记物的存在和数量更能指示至少一种疾病的存在。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标细胞内生物标记物的存在和数量更能指示所述至少一种疾病并且提供选自所述相关生物标记物及疾病组合的数据库的至少一种疾病诊断。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物标记物指示选自以下的至少一种疾病：传染病、恶性疾病、自身免疫病、代谢疾病、遗传性遗传障碍疾病；或其组合。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞内生物标记物选自：特定核酸、特定蛋白或其混合物。
23.一种用于将第一细胞中测量的细胞内生物标记物与测量的患病第二细胞或具有所述患病第二细胞的生物体相关联的方法，包含：
使含有至少一个细胞的样品与细胞内染色制剂接触，以在闭合的Q卡内形成细胞内反应产物；
用成像器对所述细胞内反应产物进行成像，以生成所述细胞内反应产物的图像；
分析所述图像，以生成对所述细胞内反应产物的分析，以确定所述测量的细胞内生物标记物的存在和数量；以及
通过将所述测量的细胞内生物标记物的确定的存在和数量与相关生物标记物及疾病组合的数据库相关联，生成至少一种疾病诊断。
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