CN107110847A - 用于检测或测量乙基葡萄糖醛酸苷的乙基葡萄糖醛酸苷侧向流动测试带、免疫测定、装置和方法 - Google Patents

用于检测或测量乙基葡萄糖醛酸苷的乙基葡萄糖醛酸苷侧向流动测试带、免疫测定、装置和方法 Download PDF

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Abstract

可以用于检测针对酒精滥用的酒精摄入或者相关疾病和治疗监测的乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)侧向流动免疫测定测试带、装置和方法。

Description

用于检测或测量乙基葡萄糖醛酸苷的乙基葡萄糖醛酸苷侧向 流动测试带、免疫测定、装置和方法
发明领域
本发明涉及可以用于针对酒精滥用或戒酒检测或监测的酒精摄入或者相关疾病和治疗监测的乙基葡萄糖醛酸苷(“EtG”)侧向流动免疫测定测试带、装置和方法。
背景
作为用于检测或监测体液或生物样品中药物或分析物的存在的方法，免疫测定变得越来越普及。在免疫测定的开发中的具体挑战是针对靶标药物/分析物的抗体的制备，因为许多不是固有抗原性的。通常，必须将药物修饰以制备抗原衍生物，但是当药物以适当可用的灵敏度(通常具有生理和/或药理学显著性的水平)包含在待测试的液体样本中时，针对抗原衍生物制备的抗体必须能够识别药物。灵敏度不是唯一的担忧。各种代谢物经常存在并且其他药物可能会与靶标分析物一起存在。优选地，针对特定药物或代谢物的抗体与其他代谢物或其他药物具有最小的交叉反应性(如果存在的话)。
侧向流动测试，也被称为侧向流动免疫层析测定，是预期用于在不需要专门且昂贵的设备的情况下检测样品(基质)中靶标代谢物的存在(或不存在)的装置，尽管存在许多由读取设备支持的基于实验室的应用。通常，这些检测用于针对家庭检测、护理点检测(point of care testing)或实验室用途的医学诊断以及车辆驾驶员的法律强制检测。
所述技术基于一系列毛细管床，如多孔纸或烧结聚合物的层。这些层中的每一层具有自发输送液体(例如，尿液)的能力。第一层(样品垫)起海绵的作用并且容纳过量的样品液体。一旦浸渍，液体即迁移至第二层(缀合物垫)，制造商已经在其中储存了所谓的缀合物，即在含有保证靶标分子(例如，抗原)与已经固定在粒子表面上的其化学伴侣(例如，一抗)(任选第二标记抗体(二抗)(例如，夹心测定)之间的优化的化学反应所需的完全试剂混合物的盐-糖基质中的生物活性化合物(参见以下)的干燥形式。在样品液体溶解盐-糖基质的同时，其还溶解试剂，并且在一个组合输送作用中，样品和试剂在流经多孔结构的同时混合。以这种方式，代谢物在经由第三毛细管床进一步迁移的同时与抗体结合。这种床具有一个或多个已经由制造商固定第三分子(通常为标记的抗体)的区域(通常被称为条带)。到样品-缀合物混合物到达这些条带时，代谢物已经结合在第一抗体上并且第三“捕获”分子结合复合物。一会之后，当越来越多的液体经过条带时，抗体/代谢物复合物积聚并且条带区域改变颜色。通常，存在至少两个条带：捕获任何粒子并且从而表明反应条件和技术起作用的条带(对照)。第二条带区域含有特异性捕获分子并且仅捕获包含代谢物分子和第一抗体的那些复合物。在经过这些反应区域之后，液体进入最终的多孔材料，芯材，其提供牵引测试液体通过多个毛细管床的胶体渗透压(oncotic pressure)并且起废料容器的作用。
侧向流动测试可以作为竞争性测定或夹心测定操作。在竞争性测定中，冲洗复合物，抗体受到限制或者存在与用于一抗结合的靶标竞争的靶标类似物。在夹心测定中，使用对抗原特异的一抗，并且二抗位于第三层中，二抗仅对第一抗体是特异性的。当使用二抗时，其可以与视觉(或可视化)标记物如荧光团或对可视化的发色团特异的酶缀合。
在图3中示出的乙基葡萄糖醛酸苷(“EtG”)是通过乙醇与活化葡萄糖醛酸在UDP葡萄糖醛酸基转移酶(glucuronyl transferase)的存在下在线粒体膜上缀合形成的乙醇的直接代谢物。尽管乙醇在饮用之后仅数小时内是可检测的，而EtG在酒精饮用之后多至约四或五天是可检测的，使其成为用于确定酒精饮用的可靠靶标分析物(假定该测试可以针对假阳性和假阴性进行验证和控制)。酒精饮用的监测由于许多原因是重要的，包括与酒精滥用和戒酒检测和监测结合的用途(用于医学治疗、和法庭或法律强制检测和监测中的一种或多种)、安全敏感性程序如航空公司飞行员以及卫生保健或急救护理专业人员以及重型机械或车辆操作员。
目前，EtG通过气相色谱法/质谱法(“GC/MS”)和液相色谱法/联用质谱法(“LC/MS/MS”)准确且可重复地检测。已经尝试了使用多克隆抗血清检测EtG的酶联免疫测定(“ELISA”)试验，但是多克隆抗体的使用可能会导致显著且增加的假阳性和假阴性数量，这表明该测定的差的特异性和灵敏度。此外，暴露于外部乙醇(例如，含有乙醇的个人护理产品、急救产品、清洁产品等)也产生假阳性。这种不准确性导致了这样的建议或策略：对于阳性测试结果来说，仅高水平的EtG(例如，至少500、750、或1000ng/mL尿液)是可接受的，这可能会导致显著数量的假阴性，尤其是使用免疫测定检测EtG。因此，市场上似乎没有提供针对EtG的准确、可重复且商业可行的免疫测定的优点的产品，所述免疫测定任选不需要通过使用包括(“GC/MS”)和液相色谱法/联用质谱法(“LC/MS/MS”)在内的额外检测进一步验证。这样的测试还需要大量时间以提供结果，例如至少数小时、数天、或数周。
因此，需要提供和解决与开发用于针对EtG的准确、可重复且商业可行的免疫测定的装置和方法相关的当前问题中的一个或多个，例如，与现有的测定相比，提供更好的灵敏度和/或特异性(例如，使用EtG特异性单克隆抗体)、较低和/或可接受的假阴性和/或假阳性比率中的一个或多个，不需要使用更加昂贵且耗时和实验室所需的测试(例如，GC/MS和/或LC/MS/MS)的第二轮检测来确认阳性检测。因此，还需要提供超过已知系统或方法的改进(任选地克服这些问题中的一个或多个)的制造系统和方法。
概述
本发明的非限制性实施方案可以任选包括EtG免疫测定侧向流动测试带、装置、方法、和/或试剂中的一个或多个，如EtG特异性侧向流动带免疫测定装置以及制造和使用其的方法。
非限制性的任选的实施方案可以包括装置、制造或使用方法、软件、计算机可读的计算机系统、和/或用于检验或检测药物或其他化学品或代谢物的存在的系统，例如，但不限于诊断、监测、或测量与疾病或医学病症相关的化学或其他参数，或者用于任选在非控制或难控制环境中检验非法或违禁药物。
本发明的装置、方法或系统可以任选使用组织或体液中的一种或多种(例如，但不限于尿液、血液、唾液、或等血浆)作为用于检测EtG的测试样品。非限制性的任选的实施方案可以任选包括下列各项中的一种或多种：电子器件如智能电话或其他无线、互联网或蜂窝通讯能力的器件，以及数字和/或其他成像、数据处理、数据存储和/或经由蜂窝网络或Wi-Fi的数据的无线电子传输。
装置、系统或方法可以任选收集、检测、处理、操控、改变、调节、确定、验证、和/或测试足以测试、化学和/或机械收集、检测、处理、操控、改变、调节、确定、验证、和/或测试尿液或口腔或其他体液或组织中的一个或多个中的EtG的体积的尿液、口腔或其他体液或组织。针对检测和/或将调节的液体递送至用于诊断、监测、或测量与疾病或医学病症相关的化学或其他参数、或确定EtG存在或不存在、或EtG的其他定量或定性测量的侧向流动测试带或其他检测系统，装置、系统或方法也可以提供设置和/或优化。
通过一旦将检测装置插入至定位外罩中即自动引发计时或者由用户借助与触敏或其他图形用户界面相互作用来引发测试的起始时间，这样的装置还可以任选提供测试终点和/或随后的图像捕获的定时。
侧向流动测试条装置、系统或方法可以任选提供进行测试的人员(测试者)进行选自由下列各项组成的组的至少一种：将测试装置从包装中移除，将盖从液体收集装置中移除或将尿液或其他体液放置在液体收集装置中或测试条或检测装置(例如，但不限于测试条保持器、盒、插入物、检测装置组分等)上。
测试条、装置、或系统可以任选包括用于检测尿液或其他体液(例如，唾液、血液、血液组分、或其他组织样品(例如，皮肤、头发或指甲)中乙基葡萄糖醛酸苷的乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)侧向流动测试条免疫测定系统、装置或方法，其包括下列各项中的至少一个或多个：
(a)如图1和2中示意性地示出的侧向流动测试条，所述测试条包括；
(i)至少一种类型的毛细管流动材料，其能够可重复地提供尿液、体液或组织样品经由测试条的侧向流动，以可重复地相互作用并且使用在测试条中包含的可检测标记的EtG特异性抗体以及第一和第二可检测标记物检测EtG，所述系统提供(1)阳性结果，如在图2中所示的仅(C)着色带显色；(2阴性结果，)如在图2中所示的(T)着色带和(C)着色带二者均显色；或无效结果，如在图2中所示的仅(T)着色带显色，或没有带；
(ii)如在图1中所示的尿液/体液/组织样品或对照样品施加区域(A)，其包含样品施加组分；
(iii)如在图1中所示的标记的EtG标记的抗体区域(B)，其包含设置在测试条材料上或设置到测试条材料的可检测标记的EtG特异性抗体，所述可检测标记的EtG特异性抗体包含在施加至测试条之后与可检测标记物组分缀合并且由于尿液、体液或组织或对照样品的毛细管作用而可溶于测试条或沿着测试条传导的EtG特异性抗体；
(iv)第一检测区域(D)，其包含所述第一可检测标记物作为当尿液、体液或组织或对照样品中的EtG的浓度低于在100至2000ng/mL之间的预选择的阈值时结合可检测标记的EtG特异性抗体的第一标记部分；其中低于预选择的阈值的可检测标记的EtG特异性抗体的结合得到如在图2中所示的具有(T)和(C)着色带二者的阴性结果；并且其中当尿液、体液或组织或对照样品中的EtG高于预选择的阈值时，所述可检测标记的EtG特异性抗体未可检测地或明显地结合第一可检测标记物并且也不提供阴性结果；
(v)第二检测区域(E)，其包含第二可检测标记物作为当尿液、体液或组织或对照样品中的EtG的浓度高于在100至2000ng/mL之间的预选择的阈值时结合可检测标记的EtG特异性抗体的第二标记部分；并且其中高于预选择的阈值的可检测标记的EtG特异性抗体的结合得到如在图2中所示的仅具有(C)着色带的阳性结果；并且其中当尿液、体液或组织或对照样品中的EtG高于预选择的阈值时，可检测标记的EtG特异性抗体未可检测地或明显地结合第一可检测标记物；并且
其中当测定无效时，可检测标记的EtG特异性抗体的结合得到如在图2中所示的仅具有(T)着色带或没有带的无效结果；并且其中可检测标记的EtG特异性抗体未可检测地或明显地结合第二可检测标记物。
任选地，可以包括以下中的一个或多个：其中：阈值是500、750、或1000ng/mL；可检测标记物是胶体金或胶乳金；EtG特异性抗体是单克隆的；EtG特异性抗体对EtG的亲和力是至少10-7KD；可检测标记物包含酶、酶片段或酶供体片段。
