CN104650196A - 一种用于检测鸭出血性卵巢炎病毒抗体的抗原蛋白及其应用 - Google Patents

一种用于检测鸭出血性卵巢炎病毒抗体的抗原蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测鸭出血性卵巢炎病毒抗体的抗原蛋白及其应用。该抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了所述的抗原蛋白在制备检测鸭出血性卵巢炎病毒抗体试剂盒中的应用。本发明抗原蛋白灵敏度高，特异性好，在表达过程中抗原蛋白以包涵体形式在诱导宿主菌中存在，易于分离纯化，可以进行工业化生产。应用本发明抗原蛋白制备ELISA检测试剂盒，灵敏度高、特异性好，可用于鸭出血性卵巢炎病毒血清抗体的快速检测。

Description

一种用于检测鸭出血性卵巢炎病毒抗体的抗原蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一种用于检测鸭出血性卵巢炎病毒抗体的抗原蛋白及其应用。
背景技术
鸭出血性卵巢炎是2010年在我国中南部种鸭和蛋鸭主产区突发的一种主要引起产蛋下降的新发传染病，病原为坦布苏病毒(Tembusu virus，TMUV)，属于黄病毒科黄病毒属的恩塔亚病毒群，是国际上首次发现的能致鸭发病的虫媒黄病毒。据国家水禽产业技术体系的调研数据显示，2010年，我国因该病造成的经济损失达50亿元，是当前困扰我国养鸭业的重要传染病之一。
截止目前，GenBank数据库收录了9株鸭源、1株鹅源、1株鸡源共11株鸭出血性卵巢炎病毒(DTMUV)的基因序列，病毒株名称分别为YY5株、duck/SD/CHN/2010株、BYD-1株、Fengxian株、CJD05/CHN/2010株、Huabei株、HBJL株、JS804株、muscovy/SD/ChIna2011株、FS株、JM株。11株DTMUV的多聚蛋白、NS5、E基因核苷酸序列同源性均大于98％。
在鸭出血性卵巢炎的诊断方面，当前国内学者已建立了检测病原的RT-PCR以及LAMP等检测方法，如公开号为CN102876815A的中国专利文献公开了一种快速检测鸭出血性卵巢炎病毒的RT-PCR法，可特异性、敏感性及重复性的对鸭出血性卵巢炎病毒进行检测。而目前，鸭出血性卵巢炎病毒抗体的检测只能采用病毒中和试验，该法费时费力，灵敏性差，不易于高通量检测。
因此，研制开发适用于鸭出血性卵巢炎抗体检测的特异的、敏感的、快速的检测方法，对开展鸭出血性卵巢炎流行病学调查和建立科学、灵活的疫苗免疫程序，以及对疫病的早期预警具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种用于检测鸭出血性卵巢炎病毒抗体的抗原蛋白及其应用，该抗原蛋白能够和鸭出血性卵巢炎病毒抗体特异性接合，具有很高的特异性和敏感性，且为非全病毒抗原，安全性好。
一种抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
DTMUV属于黄病毒科(Flaviviridate)黄病毒属(Flavivirus)，DTMUV基因组由5’端和3’端非编码区和一个开放阅读框组成，编码三个结构蛋白和七个非结构蛋白，三个结构蛋白分别为核衣壳蛋白(C)、膜蛋白(PrM/M)和囊膜糖蛋白(E)，其中，DTMUV E蛋白是病毒离子表面最主要的结构蛋白，由501个氨基酸残基构成，含有1个糖基化位点。
根据黄病毒科成员的结构特点，推测DTMUV E位于病毒表面，在病毒感染靶细胞的受体结合、膜融合和侵入过程中起着关键的作用。DTMUVE蛋白在病毒感染早期即可诱导机体产生血凝抑制抗体、补体结合抗体、中和抗体，从而引起宿主产生保护性的免疫应答，同时E蛋白还具有神经侵袭性和神经毒性的致病性位点，为病毒进入神经细胞的必要蛋白。
黄病毒E蛋白在空间上形成三个不同的结构域，即DI，DII，DIII。DI包含E1～51、E137～196和E293～311位的130个氨基酸残基、具有糖基化位点和生物活性的抗原表位；DII包含E52～136和E197～292位的181个氨基酸残基，具有中和活性和血凝活性的抗原表位；DIII包含E312～411位的100个氨基酸残基，参与受体结合过程。
