CN113533740A - 用于eb病毒抗体快速联合检测的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及体外诊断免疫分析技术及纳米技术领域，具体为一种用于EB病毒抗体快速联合检测的试剂盒；所述试剂盒包括:EB病毒抗体标志物联合检测试剂卡、样本稀释液和固体底物试剂；本发明提供了一种快速现场检测EB病毒抗体的产品，解决了现有技术中不能快速高灵敏现场检测EB病毒抗体的不足，且可实现多指标联合检测；本申请中的试剂盒与传统ELISA试剂盒相比，灵敏度相当或更优，简单快速便携，16min内即可完成，无需大型精密仪器，稳定性良好，可常温保存及运输，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断免疫分析技术及纳米技术领域，具体为一种用于EB病毒抗体快速 联合检测的试剂盒。
背景技术
鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一类发生于鼻咽粘膜处上皮性质的恶性肿瘤。 早期鼻咽癌对放射治疗敏感，及时干预治疗临床治愈率可达90％以上；中期鼻咽癌生存率 可达80％；而晚期鼻咽癌易发生转移，致死率高，五年生存率低于20％。因此，早发现， 早治疗对于提高鼻咽癌患者治愈率，延长患者生存期具有重要意义。然而，由于鼻咽癌早 期症状不明显，易漏诊，约80％鼻咽癌患者在就诊时已发展至中晚期，延误了最佳治疗时 机。在高风险地区(如广西、广东中山等地)推行鼻咽癌筛查，有助于及早发现鼻咽癌高 风险人群，并进行追踪随访及干预，提高鼻炎癌早诊率。
经流行病学研究发现，约95％以上的鼻咽癌与EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染 密切相关。EB病毒是一种γ疱疹DNA病毒，也称为嗜淋巴细胞病毒，其感染还可能引起单核细胞增多症、恶性淋巴瘤等。在鼻咽癌患者的肿瘤活检组织中可检出EBV核酸或抗原[2](Liu Y等，Genet Test Mol Biomarkers，2011)，患者血清中亦存在针对EBV病毒抗原的特异性抗体。EBV感染后，机体会产生针对EB病毒多种抗原的免疫反应，产生多种EB 病毒抗体，包括EBV衣壳抗原抗体(EBV-VCA-IgG/IgA/IgM)，EBV早期抗原抗体 (EBV-EA-IgA)，EBV核抗原抗体(EBV-NA-IgG/IgA)、Rta蛋白抗体(Rta-IgG)及Zta 蛋白抗体(Zta-IgG)等[3](Li,Y.Q.等，Cancer Biol Med,2018)。不同抗体出现在病毒感 染的不同阶段，其滴度的动态变化和监测，可用于鼻咽癌早期筛查、临床诊断、治疗效果 及预后判断[4](鼻咽癌标志物专家委员会，鼻咽癌标志物临床应用专家共识，中国癌症防 治杂志，2019)。尽管90％以上的成人均为EB病毒感染者，然而大规模人群普查及跟踪随 访发现，仅鼻咽癌患者在出现临床症状前三年，表现出血清中多种IgA抗体显著升高[5,6](Ji, M.F.等，BritishJ Cancer，2007；季明芳等，中华肿瘤杂志，2003)。EB病毒IgA抗体水平 持续升高预示鼻咽癌发病高风险，其中，VCA-IgA 5年随访升高组风险调整比21.3％，且抗 体滴度与发病风险存在剂量-反应关系[7](Cao SM.,等，PLoS One,2011)。因此，基于 EBV-IgA等抗体的滴度检测和动态监测，可初筛罹患鼻咽癌高风险人群，进一步开展3-5 年的持续跟踪监测及风险管理，有助于在早期阶段筛查并发现鼻咽癌患者；同时可作为鼻 咽镜等侵入性检测手段的补充，用于鼻咽癌的临床早期辅助诊断[8](Cheng,W.M.等，Int J Cancer，2002)。过去十多年，针对中山等地的人群队列筛查结果显示，基于ELISA的 VCA-IgA和/或NA-IgA抗体筛查可将鼻咽癌的早诊率提高3-4倍，入组筛查的鼻咽癌患者， 5年生存率显著提高，对人群风险管理及尽早干预治疗大有裨益[9](Yu X.等，J Cancer，2018)。 此外，由于不同抗体标志物在特异性、敏感性及窗口期上存在一定差异，采用多项指标组 合检测，可有效提高筛查的特异性和准确率[10](Chen,H.等，Cancer Prev Res(Phila)，2017)。