所述方法可以任选包括下列步骤中的一个或多个：提供如图1和2中示意性地示出的侧向流动测试条；将尿液、体液或组织或对照样品施加至测试条；和确定尿液、体液或组织或对照样品是否包含高于或低于阈值的EtG。
本发明的这些和其他优点和特征根据以下描述和所附权利要求将会变得更加显而易见，或者可以通过如在下文中给出的本发明的实践而获知。
附图简述
为了进一步阐明本发明的以上和其他优点和特征，本发明的更具体的描述将会参照在附图中所示的其具体实施方案给出。应理解的是，这些附图仅描绘了本发明的典型实施方案并且因此不应被认为限制其范围。将通过使用附图额外具体且详细地描述和解释本发明，其中：
图1示出了本发明的测试条的非限制性实例的示意图。
图2示出了显示阴性、阳性和无效结果的本发明的测试条的非限制性实例的示意图。
图3示出了乙基葡萄糖醛酸苷的化学结构。
描述
在图3中示出的乙基葡萄糖醛酸苷(“EtG”)是通过乙醇与活化葡萄糖醛酸在UDP葡萄糖醛酸基转移酶的存在下在线粒体膜上缀合形成的乙醇的直接代谢物。尽管乙醇在饮用之后仅数小时内是可检测的，EtG在酒精饮用之后多至四或五天内是可检测的，使其成为用于确定酒精饮用的可靠靶标分析物。酒精饮用的监测由于许多原因是重要的，包括与酒精滥用和戒酒检测和监测结合的用途(用于医学治疗、和法庭或法律强制检测和监测中的一种或多种)、安全敏感性程序如航空公司飞行员以及卫生保健或急救护理专业人员以及重型机械或车辆操作员。
目前，EtG通过气相色谱法/质谱法(“GC/MS”)和液相色谱法/联用质谱法(“LC/MS/MS”)检测。这样的方法耗时且昂贵。Zimmer等人(J.Analytical Toxicology,26:11-16,2002；整体结合在本文中)描述了使用通过用经由在EtG的5位置的羧基直接连接至过氧化物酶的EtG免疫诱导的多克隆抗血清检测EtG的酶联免疫测定(“ELISA”)或酶免疫测定(EIA)试验。多克隆抗体的使用可能会增加的假阳性(23.2％)和假阴性(24.3％)数量，这表明该测定的差的特异性和灵敏度。在2001年，Mediagnost Company Ltd.(Reutlingen,Germany)开始开发了使用通过用EtG的脂肽缀合物免疫制备的单克隆抗体的ELISA试验(Wurst等人，Addiction 98(Suppl.2),51-61页,2003)。然而，至今，没有制造可用的产品。
通常，本发明可以任选包括改进的EtG免疫测定侧向流动测试带以及装置和方法中的一个或多个，其包括提供抗体用作EtG特异性免疫诊断试剂的成分并且用于免疫诊断方案中。因此，本发明可以任选包括改进的基于EtG的免疫原，基于EtG的抗原，由基于EtG的免疫原制备的抗体，以及制造和使用其的方法。更具体地，本发明可以任选包括根据本发明的可以与由基于EtG的免疫原制备的EtG特异性抗体一起使用的改进的免疫测定侧向流动测试带、装置、和技术。
在非限制性的实施方案中，本发明可以任选包括利用基于EtG的免疫原制备的抗体，其中抗体是能够与EtG和EtG类似物相互作用的抗EtG抗体。此外，抗体能够与样品中的浓度小于或等于约0.05mg/dL的EtG相互作用，并且与乙基葡萄糖醛酸苷、劳拉西泮(lorazepam)葡萄糖醛酸苷、奥沙西泮(oxazepam)葡萄糖醛酸苷、替马西泮(temazepam)葡萄糖醛酸苷、D-葡萄糖、1-丁醇、或2-丁醇中的至少一种具有小于约1％的交叉反应性。
在非限制性的实施方案中，本发明可以任选包括用于检测EtG的免疫测定系统，其中所述系统可以具有利用本文所述的基于EtG的免疫原制备的抗EtG抗体。此外，免疫测定系统可以具有基于EtG的免疫测定试剂。
在非限制性的实施方案中，本发明可以任选包括检测样品中EtG的方法。这样的方法可以包括以下：从疑似饮用乙醇的受试者得到样品；将抗EtG抗体和EtG类似物与样品组合以形成第一组合物，所述抗体和类似物在第一组合物内游离，并且所述抗体能够结合EtG和EtG类似物；使得来自样品的任何游离EtG和EtG类似物为与抗体结合而竞争；和检测EtG类似物和抗体之间的结合。通过为游离形式，抗原和抗体能够在溶液内自由移动从而溶解或悬浮，而不是如在ELISA测定中附着至反应容器。可以利用如在本文中所描述的基于EtG的免疫原来制备抗EtG抗体。可以根据本文中描述来制备EtG类似物以包含可检测标记物，如酶(例如，G6PDH)、酶片段或酶供体片段(例如，β-半乳糖苷酶供体片段ED28并且n是约2)。
乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)是通过乙醇与葡萄糖醛酸借助UDP葡萄糖醛酰基转移酶(glucuronosyl transferase)的体内缀合形成的少量的乙醇非氧化性代谢物。ETG是摄入的酒精(乙醇)的代谢过程的产物，其在体内迅速代谢，并且其在血液、毛发和尿液中被排出。通过使用ETG快速测试装置，可以在尿液中检测ETG，确认酒精的饮用。ETG代谢物在体内保持较长并且因此具有8至80小时的更有用的检测窗口。根据本发明的ETG检测是优异的选择，例如，但不限于零容忍酒精饮用或康复程序。
本发明的非限制性的实施方案可以包括EtG侧向流动免疫测定测试条和/或装置，例如设计为通过装置中显色的视觉解读来检测ETG的ETG快速测试装置(尿液)，所述检测通过使用已经为检测而标记的EtG特异性抗体介导。测试条的膜或相似组分可以与ETG缀合物固定在测试区域上，并且缀合物垫可以任选预涂布有着色或标记的抗ETG抗体，例如，但不限于胶体金或胶乳金标记的EtG抗体(例如，单克隆的或多克隆的，或者其EtG结合片段)缀合物。抗体可以任选不设置在缀合物垫上，但是任选可以包括这样的情况：将金直接放置到塑料装置上、干燥、向金加入样本以溶解，并且之后将金和样本混合，然后向上流动至包含底垫/样品垫、膜和芯吸材料/垫的带。在加入样本(例如，尿液、体液或组织和对照，例如阳性和/或阴性对照)之后，金缀合物沿着膜或测试条移动(通过毛细管作用而层析移动)并且抗体迁移至测试区域。如果在尿液中不存在药物分子(即，EtG)，则抗体-金缀合物附着至药物缀合物以在测试区域中形成可见的线，在这种情况下，当尿液、体液或组织对于药物来说是阴性时，在测试区域中发生可见的沉淀物的形成。如果在尿液中存在ETG，则药物抗原与在测试区域上固定的药物缀合物竞争有限的抗体位点。任选地，如在本领域中已知的，可以利用使用第二标记抗体检测第一抗体的夹心测定来检测EtG。在足够浓度的药物代谢物EtG的情况下，其填充有限的抗体结合位点。这将会阻止着色的抗体-胶体金或胶乳金缀合物附着至测试区域上的药物缀合物区域。因此，在测试区域上不存在着色带显示出阳性结果。在对照区域的着色带的外观充当程序性对照。这表明已经加入了适当体积的样本并且已经发生了膜芯吸。
在检测期间，一部分尿液、体液或组织样本通过毛细管作用向上迁移。如果以低于其截留浓度存在于尿液、体液或组织中，EtG将不会使其特异性抗体的结合位点饱和。抗体之后将会与药物-蛋白质缀合物反应并且将会在特异性药物带的测试线区域中出现可见的着色线。在尿液、体液或组织或口腔液样本中高于截留浓度的药物的存在将会使抗体的全部结合位点饱和。因此，将不会在测试线区域中形成着色线。药物阳性的尿液、体液或组织样本由于药物竞争将不会在带的特异性测试线区域中产生着色线，而药物阴性的尿液、体液或组织或口腔液样本由于不存在药物竞争将会在测试线区域中产生线。
为了充当程序性对照，着色线将总会在对照线区域出现，表明已经加入了适当体积的样本并且已经发生了膜芯吸。
如在图1中所示，样本在样品施加区域例如(A)加入，并且之后经由毛细管作用沿着膜或测试条迁移以与可以以备选标记形式提供的标记的缀合物(B)相互作用。在样本(例如，尿液或其他体液或组织)中存在的低于截留或阈值量(例如，小于100、200、250、300、350、400、450、或500、600、700、750、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1700、1750、1800、1900、或2000ng/mL)的EtG将不会使金缀合的抗EtG抗体的全部结合位点饱和并且将不会形成着色的抗体-抗原复合物(C)。金缀合的抗体之后将会被固定的缀合物捕获并且将会在位置(D)(对应于以下图2中的(T))形成代表阴性结果的可见的(例如，红色)带，在这种情况下，金-EtG抗体复合物将会在(D)结合，因为在EtG抗体上的EtG结合位点不饱和并且将会结合固定在(D)的EtG或表位或其模拟物以在(D)(对应于图2中的带(T))处提供标记的阴性结果和带。在测试线区域中不存在线形成代表阳性读数并且测试样本的(A)水平高于测试的检测灵敏度(例如，100、200、250、400、或500、600、700、750、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1700、1750、1800、1900、或2000ng/mL的检测灵敏度，其中500、750、或1000ng/mL是优选的)。
在膜的对照线区域中，无论是否存在测试样本组合物，固定的试剂都捕获着色的缀合物。所得的可见的红色带(E)确认了测定正确地发挥功能。图2示出了在非限制性实例中的一组可能的测试结果。
测试条、装置、或系统可以任选包括用于检测尿液中乙基葡萄糖醛酸苷的乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)侧向流动测试条免疫测定系统、装置或方法，其包括下列各项中的至少一个或多个：
(a)如图1和2中示意性地示出的侧向流动测试条，所述测试条包括；
(i)至少一种类型的毛细管流动材料，其能够可重复地提供尿液、体液或组织样品经由测试条的侧向流动，以可重复地相互作用并且使用在测试条中包含的可检测标记的EtG特异性抗体以及第一和第二可检测标记物检测EtG，所述系统提供(1)阳性结果，如在图2中所示的仅(C)着色带显色；(2)阴性结果，如在图2中所示的(T)着色带和(C)着色带二者均显色；或无效结果，如在图2中所示的仅(T)着色带显色，或没有带；
(ii)如在图1中所示的尿液、体液或组织或对照样品施加区域(A)，其包含样品施加组分；
(iii)如在图1中所示的标记的EtG标记的抗体区域(B)，其包含设置在测试条材料上或设置到测试条材料的可检测标记的EtG特异性抗体，所述可检测标记的EtG特异性抗体包含在施加至测试条之后与可检测标记物组分缀合并且由于尿液、体液或组织或对照样品的毛细管作用而可溶于测试条或沿着测试条传导的EtG特异性抗体；
(iv)第一检测区域(D)，其包含所述第一可检测标记物作为当尿液或对照样品中的EtG的浓度低于在100至2000ng/mL之间的预选择的阈值时结合可检测标记的EtG特异性抗体的第一标记部分；其中低于预选择的阈值的可检测标记的EtG特异性抗体的结合得到如在图2A中所示的具有(T)和(C)着色带二者的阴性结果；并且其中当尿液、体液或组织或对照样品中的EtG高于预选择的阈值时，所述可检测标记的EtG特异性抗体未可检测地或明显地结合第一可检测标记物并且也未提供阴性结果；