本发明抗原蛋白包含241个氨基酸，包含两个重复的蛋白片段，该蛋白片段包含了鸭出血性卵巢炎病毒E蛋白的第三结构域，如此设计有助于提高抗原蛋白的结合抗体的灵敏度和蛋白的纯化。
本发明还提供了一种编码所述的抗原蛋白的基因。
本发明还提供了一种含有所述基因的表达盒、重组载体。所述的重组载体中，原始载体可以为pET28a。
本发明还提供了一种含有所述基因的转化子。所述的转化子中，宿主细胞可以为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明还提供了所述抗原蛋白的制备方法，包括：利用逆转录PCR扩增位于鸭出血性卵巢炎病毒囊膜蛋白(E蛋白)基因上的第三结构域(DIII)，利用引物不同，分别得到片段DIII-1和片段DIII-2，两个片段扩增区域相同(均如SEQ ID NO.1所示)，两个片段通过内切酶位点连接后与表达载体重组，转入宿主菌并进行基因表达，分离纯化获得所述的抗原蛋白。
逆转录PCR所采用RNA模板可以从感染鸭出血性卵巢炎病毒YY5株的病变BHK-21细胞中提取。
其中，扩增DIII-1所用引物如下：
5’端引物：5’-GGGCCATGGGCAATGACAACAGGTGGA-3’；
3’端引物：5’-TTTGCGGCCGCGGCGCTGGCGTTTGGA-3’；
扩增DIII-2所用引物如下：
5’端引物：5’-GGGGCGGCCGCGCAATGACAACAGGTGGA-3’；
3’端引物：5’-TTTCTCGAGGGCGCTGGCGTTTGGA-3’。
所述的表达载体可以为pET28a。
所述的宿主菌可以为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明提供了所述抗原蛋白在制备检测鸭出血性卵巢炎病毒抗体试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种含上述抗原蛋白的检测鸭出血性卵巢炎病毒抗体的试剂盒，尤其是ELISA试剂盒。
具体的，上述的鸭出血性卵巢炎病毒为鸭出血性卵巢炎病毒YY5株。
所述ELISA试剂盒一般包括抗体检测板、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、酶标二抗贮存液、底物贮存液、底物缓冲液、洗涤液以及终止液。
所述的抗原检测板为包被了上述的抗原蛋白的酶标板，包被抗原蛋白时，可采用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液作包被液，所述抗原蛋白的包被量优选为0.5～1μg/孔，更优选为0.5μg/孔。
所述的样品稀释液为含10％(v/v)成年牛血清，0.05％吐温-20(v/v)，0.01％硫柳汞钠(w/v)的0.01M磷酸盐缓冲液。
所述的阳性对照为经鸭TMUV灭活疫苗免疫健康鸭获得的高免阳性血清经稀释得到，所述阳性对照的OD450nm≥0.8。
所述的阴性对照为健康非免疫健康鸭血清经稀释得到，所述阴性对照的OD450nm≤0.2。
为配置阳性、阴性对照，可采用含0.1％BSA(v/v)、0.01％硫柳汞钠(w/v)和0.05％吐温-20(v/v)的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)分别稀释上述鸭血清。
所述的酶标二抗贮存液为酶标二抗经稀释得到。
所述的酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭IgG(H+L)结合物，所述酶标二抗最佳工作浓度为0.1-0.25μg/ml。
配置所述的酶标二抗贮存液时，可采用含0.2％BSA(v/v)，0.1％吐温-20(v/v)，0.02％硫柳汞钠，pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释所述的酶标二抗。
所述的底物贮存液为四甲基联苯胺(TMB)的二甲基亚砜(DMSO)溶液，四甲基联苯胺的质量百分比浓度为1％，所述底物贮存液的最佳工作浓度为0.16mg/ml。
所述的底物缓冲液的组成为0.2M Na2PO4液257ml，0.1M柠檬酸液243ml，0.5g过氧化氢尿素，加蒸馏水定容至1000ml。
所述的洗涤液为含0.5％吐温-20的0.1M磷酸盐缓冲液。