鼻咽癌的早期筛查和高风险人群管理，是实现鼻咽癌早诊早治的重要手段。根据应用 场景，现有鼻咽癌检查手段可分为临床诊断和人群筛查两大类，检测技术包括：纤维鼻咽 镜检查及病理学检测、影像学诊断(鼻咽CT、MRI等)、EBV-DNA检测、EBV血清学抗 体检测等。迄今为止，我国食品药品监督管理局共计批准106种鼻咽癌EBV检测相关试剂 产品，包括进口及国产医疗器械，其中酶联免疫(ELISA)试剂盒及化学发光试剂占主要， 分别占比44％和32％，此外基于荧光PCR技术的分子诊断试剂占10％，胶体金试纸及免疫 荧光试剂占比较小。对于血清学免疫检测，化学发光技术由于其高敏感性和特异性，市场 份额逐年上升，但其依赖于大型精密仪器，成本较高，因此多适用于中心实验室，用于临 床诊断及预后观察，占据三甲医院等高端市场。而ELISA、胶体金、免疫荧光试剂多用于 二级及以下医疗机构，也用于人群普查或体检中心机会性筛查。20世纪以前，我国鼻咽癌 人群筛查主要基于传统免疫荧光定性检查，缺乏标准化，存在人为判断的主观性。随后， 随着技术的发展和革新，灵敏度较高、结果精准量化的ELISA技术逐渐取代免疫荧光，成 为国家卫生计生委推荐的鼻咽癌筛查技术方案[11](Li,T.等，Cancer Med，2018)。然而， 由于ELISA检测操作繁琐耗时，且依赖于大型配套检测仪器，需动员村医、县医院、市医 院三级医务人员，运送血液样本至实验室由专业人员开展检测，至少72小时以后才能得到 检测结果，不仅耗时且综合成本较高，单一指标的结果还可能影响筛查结果准确性，导致 群众依从性不高，参与度低，在南方基层地区的推广效果不甚理想。尽管，目前市场上， 也有少量胶体金试纸产品，然而检测灵敏度不足限制其应用范围。因此，亟需开发便携式、 高灵敏且简单的检测产品。
发明内容
本申请提供了一种用于EB病毒抗体快速联合检测的试剂盒，以解决现有技术中EBV 抗体检测操作繁琐、便携度低的问题。
本申请公开了一种用于EB病毒抗体快速联合检测试剂盒，所述试剂盒包括:EB病毒抗 体标志物联合检测试剂卡、样本稀释液和固体底物试剂。
可选的，以质量分数计，所述样本稀释液包括：以质量分数计，0.05％-5％封闭剂；以 体积分数计：0.05％-5％表面活性剂和0.05％-0.15％防腐剂；以摩尔浓度计：0.01M-0.5M Tris 缓冲液。
可选的，所述封闭剂包括牛血清白蛋白、羊血清、鱼明胶中的至少一种。
可选的，所述表面活性剂为NP-40、Tween、Trixton X-100中的至少一种。
可选的，所述防腐剂为Proclin 300和叠氮化钠中的至少一种。
可选的，所述固体底物试剂包括固体化学发光剂、固体过氧化物、底物缓冲液。
可选的，所述底物缓冲液包括：以体积分数计，0.05％-1％表面活性剂，0.05％-0.15％ 防腐剂；以摩尔浓度计，0.05M-1M NaCl和0.01M-0.5M Tris缓冲液。
可选的，所述底物缓冲液中表面活性剂为NP-40、Tween、Triton X-100中的至少一种。
可选的，所述底物缓冲液中防腐剂为Proclin 300和叠氮化钠中的至少一种。
可选的，所述试剂盒还包括：阳性质控品及阴性质控品、一体化底物配液管、取样管 和使用说明书。
可选的，所述一体化底物配液管包括三个独立的腔体，一个腔体用于存放固体发光剂， 另一个用于存放固体氧化物，剩余一个腔体用于存放底物缓冲液。
可选的，所述EB病毒抗体标志物联合检测试剂卡包括硝酸纤维素膜和纳米酶结合垫， 所述硝酸纤维素膜设有EB病毒抗原蛋白，所述EB病毒抗原蛋白包括衣壳抗原(VCA)、早期抗原(EA)及核抗原(NA)中的至少两种组合；所述纳米酶结合垫设有用于识别人IgA 抗体及催化化学发光底物的纳米酶抗体探针。
本发明至少具有如下技术效果或优点：
本申请解决了现有技术中无法快速直观检测EB病毒抗体，且解决了检测过程中检测阴 性血清组，造成严重假阳性问题，本申请的试剂盒使用纳米酶标记抗体探针、稀释样本和 EB病毒抗原蛋白接触待测物；添加固体底物试剂，所述纳米酶探针抗原抗体复合物和所述 纳米酶探针抗体复合物催化固体底物试剂产生化学信号，实现对EB病毒抗体的联合检测。 与传统ELISA试剂盒相比，灵敏度更优，但简单快速便携，16min内即可完成，且无需大 型精密仪器。试剂稳定性良好，可常温保存及运输，同时成本低。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可 依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明 显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的 附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领 域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附 图。
图1为本申请实施例中纳米酶联合检测EBV-IgA抗体示意图；
图2为本申请实施例中样品稀释液筛选测试结果图；
图3为本申请实施例中底物缓冲液筛选测试结果图；
图4为本申请实施例中混合阳性血清抗体滴度ELISA对比测试结果图；
图5为本申请实施例中临床NPC患者及正常人血清测试结果图；
图6为本申请实施例中纳米酶化学发光三联检测试剂重复性评价；
图7为本申请实施例中纳米酶化学发光二联检测试剂抗干扰能力评价；
图8为本申请实施例中纳米酶化学发光三联检测试剂全血样本测试结果图；
图9为本申请实施例中纳米酶化学发光三联检测试剂热稳定性评价；