(v)第二检测区域(E)，其包含第二可检测标记物作为当尿液、体液或组织或对照样品中的EtG的浓度高于在100至2000ng/mL之间的预选择的阈值时结合可检测标记的EtG特异性抗体的第二标记部分；并且其中高于预选择的阈值的可检测标记的EtG特异性抗体的结合得到如在图2B中所示的仅具有(C)着色带的阳性结果；并且其中当尿液、体液或组织或对照样品中的EtG高于预选择的阈值时，可检测标记的EtG特异性抗体未可检测地或明显地结合第一可检测标记物；并且
其中当测定无效时，可检测标记的EtG特异性抗体的结合得到如在图2C中所示的仅具有(T)着色带或没有带的无效结果；并且其中可检测标记的EtG特异性抗体未可检测地或明显地结合第二可检测标记物。
任选地，可以包括以下各项中的一个或多个：其中：阈值是500、750、或1000ng/mL；可检测标记物是胶体金或胶乳金或ELISA或EIA标记物；EtG特异性抗体是单克隆的或多克隆的；EtG特异性抗体对EtG的亲和力是至少1、2、3、4、5、6、7、8、或9乘以10-5KD、10-6KD、10- 7KD、10-8KD、或10-9KD中的一个或多个；所述可检测标记物包含酶、酶片段或酶供体片段、和/或可检测标记物。如在本领域内公知的，在ELISA或EIA中使用的酶的非限制性的实例包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)或葡萄糖氧化酶、或链霉亲和素/生物素。这些酶允许用于检测，通常因为它们在特定试剂存在下产生可观察的颜色变化。参见，例如，“免疫测定手册(The Immunoassay Handbook)”，第3版，David Wild编,Elsevier,2008，其通过引用整体结合在本文中。
所述方法可以任选包括下列步骤中的一个或多个：提供如图1和2中示意性地示出的侧向流动测试条；将尿液、体液或组织或对照样品施加至测试条；和确定尿液、体液或组织或对照样品是否包含高于或低于阈值的EtG。
在非限制性的实施方案中，本发明可以任选包括用于以适合的特异性和灵敏度(例如，亲和力、结合速率(on-rate)、解离速率(off-rate)、亲合力(avidity)、KD等)确定样品中EtG的存在和/或量(例如，尿液中，例如至少100、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000ng/mL尿液或更多，或在其中的任何范围或值)的免疫测定。
在本发明的非限制性的实施方案中，可以将EtG化学修饰以制备能够在哺乳动物中诱导免疫反应的免疫原，从而制备抗EtG抗体。此外，可以将EtG化学修饰以制备能够与抗EtG抗体相互作用的抗原。此外，可以将EtG化学修饰以制备包含与也能够与抗EtG抗体相互作用的标记物结合的EtG的缀合物。
在本发明的另一个实施方案中，可以使用基于EtG的免疫原制备对EtG具有特异性和灵敏度的抗EtG抗体。此外，针对EtG的抗EtG抗体可以与免疫测定结合使用以检测样品如患者样本中EtG的存在和/或确定EtG的浓度。此外，可以在用于检测样品如尿液中的EtG的存在和/或确定EtG的浓度的系统或试剂盒中结合由基于EtG的免疫原制备的抗EtG抗体。
根据本发明的一个实施方案，用于制造由基于EtG的免疫原或EtG的免疫原性衍生物制备的抗EtG抗体(例如，单克隆的和/或多克隆的)的方法是在本领域内公知的和/或如在本文中描述或引用的。
定义：
除非另外说明，以下术语和短语具有以下提供的含义。
如在本文中所使用的，术语“亲和力”意指表位和抗体之间结合强度的量度。因此，单一抗体对于多种表位可以具有不同的亲和力。这可以允许单一抗体与一个表位强烈结合并且与另一个表位较不强烈结合。
如在本文中所使用的，术语“类似物”或“衍生物”意指由母体化合物或分子通过一个或多个化学反应制造的化学化合物或分子。因此，类似物可以是具有与EtG的结构相似的结构或基于EtG骨架但是在某些组分或结构组成方面与其不同的化合物，其在代谢上可以具有相似或相反的作用。根据本发明的EtG的类似物或衍生物可以用于识别类似物和EtG二者的抗体竞争结合。此外，类似物可以包括经由接头基团与EtG偶联的操作部分。
如在本文中所使用的，术语“抗体”意指多克隆和/或单克隆抗体和相关的抗原识别单元，如在本领域中已知的，包括免疫球蛋白分子的片段和衍生物(例如，如在本领域中已知的，可变区、恒定区或连接区，重链和/或轻链，CDR 1、2和/或3等中的一个或多个，以及其融合蛋白，例如，PEG化的、缀合的等)。可以使用任何已知的方法，例如从免疫的动物(例如，小鼠、大鼠等)的B细胞中分离并且克隆，重组方法，例如噬菌体展示、转基因小鼠、嵌合等，其可以任选使用蛋白质A以结合抗体和/或代替在测试条上任选使用的金标记物。使用免疫的动物制备抗体的一种方法是：出于诱导免疫应答的目的以一系列注射向宿主动物施用通常与佐剂如弗氏佐剂(Freund's adjuvant)组合的靶标分析物的免疫原性衍生物，并且之后从动物的脾或血液中分离并且克隆产生抗体的B细胞。这样的方法是本领域技术人员公知的。用于制备单克隆抗体的方法首先由Kohler和Milstein描述(Nature,Vol.256,pp495-497,1975；整体结合在本文中)并且自从该出版物出现已经改进数次。对于杂交瘤技术来说，读者通常参考美国专利号4,491,632；4,472,500；和4,444,887；和酶学中的方法(Methods in Enzymology),73B:3(1981)；其各自整体结合在本文中。因为具体方法不是至关重要的，任何证实的方法均可以用于使用如在本文中所描述的免疫原制备抗体，其针对所需性能进行选择，所述性能例如特异性、亲和力、结合速率、解离速率、KD等。如在本文中所使用的，术语“抗体”意指响应体内的外源分子的存在而产生的蛋白质。它们特征可以在于它们结合抗原和结合免疫系统的专门细胞或蛋白质二者的能力。例如，抗体分为五类，IgG、IgM、IgA、IgE、和IgD，并且是由浆细胞产生的免疫球蛋白。
如在本文中所使用的，术语“载体”、“免疫原性部分”、或“免疫原性载体”意指免疫原性物质，通常为可以与半抗原偶联的蛋白质。与半抗原偶联的免疫原性部分可以诱导免疫应答并且诱发可以与半抗原特异性结合的抗体的产生。免疫原性部分是包括被识别为外来物质并且诱发来自宿主的免疫应答的蛋白质、多肽、糖蛋白、复杂多糖、粒子、核酸、多核苷酸等的操作部分。多糖的实例是淀粉、糖原、纤维素、糖胶如阿拉伯胶、琼脂等。多糖还可以含有聚(氨基酸)残基和/或脂质残基。目前使用的最常用的载体蛋白质中的一些是钥孔虫戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，“KLH”，MW 450,000至13,000,000)、卵清蛋白、牛γ-球蛋白(“BGG”)、和牛血清白蛋白(“BSA”，MW 67,000)。
如在本文中所使用的，术语“表位”意在限定抗原与抗体相互作用的区域。因此，作为抗原的分子或其他物质可以包括至少一个具有抗体活性的表位。这可以使得抗原具有被相同或不同抗体识别的多个表位。此外，表位不是任何具体结构的固有性质，而是可以被定义为与抗体相互作用的结合位点。
如在本文中所使用的，术语“半抗原”意指部分或不完全抗原。它们是不含蛋白质的物质，大多数是低分子量物质，其不能刺激抗体形成，但是与抗体反应，所述抗体通过将半抗原与高分子量载体偶联并且之后将偶联产物(即免疫原)注入至人或其他动物受试者中而形成。
如在本文中所使用的，术语“免疫测定”或“免疫诊断”意指利用抗原和抗体之间的结合从而确定和/或量化生物样品中的特异性抗原或特异性抗体中的至少一种的技术。免疫测定的实例可以包括以下：(1)抗体捕获测定；(2)抗原捕获测定；(3)双抗体夹心测定；和(4)可检测的抗原-抗体相互作用。此外，考虑了将会开发新型免疫测定并且其将能够采用本发明的类似物和抗体。
如在本文中所使用的，术语“标记物”、“检测分子”、或“示踪物”意指产生或可以被诱导而产生可检测信号的任何分子。标记物可以与分析物、免疫原、抗体或者与另一个分子如受体或与受体结合的分子如配体直接或者经由接头缀合。标记物、检测分子、或示踪物的非限制性实例包括放射性同位素、酶、酶片段、酶底物、酶抑制剂、辅酶、催化剂、荧光团、染料、化学发光剂(chemiluminescer)、发光剂(luminescer)、敏化剂、非磁性或磁性粒子、固体支持物、脂质体、配体、受体、半抗原放射性同位素等。如在本文中所描述的，还可以通过在本领域内公知的方法将类似物与各种标记物偶联以提供可以以各种免疫测定形式使用的各种试剂。为了检测免疫测定的结果，可以将检测分子如荧光团，例如荧光素、放射性标记物、或化学发光基团与类似物偶联以产生示踪物。
如在本文中所使用的术语“操作部分”意指经由接头基团与EtG偶联的分子或大分子。此外，操作部分为EtG提供操作功能以用于准备或进行免疫诊断测定。操作基团可以包括免疫原性部分、抗原部分、示踪物部分等。通常，操作基团在以下提供的化学式中被表示为“Z”。
如在本文中所使用的，术语“样品”或“生物样品”意指来自包括人在内的生物的任何量的物质。这样的物质包括，但不限于血液、血清、尿液、眼泪、细胞、器官、组织、和毛发。
此外，在本文中用于描述本发明的术语可以解释为使用前述定义和/或在本领域内公知的定义。因此，前述术语意在描述本发明并且并非意在限制。
如在本文中进一步描述的，和/或如在本领域中已知的，本公开通常涉及制备、提供和/或使用便携式侧向流动测试条系统、装置、或方法的方法，唾液或体液侧向流动测试条系统、装置或方法，任选的检测盒、系统、装置、和/或系统任选使用一个或多个压制(press)制造方法。
如在本文中所描述的，任选利用在本领域中已知的，已经意外地发现，设计、含量、组分、方向、压缩、粘合剂、塑料、辊系统和方法、接触、液体接触、形状、尺寸、规格、孔、切割、狭缝、覆盖物、通风、时机、对照中的一个或多个方面，和/或材料、组分、制造方法和结构的其他方面为测试带提供了意外的、协同的、反向教导的(taught away from)、有利的、更低成本的、更准确的、更加可重复的、更一致的结果，提供了精确的体积控制和/或准确性，以更低的成本和/或更快的制造提供了更加可重复且准确的结果。
本发明的非限制性的任选的实施方案基于如在本文中所描述的和在本领域中已知的改进的测试带和制造方法的发现和改造。已经意外地发现或者反向教导了(包括但不限于)以下中的一个或多个作为非限制性实例：
毛细管力驱动的-已经发现毛细管力驱动的迁移受打开或关闭可以使用如在本文中所描述的新型方法结合在本领域中已知的那些制造和控制的外部通风口中的一个或多个控制。因为随着液体流入因此置换密封腔中的空气，关闭的通风口将会引起空气压力在装置中积累，打开外部通风口释放了这种压力，使得流动能够继续进行，同时可以通过在根据需要停止样品液体流动的位置和校准的位置通风口实现自动关闭，以提供准确性、一致性、预校准、更快的制造、或更廉价的制造中的一个或多个；可以采用可溶解的膜以使流动停止，直到膜溶解，以提供准确性、一致性、预校准、更快的制造、或更廉价的制造中的一个或多个。作为非限制性实例，可以设计和/或制造这样的通风口以在润湿时关闭空气通道，因为在区室内由毛细管力驱动的液体流动生成的空气压力足够低从而不足以迫使空气通过润湿的材料，其中这可以用于在仅由液体向阀移动的流量和流入距离确定的时间时被动且自动地使流动停止。可以任选使用这样的特征作为液体控制的停止或开始开关。