所述的终止液为2M硫酸溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明抗原蛋白为非全病毒抗原、安全性好，不含无关杂蛋白，只与血清中病毒抗体特异结合，不与鸭其它疫病阳性血清发生交叉反应，灵敏度和特异性较高。
(2)本发明抗原蛋白通过基因工程手段克隆表达得到，在表达过程中抗原蛋白以包涵体形式在宿主菌中存在，且含有6×His标签，易于分离纯化，可以进行工业化生产。
(3)本发明试剂盒操作简便快速，检测时样品无需预处理，样品需求量少，无需另配其它试剂，在2小时内即可完成检测。结果判定形象、准确、灵活，可高通量检测。
附图说明
图1为本发明目的基因凝胶电泳分离图谱；
图2为目标蛋白SDS-PAGE分析图谱；
M为蛋白质Marker；1为重组大肠杆菌诱导前菌体蛋白；2为重组大肠杆菌诱导4h表达产物；
图3为表达产物r2DIII蛋白的Western blot鉴定图谱；
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明作进一步的阐释和说明。
本发明实施例中所述的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1 获得目的蛋白
取感染鸭出血性卵巢炎病毒YY5株(全基因组序列GENBANK登录号：JF270480)的病变BHK-21细胞，用UNIQ-10柱式TRIzol总RNA提取试剂盒(上海生工)提取病毒RNA，具体操作参照说明书进行。以提取的病毒总RNA为模板进行逆转录，逆转录体系20μL如下：
病毒总RNA 6μL；5×M-MLV Buffer 4μL，dNTP(10mmol/L)1μL；RNase抑制剂(20U/L)0.5μL；M-MLV 1μL；E蛋白DIII基因下游引物(5’-TTTCTCGAGGGCGCTGGCGTTTGGA-3’)1μL；DEPC水补足体积至20μL。移入42℃恒温水浴箱中保温1h，然后在冰中冷却2min，即获得cDNA第一链。
以上述cDNA为模板进行PCR扩增，扩增DIII-1所用引物如下：
5’端引物：5’-GGGGCAATGACAACAGGTGGA-3’
3’端引物：5’TTTGGCGCTGGCGTTTGGA-3’
5’端引物引入Nco I酶切位点，3’端引物引入Not I酶切位点(参见加粗斜体碱基)。
扩增DIII-2所用引物如下：
5’端引物：5’-GGGGCAATGACAACAGGTGGA-3’
3’端引物：5’-TTTGGCGCTGGCGTTTGGA-3’
5’端引物引入Not I酶切位点，3’端引物引入Xho I酶切位点(参见加粗斜体碱基)。
PCR反应体系为：
10×LA PCR Buffer 5μL；dNTP(2.5mmol/L)6μL；5’端引物2μL；3’端引物2μL；cDNA 1μL；LA Taq 0.5μL；去离子水33.5μL。
PCR反应条件为：
94℃预变性5min；94℃1min，55℃1min，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min。反应结束后，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图1所示。
用PCR产物纯化试剂盒回收目的片段，利用T-A克隆方法直接将PCR产物连接于PMD18-T载体上，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，分别进行酶切鉴定和DNA序列测定，目的基因碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
片段1(DIII-1)阳性质粒和pET28a载体分别经Nco I、Not I双酶切后，回收目的片段及线性化载体片断，用T4 DNA连接酶连接，构建重组表达质粒pET28a-DIII，转化DH5α感受态细胞，提取重组质粒进行双酶切鉴定和序列鉴定。再将片段2(DIII-2)阳性质粒和pET28a-DIII质粒分别经Not I和Xho I双酶切后，回收目的片段及线性化载体片断，用T4 DNA连接酶连接，构建重组表达质粒pET28a-2DIII，转化DH5α感受态细胞，提取重组质粒进行双酶切鉴定和序列鉴定。