图10为本申请实施例中纳米酶化学发光固体底物试剂性能评价。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由 此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发 明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使 用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域 技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市 场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
一种EB病毒抗体快速联合检测的试剂盒，具体制备步骤包括：
制备EBV-IgA纳米酶联合检测试纸。鼻咽癌EB病毒抗体标志物联合检测试剂卡包括VCA-IgA、EA-IgA和(或)NA-IgA联合检测试纸卡。
首先标记制备纳米酶检测探针，并固定干燥于玻璃纤维垫上，制得纳米酶结合垫；将 VCA、EA及NA抗原中的至少两种蛋白包被固定于硝酸纤维素(NC)膜上，形成检测线 (T1、T2或T3)；同时将质控抗体(抗鼠或抗兔或抗羊IgG)包被于NC膜上，形成质控线(C 线)，将上述结合垫、NC膜、PVC板、样品垫及吸水垫组装成试纸大板，并斩切成4mm 宽的试纸条，置于塑料卡壳中制得联合检测试纸卡，干燥环境常温保存。
联合检测：采用样本稀释液适当稀释待测物，取100-150μL样品，逐滴加入试纸卡上 样孔，常温下层析10-15min，纳米酶检测探针特异结合待测样品中的IgA抗体，在毛细管作用下，沿试纸条向前发生侧向横流层析运动；移动至检测区时被相应的EBV抗原所捕获，形成纳米酶探针-抗体-抗原免疫复合物，聚集形成T线；未结合IgA抗体的纳米酶探针继续移动，并被质控抗体所捕获，聚集形成C线；因纳米酶标记探针具有高效化学发光催化活性，层析反应后采用一体化配液管即时溶解固体底物，自一侧滴加孔滴加2-3滴底物工作液至检测窗口区，即可在T线或C线出产生化学发光信号，进一步放大免疫反应信号；可凭 肉眼观察或借助智能手机或手持便携式化学发光检测仪采集信号并判定结果。
一种用于EB病毒抗体快速联合检测的试剂盒，所述试剂盒包括：EB病毒抗体标志物 联合检测试剂卡、固体底物试剂、样本稀释液、阳性质控品及阴性质控品、一体化底物配液管、取样管和使用说明书。
作为一种可选的实施方式，所述样本稀释液包括含封闭剂、表面活性剂、防腐剂的缓 冲液，用于稀释人体血清或全血样本，同时起封闭纳米酶抗体探针，减少非特异性结合及 分散探针颗粒的作用。优选为含0.05-5％封闭剂(包括牛血清白蛋白、羊血清、鱼明胶中的 至少1种)、0.05-5％表面活性剂(所述表面活性剂为NP-40、Tween、Triton X-100中的至少一种)、0.05％-0.15％防腐剂(所述防腐剂为Proclin 300、叠氮化钠中的至少一种)的Tris缓冲液。
作为一种可选的实施方式，所述EB病毒抗体标志物联合检测试剂卡包括硝酸纤维素膜 和纳米酶结合垫，所述硝酸纤维素膜设有EB病毒抗原蛋白包括衣壳抗原(VCA)、早期抗 原(EA)及核抗原(NA)中的至少两种组份；所述纳米酶结合垫设有用于标记抗人IgA抗体的所述纳米酶抗体探针；所述样本稀释液包括含封闭剂、表面活性剂、防腐剂的缓冲液，用于稀释人体血清或全血样本。
作为一种可选的实施方式，所述一体化底物配液管包括三个独立的腔体，一个腔体用 于存放固体发光剂，另一个用于存放固体氧化物，剩余一个腔体用于存放样本稀释液。所 述的一体化底物配液管，其特征是具备三个分隔腔的塑料管或塑料安瓿瓶，一侧两个腔体 分别用于固体发光剂和固体氧化物存放，另一侧腔体可装底物缓冲液；一端具有滴定孔及 管盖。
作为一种可选的实施方式，所述EB病毒抗原蛋白包括衣壳抗原(VCA)、早期抗原(EA) 和核抗原(NA)中的至少两种任意组合和缓冲液，所述缓冲液包括含有0-1％海藻糖的磷酸 缓冲液。不同抗原蛋白包被，形成T线，两条检测线之间距离4-5mm左右。
所述固体底物试剂包括固体化学发光剂、固体氧化剂及底物缓冲液，所述固体化学发 光剂，包括鲁米诺或其衍生物、1，2-二氧环已烷衍生物(AMPPD)、1,2-二氧环丁烷(CDP-STAR) 等。优选地，所述固体化学发光剂为鲁米诺或其衍生物。所述固体过氧化物，包括过硼酸 钠、过碳酸钠等。底物缓冲液为含有0.05-1M NaCl，0.05％-1％表面活性剂，0.05％-0.15％防 腐剂的Tris缓冲液。以上底物组分均为固体粉剂或冻干剂型，保存于底物配液管分隔腔中， 使用前采用底物缓冲液迅速溶解后混合即可。
针对EB病毒抗原蛋白的IgA抗体进行快速联合检测，利用高活性纳米酶抗体探针催化 底物化学发光放大反应信号，提高检测灵敏度和准确度；对不同的抗体标志物组合检测， 提高检测的特异性和准确度。
