CN104628831A - 一种鸭坦布苏病毒e蛋白线性b细胞抗原表位多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鸭坦布苏病毒E蛋白线性B细胞抗原表位多肽及其应用，该抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明筛选出DTMUV的一个B细胞线性表位，该表位与MBP融合表达后免疫小鼠，获得的多克隆抗体能够和E蛋白反应，表明出良好的免疫原性，为DTMUV多肽疫苗的研制及特异血清学诊断方法的开发奠定了基础。

Description

一种鸭坦布苏病毒E蛋白线性B细胞抗原表位多肽及其应用
技术领域
本发明涉及分子免疫学领域，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒E蛋白线性B细胞抗原表位多肽及其应用。
背景技术
2010年4月以来，我国主要的蛋鸭养殖区浙江、福建、山东、上海、江苏等地陆续暴发了一种以蛋鸭、种鸭产蛋骤然大幅下降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征的急性传染病，经济损失高达数十亿元。随着病原学研究的深入，该病被确诊是由一种新型黄病毒-鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)引起。该病具有发病急、传播速度快、发病率高等特点，病鸭主要表现为高热、食欲下降甚至废绝、产蛋数量下降直至停产、群内发病率高达100％，病死率约为5％～10％。时至今日，DTMUV仍是危害我国水禽养殖业的主要疫病。
DTMUV属于黄病毒科(Flaviviridate)黄病毒属(Flavivirus)，DTMUV基因组由5’端和3’端非编码区和一个开放阅读框组成，编码三个结构蛋白和七个非结构蛋白，三个结构蛋白分别为核衣壳蛋白(C)、膜蛋白(PrM/M)和囊膜糖蛋白(E)，其中，DTMUV E蛋白是病毒离子表面最主要的结构蛋白，由501个氨基酸残基构成，含有1个糖基化位点。根据黄病毒科成员的结构特点，推测DTMUV E位于病毒表面，在病毒感染靶细胞的受体结合、膜融合和侵入过程中起着关键的作用。DTMUV E蛋白在病毒感染早期即可诱导机体产生血凝抑制抗体、补体结合抗体、中和抗体，从而引起宿主产生保护性的免疫应答，同时E蛋白还具有神经侵袭性和神经毒性的致病性位点，为病毒进入神经细胞的必要蛋白。黄病毒E蛋白在空间上形成三个不同的结构域，即DI，DII，DIII。DI包含E1～51、E137～196和E293～311位的130个氨基酸残基、具有糖基化位点和生物活性的抗原表位；DII包含E52～136和E197～292位的181个氨基酸残基，具有中和活性和血凝活性的抗原表位；DIII包含E312～411位的100个氨基酸残基，参与受体结合过程，在黄病毒属中十分保守，而与此同时，DIII结构域是一个假定的受体结构域，是病毒与细胞受体结合的区域，其内可能含有与病毒致病性相关的抗原决定簇。
因此，有必要针对DTMUV E蛋白的DIII结构域研究，定位E蛋白DIII结构域的抗原表位，为研究基于抗原表位的新型疫苗和诊断方法奠定基础。
发明内容
本发明提供了一种鸭坦布苏病毒E蛋白线性B细胞抗原表位多肽及其应用，该抗原表位多肽为鸭坦布苏病毒E蛋白B细胞的线性表位，具有良好的免疫原性，可用于制备鸭坦布苏病毒的表位疫苗以及诊断或检测感染了鸭坦布苏病毒的动物血清的试剂。
本发明提供了一种鸭坦布苏病毒E蛋白线性B细胞抗原表位多肽，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
该抗原表位多肽为鸭坦布苏病毒E蛋白B细胞的线性表位，氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示(385LVGSGKGQI393)。该抗原表位序列在鸭、鹅坦布苏E蛋白中为保守序列。
编码所述鸭坦布苏病毒E蛋白线性B细胞抗原表位多肽的基因，
优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
为鉴定鸭坦布苏病毒(DTMUV)的B细胞抗原表位，本发明以纯化的DTMUV YY5株为抗原获得了2株单克隆抗体AE4和BD10，免疫印迹结果显示BD10为线性化表位，其结合的抗原表位位于E蛋白的第三结构域(Domain III，DIII)。将DTMUV E蛋白DIII结构域基因截短为具有末端相互重叠的15段，与MBP融合表达后以单克隆抗体BD10进行肽库扫描，结果筛选出DTMUV的一个B细胞线性表位385LVGSGKGQI393(EP385)。
本发明还提供了所述的鸭坦布苏病毒E蛋白线性B细胞抗原表位多肽在制备鸭坦布苏病毒的疫苗中应用。