经鉴定正确的重组质粒转入宿主菌BL21(DE3)，挑取单克隆接种到含有50μg/ml卡那霉素LB培养基中，37℃培养过夜，按1∶100的比例将培养物接种于LB培养基中，250rpm震荡培养2小时左右，使OD600＝0.6，按1∶100的比例加入100mM IPTG诱导培养3小时，离心收集菌体。将菌体加入适量的1×上样缓冲液，采用12％的SDS-PAGE鉴定，产物r2DIII蛋白表达量可占菌体总蛋白30-40％(见图2)。
以逆转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增时，利用上述引物扩增出两段基因片段，即DIII-1和DIII-2，该两段基因片段的碱基序列是完全一致的，通过连接酶连接到同一重组质粒中，转入宿主细胞后，经大肠杆菌菌株表达获得r2DIII蛋白。
经大肠杆菌菌株BL21(DE3)表达的r2DIII蛋白以包涵体的形式存在，菌体经超声波破碎后，离心可以得到r2DIII蛋白包涵体，沉淀进一步用Ni-NTA蛋白纯化系统(QIAGEN公司)可以较快的得到r2DIII蛋白纯品，经测序，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该氨基酸序列是由包含两段相同序列的基因片段，即DIII-1和DIII-2编码获得。
实施例2 抗原蛋白特异性试验
取实施例1中纯化的r2DIII蛋白样品，经10％胶浓度SDS-PAGE电泳后，转印至硝酸纤维素膜上，5％脱脂乳4℃封闭过夜，PBST漂洗3次，浸入1∶500稀释的鸭TMUV高免鸭血清中，37℃作用1h，PBST洗三次，再将膜浸入1∶100稀释的HRP标记的羊抗鸭酶标二抗，37℃作用1h，PBST洗三次，最后用DAB显色，膜上可见一35kDa棕色条带(见图3)。
实施例3 ELISA试剂盒的制备
1、制备抗体检测板
用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液作包被液，将纯化的r2DIII蛋白稀释为5μg/ml，按100μl/孔加入96孔酶标板，4℃包被过夜，用含5％脱脂乳的PH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)37℃封闭2小时，再以含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤3次甩干，真空干燥后，装入含干燥剂的包装袋中置4℃保存。
2、制备100×浓缩酶标二抗贮存液
将KPL公司HRP标记的羊抗鸭酶标二抗利用方阵试验确定最佳工作浓度，再以含0.2％BSA，0.1％吐温-20，0.02％硫柳汞钠，pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释至200倍工作浓度，加等量甘油混匀，-20℃保存，用于鸭TMUV抗体检测试剂盒100×浓缩酶标二抗贮存液。
3、配制样品稀释液、洗涤液、终止液
样品稀释液：KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8g，成年牛血清100ml，加蒸馏水定容至1000ml，再加0.5ml吐温-20，0.01％硫柳汞钠；
洗涤液：10×浓缩洗涤液为含0.5％吐温-20的0.1M磷酸盐缓冲液(KH2PO42g，Na2HPO4·12H2O 29g，NaCl 80g，定容至1000ml，pH7.4，再加5ml吐温-20)；
终止液：2M硫酸溶液，即量取111.2ml浓硫酸稀释定容至1000ml。
4、制备阳性对照和阴性对照
将经鸭TMUV灭活疫苗免疫健康绍兴麻鸭获得的高免阳性血清，用含0.1％BSA、0.01％硫柳汞钠和0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释100倍后分装即为阳性对照(检测OD450nm≥0.8)；同样将健康非免鸭血清用含0.1％BSA、0.01％硫柳汞钠和0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释100倍后分装即为阴性对照(检测OD450nm≤0.2)。
5、配置100×浓缩底物贮存液和底物缓冲液
称取1g四甲基联苯胺(TMB)，用100ml DMSO溶解后避光保存，即得到100×浓缩底物贮存液。
0.2M Na2PO4液257ml，0.1M柠檬酸液243ml，0.5g过氧化氢尿素，加蒸馏水定容至1000ml，即得到底物缓冲液。