优选的，所述底物缓冲液包括：以体积分数计，0.05％-1％表面活性剂，0.05％-0.15％ 防腐剂；以摩尔浓度计，0.05-1M NaCl和0.01M-0.5M Tris缓冲液。
所述EB病毒抗原蛋白包括衣壳抗原(VCA)、早期抗原(EA)和核抗原(NA)中的 至少两种组合和缓冲液，所述缓冲液包括含有0-1％海藻糖的磷酸缓冲液。
所述阳性质控品包括为同时含VCA-IgA、EA-IgA及NA-IgA中至少两种抗体的人体血 清或血浆制品；所述阴性质控品包括不含VCA-IgA、EA-IgA及NA-IgA中至少两种抗体的人体血清或血浆制品。
所述纳米酶探针为标记有抗人IgA抗体的纳米酶，其为粒径50-200nm的纳米材料，具有与天然辣根过氧化物酶(HPR)相当的化学发光催化活性。优选为掺钴、铁或锌的金属氧化物纳米酶。
所述纳米探针，通过化学偶联方法将抗人IgA抗体与纳米酶表面羧基基团偶联制得。
所述检测结果判断可根据暗室肉眼定性观察或结合智能手机或手持免疫分析仪拍照分 析在不同检测线处是否有化学发光信号从而判断标志物是否为阳性。
基于前述方法，采用本试剂盒进行样品检测的同时测试试剂盒阴性及阳性质控品，样 品检测结果分析比照阴性及阳性质控品检测结果。检测无C线信号判断为无效检测；仅有 C线信号判断为联合指标均为阴性。
本申请实施例的试剂盒的检测原理为：用样本稀释液稀释待测物，获得稀释样本；
纳米酶标记抗体探针依次与稀释样本、EB病毒抗原蛋白和质控抗体接触；若待测样本 含IgA抗体，则纳米酶标记抗体探针识别EB病毒IgA抗体，并与EB病毒抗原蛋白结合，形成纳米酶探针抗原抗体复合物；若纳米酶标记抗体探针未与EB病毒IgA抗体结合，则与质控抗体结合，形成纳米酶探针抗体复合物；添加固体底物试剂，所述纳米酶探针抗原抗体复合物和所述纳米酶探针抗体复合物催化固体底物试剂产生化学信号；实现对所述EB病毒IgA抗体的联合检测。
从上述技术方案可以看出，纳米酶EBV-IgA联合检测的试剂盒，具有以下有益效果：
(1)本发明所提出的纳米酶联合检测试纸层析技术，用于鼻咽癌相关EBV-IgA抗体检 测，无需专业人员及培训，16min内即可同时完成至少2种抗体标志物的检测，相对现行ELISA方法(耗时1-2小时，样品运送至少72小时后出结果)更加简单快速便携，省时省 力。
(2)检测试纸采用纳米酶催化底物发光，放大层析免疫反应信号，有效提高快速层析 检测灵敏度，灵敏度较传统胶体金或荧光试纸更高，达到ELISA方法水平；敏感性的提高有助于降低低丰度抗体如EA-IgA的假阴性率，提高鼻咽癌筛查抗体检测的准确性。
(3)联合检测试纸可同时实现2-3种抗体标志物的组合检测，提示EB病毒感染阶段， 有效提高检测特异性及准确度，同时较ELISA单指标检测更节约成本。
(4)本发明联合检测试剂盒核心原料纳米酶为无机材料，较天然蛋白酶(如HRP)稳定，适于常温保存及运输；同时采用固体发光底物试剂，较传统液体化学发光底物液活性高且稳定，无需冷链运输及储存，适于现场检测。
(5)本发明联合检测试剂采用纳米酶催化底物发光法，检测结果肉眼可见(暗室)，也可通过智能手机或手持便携式分析仪进行信号采集和分析，无需大型精密仪器，便于现场检测和基层应用推广。
(6)本发明所使用的纳米酶材料可实现实验室自主规模合成，制备简单且廉价，不依 赖于进口，用于制备联合检测试剂，综合成本较ELISA低。
综上所述，本发明所采用纳米酶EBV-IgA抗体联合检测技术与试剂盒，简单快速便携， 灵敏度高、特异性好且试剂稳定、成本相对较低。
实施例1.纳米酶EBV-IgA抗体联合检测卡制备
(1)纳米酶检测探针制备
采用水热法制备表面带有羧基修饰的掺钴纳米酶材料(粒径100nm)(参考中国专利 CN201910195758.8)。运用化学偶联法制备抗体标记的纳米酶检测探针：采用EDC(Sigma， E6383)和NHS(Sigma，56485)试剂活化纳米材料表面羧基基团，室温孵育30min后，离心(12000rpm,5分钟)弃上清，加入去离子水洗一次，离心后弃上清，加入100μg 鼠抗人IgA抗体(北京华兴博创生物技术中心，HX2157)，4℃孵育12小时，磁吸附，吸 弃上清后，加入1ml 50mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液，室温孵育30分钟后，磁吸附弃上清， 重悬并超声分散于含5％BSA的保存缓冲液中。采用Bio-Dot喷膜仪将超声分散好的纳米酶 探针喷涂于预制10mm×300mm规格玻璃纤维垫上，37℃干燥1-2小时，制备成纳米酶 结合垫，干燥条件常温保存。
(2)EBV-IgA联合检测试纸制备
筛选确定EBV重组抗原蛋白：VCA(深圳亚辉龙，059000)、EA(深圳亚辉龙，058800)及NA(深圳亚辉龙，058900)。用10mM PB缓冲液稀释质控抗体羊抗鼠IgG(北京博奥 龙免疫技术公司，BF02001C)及重组抗原至工作浓度(0.5-1.5mg/ml)。将吸水垫及硝酸 纤维素膜(Merk Millipore，HF13502S25)交叠2mm依次贴于背衬底板上制成试纸板。采 用Bio-Dot喷膜仪在硝酸纤维素膜上包被质控抗体与VCA、EA及NA抗原蛋白，形成质控 C线及检测线T1、T2、T3(如图1所示)，37℃干燥1-2小时，干燥条件常温保存。