被动体积控制：毛细管驱动的填充可以由针对水性材料展现出毛细管力的材料的尺寸控制；可以通过材料所在的区室的高度非常严格地控制材料的体积，因为这种层压组合件具有非常精确的垂直维数(dimensionality)，例如在0.1-5％变化中的至少一个内；当材料充满液体时流动停止；材料被疏水性材料包围以确保在支持毛细管力驱动的流动的材料外部存在流动。
材料之间的液体接触可以通过在不透液体(liquid tight)的层压层放置孔而不是用于侧向流动快速测试带的典型重叠途径实现，以得到更精确的液体转移体积。当引导流动以从位于第二输送材料下方的输送材料移动并且通过层压层中的一个的孔将这两种材料连接时，这确保了所有流动由毛细管力而不是由液体头部压力驱动。与将测试条浸渍在液体中相反，可以使液体在非常精确的位置进入输送材料。
标记可以针对组合装置内的重要组件对准。这明显地使对准误差(registrationerror)最小化。
可以将具有亲水性表面的开放空间区室设计到装置中。这些基本上是毛细管。这些空间从样品施加点填充至最远端部。当测试条或其他液体组分位于该通道的远端时，该通道充当液体计量装置，因此确保检测过程直到通道充满并且具有足够样品体积以完成检测过程才开始。
液体收集和/或检测装置的任选的实施方案可以任选通过由对于规定吸收材料来说天然的毛细管力驱动的吸收来从被测试的人员收集液体，其中当装置充满或具有足够液体以进行所选择的测试时，所述装置可以任选具有改变颜色的指示物或者提供视觉、机械、或电指示物。这种指示物还可以充当用于化学调节液体的被动计时器，因为干燥化学品的溶解和/或这些化学品对液体的组分的作用不是瞬间的过程和/或可能会需要一些时间以最佳地调节液体。与监督检测执行或提供该过程的液体调节部分的时机的人员相反，可以任选包括这种功能作为检测装置本身的特征。作为非限制性实例，可以通过改变迁移的距离或支持迁移的材料来改变该时机以到达用于调节的最佳时间。
样品进入控制和准备、流动控制、和通风。如在非限制性的任选的实施方案中提供的，检测装置的特征是，可以任选直到已经经过了足够的温育时间和/或从装置移除标记物或贴纸才将未调节的液体引入至侧向流动测试带。在装置填充或收集液体时，液体可以进入含有调节化学品和/或缓冲液的区域。检测装置可以任选含有一个或多个基于毛细管力的和/或成形的区室，其可以任选为当将液体引入至装置时功能上相对于外部环境不透气的，任选地除非加入、提供、或激活通风口，如将通风孔设置在装置中，其可以任选通过液体移动至装置中的预定位置而关闭。为了液体任选流动至在每个区室中包含的材料中，可以任选存在通向外部的通风口以允许空气被进入的液体置换。如果不存在通风口，液体可以任选不仅通过毛细管力进入区室。通过在一个或多个含有稍后的流动测试带的腔的通风口上放置可移除贴纸，用户可以任选控制液体在什么时候进入该腔。在一个实施方案中，可以任选仅当装置显示已经收集足够液体时和/或由于任选设计到填充指示物中的预设被动时机方面而移除覆盖测试条腔的通风口的检测引发贴纸，此时为了调节液体已经经过了足够的时间，所述液体在填充指示物显示为“完全”之前与调节化学品接触和/或之后将会处于用于侧向流动检测的最佳状态。
非限制性的任选的实施方案的任选的功能可以包括下列各项中的一个或多个：
1.体液的收集和/或确保检测装置的内部区室的填充仅通过由液体与装置内结合的输送材料的相互作用产生的毛细管力进行。没有测试受试者产生真空效应的压力。
2.确保液体对于液体调节化学品花费设定的或最少的时间。
3.填充指示物可以任选用于两种目的。
a.表示已经收集了足够的液体以确保装置具有足够的样品以完成检测。
i.填充所需的时间任选并且不直接与指示物表示充满状态所花费的时间相关。可以人为地延长观察到的填充时间以确保已经将液体与调节化学品温育足够量的时间。这可以任选通过填充指示区域中材料的选择来实现，因为这些可以基于侧向流量选择，因此影响观察到的填充时间。这还可以任选通过仅延长填充指示物区域中液体的迁移距离来实现以改变观察到的填充时间。
4.任选的可移除标记物或结合的通风孔当存在时可以防止液体流动至稍后的流动测试条上和/或当移除打开或关闭时允许液体流动至侧向流动测试带上。
a.控制侧向流动检测装置中的液体流量。层压结构的精确性质可以向试剂测试条或侧向流动测试条的垫施加非常精确的压力，因此将垫稍微压缩但是限制压缩的量和/或延缓和/或到侧向流动测试条中的流量，提供更多的时间和/或指示物反应进行的优化。
b.归因于试剂垫的可变密度，在大量测试带内的流量可以是可变的。任选在带或垫中使用表面活性剂，已经发现利用有限的和/或精确的量的体积压缩将这些垫压缩至相同的高度，以提高了流量一致性。
测试条可以任选分析体液或组织中的其EtG乙醇代谢物的存在或量，以确定所述量是否高于预选择的阈值或浓度，或者定量地或定性地提供结果的读取。
术语“组件”可以指，但不限于指定的选择的区域，如边缘、拐角、侧边等；结构构件，如条、垫、层或面板、材料层等。
在整个说明书中，术语“放置”和表达方式“置于……上”、“放置在……上”、“放置在……中”、“放置在……之间”及其变化形式(例如，在词语“放置”和“上”之间插入被“放置”制品的描述)意在表示一个元件可以与另一个元件构成整体，或者一个元件可以是与另一个元件结合或与另一个元件一起放置或放置在另一个元件附近的单独的结构。因此，可以直接或间接将“放置”在吸收性服装的元件上的组件形成或施加至该元件的表面，在多个层元件的层之间形成或施加，形成或施加至与该元件一起放置或放置在该元件附近的测试条，在元件或另一个测试条的层中形成或施加，或其他变体或它们的组合。
测试条的多种部分可以彼此附着或彼此相连以形成在测试条的使用寿命期间优选维持其形状的结构。如在本文中所使用的，术语“附着”、“连接”、“相连”和相似术语包括其中通过将第一部分直接附加至第二部分、通过将第一部分经由中间构件间接连接至第二部分、和通过借助其他部分之间的捕获部分固定多个部分的相对位置来将第一部分直接连接至第二部分的构造。本领域技术人员将会理解，多个方法或方法的组合可以用于将测试条的相应部分彼此牢固地连接。
乙基葡萄糖醛酸苷免疫原
实施用于检测小分子如EtG的免疫测定可能会是一个挑战。这是因为这样的小分子可能通常缺少抗原性，使其难以产生抗体。对于缺乏免疫原性的EtG来说尤其是有问题的。为了增加免疫原性，可以将较大的抗原化合物(包括但不限于BSA、卵清蛋白、KLH等)与EtG偶联。此外，免疫测定中EtG的检测通常需要使用与抗体、EtG、或EtG类似物缀合的可检测示踪物。
因此，将免疫原性操作部分与EtG偶联可以提供与EtG充分免疫学上相似的EtG免疫原，从而由免疫原诱导的抗体可以与免疫原、EtG、和其他EtG类似物反应。因此，基于EtG的免疫原也被认为是EtG类似物。包括免疫原性载体的根据本发明的EtG类似物可以能够诱导抗EtG抗体如单克隆和多克隆抗体的产生。因此，使用独特EtG免疫原生成的抗体可以与EtG和其他EtG类似物相互作用和/或结合。这些抗体、免疫原、抗原、和类似物可以用于准备和进行用于检测生物样品中EtG的免疫测定。
可以通过将EtG与免疫原或抗原载体蛋白经由在EtG或EtG类似物的糖基(glucyl)环的1-碳或5-碳位置的接头偶联来制造免疫原。此外，已经在一些实例中发现，较长的接头可以增加所产生的抗体的亲和力。部分认为，而不被约束于此，较长的接头可以允许更多的对抗原的可达性(accessibility)。此外，归因于暴露的抗原或表位的增加的表面积，还可以增加亲合力，在本领域中提供了改进。
免疫原部分可以包括多种蛋白质或多肽，其可以起免疫原载体的作用。这些类型的多肽包括白蛋白、血清蛋白、球蛋白、晶状体蛋白、脂蛋白、和其部分。说明性的蛋白质包括BSA、KLH、卵清蛋白、牛γ-球蛋白(“BGG”)等。备选地，可以使用合成多肽。此外，免疫原部分还可以是多糖，其为高分子量聚合物。多糖的实例是淀粉、糖原、纤维素、糖胶如阿拉伯胶、琼脂等。此外，免疫原部分可以是多核苷酸，如DNA或RNA。多核苷酸可以是修饰的或未修饰的，并且包含任何数量的核酸，只要其提供载体和/或免疫原功能即可。多糖还可以含有或连接至多肽残基、多核苷酸残基、和/或脂质残基。此外，免疫原部分可以单独是多核苷酸或与上述多肽或多糖中的一种缀合。
免疫原部分或载体还可以是粒子或微粒。免疫原粒子通常为至少约0.02微米(μm)且不大于约100μm，并且通常直径为约0.05μm至10μm。粒子可以是有机的或无机的，可溶胀的或不可溶胀的，和/或多孔的或无孔的。任选地，免疫原粒子可以具有接近水的密度，通常约0.5至1.5g/mL，并且包含可以为透明、部分透明、或不透明的材料。免疫原粒子可以是生物材料如细胞和微生物，包括非限制性实例如红细胞、白细胞、淋巴细胞、链球菌属(Streptococcus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(E.coli)、和病毒粒子。粒子还可以包含有机和无机聚合物、脂质体、胶乳、磷脂囊泡、脂质体、阳离子脂质体、阴离子脂质体、脂蛋白、脂质聚合物等。
本发明的任选的实施方案可以包括一种或多种用于产生EtG抗体的EtG免疫原，其为在用于准备和/或实施用于检测样品中EtG的免疫测定的过程中使用的EtG类似物。可以根据式(I)制备这样的EtG类似物：–[-EtG-L-X-Y-]n-Z。根据该式，EtG类似物可以表征如下：n可以大于或等于1和/或小于约1000；L可以是基团O、S、CO、COO、SO2、CH2、NH、NH(CH2)2NH、CONH、Ph、NHCH2Ph等中的至少一种；X可以是L和Y之间的键、芳族基、或脂族基中的至少一种；Y可以选自由下列各项组成的组：脂族、醇、胺、酰胺、羧酸、醛、酯、活化酯、脂族酯、亚胺酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酸酐、硫醇、硫代内酯、重氮、马来酰亚胺基、NHS、O--NHS、和与操作部分偶联的源自其的接头；并且Z可以是操作部分。
在非限制性的实施方案中，X可以是L和Y之间的键、具有1至2个环的取代的或未取代的芳族或脂族基、或具有1至20个碳和/或杂链原子的饱和的或不饱和的、取代的或未取代的直链或支链中的至少一种。此外，当使用时，操作部分Z可以选自由下列各项组成的组：蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、多肽、聚(氨基酸)、多糖、核酸、多核苷酸、磷壁酸、可检测标记物、放射性同位素、酶、酶片段、酶供体片段、酶受体片段、酶底物、酶抑制剂、辅酶、荧光部分、磷光部分、反斯托克斯向上调节(anti-stokes up-regulating)部分、化学发光部分、发光部分、染料、敏化剂、粒子、微粒、磁性粒子、固体支持物、脂质体、配体、受体、半抗原放射性同位素、白蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、钥孔虫戚血蓝蛋白、以及它们的组合。在类似物是免疫原的情况下，Z可以是以下中的至少一种：n为约1至约35的人血清白蛋白；n为约1至约35的牛血清白蛋白；或n为约1至约500的钥孔虫戚血蓝蛋白。在类似物是用于检测EtG的免疫测定试剂的情况下，Z可以是可检测标记物。例如，可检测标记物可以是酶(例如，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶“G6PDH”)、酶片段、或酶供体片段(例如，β-半乳糖苷酶供体片段ED28)。