本发明还提供了所述的鸭坦布苏病毒E蛋白线性B细胞抗原表位多肽在制备诊断或检测鸭坦布苏病毒试剂中的应用。
本发明还提供了一种所述的基因的重组载体、转化子或试剂盒。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明筛选出DTMUV的一个B细胞线性表位，该表位与MBP融合表达后免疫小鼠，获得的多克隆抗体能够和E蛋白反应，表明出良好的免疫原性，为DTMUV多肽疫苗的研制及特异血清学诊断方法的开发奠定了基础。
附图说明
图1为单克隆抗体的间接免疫荧光反应结果；
A：单克隆抗体AE4，B：单克隆抗体BD10，C：阳性对照，D：阴性对照。
图2为单克隆抗体的Western blot分析结果；
A：单克隆抗体BD10；B：单克隆抗体AE4；
M：预染蛋白质marker；1：MBP；2：MBP-E重组蛋白。
图3为融合蛋白的SDS-PAGE分析结果；
M：标准蛋白分子marker；1：MBP空载体对照；E1-E15：融合蛋白；94102：表位短肽。
图4为鸭坦布苏病毒E蛋白线性B细胞抗原表位的ELISA筛选。
图5为鸭坦布苏病毒E蛋白线性B细胞抗原表位的western blot筛选。
图6为鸭坦布苏病毒E蛋白线性B细胞抗原表位的鉴定结果示意图。
图7为融合的鸭坦布苏病毒E蛋白线性B细胞抗原表位的Western blot印证结果；
M：预染标准蛋白marker；1：DIII蛋白；2：MBP-EP385；3：MBP-E融合蛋白。
具体实施方式
本发明实施例中所述的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明采用的材料信息如下：质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；胶回收试剂盒、pMD18-T载体、限制性内切酶、DNAMarker购自宝生物公司；Trans10、Trans1-T1感受态购自北京全式金公司；蛋白Marker购自Fermentas公司；弗氏佐剂、PEG3350、HAT、HT购自SIGMA公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉公司；DTMUVYY5分离株、小鼠骨髓瘤细胞株(SP2/0)，融合表达载体pMBP-c为本实验室保存；BAL B/c小鼠购自浙江省医学科学院实验动物中心。
实施例1
1、单克隆抗体的制备
将DTMUVYY5分离株在DF-1细胞增殖后，采用不连续蔗糖梯度离心法提纯病毒。将纯化的病毒用β-丙内酯进行灭活，按照《抗体技术实验指南》(作者：E.哈洛，沈关心等译，科学出版社，2002年9月第一版)的方法进行BAL B/c小鼠的免疫以及细胞融合，用间接免疫荧光(IFA)和DIII-ELISA交叉筛选双阳性杂交瘤细胞株。
以纯化的DTMUV为抗原，按常规方法进行小鼠免疫和细胞融合，用间接免疫荧光(IFA)和DIII-ELISA交叉筛选到2株双阳性单克隆抗体，分别命名为AE4和BD10(图1)。免疫印迹结果显示，BD10能够特异性地识别DTMUV E蛋白，而AE4则不能(图2)。由此可以确定BD10识别DTMUV E蛋白的线性表位，而AE4识别E蛋白的构象表位。
2、融合蛋白的表达及纯化
根据E蛋白基因序列，递交生物信息学网站(http：//www.cbs.dtu.dk/services/software.php)进行B细胞表位预测，设计一套覆盖E蛋白DIII结构域(AA291-AA406)并尽可能涵盖预测表位的15个短肽，这些短肽长约16个氨基酸，相邻两个短肽末端彼此重叠6-8个氨基酸。针对每条短肽合成正负两条寡核苷酸链，相互配对，序列如表1所示，每对寡核苷酸链退火后在5’端和3’端分别形成BamHI和NheI粘性末端。将退火的DNA与经BamHI，NheI双酶切的载体pMBP-C连接过夜，转化大肠杆菌Trans10感受态，将测序正确的阳性克隆扩大培养，培养至对数生长期(OD600＝0.6)时加终浓度为100μg/ml的IPTG，30℃诱导培养3h。用Amylose亲和层析柱纯化融合蛋白，操作步骤按说明书进行，SDS-PAGE检测表达纯化情况。
将编码15个短肽和表位短肽的寡核苷酸退火后插入表达载体pMBP-c，经IPTG诱导后，各融合蛋白均得到了可溶性的表达。将表达的蛋白经MBP柱纯化后得到了纯化的融合蛋白(见图3)。
3、抗原表位的鉴定
3.1酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选