(3)纳米酶联合检测试纸卡组装
将纳米酶结合垫、样品垫(或滤血垫)依次交叠2mm粘贴于包被试纸板上，制成试纸大板，采用切条机将试纸板斩切成4mm宽的试纸条，并置于塑料卡壳中，铝箔袋包装，常 温干燥保存。
实施例2.样品稀释液筛选测试
根据实施例1所述制备EBV-IgA三联检测卡，配制不同缓冲液包括0.1M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)、0.9％生理盐水(pH7.4)、50mM磷酸缓冲液(PB，pH7.4)、0.1M Tris 缓冲液(含3％BSA，2％NP-40，0.05％Proclin 300，pH7.4)。另外配制0.1M Tris缓冲液 (含2％BSA,0.05％Proclin 300,pH7.4)，并添加1％、2.5％或5％NP-40；配制0.1M Tris缓 冲液(含2％NP-40,0.05％Proclin 300,pH7.4)，并添加1％、2.5％或5％BSA。上述缓冲液分 别用于稀释阴性(正常人)血清样品及阳性(鼻咽癌患者)血清样品(1:100)。然后取100μL稀释样本加入同一批检测卡加样孔，室温层析15min后，取商品化液体化学发光底物工 作液(Thermo,37074)2-3滴加至检测视窗区，1min内采用MiniChemiTM化学发光成像 系统信号采集分析。
如图2A结果显示，对比稀释液1(PBS)、对比稀释液2(生理盐水)及对比稀释液3(PB缓冲液)用于稀释样品，纳米酶探针倾向于聚集于靠近结合垫的检测线处，检测阴性 血清，造成严重假阳性，不适合用于本试剂盒快速检测。Tris缓冲液组(本申请中样品稀释液)无明显假阳性，且阳性血清组VCA-IgA/NA-IgA/EA-IgA三项指标信号强度与ELISA 检测强度相符。如图2B所示，提高Tris样品稀释液中表面活性剂如NP-40的含量，可有效 提高信号强度和灵敏度，此外表面活性剂含量过高(>5％)，易造成假阳性结果，尤其是靠 近结合垫的抗体指标。如图2C所示，提高Tris样品稀释液中BSA含量，也可增强检测信 号强度，同时超过一定含量，易产生假阳性信号。
常规的所述表面活性剂可用于蛋白质的溶解及分散作用；而本申请的Tris缓冲液中表 面活性剂组分促进纳米检测探针颗粒分散(纳米材料表面活性较高，易于团聚)，促进其 在NC膜上的侧向移动，同时增加液体粘稠度，减缓液体流速，促进抗原抗体结合，提高灵敏度。
封闭剂，可降低生物大分子非特异性结合，有助于提高特异性，同时增加溶液粘度， 减缓液体流速，提高灵敏度；另外BSA作用类似于溶剂化膜，溶剂化膜具有一定的机械强 度和弹性，可防止抗体聚集，维持抗体活性。
上述两种组分(表面活性剂和封闭剂)具有协同增强效果，在样品稀释液中添加上述 组分，在提高检测信号强度和灵敏度的同时，也会增强背景信号和非特异性，因此选择合 适的添加剂量及组合，才能达到最优的检测效果。
此外，添加所述防腐剂的原因是为了防止微生物生长，避免影响试剂稳定性。
综上所知，样本稀释液直接影响纳米酶化学发光快速联合检测性能，使用本发明的Tris 样品稀释液进行EBV-IgA联合检测，才能达到较高的灵敏度及特异性。
实施例3.底物缓冲液筛选测试
配制不同底物缓冲液包括:0.1M Tris-NaCl(含0.1％NP-40或0.1％Tween-20或0.1％ Triton X-100)缓冲液(0.05％Proclin 300,pH12.0)、0.1M Tris(pH12.0或pH11.0或pH10.0)缓 冲液(0.1％Triton X-100,0.05％Proclin 300)，分别用于溶解固体鲁米诺及过氧化物组分。 根据实施例1所述方法制备一批EBV-IgA三联检测卡，采用Tris样本稀释液分别稀释阴性 正常人阴性血清样品及阳性血清样品(1:100)。依次取100μL稀释样本加入同一批检测 卡加样孔，室温层析15min。取500微升上述不同缓冲液分别溶解适量固体鲁米诺及过氧 化物组分，等体积混合后，于层析结束时滴加2-3滴至检测视窗区，1min内采用MiniChemiTM化学发光成像系统信号采集分析。
如图3结果所示，Tris-NaCl作为基础溶液组(添加不同活性剂)阳性信号整体高于Tris 缓冲液组(不同pH条件)。可见，添加无机盐组分，有助于提高纳米酶催化化学发光底物活性，从而提高信号强度及灵敏度。
Tris-NaCl作为基础溶液组中添加不同表面活性剂，信号强度也有所差异，其中添加 Triton X-100成分阳性信号高于添加Tween-20或NP-40组，且检测正成人血清时假阳性最 低，因此底物缓冲液中添加Triton X-100表面活性剂相对于其它表面活性剂，表现出更优 异的效果，即高灵敏度及高特异性。此外，溶液pH值对发光信号也有显著影响。综上所述，不同底物缓冲液组分影响纳米酶化学发光催化效果，采用本发明所述底物缓冲液，具有较高的信噪比，有助于实现高灵敏度及高特异性检测效果。