因此、根据本发明制备的免疫原可以用于产生可以具有对EtG以及EtG类似物的亲和力的抗体。
抗EtG抗体
在非限制性的实施方案中，可以在用于制备单克隆和/或多克隆抗体的方法中使用根据本发明的EtG类似物系免疫原。因此，抗体可以由基于EtG的免疫原产生并且与EtG相互作用和/或结合。此外，利用免疫原制备抗体的方法是在本领域内公知的。可以在用于与EtG相互作用和/或结合的单克隆和/或多克隆抗体的筛选中使用免疫原。
例如，以用于得到抗体的公知方法可以与基于EtG的免疫原一起使用从而制备抗EtG抗体。因此，可以得到基于EtG或EtG类似物的免疫原并且将其与免疫原制剂组合。简而言之，将约0.5mL的免疫原组合物与约0.5mL的完全弗氏佐剂混合；然而，可以使用其他量的免疫原和/或佐剂。之后可以将免疫原制剂施用于产生抗体的受试者，其可以是大鼠、小鼠、猪、兔、鸟、绵羊、和/或其他动物，但是优选哺乳动物。施用可以经由尾部静脉注射、皮下注射、静脉内注射、或其他公知的注射位置。随后，可以将免疫原增强剂施用于接受了最初施用的动物，其中增强剂可以包括与最初制剂基本上相同的成分并且可以以预定间隔施用。例如，最初施用之后可以是随后的每周一次或其他较长或较短间隔的增强剂。在至少最初施用之后，以及任选在随后的增强剂之后，可以收集由动物产生的抗EtG抗体。可以通过从之前施用了免疫原的动物中获得血液、血清、血浆、或其他生物样品来收集抗体。任选地，之后可以按照在本领域内公知的来处理含抗体的组合物，其中这样的处理可以包括以适用于进行免疫诊断测定的形式放置抗体的技术。备选地，该处理可以包括利用ELISA通过公知和广泛接受的技术来筛选抗体。此外，可以使用该处理获得如在本领域内公知的多克隆抗体。
测试条特征和组分：根据本发明制造的非限制性的任选的实施方案的侧向流动检测装置可以具有任何形状和规格，如正方形、圆形、椭圆形、多边形、六边形等中的一种或组合，但是优选是矩形测试条。
根据本发明制造的非限制性的任选的实施方案的测试装置的测试条可以包含为包含基板，其至少部分为任何吸水或非吸水材料等，如硝酸纤维素、尼龙、纸、玻璃纤维、涤纶、聚酯、聚乙烯、烯烃或其他铸型或热塑材料，如聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙酸乙烯酯和氯乙烯的共聚物、聚酰胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯等。在优选的实施方案中，至少一种测试条材料是具有至少约1微米、更优选大于约5微米或约8-12微米的孔径的硝酸纤维素。具有多至大约12微米的标称孔径的适合的硝酸纤维素片材可商购自例如Schleicher和SchuellGmbH。
在上下文中与非限制性的任选的实施方案一起使用的测试条可以任选包括标记，其可以包括用于使用测试条进行的测试的符号。这样的标记可以使用在本领域中已知的方法印刷在测试条材料上。备选地，标记可以是在附着至测试条(如通过粘合剂)的其他薄构件如塑料或纸上。
测试条可以包含一种或多种材料。如果测试条包含多于一种材料，所述一种或多种材料优选是液体连通的。测试条的一种材料可以覆盖在测试条的另一种材料上，例如覆盖在硝酸纤维素上的滤纸。备选地或此外，测试条可以包括包含一种或多种材料的区域和随后的包含一种或多种不同材料的区域。在这种情况下，区域是液体连通的并且彼此可以或可以不部分重叠。
测试条的一种或多种材料可以与例如在薄层层析中发现的支持物或固体表面结合，并且可以具有作为整体部分或液体接触的吸收垫。例如，测试条可以包含例如利用支持片材如塑料片材“支撑”的硝酸纤维素片材以增加其操作强度。这可以通过在支撑材料的片材上形成硝酸纤维素的薄层来制造。当以这种方式支撑时，硝酸纤维素的实际孔径将会倾向于低于相应的未被支撑的材料的孔径。备选地，硝酸纤维素的预制片材和/或一种或多种其他吸水或非吸水材料可以附着至至少一种支持片材，如由聚合物制成的片材(参见，例如，US 5,656,503，通过引用整体结合)。支持片材可以是透明的、半透明的或不透明的。在其中支持物片材为透明的非限制性的任选的实施方案的方面中，支持片材优选为不透水的，但是可以是耐水的或可透水的。在非限制性的任选的实施方案中，可以通过包含透明材料如玻璃、塑料、或mylar(但是优选是耐断裂的)的窗口观察测试条。
在以下讨论中，将通过说明而不是限制的方式描述测试条材料的条。
通常，非限制性的任选的实施方案的测试条包括样品施加区域和测试结果确定区域。测试结果确定区域可以包括一个或多个EtG乙醇代谢物检测区域和一个或多个对照区域中的一个或二者。任选地，测试条可以包括试剂区域。
可以将在测试条的测试结果确定区域中的一个或多个特异性结合成分浸渍在作为测试结果确定区域中的吸水或非吸水材料的基板的整个厚度中(例如，可以将针对一种或多种药物、化合物、或代谢物的特异性结合成分浸渍在一个或多个EtG乙醇代谢物检测区域中的测试条材料的整个厚度中，并且可以将针对一种或多种EtG乙醇代谢物的特异性结合成分浸渍在一个或多个对照区域中的测试条材料的整个厚度中，但是并非必须是这样的情况)。这样的浸渍可以提高固定的试剂可以捕获迁移样品中存在的EtG乙醇代谢物的程度。备选地，可以将包括信号产生系统的特异性结合成分和组分的试剂涂覆至吸水或非吸水材料的表面。可以手动或通过机器完成将特异性结合成分浸渍至测试条材料中或将特异性结合成分涂覆至测试条材料上。
硝酸纤维素具有在测试结果确定区域中的特异性结合成分可以在没有前化学处理的情况下固定的优点。如果多孔固相材料包含纸，例如，可以通过使用例如CNBr、羰基二咪唑、或三氟乙烷磺酰氯(tresyl chloride)的化学偶联来进行在测试结果确定区域中的抗体的固定。
在将特异性结合成分施加至测试结果确定区域之后，应当处理多孔固相材料的其余部分以阻断其他地方的任何剩余结合位点。可以通过用蛋白质(例如牛血清白蛋白或乳汁蛋白)或用聚乙烯醇或乙醇胺或这些试剂的任何组合处理来实现阻断。用于试剂区域的标记的试剂之后可以被分配至干燥载体上并且当处于润湿状态时将会变得在载体中可移动。在这些多个工艺步骤(敏化、未标记的试剂的施加、标记的试剂的阻断和施加)中的每一个之间，应当将多孔固相材料干燥。
为了当用样品将测试条润湿时有助于标记的试剂的自由迁移率，可以将标记的试剂涂覆至吸水或非吸水材料作为表面层，而不是浸渍在吸水材料的厚度中。这可以使吸水或非吸水材料和标记的试剂之间的相互作用最小化。例如，可以在要施加标记的试剂的区域中用上釉材料将吸水或非吸水材料预处理。例如，可以通过将例如蔗糖或乳糖的糖或纤维素水溶液沉积在相关部分的载体上并且干燥来实现上釉(U.S.5,656,503)。之后可以将标记的试剂涂覆至上釉部分。载体材料的其余部分不应上釉。
可以以各种方式将试剂涂覆至载体材料。对于将液体试剂施加至载体来说，之前已经使用或知晓了多种“打印”技术，例如微注射器、使用计量泵的笔、直接打印和喷墨打印，并且在本发明的上下文中可以使用这些技术中的任何一种。为了有助于制造，可以用试剂处理载体(例如片材)并且之后细分为一个或多个更小的部分、层、组分、层压体、或其他结构(例如各自包含所需含试剂区域的小窄条)以提供多个相同的载体单元。
在通过信号产生系统，如通过一种或多种与分析物特异性反应的酶检测EtG的实施方案中，信号产生系统的一种或多种组分可以以与如上所述的特异性结合成分结合测试条材料相同的方式与测试条材料的EtG检测区域结合。备选地或此外，可以将在测试条的样品施加区域、试剂区域、或EtG检测区域中包含或者在整个测试条中包含的信号产生系统的组分浸渍至测试条的一种或多种材料中。这可以通过表面施加这样的组分的溶液或者通过将一种或多种测试条材料浸渍至这样的组分的溶液中来实现。在一次或多次施用或一次或多次浸渍之后，将测试条材料干燥。备选地或此外，如对于标记的试剂所描述的，可以将在测试条的样品施加区域、试剂区域、或EtG检测区域中包含或者在整个测试条中包含的信号产生系统的组分涂覆至测试条的一种或多种测试条材料的表面。
样品施加区域
样品施加区域是测试条施加样品，如液体样品，如生物液体样品如血液、血清、唾液、或尿液、或来源于生物样品的液体，如喉咙或生殖道拭子(swab)的区域。样品施加区域可以包括吸水或非吸水材料，如滤纸、硝酸纤维素、玻璃纤维、聚酯或其他适当材料。样品施加区域的一种或多种材料可以发挥过滤功能，从而防止大粒子或细胞通过测试条移动。样品施加区域可以与测试条的包括测试结果确定区域在内的其余部分直接或间接液体连通。直接或间接液体连通可以是，例如末端与末端连通、重叠连通、或涉及另一个元件如液体连通结构如滤纸的重叠或末端与末端连通。
样品施加区域或基板的其他部分还可以任选包括对于检测和/或测试的最佳性能来说可能是必需或理想的化合物或分子。样品施加区域或基板可以任选包括，例如，但不限于下列各项中的一种或多种：加入、预加入或后加入的缓冲液、稳定剂、表面活性剂、盐、还原剂、亲和剂、标记物、酶、指示物、粘结剂、标记的试剂或特异性结合成分如与标记物相连或连接的抗体或其活性片段等，其可以使用本领域中已知的方法制造。特异性结合成分可以结合药物、化合物、组织、生物成分、或代谢物和/或可以结合任选的化合物等。
试剂区域
测试条还可以包括其中尤其是当处于液体状态时可以提供固定的(共价或非共价固定)或非固定的可用于检测EtG乙醇代谢物的试剂的试剂区域。试剂区域可以在试剂垫上，例如包含在测试条上包括的吸水或非吸水材料的单独的基板区段，或者其可以是还包括其他区域(如EtG乙醇代谢物检测区域)的测试条的吸水或非吸水材料的区域。在非限制性的任选的实施方案的一个方面中，试剂区域或基板可以任选包括，例如，但不限于下列各项中的一种或多种：加入、预加入或后加入的缓冲液、稳定剂、表面活性剂、盐、还原剂、亲和剂、标记物、酶、指示物、粘结剂、标记的试剂或特异性结合成分如与标记物相连或连接的抗体或其活性片段等，其可以使用本领域中已知的方法制造。特异性结合成分可以结合药物、化合物、组织、生物成分、或代谢物和/或可以结合任选的化合物等。
在一个实例中，试剂区域可以包括两群以上的着色珠。一群着色珠附着至抗兔IgG抗体或其活性片段并且另一群着色珠附着至抗EtG乙醇代谢物抗体或其活性片段。标记的抗兔IgG抗体或抗体片段用于视觉检测测试条的对照区域中的信号。在对照区域中的颜色信号表明样品已经经过检测区域。标记的抗EtG乙醇代谢物抗体或其片段在检测区域中提供指示样品中EtG乙醇代谢物的存在的视觉信号。