用0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)将纯化的蛋白稀释至5μg/ml，以100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜，用5％脱脂乳37℃封闭2h。封闭后用PBST(PBS含0.05％Tween-20)洗三次，加入杂交瘤培养上清液，37℃孵育1h，PBST洗3次；加入1∶5000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育1h，PBST洗3遍，加入TMB显色液避光显色10分钟，加入50μl/孔2mol/L H2SO4终止液终止反应，450nm波长测量吸收值。
表1 编码短肽寡核苷酸序列表
3.2免疫印迹试验(Western blot)鉴定
将表达纯化的蛋白经10％分离胶SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，5％脱脂乳4℃封闭过夜，PBST洗三次，浸入1∶10稀释的杂交瘤培养上清中，室温作用1h，PBST洗三次后浸入1∶5000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG抗体，室温作用1h，PBST洗涤三次后，DAB显色。
3.3抗原表位的抗原特性
由酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选和免疫印迹试验(Western blot)鉴定的结果可以看出，BD10与15段短肽中的E12和E13两个相邻蛋白呈现明显的阳性反应，而其他短肽则呈阴性。为此，针对E12，E13重叠部分(385LVGSGKGQI393)设计寡核苷酸序列EP385F(5’-gatccAtcttagtaggaagtggaaaaggacagg-3’)和EP385R(5’-ctagcctgtccttttccacttcctactaagaTg-3’)，按15段短肽链经MBP可溶性表达、纯化后，用ELISA和Western blot法进行肽库扫描。结果显示短肽E12和E13能够与BD10呈阳性反应(图4，图5)。E12和E13两个融合短肽中，重叠的氨基酸序列LVGSGKGQI(图6)，为验证该序列是否为核心表位，设计并合成了重叠部分的表位短肽，同法进行免疫扫描，结果显示，385LVGSGKGQI393为BD10识别线性表位的核心序列。按照步骤3，即融合蛋白的表达及纯化，进行抗原表位多肽的表达和纯化。
融合表达的表位短肽纯化后免疫小鼠，制备免疫血清，通过免疫印迹反应分析，结果表明，融合的表位短肽能够诱导小鼠产生针对表位的特异性抗体，印证385LVGSGKGQI393确实是B细胞的一个线性表位，且具有良好的免疫原性和反应原性(图7)。
研究抗原表位有助于了解抗原结构及抗原变异预测，为表位疫苗以及分子诊断技术研究奠定基础。常用的鉴别B细胞抗原表位的方法主要有：肽探针扫描技术(Pepscan)、噬菌体展示技术和计算机软件预测等。软件预测虽然简单快速，但准确性欠佳，预测结果只能作为确定各个蛋白潜在表位的参考，最终还需用进一步的实验结果来确认。本文以制备的单克隆抗体为研究工具，采用间接ELISA及Western blot法进行肽库扫描，结合计算机模拟分析对抗原表位进行研究，取得了较为理想的结果。
在单克隆抗体制备过程中，采用间接免疫荧光(IFA)和DIII-ELISA交叉筛选，获得AE4和BD102株双阳性的高特异性、高亲和力的单克隆抗体。Western blot鉴定结果显示，BD10能够特异性的识别DTMUV E蛋白，而AE4则不能，由此可以确定BD10识别DTMUV E蛋白的线性表位，而AE4识别E蛋白的构象表位。为了更详细地研究BD10的特异性以及对其表位进行作图，将DTMUV YY5株E蛋白DIII区截短为具有部分重叠的15段小肽，原核表达为带MBP标签的重组蛋白，用pepscan技术鉴定BD10识别的核心区域为385LVGSGKGQI393，系列对比表明，该表位序列与GenBank已公布鸭、鹅坦布苏E蛋白相应序列均保守。

Claims (8)

1.一种鸭坦布苏病毒E蛋白线性B细胞抗原表位多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述鸭坦布苏病毒E蛋白线性B细胞抗原表位多肽的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.如权利要求1所述的鸭坦布苏病毒E蛋白线性B细胞抗原表位多肽在制备鸭坦布苏病毒疫苗中的应用。
5.如权利要求1所述的鸭坦布苏病毒E蛋白线性B细胞抗原表位多肽在制备诊断或检测鸭坦布苏病毒试剂中的应用。
6.一种包含权利要求3所述的基因的重组载体。
7.一种包含权利要求3所述的基因的转化子。
8.一种包含权利要求3所述的基因的试剂盒。
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