实施例4.混合阳性血清IgA抗体滴度对比测试
(1)收集临床确诊NPC患者血清，混合制成阳性血清制品。采用纳米酶联合检测试纸 卡测试混合阳性血清IgA抗体滴度。取样品稀释液按1:2、1:5、1:10、1:50、1:100、1:1000、 1:10000、1:100000、1:200000比例梯度稀释混合阳性血清。各取100μL稀释样本加入样品 孔，室温层析15min。取500微升底物缓冲液分别溶解适量鲁米诺固体及过氧化氢，等体 积混合后，加入2-3滴至检测视窗区，1min内采用MiniChemiTM化学发光成像系统或智能手机进行信号采集，结合Image-Pro Plus软件进行发光信号分析，确定最低检出限。
(2)ELISA方法检测混合血清制品抗体滴度。采用商品化VCA-IgA(中山生物工程有限公司)、NA-IgA(中山生物工程有限公司)、EA-IgA(北京贝尔生物工程有限公司)ELISA 试剂盒进行测试。采用试剂盒样本稀释液按比例1:10、1:50、1:100、1:1000、1:4000、1:8000、1:10000稀释血清样本；根据试剂盒说明书进行操作，使用酶标仪测定OD450值，根据阴 性对照平均值x+2SD确定检出限。所有血清污染物均按照生物安全垃圾高温灭菌处理后丢弃。
根据混合阳性血清样本滴度对比检测结果，纳米酶联合检测卡测试三种抗体指标VCA-IgA/EA-IgA/NA-IgA检出限均可达到1:100000(图4A)；ELISA法测试 VCA-IgA/NA-IgA/EA-IgA指标检出限分别为1:100、1:10000、1:100(图4B)。上述结果显 示针对混合阳性血清，纳米酶化学发光联合检测卡灵敏度显著高于ELISA试剂，同时16min 内两步操作即可完成检测，较ELISA方法更省时省力。此外，针对高浓度血清样本(1:50 以下低倍稀释样品或全血清)，纳米酶化学发光检测存在钩状效应(HOOK效应)，低倍 稀释样品阳性信号随稀释倍数降低(1:50-1:2)，阳性信号反而降低(图4A)。
实施例5.临床血清IgA抗体联合检测
收集44例临床确诊NPC患者血清及153例正常人血清(样本来源：深圳市第二人民医 院)，采用ELISA试剂盒样本稀释液10倍稀释血清样本，根据实施例2中所述商品化ELISA试剂盒说明书，分别进行三种EBV相关抗体标志物VCA-IgA、EA-IgA及NA-IgA的ELISA 检测，根据试剂盒提供阳性质控血清或阴性对照样本，确定检测临界值Cut off值(质控血 清平均A值×20％或阴性对照平均A值+0.1)，判断血清中上述三种抗体指标是否为阳性。
同时，采用层析检测样本缓冲液，100倍稀释上述临床血清样本。并根据ELISA测试结果，选取正常人血清中三项指标均为阴性的样本作为阴性对照；采用实施例2中所述阳性混合血清为阳性对照，根据实施例2中所述的化学发光层析检测方法，进行上述临床血清样本的纳米酶联合抗体检测，重复测试3次。化学发光信号采集成像，结合Image-ProPlus 软件进行发光信号定量分析，根据公式
其中，
阴性对照信号平均值，SD:阴性 对照信号值标准偏差，判断临床血清样本中三种抗体指标是否为阳性，并汇总整理结果如 表1。
结果统计分析显示，采用商品化ELISA试剂，153例正常人血清样本中VCA-IgA 阴性符合率为92.80％，纳米酶化学发光联合检测阴性符合率为89.54％；针对45例临床确 诊血清，ELISA与纳米酶联合检测试纸的阳性检出率分别为64.44％及93.30％。对于EA-IgA抗体指标，ELISA与纳米酶联合检测正常人血清阴性符合率分别为95.42％和90.85％；临床确诊血清阳性检出率分别为66.67％和75.56％。对于NA-IgA抗体指标，ELISA与纳米酶联合检测正常人血清阴性符合率分别为91.50％和90.20％，临床确诊血清阳性检出率分别为82.22％及91.10％。上述对比结果表明，针对临床血清样本检测，纳米酶化学发光联合检测试纸阳性检出率即灵敏度均高于商品化ELISA试剂盒，同时单个指标阴性符合率略低于ELISA，检测结果更为灵敏和准确。
表1，临床样本ELISA对比测试结果
针对其中10例NPC患者血清和10例正常人血清，纳米酶联合检测结果如图5A,5B所示。
实施例6.纳米酶化学发光联合检测试剂重复性评价
根据实施例1所述方法制备一批EBV-IgA抗体三联检测卡，混合阳性血清样品1:100 稀释后，分别由同一人进行10次重复测试，采用MiniChemiTM化学发光成像系统对同一浓度的重复测试卡同时进行信号采集，结合Image-Pro Plus软件进行信号定量分析，根据公 式(变异系数CV＝标准偏差SD/平均值x×100％)计算特定稀释比例下EA-IgA、NA-IgA、VCA-IgA三项指标测试结果的变异系数(CV)。