其他优选实施方案是使抗(滥用药物)抗体或其活性片段与着色珠群体结合。可以与在前述实例中一样使用多于一群珠以在检测区域中提供视觉信号和在对照区域中提供第二视觉信号。多群珠可以是相同或是不同的颜色或者可以作为颜色的混合物提供。备选地或此外，与不同抗体或抗体片段结合的不同群的珠可以用于通过在一个或多个检测区域中产生一个或多个视觉信号来指示样品中多于一种EtG乙醇代谢物的存在。检测区域或基板可以任选包括，例如，但不限于下列各项中的一种或多种：加入、预加入或后加入的缓冲液、稳定剂、表面活性剂、盐、还原剂、亲和剂、标记物、酶、指示物、粘结剂、标记的试剂或特异性结合成分如与标记物相连或连接的抗体或其活性片段等，其可以使用本领域中已知的方法制造。特异性结合成分可以结合药物、化合物、组织、生物成分、或代谢物和/或可以结合任选的化合物等。
优选标记物是珠如金属粒子，如胶体金或胶乳金、或聚合物珠，如着色珠、或炭黑粒子。其他标记物包括，例如酶、发色团或荧光团，如它们是在本领域中、尤其是免疫测定中已知的，或以后开发的。珠群体以粉末状形式设置在可以包括吸水材料如滤纸、玻璃纤维、尼龙、或硝酸纤维素的试剂区域上。这些试剂与试剂区域可逆地结合，因为当与液体如沿着测试条经过的液体样品接触放置时它们可以移动。
在非限制性的任选的实施方案的另一个实施方案中，试剂区域可以包括信号产生系统的组分，例如，催化剂，如酶、辅因子、电子供体或受体、和/或指示物化合物。
试剂区域还可以包括对于测试的最佳性能来说可能会是必需或理想的化合物或分子，例如缓冲液(优选干燥缓冲液或调节剂)、稳定剂、表面活性剂、盐、还原剂、或酶。
测试结果确定区域
测试结果确定区域包括固定的或非固定的试剂，其可以检测被测试的EtG和抗体的存在。这样的试剂优选处于干燥状态并且可以在液体状态下共价固定、非共价固定、或不固定。测试结果确定区域可以包括一个或多个EtG乙醇代谢物检测区域和一个或多个对照区域中的一个或二者。
根据具体形式和测试的EtG乙醇代谢物，可以在测试结果确定区域提供多种试剂。例如，测试结果确定区域可以包括特异性结合成分如抗体、酶、酶底物、辅酶、增强剂、第二酶、活化剂、辅因子、抑制剂、清除剂、金属离子等。在测试结果确定区域设置的一种或多种试剂可以与测试条材料结合。包括这样的试剂的测试带是在本领域中已知的并且可以适用于本发明的测试装置。
在本发明的优选方面中，测试结果确定区域的一个或多个医学、EtG乙醇代谢物检测区域包括一个或多个固定的(共价或非共价固定的)与EtG结合的特异性结合成分，其与设置在试剂区域中的与标记物结合的特异性结合成分一样结合。因此，在其中试剂区域含有一种或多种针对分析物的特异性结合成分的实施方案中，试剂区域和EtG乙醇代谢物检测区域的特异性结合成分应当与被测试的EtG乙醇代谢物上的不同表位结合。例如，当试剂区域中的标记的特异性结合成分与EtG结合时，则EtG检测区域中的固定的特异性结合成分应当与EtG乙醇代谢物的另一个区域结合。因此，当在样品中存在EtG时，EtG将会结合标记的抗EtG乙醇抗体，其被输送至在与固定的抗EtG结合的EtG检测区域的测试结果确定区域以提供视觉读数。
EtG检测区域可以包括当EtG乙醇代谢物存在时光学性质(如颜色、化学发光或荧光)变化的底物。这样的底物是在本领域中已知的，如，但不限于，用于过氧化物酶的1,2-苯二胺、5-氨基水杨酸、3,3',5,5'四甲基联苯胺、或联甲苯胺；用于碱性磷酸酶的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四唑和用于β半乳糖苷酶的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷、萘酚-AS-BI-β-D-吡喃半乳糖苷、和4-甲基-伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷。
在其中通过信号产生系统检测EtG的实施方案中，信号产生系统的一种或多种组分，如酶、底物、和/或指示物可以设置在EtG检测区域中。备选地，信号产生系统的组分可以设置在测试条中的其他地方并且可以迁移至EtG检测区域中。
任选地，测试结果确定区域可以包括任选的对照区域。对照区域可以在测试结果确定区域的EtG检测区域的上游、下游、或与EtG检测区域构成整体。在后一种情况中，当EtG乙醇代谢物和对照提供阳性反应时，对照区域和/或EtG乙醇代谢物检测区域可以基于测定的具体形式形成标记，如针对阳性反应的着色条、记号、指示物、或“+”符号和针对阴性反应的着色条、记号、指示物、“-”符号，并且对于在一个或多个测试带上进行的一个或多个测定来说，测定测试条或外罩或外壳还可以任选包括指示测定中的一个或多个无效的指示或指示区域作为测试或对照，任选作为阴性或阳性对照。
对照区域提供指示在测试条上的测试已经正确进行的结果。在本发明的一个优选方面中，试剂区域包括与被测试的EtG不同的已知EtG乙醇代谢物结合的特异性结合成分。例如，可以在试剂区域中提供兔IgG。对照区域可以包括固定(共价或非共价)抗兔IgG抗体。在操作中，当将试剂区域中的标记的兔IgG输送至其中的测试结果确定区域和对照区域时，标记的兔IgG将会与固定的抗兔IgG结合并且形成可检测信号。
对照区域可以包括当任选的物质存在时光学性质(如颜色、化学发光或荧光)变化的底物。
在本发明的一个优选方面中，测试条可以包括结果确定区域(其包括任选的EtG乙醇代谢物检测区域)和样品掺杂对照区域。在本发明的另一个方面中，测试条可以包括结果确定区域(其任选地包括任选物)和任选的掺杂对照区域。第二测试条可以包括掺杂对照区域和任选的任选物。优选地，这种第二测试条包括掺杂对照区域和任选物二者，但是并非必须是这样的情况。在其中可以使用一个或多个第一测试条检测除掺杂EtG乙醇代谢物外的EtG乙醇代谢物并且可以使用一个或多个第二测试条检测掺杂分析物的情况中，测试条可以作为检测多种药物、化合物或代谢物的多个测试条或测试条提供。
区域的方向
测试条的多个区域，包括样品施加区域、一个或多个试剂区域、和一个或多个测试结果确定区域(其包括一个或多个EtG乙醇代谢物检测区域并且任选包括一个或多个对照和一个或多个掺杂区域)，可以在单一的材料带，如滤纸或硝酸纤维素上，或者可以设置在材料的单独的部件和/或层上。不同的区域可以由相同或不同的材料或材料的组合制成，但是优选选自吸水材料，如滤纸、玻璃纤维目和硝酸纤维素。样品施加区域优选包括玻璃纤维、聚酯或滤纸，一个或多个试剂区域优选包括玻璃纤维、聚酯或滤纸，并且测试结果确定区域(其包括一个或多个EtG乙醇代谢物检测区域并且任选包括一个或多个对照)优选包括硝酸纤维素。
任选地，包括液体吸收区域。液体吸收区域优选包括吸收性纸并且用于吸收样品中的液体以将液体从样品施加区域经由试剂区域和检测区域驱动，其还可以任选包括干燥缓冲液或调节组合物。
优选地，将区域如下排列：样品施加区域、一个或多个试剂区域、一个或多个测试结果确定区域、一个或多个对照、一个或多个掺杂区域、和液体吸收区域。如果测试结果确定区域包括任选物，优选其在测试结果确定区域的EtG检测区域之后。所有这些区域或它们的组合可以设置在单一材料的单一带中。备选地，区域由不同材料制成并且以液体连通方式连接在一起。例如，不同区域可以直接或间接液体连通。在这种情况下，不同区域可以末端与末端连接以液体连通，重叠以液体连通，或者通过另一个构件连通，这样的相邻材料优选为吸水的如滤纸、玻璃纤维或硝酸纤维素。在使用连接材料中，连接材料可以从末端与末端连接的区域或包括这样的区域的材料、不液体连通的末端与末端连接的区域或包括这样的区域的材料、或重叠(如，但不限于从上到下)但是不液体连通的连接区域或包括这样的区域的材料连通液体。
当并且如果测试条包括掺杂对照区域时，掺杂对照区域可以放置在结果确定区域之前或之后。当在这样的测试条上的结果确定区域中存在任选的掺杂对照区域时，则掺杂对照区域优选在对照区域之前，但是并非必须是这样的情况。在其中测试条是用于确定掺杂EtG乙醇代谢物和/或任选物的任选的测试条的非限制性的任选的实施方案中，则掺杂对照区域可以放置在对照区域之前或之后，但是优选在对照区域之前。
检测样品中EtG乙醇代谢物的方法
非限制性的任选的实施方案的装置可以用于收集样品、将样品转移至接收测试条样品的区域并且任选将样品与一种或多种试剂如干燥缓冲液或调节剂混合。之后可以在测试条内将样品或样品和一种或多种试剂引导至测试元件以检测样品中的一种或多种药物、化合物、或代谢物，优选测试条的样品施加区域。样品可以是液体或胶体。可以施加至测试条的液体或流体样品的实例可以包括血液、血清、唾液、或尿液。
为了收集样品，可以经由多种技术施加液体或胶体样品，例如使用移液管、倾倒或使用滴管。备选地，可以使用样品收集装置收集样品并且将样品转移至测试条上。样品收集装置可以具有不同结构但是优选为拭子。可以通过不同实施方案例如浸渍、刷抹或拭抹使用拭子将样品收集至拭子头部上。可以将具有样品的拭子施加至可以任选含有一种或多种试剂的测试条，或者将干燥缓冲液加入至样品中。
非限制性的任选的实施方案任选提供用于使用干燥缓冲液或唾液或体液测试样品的预调节预校准/定量的侧向流动药物测试条的数字图像捕获和分析的便携式药物检测平台。平台可以任选包括具有记录包括针对一种或多种药物、化合物、或代谢物的活性化学性质和特异性的预校准/定量的测试条的数字组件的数码相机硬件；用于制备测试样品的干燥缓冲液或调节介质；用于与用户连接的软件，以及与数码相机连接的图像处理和计算装置。
在具体的实施方案中，系统接受大范围的侧向流动检测装置。测试样品(例如，唾液或体液)从被测试的人员取得并且加入至设置有干燥缓冲液或调节剂的一个或多个测试盒或测试条，以设置样品用于加入至用于检测的测试条。侧向测试条或测试盒在指定区域设置有被调节的测试样品并且样品之后根据时机或指示继续到达指定或适当位置以与测试条的药物分析组分相互作用，从而使样品反应以提供阳性、阴性、和/或由特定测试条测试的EtG的阈值量的指示。测试条或测试条的外壳设置有校准的、足够的测试样品，以及结果指示标识以显示每个测试条和被测试的相应药物、化合物或代谢物的测试结果。
通过选取在具有任选通过测试仪、外罩和/或外壳定位的数码相机的每个测试条上调节并且运行的样品的数字图像，系统之后继续进行药物检测。可以任选通过数码相机或单独的照明源提供照明。测试条结果的数字图像数据、额外的识别信息(包括被测试的人员的识别、关于测试仪的信息、位置、完成的药物检测等中的一种或多种)、以及该图像和其他数据收集并且储存于数码相机、数据存储器、和/或基于云端或单独的数据存储器存储装置中。之后利用与系统的软件组件结合的处理能力使用主机装置(例如专用智能电话、PDA、笔记本电脑、蜂窝电话等)处理数字图像数据。预加载至智能电话或处理器上的软件向预定的校准数据提供处理指令并且比较图像分析数据以，得到定性或定量结果，例如，但不限于阳性、阴性、高于或低于一个或多个阈值浓度或量等。系统可以经由多种不同物理标准与主机装置连接。这些标准包括行业标准如个人计算机存储卡国际联合会(Personal ComputerMemory Card International Association，PCMCIA)，通用串行总线(USB)，串行，安全数字(Secure Digital)，蓝牙TM，光、磁、或固态数据驱动器中的一种或组合，Wi-Fi或其他公司专门标准如Handspring Springboard PlatformTM。