6、ELISA试剂盒的使用方法
1)将10×浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍即为洗涤液；
2)将待检血清用样品稀释液作1∶100稀释，按100μl/孔加入抗体检测板中，同时设空白(只加100μl样品稀释液)、阴性对照和阳性对照每孔各100μl，37℃孵育45分钟，甩干；
3)每孔加洗涤液200μl，洗涤3次，每次间隔1分钟，拍干；
4)用洗涤液将100×浓缩酶标二抗贮存液稀释100倍至工作浓度，每孔加100μl，37℃孵育45分钟，甩干；
5)每孔加洗涤液200μl，洗涤3次，每次间隔1分钟，拍干；
6)用底物缓冲液将100×浓缩底物贮存液稀释100倍至工作浓度，每孔加100μl，37℃避光孵育10分钟；
7)加50μl终止液，用酶标仪在450nm波长下读取每孔光吸收值(OD450nm值)。
7、结果判定标准
以待检样本OD450值与标准阴性OD450值比值(P/N)作为判定标准。在阳性对照孔OD450大于0.8，阴性对照孔OD450小于0.2的前提下，样品孔OD450/阴性对照孔OD450≥2.1判定为阳性，反之为阴性。如果阳性对照孔OD450小于0.8，或阴性对照孔OD450大于0.2，表明试剂盒失效或检测操作有误，需重新检测。
实施例4 鸭DTMUV抗体的检测
采用实施例3制备的ELISA试剂盒以及建立的间接ELISA方法与中和试验(NT)进行比较。
对108份来自浙江不同地区、不同年份的鸭血清样品进行检测，检测结果(见表1)显示两种方法的阳性符合率为83.6％(51/61)，阴性符合率为79.6％(39/49)，总符合率为83.3％(90/108)。
表1 血清样品的间接ELISA与NT法检测结果比较
*指在间接ELISA实验与中和实验平行检测结果相同的数值
采用实施例3制备的ELISA试剂盒以及建立的间接ELISA方法，对来自浙江省6个不同地区的1168份血清样本进行检测，各地的样品数量分别为兰溪70份，上虞316份，余杭415份，余姚221份，龙游64份，农科院临床送检样品82份。
表2 ELISA法检测鸭DTMUV抗体情况
ELISA法检测结果见表2，ELISA法检测的总阳性率为89.6％。

Claims (9)

1.一种抗原蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种编码如权利要求1所述的抗原蛋白的基因。
3.一种含有如权利要求2所述基因的表达盒、重组载体或转化子。
4.如权利要求1所述的抗原蛋白在制备检测鸭出血性卵巢炎病毒抗体试剂盒中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的鸭出血性卵巢炎病毒为鸭出血性卵巢炎病毒YY5株。
6.一种含如权利要求1所述的抗原蛋白的检测鸭出血性卵巢炎病毒抗体的试剂盒。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒为ELISA试剂盒。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：抗体检测板、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、酶标二抗贮存液、底物贮存液、底物缓冲液、洗涤液以及终止液；
其中，所述的抗原检测板为包被了所述抗原蛋白的酶标板，所述抗原蛋白的包被量为0.5～1μg/孔。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭IgG(H+L)结合物。
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CN107656066A (zh) * 2017-09-07 2018-02-02 华中农业大学 一种鸭坦布苏病毒e蛋白截短蛋白及应用

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CN104628831A (zh) * 2015-03-20 2015-05-20 浙江省农业科学院 一种鸭坦布苏病毒e蛋白线性b细胞抗原表位多肽及其应用

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