测试结果拍照如图6，数据分析显示，针对稀释血清样品检测，EA-IgA、NA-IgA、VCA-IgA指标的批内变异系数分别为5.96％、7.21％及7.24％；混合血清中VCA-IgA含量 较高，相应CV值相对较高，批内变异系数CV值均小于15％。
实施例7.纳米酶化学发光联合检测试剂抗干扰测试
为评估纳米酶化学发光检测试剂盒对内源性干扰物质(胆红素、甘油三酯、血红蛋白) 的抗干扰能力，采用添加上述组分的阳性血清样本进行抗干扰测试。在1:100稀释血清样本 池中，分别添加浓度梯度为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4mg/ml的胆红素(上 海源叶生物科技有限公司，S30376)，或浓度梯度2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20mg/ml 的甘油三酯(北京索莱宝科技有限公司，ST9330)，或浓度梯度为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml的血红蛋白(Sigma,H7379)。根据实施例1种所述的方法制备一批不含滤血垫组成 的纳米酶IgA二联检测卡(EA-IgA/NA-IgA)，参考实施例2中所述的方法进行纳米酶联合 检测，采用MiniChemiTM化学发光成像系统对不同浓度梯度的测试卡同时进行信号采集。
结果显示，添加0.4mg/ml及以下浓度的胆红素对稀释血清样本检测无显著干扰(图7A)； 添加15mg/ml及以下浓度的甘油三酯对稀释血清样本检测无显著干扰(图7B)；而血红 蛋白易对纳米酶化学发光体系造成干扰，添加0.25mg/ml及以下浓度的血红蛋白对血清样 本检测无显著干扰，当血红蛋白浓度高于0.25mg/ml时，可造成明显背景干扰。综上所述， 血清干扰物质胆红素、甘油三酯对纳米酶检测卡干扰较小(浓度上限分别为0.4mg/ml及15 mg/ml)；血红蛋白不高于0.25mg/ml的样本对结果干扰较小，在全血检测中应使用含滤血 垫结构的检测卡，且尽量避免使用溶血样本。
实施例8.纳米酶化学发光联合检测试剂全血测试
采集新鲜鸡血模拟人全血测试，加入适量柠檬酸钠抗凝剂(鼎国昌盛，Cat#AC-0011)， 混匀后4℃保存备用。根据实施例1所述方法制备带增加滤血垫结构的纳米酶化学发光三联 检测卡。采用样本稀释液按1:25、1:50、1:100、1:200稀释全血，并按1:100添加低值阳性 血清样本或高值血清样本，如实施例2所述方法进行纳米酶化学发光联合检测，以不添加 全血样本的低值血清或高值阳性血清稀释样品作为对照，进行结果对比分析。
如图8所示，低值阳性样本及高值样本组添加稀释全血时，层析时无显著背景，滤血 膜对全血起到较好的过滤作用，全血稀释倍数为1:25时，加入化学发光底物检测时产生较 重的背景干扰，全血稀释比例为1:100及以上时，阳性信号与背景血清样本测试无显著差异。 因此，本发明所述纳米酶联合检测卡用于现场末梢血快速检测时，推荐全血样本稀释比例 为1:100-1:50。
实施例9.纳米酶化学发光联合检测试剂热稳定性评价
根据实施例1所述方法批量制备EBV-IgA抗体三联检测试剂，铝箔袋封口，置于37℃ 干燥箱中保存，每周取37℃保存的试剂盒进行加速稳定性测试。取同一份分装保存的正常 人血清及确诊患者阳性血清样本1:100倍稀释后分别进行纳米酶化学发光联合检测，采用鲁 米诺发光底物进行化学发光信号放大或采用DAB底物显色放大，采集图像信号并分析。同 时重复实施例2、4中灵敏度评价及重复性评价，并根据实施3所选择10例阳性血清参考 品及阴性血清参考品进行阳性符合率及阴性符合率评价。
结果所示，纳米酶联合检测试剂置于37℃保存7天、14天及33天时,针对同一份正常 人血清或患者血清检测，信号强度无明显下降(图9)，混合阳性血清最低检出限保持在1:10000稀释倍数，重复性CV值保持在15％以内，阳性符合率与阴性符合率与37℃加速前无显著差异。加速试验1个月终止时，相对于37℃加速前，联合检测固体底物试剂仍保持90％以上的活性。根据阿伦尼乌斯公式，37℃加速1个月保存相当于常温保存1年，因此， 本发明所述纳米酶联合检测试剂具有良好的稳定性，常温可稳定保存至少1年。
实施例10.纳米酶化学发光固体底物试剂性能评价
采用微孔板测试单独评价试剂盒中固体化学发光底物试剂稳定性。按实施例2配制固 体底物及底物缓冲液，分装后置于室温或37℃干燥箱避光保存。每隔7天左右从37℃干燥 箱取分装固体底物试剂配制成底物工作液，在白色酶标板(Thermo,463201)中,每孔加入 10μL纳米酶材料(0.2mg/ml)或10μL去离子水(阴性对照)，再按90μL/孔加入底物工作液(n＝3)，立即采用多功能酶标仪测试微孔化学发光强度。