在另一个实施方案中，软件自动用于稍后的针对交叉场检测兼容性的流动测试条数字成像。这种系统可以提供与一系列商业或定制侧向流动条的兼容性。系统将来自测试的结果(如可以任选常规上由人手动读取的测试条)数字化并且客观地量化；将原始和修改的数字图像和数据储存至存储器以用于检查；并且通过执行图像处理算法来提高测试处理。
免疫诊断测定
可以在用于鉴别样品如血液、血浆、血清、组织等中EtG的存在的免疫测定中使用抗EtG抗体，单克隆的或多克隆的。这可以有益于鉴别或确定受试者是否摄入了酒精饮料。因此，可以在免疫诊断测定中使用抗EtG抗体代替其他抗体，从而可以将测定配置为用于鉴别作为酒精饮用的指示的EtG的存在并且任选量化EtG的量。此外，免疫诊断测定可以使用根据本发明的EtG类似物或其他EtG类似物。
本文所述的EtG抗体还适用于许多具有包括但不限于酶或荧光的一系列检测系统的异相免疫测定和/或包括但不限于快速侧向流动测定的均相免疫测定中的任何一种，和抗体阵列，以及尚待开发的形式。
尽管已经在本文中描述了使用EtG类似物、缀合物、抗体、免疫原和/或示踪物的多种免疫诊断测定，如在本领域内公知的，还可以对这样的测定进行修改。因此，可以在本发明的范围内做出用于进行这样的免疫测定的步骤或行为的各种修改。
实施例
提供以下实施例以说明本发明的实施方案并且其并非意在限制。因此，实施例中的一些已经通过实验进行并且一些是基于在本领域内公知的技术、标准、和结果预测的。此外，应当显而易见的是，本发明可以任选包括未通过实施例示出的额外的实施方案。此外，许多实施例已经借助在本领域内公知的实验方案使用根据本发明制备的EtG类似物、抗原、免疫原、和抗EtG抗体进行。
实施例1抗EtG抗体的制备
如以上所讨论的，可以使用任何数量的被接受的过程以使用如上所述的免疫原制备抗体。例如，图2A-C中所示的在弗氏佐剂中的免疫原用于免疫小鼠。在一系列免疫之后，如本领域中常规的，使用本领域中已知的方法，取出脾并且与永生化的非生产性骨髓瘤细胞系融合，制备杂交瘤细胞系。为了本发明的目的，在针对识别EtG的能力初步筛选培养物上清液之后，选择各种杂交瘤细胞系(例如，19D7、14C5、和12E7克隆)用于制备单克隆抗体。尽管多种杂交瘤细胞系当针对EtG筛选时显示出阳性的反应性，由于各种原因而选择杂交瘤细胞系19D7、14C5、和12E7克隆，包括其生长和抗体产生特性。
实施例2：来自尿液的EtG的检测
乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)是通过乙醇与葡萄糖醛酸借助UDP葡萄糖醛酰转移酶(glucuronosyl transferase)的体内缀合形成的乙醇的少量非氧化性代谢物。ETG是摄入的酒精(乙醇)的代谢过程的产物，其在体内迅速代谢，并且其在血液、毛发和尿液中被排出。通过使用ETG快速测试装置，可以在尿液中检测ETG，确认酒精的饮用。ETG代谢物在体内保持较长并且因此具有8至80小时的更有用的检测窗口。根据本发明的ETG检测是优异的选择，例如，但不限于零容忍酒精饮用或康复程序。
本发明的非限制性的实施方案可以包括EtG侧向流动免疫测定测试条和/或装置，例如设计为通过装置中显色的视觉解读来检测ETG的ETG快速测试装置(尿液)，所述检测通过使用已经为检测而标记的EtG特异性抗体介导。测试条的膜或相似组件可以与ETG缀合物固定在测试区域上，并且样品垫预涂布有着色或标记的抗ETG抗体，例如，但不限于胶体金或胶乳金标记的EtG抗体(例如，单克隆的或多克隆的，或者其EtG结合片段)缀合物。在加入样本(例如，尿液和对照，例如阳性和/或阴性对照)之后，金缀合物沿着膜或测试条移动(例如通过毛细管作用而层析移动)并且抗体迁移至测试区域。如果在尿液中不存在药物分子(即，EtG)，则抗体-金缀合物附着至药物缀合物以在测试区域中形成可见的线，在这种情况下，当尿液对于药物来说是阴性时，在测试区域中发生可见的沉淀物的形成。如果在尿液中存在ETG，则药物抗原与在测试区域上固定的药物缀合物竞争有限的抗体位点。在足够浓度的药物代谢物EtG的情况下，其填充有限的抗体结合位点。这将会阻止着色的抗体-胶体金或胶乳金缀合物附着至测试区域上的药物缀合物区域。因此，在测试区域上不存在着色带显示出阳性结果。在对照区域着色带的出现充当程序性对照。这表明已经加入了适当体积的样本并且已经发生了膜芯吸。
在检测期间，一部分尿液样本通过毛细管作用向上(或横向)迁移。如果以低于其截留浓度存在于尿液中，EtG将不会使其特异性抗体的结合位点饱和。抗体之后将会与药物-蛋白质缀合物反应并且将会在特异性药物带的测试线区域中出现可见的着色线。在尿液或口腔液样本中高于截留浓度的药物的存在将会使抗体的全部结合位点饱和。因此，将不会在测试线区域中形成着色线。药物阳性的尿液样本由于药物竞争将不会在带的特异性测试线区域中产生着色线，而药物阴性的尿液或口腔液样本由于不存在药物竞争将会在测试线区域中产生线。
为了充当程序性对照，着色线将会在对照线区域一直出现，表明已经加入了适当体积的样本并且已经发生了膜芯吸。
如在图1中所示，样本在样品施加区域例如(A)加入，并且之后经由毛细管作用沿着膜或测试条迁移以与可以以备选标记形式提供的标记的缀合物(B)相互作用。在样本(例如，尿液或其他体液)中存在的低于截留或阈值量(例如，小于100、200、250、300、350、400、450、或500、600、700、750、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1700、1750、1800、1900、或2000ng/mL)的EtG将不会使金缀合的抗EtG抗体的全部结合位点饱和并且将不会形成着色的抗体-抗原复合物(C)。金缀合的抗体之后将会被固定的缀合物捕获并且将会在位置(D)(对应于以下图2中的(T))形成代表阴性结果的可见的(例如，红色)带，在这种情况下，金-EtG抗体复合物将会在(D)结合，因为在EtG抗体上的EtG结合位点不饱和并且将结合固定在(D)的EtG或其表位或模拟物以在(D)(对应于图2A-C中的带(T))提供标记的阴性结果和带。在测试线区域中不存在线形成代表阳性读数并且测试样本的(A)水平高于测试的检测灵敏度(例如，100、200、250、400、或500、600、700、750、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1700、1750、1800、1900、或2000ng/mL的检测灵敏度，其中500、750、或1000ng/mL是优选的)。
在膜的对照线区域中，无论是否存在测试样本组合物，固定的试剂都捕获着色的缀合物。所得的可见的红色带(E)确认了测定正确地发挥功能。图2A-C示出了在非限制性实例中的一组可能的测试结果。
实施例3：均相竞争性免疫测定
G6PDH-EtG缀合物用于为与抗EtG抗体例如根据本文所述的过程制备的单克隆抗体结合而与尿液、血清、或其他样品中的EtG竞争。在测试的样品中不存在EtG的情况下，抗EtG抗体与G6PDH-EtG缀合物结合，抑制酶活性。当在样品中存在EtG时，其竞争抗EtG抗体上的结合位点，留下至少一些未结合并且能够与底物反应的EtG-G6PDH。因此，随着样品中EtG的浓度增加，酶活性的量成比例地增加。
用于进行这样的测定的示例性试剂包括：抗EtG抗体，其优选为具有专门针对EtG的灵敏度和特异性的单克隆抗体；底物试剂，其包含在pH 5.0的Tris缓冲液中的8.5mM葡萄糖-6-磷酸和5.25mM NAD，其可以与作为防腐剂的叠氮化钠组合；酶缀合物试剂，其包含在pH 8.0的Tris缓冲液中的如在本文中所描述的EtG-G6PDH缀合物，其可以与作为防腐剂的叠氮化钠组合；和校准剂(calibrator)，例如在适用于与待测试的特定样品类型一起使用的pH 6.0的缓冲液或尿液缓冲溶液或其他缓冲溶液中的不同浓度的EtG(如0和100、200、250、300、350、和/或500、600、700、750、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1700、1750、1800、1900、或2000ng/mL)。优选地，将抗EtG抗体混合至底物试剂中。可以将以上试剂包装在一起作为具有或不具有校准剂(其可以单独包装)的试剂盒。
使用例如Hitachi分析仪(917或717或Olympus AU 640)或其他相当的仪器建立校准曲线。为了使用Hitachi 917分析仪，将35微升校准剂与80微升含有抗EtG抗体的底物试剂和80微升酶缀合物试剂混合。为了使用Hitachi 717仪器，将20微升校准剂加入至125微升含有抗EtG抗体的底物试剂和125微升酶缀合物试剂中，并且根据制造商的建议使用仪器。为了使用Olympus AU640仪器，将50微升校准剂加入至80微升含有抗EtG抗体的底物试剂和80微升酶缀合物试剂中，并且根据制造商的建议使用仪器。当检测样本(尿液、血清等)时，用样本的样品代替以上过程中的校准剂。
从1至12连续编号的以下段落提供了本发明的各个方面。在一个实施方案中，在第一段(1)中，本发明提供：
1.一种用于检测尿液中乙基葡萄糖醛酸苷的乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)侧向流动测试条免疫测定系统，所述系统包括：
(a)如图1和2A-C中示意性地示出的侧向流动测试条，所述测试条包括；
(i)至少一种类型的毛细管流动材料，其能够可重复地提供尿液、体液或组织样品经由测试条的侧向流动，以可重复地相互作用并且使用在测试条中包含的可检测标记的EtG特异性抗体以及第一和第二可检测标记物检测EtG，所述系统提供(1)阳性结果，如在图2B中所示的仅(C)着色带显色；(2)阴性结果，如在图2A中所示的(T)着色带和(C)着色带二者均显色；或无效结果，如在图2C中所示的仅(T)着色带显色，或没有带；
(ii)如在图1中所示的尿液或对照样品施加区域(A)，其包含样品施加组分；
(iii)如在图1中所示的标记的EtG标记的抗体区域(B)，其包含设置在测试条材料上或设置到测试条材料的可检测标记的EtG特异性抗体，所述可检测标记的EtG特异性抗体包含在施加至测试条之后与可检测标记物组分缀合并且由于尿液或对照样品的毛细管作用而可溶于测试条或沿着测试条传导的EtG特异性抗体；
(iv)第一检测区域(D)，其包含第一可检测标记物作为当尿液或对照样品中的EtG的浓度低于在100至2000ng/mL之间的预选择的阈值时结合可检测标记的EtG特异性抗体的第一标记部分；其中低于预选择的阈值的可检测标记的EtG特异性抗体的结合得到如在图2A中所示的具有(T)和(C)着色带二者的阴性结果；并且其中当尿液或对照样品中的EtG高于预选择的阈值时，可检测标记的EtG特异性抗体未可检测地或明显地结合第一可检测标记物并且也未提供阴性结果；