取室温保存及37℃保存35天的固体底物试剂，同时评价层析试纸检测中底物催化效果。 参照实施例1中制备EA-IgA单检试纸条，自滴加孔加入阳性质控血清，室温层析15min 后，滴加上述配制固体底物工作液，同时滴加商品化液体化学发光底物液(Thermo,37074) 作为对照。采用MiniChemiTM化学发光成像系统采集化学发光信号进行比较。
结果如图10所示，固体化学发光底物试剂37℃保存35天后，催化活性(阳性信号S)保持为加速试验前的90％左右，且无明显背景信号(本底背景N)；在层析检测中，信号 强度与室温保存固体底物试剂相当，且显著高于商品化液体化学发光底物试剂。因此，本 发明试剂盒中的固体底物试剂，相对于传统商品化液体发光底物，活性更高，且可常温保 存至少1年，无需冷链保存与运输，适用于本试剂盒现场快速检测应用场景。
综上所述，本发明公布了一种快速联合检测EB病毒IgA抗体的纳米酶化学发光检测技 术及试剂盒，该技术利用纳米酶催化化学发光底物放大免疫反应信号，可在16min内实现 对VCA-IgA、EA-IgA和(或)NA-IgA的联合检测，操作简单快速便携、灵敏度高于传统ELISA试剂，且成本相对较低，
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包括”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包括，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素， 而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所 固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概 念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选 实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和 范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内， 则本发明也意图包括这些改动和变型在内。
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Claims (10)
1.一种用于EB病毒抗体快速联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:EB病毒抗体标志物联合检测试剂卡、样本稀释液和固体底物试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液包括：以质量分数计，0.05％-5％封闭剂；以体积分数计，0.05％-5％表面活性剂和0.05％-0.15％防腐剂；以摩尔浓度计，0.01M-0.5M Tris缓冲液。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭剂包括牛血清白蛋白、羊血清、鱼明胶中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为NP-40、Tween和Triton X-100中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为Proclin 300和叠氮化钠中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固体底物试剂包括固体化学发光剂、固体过氧化物和底物缓冲液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述底物缓冲液包括：以体积分数计，0.05％-1％表面活性剂，0.05％-0.15％防腐剂；以摩尔浓度计，0.05M-1M NaCl和0.01M-0.5M Tris缓冲液。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括:阳性质控品及阴性质控品、一体化底物配液管、取样管和使用说明书。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述一体化底物配液管包括三个独立的腔体，一个腔体用于存放固体发光剂，另一个用于存放固体氧化物，剩余一个腔体用于存放底物缓冲液。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述EB病毒抗体标志物联合检测试剂卡包括硝酸纤维素膜和纳米酶结合垫，所述硝酸纤维素膜设有EB病毒抗原蛋白，所述EB病毒抗原蛋白包括衣壳抗原(VCA)、早期抗原(EA)及核抗原(NA)中的至少两种组合；所述纳米酶结合垫设有用于识别人IgA抗体及催化化学发光底物的纳米酶抗体探针。
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