(v)第二检测区域(E)，其包含第二可检测标记物作为当尿液或对照样品中的EtG的浓度高于在100至2000ng/mL之间的预选择的阈值时结合可检测标记的EtG特异性抗体的第二标记部分；并且其中高于预选择的阈值的可检测标记的EtG特异性抗体的结合得到如在图2B中所示的仅具有(C)着色带的阳性结果；并且其中当尿液或对照样品中的EtG高于预选择的阈值时，可检测标记的EtG特异性抗体未可检测地或明显地结合第一可检测标记物；并且
其中当测定无效时，可检测标记的EtG特异性抗体的结合得到如在图2C中所示的仅具有(T)着色带，或没有带的无效结果；并且其中可检测标记的EtG特异性抗体未可检测地或明显地结合第二可检测标记物。
2.根据第1段中所述的免疫测定系统，其中阈值是500、750、或1000ng/mL。
3.根据第1至2段中所述的免疫测定系统，其中可检测标记物是胶体金或胶乳金。
4.根据第1至3段中所述的免疫测定系统，其中EtG特异性抗体是单克隆的。
5.根据第1至4段中所述的免疫测定系统，其中EtG特异性抗体对EtG的亲和力是至少10-7KD。
6.根据第1至5段中所述的免疫测定系统，其中可检测标记物包含酶、酶片段或酶供体片段。
7.一种关于用于检测尿液中乙基葡萄糖醛酸苷的乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)侧向流动测试条免疫测定的方法，所述系统包括：
(a)提供如图1和2中示意性地示出的侧向流动测试条，所述测试条包括；
(i)至少一种类型的毛细管流动材料，其能够可重复地提供尿液、体液或组织样品经由测试条的侧向流动，以可重复地相互作用并且使用在测试条中包含的可检测标记的EtG特异性抗体以及第一和第二可检测标记物检测EtG，所述系统提供(1)阳性结果，如在图2B中所示的仅(C)着色带显色；(2)阴性结果，如在图2A中所示的(T)着色带和(C)着色带二者均显色；或无效结果，如在图2C中所示的仅(T)着色带显色，或没有带；
(ii)如在图1中所示的尿液或对照样品施加区域(A)，其包含样品施加组分；
(iii)如在图1中所示的标记的EtG标记的抗体区域(B)，其包含设置在测试条材料上或设置到测试条材料的可检测标记的EtG特异性抗体，所述可检测标记的EtG特异性抗体包含在施加至测试条之后与可检测标记物组分缀合并且由于尿液或对照样品的毛细管作用而可溶于测试条或沿着测试条传导的EtG特异性抗体；
(iv)第一检测区域(D)，其包含第一可检测标记物作为当尿液或对照样品中的EtG的浓度低于在100至2000ng/mL之间的预选择的阈值时结合可检测标记的EtG特异性抗体的第一标记部分；其中低于预选择的阈值的可检测标记的EtG特异性抗体的结合得到如在图2A中所示的具有(T)和(C)着色带二者的阴性结果；并且其中当尿液或对照样品中的EtG高于预选择的阈值时，可检测标记的EtG特异性抗体未可检测地或明显地结合第一可检测标记物并且也未提供阴性结果；
(v)第二检测区域(E)，其包含第二可检测标记物作为当尿液或对照样品中的EtG的浓度高于在100至2000ng/mL之间的预选择的阈值时结合可检测标记的EtG特异性抗体的第二标记部分；并且其中高于预选择的阈值的可检测标记的EtG特异性抗体的结合得到如在图2B中所示的仅具有(C)着色带的阳性结果；并且其中当尿液或对照样品中的EtG高于预选择的阈值时，可检测标记的EtG特异性抗体未可检测地或明显地结合第一可检测标记物；并且
其中当测定无效时，可检测标记的EtG特异性抗体的结合得到如在图2C中所示的仅具有(T)着色带，或没有带的无效结果；并且其中可检测标记的EtG特异性抗体未可检测地或明显地结合第二可检测标记物；
将尿液或对照样品施加至测试条；
确定尿液或对照样品是否包含高于或低于阈值的EtG。
8.根据第7段所述的方法，其中阈值是500、750、或1000ng/mL。
9.根据第7至8段所述的方法，其中可检测标记物是胶体金或胶乳金。
10.根据第7至9段所述的方法，其中EtG特异性抗体是单克隆的。
11.根据第7至10段所述的方法，其中EtG特异性抗体对EtG的亲和力是至少10-7KD。
12.根据第1至11段中所述的免疫测定系统，其中可检测标记物包含酶、酶片段或酶供体片段。
可以以其他具体形式实施本发明而不背离其精神或基本特征。所描述的实施方案在各方面均被认为仅是说明性的而不是限制性的。因此，本发明的范围由所附权利要求而不是由前述描述指定。进入权利要求的等价的含义和范围内的全部改变应包括在其范围内。

Claims (12)

1.一种用于检测尿液中乙基葡萄糖醛酸苷的乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)侧向流动测试条免疫测定系统，所述系统包括：
(a)侧向流动测试条，所述测试条包含；
(i)至少一种类型的毛细管流动材料，所述毛细管流动材料能够可重复地提供尿液、体液或组织样品经由所述测试条的侧向流动，以可重复地相互作用并且使用在所述测试条中包含的可检测标记的EtG特异性抗体以及第一和第二可检测标记物检测EtG，所述系统提供：
(1)阳性结果，仅(C)着色带显色；
(2)阴性结果，(T)着色带和(C)着色带二者均显色；或
(3)无效结果，仅(T)着色带显色或没有带；
(ii)如在图1中所示的尿液或对照样品施加区域(A)，所述尿液或对照样品施加区域(A)包含样品施加组分；
(iii)标记的EtG标记的抗体区域(B)，所述标记的EtG标记的抗体区域(B)包含设置在所述测试条材料上或设置到所述测试条材料的可检测标记的EtG特异性抗体，所述可检测标记的EtG特异性抗体包含在施加至所述测试条之后与可检测标记物组分缀合并且由于所述尿液或对照样品的毛细管作用而可溶于所述测试条或沿着所述测试条传导的EtG特异性抗体；
(iv)第一检测区域(D)，所述第一检测区域(D)包含所述第一可检测标记物作为当所述尿液或对照样品中的EtG的浓度低于在100至2000ng/mL之间的预选择的阈值时结合所述可检测标记的EtG特异性抗体的第一标记部分；
其中低于所述预选择的阈值的所述可检测标记的EtG特异性抗体的结合得到具有所述(T)和(C)着色带二者的所述阴性结果；并且
其中当所述尿液或对照样品中的所述EtG高于所述预选择的阈值时，所述可检测标记的EtG特异性抗体未可检测地或明显地结合所述第一可检测标记物并且也不提供所述阴性结果；
(v)第二检测区域(E)，所述第二检测区域(E)包含所述第二可检测标记物作为当所述尿液或对照样品中的所述EtG的浓度高于在100至2000ng/mL之间的所述预选择的阈值时结合所述可检测标记的EtG特异性抗体的第二标记部分；
其中高于所述预选择的阈值的所述可检测标记的EtG特异性抗体的结合得到仅具有所述(C)着色带的所述阳性结果；并且
其中当所述尿液或对照样品中的所述EtG高于所述预选择的阈值时，所述可检测标记的EtG特异性抗体未可检测地或明显地结合所述第一可检测标记物；并且
其中当所述测定无效时，所述可检测标记的EtG特异性抗体的结合得到仅具有所述(T)着色带或没有带的无效结果；并且其中所述可检测标记的EtG特异性抗体未可检测地或明显地结合所述第二可检测标记物。
2.根据权利要求1所述的免疫测定系统，其中所述阈值是500、750、或1000ng/mL。
3.根据权利要求1所述的免疫测定系统，其中所述可检测标记物是胶体金或胶乳金。
4.根据权利要求1所述的免疫测定系统，其中所述EtG特异性抗体是单克隆的。
5.根据权利要求4所述的免疫测定系统，其中所述EtG特异性抗体对EtG的亲和力是至少10-7KD。
6.根据权利要求1所述的免疫测定系统，其中所述可检测标记物包含酶、酶片段或酶供体片段。
7.一种关于用于检测尿液中乙基葡萄糖醛酸苷的乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)侧向流动测试条免疫测定的方法，所述系统包括：
(a)提供侧向流动测试条，所述测试条包含：
(i)至少一种类型的毛细管流动材料，所述毛细管流动材料能够可重复地提供尿液、体液或组织样品经由所述测试条的侧向流动，以可重复地相互作用并且使用在所述测试条中包含的可检测标记的EtG特异性抗体以及第一和第二可检测标记物检测EtG，所述系统提供：
(1)阳性结果，仅(C)着色带显色；
(2)阴性结果，(T)着色带和(C)着色带二者均显色；或
(3)无效结果，仅(T)着色带显色或没有带；
(ii)尿液或对照样品施加区域(A)，所述尿液或对照样品施加区域(A)包含样品施加组分；
(iii)标记的EtG标记的抗体区域(B)，所述标记的EtG标记的抗体区域(B)包含设置在所述测试条材料上或设置到所述测试条材料的可检测标记的EtG特异性抗体，所述可检测标记的EtG特异性抗体包含在施加至所述测试条之后与可检测标记物组分缀合并且由于所述尿液或对照样品的毛细管作用而可溶于所述测试条或沿着所述测试条传导的EtG特异性抗体；
(iv)第一检测区域(D)，所述第一检测区域(D)包含所述第一可检测标记物作为当所述尿液或对照样品中的EtG的浓度低于在100至2000ng/mL之间的预选择的阈值时结合所述可检测标记的EtG特异性抗体的第一标记部分；
其中低于所述预选择的阈值的所述可检测标记的EtG特异性抗体的结合得到具有所述(T)和(C)着色带二者的所述阴性结果；并且
其中当所述尿液或对照样品中的所述EtG高于所述预选择的阈值时，所述可检测标记的EtG特异性抗体未可检测地或明显地结合所述第一可检测标记物并且也不提供所述阴性结果；
(v)第二检测区域(E)，所述第二检测区域(E)包含所述第二可检测标记物作为当所述尿液或对照样品中的所述EtG的浓度高于在100至2000ng/mL之间的所述预选择的阈值时结合所述可检测标记的EtG特异性抗体的第二标记部分；和
其中高于所述预选择的阈值的所述可检测标记的EtG特异性抗体的结合得到仅具有所述(C)着色带的所述阳性结果；并且
其中当所述尿液或对照样品中的所述EtG高于所述预选择的阈值时，所述可检测标记的EtG特异性抗体未可检测地或明显地结合所述第一可检测标记物；并且
其中当测定无效时，所述可检测标记的EtG特异性抗体的结合得到仅具有所述(T)着色带或没有带的无效结果；并且其中所述可检测标记的EtG特异性抗体未可检测地或明显地结合所述第二可检测标记物；
将所述尿液或对照样品施加至所述测试条；
确定所述尿液或对照样品是否包含高于或低于所述阈值的EtG。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述阈值是500、750、或1000ng/mL。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述可检测标记物是胶体金或胶乳金。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述EtG特异性抗体是单克隆的。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述EtG特异性抗体对EtG的亲和力是至少10-7KD。
12.根据权利要求1所述的免疫测定系统，其中所述可检测标记物包含酶、酶片段或酶供体片段。
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