CN102639998A - 用于检测调节vft域膜蛋白二聚体的化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于选择对存在于测量介质中的细胞膜内表达的VFT域蛋白二聚体的活化状态具有调节作用的化合物的方法，所述二聚体由第一蛋白和第二蛋白组成，所述蛋白相同或不同，其中该方法包括下列步骤：(a)用FRET配偶体对的成员在所述第一蛋白和第二蛋白VFT域的N端部分标记所述第一蛋白和第二蛋白，所述配偶体对的半径(R0)在

Description

用于检测调节VFT域膜蛋白二聚体的化合物的方法
技术领域
本发明涉及调节膜受体的化合物，所述膜受体在寻找新型药物和新型味觉调节剂中以及在农业中是有用的。
背景技术
G-蛋白偶联受体(GPCRs)代表了3.4％的基因组，因此构成了哺乳动物膜受体的最大家族。GPCRs的分离和随后的克隆使鉴别人中的大约900个基因成为可能，这900个基因中的约500个对应于嗅觉受体和味觉受体，约400个对应于能结合内源配体的受体。因此，这些受体的异质性(heterogeneity)提供了对外部信号(气味、光线、味觉分子)和内部信号(激素和神经递质)非常广泛的识别。所述GPCRs主要有三类：
A类，以视紫红质为原型，是最具广泛代表性的类别。这些受体的配体结合位点主要涉及GPCRs的跨膜域和胞外环。
B类GPCR以包含涉及二硫桥的保守半胱氨酸的宽广的胞外N端域(100-500个氨基酸之间)为特征。这些受体的配体专一地结合至所述胞外域(N端域和GPCR胞外环)。
C类受体以类似于细菌周质蛋白的非常大的胞外域(约600个氨基酸)为特征，该胞外域涉及氨基酸、糖和离子的运输，被称作VFT(捕蝇草(Venus FlyTrap)的首字母缩略词)域。它们包括促代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptor)(mGluR1、mGluR2、mGluR3、mGluR4、mGluR5、mGluR6、mGluR7和mGluR8受体)、γ-氨基丁酸或GABA受体(GABAB受体)、甜味受体和鲜味受体、胞外钙敏感受体(CaSR)以及碱性氨基酸受体(GPRC6a)。动物界中存在包含VFT域的其它C类GPCRs、尤其是V2R信息素受体。
普遍认可所有包含VFT域的C类GPCRs都是二聚体，即它们由两个亚基组成，并且这两个亚基的结合对于该受体的功能是必不可少的。一些为同型二聚体，由两个相同的亚基组成(mGluR、CaSR和GPRC6A受体)，其它则为异源二聚体，由不同基因表达而得的亚基组成(具有GB1和GB2两个亚基的GABAB受体、具有TAS1R2和TAS1R3的甜味受体、具有TAS1R1和TAS1R3的鲜味受体)。
就包含VFT域的C类GPCRs而言，各亚基在其N端部分具有宽广的胞外域，该胞外域负责正位(orthosteric)配体的结合，被称作“VenusFlytrap”域或VFT域。该VFT域为存在于C类GPCRs以及一些其它受体(尤其是促离子型谷氨酸受体(通常被称作AMPA、NMDA或红藻氨酸盐受体)、心房利钠肽受体(atrial natriuretic peptide receptor)家族的受体(NPR-A和NPR-B)和存在于昆虫中的Venus-激酶受体(VKR))中的保守蛋白域。
这些受体的VFT域都具有蛤壳(clam shell)式的特征性结构，该结构具有布置在铰链周围的两个片状物，形成正位配体结合的裂隙(crevice)。该铰链的柔韧性使这两个片状物能够闭合以应答活化配体的结合。通过正位配体使VFT域闭合是受体活化所必需的第一步骤。反之，拮抗剂配体使VFT域保持在开放位置，使受体处于失活状态。
正如通过在mGluR1受体的VFT域二聚体上得到的X射线晶体学结构所说明的，在二聚体受体内，两个亚基的VFT域组成VFT域二聚体(Kunishima等，Nature，2000年10月26日，407(6807)：971-7；Tsuchiya等，Proc Natl Acad Sci USA，2002年3月5日，99(5)：2660-5)。包含VFT域的C类GPCRs活化的模型表明活化配体的结合不但使得至少一个VFT闭合，而且使得一个VFT相对于另一个VFT的取向发生变化。这种相对移动导致VFTs的两个C末端彼此更加靠近，这种现象自身显然就是G蛋白募集和信号转导所必需的膜域构象变化的原因。
包含VFT域的C类GPCRs在寻找新的药物中是非常重要的靶标。mGluR受体牵涉到尤其是帕金森病、精神分裂症、疼痛；GABAB受体在癫痫和毒品依赖现象中起作用；CaSR受体牵涉到骨质疏松症。这些受体对于寻找新的甜味分子(甜味受体)或新的味道增强剂(鲜味受体)也是有用的。最后，对V2R信息素受体调节剂的寻找在农业领域中也是有用的。
存在能够追踪配体的结合和/或配体结合后GPCR的活化的筛选技术：GTP-γS(放射性的)、电生理学、放射性配体的使用。这些筛选方法不能大规模使用。
高通量筛选平台通常使用哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞已被稳定转染或瞬时转染，以表达感兴趣的受体。测试化合物的作用是通过功能性试验鉴定的，所述试验基于偶联至所述受体的G-蛋白活化后出现在细胞中的第二信使的胞内浓度变化的检测。所测量的第二信使取决于偶联至感兴趣的受体的G-蛋白类型：
-Gs-蛋白偶联受体：测量第二信使cAMP的累积以表征对偶联至Gs蛋白的GPCR的药理作用。
-Gq-蛋白偶联受体(谷氨酸受体mGluR1和mGluR5、胞外钙受体CaSR以及碱性氨基酸受体GPRC6A属于这种情况)：IP3代谢产物(例如IP1)的累积。可选地，通过将荧光钙探针加载至细胞，有可能看到胞内钙浓度的瞬时增加。
-Gi-蛋白偶联受体(实例：谷氨酸受体mGluR2、mGluR3、mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8，GABA受体GABAB及甜味受体和鲜味受体)：间接地，用毛喉素或异丙基肾上腺素刺激该受体，使cAMP浓度增加。测试化合物对这种增加的抑制代表了该受体与Gi蛋白的偶联。筛选通常优选的另一种可能性为使感兴趣的受体和嵌合G蛋白共表达，所述嵌合G蛋白由Gi蛋白的部分和Gq蛋白的部分融合产生，所述Gi蛋白的部分在活化状态时能够识别GPCR，所述Gq蛋白的部分能够触发IP3/Ca2+通路。在这些条件下，可通过瞬时钙信号的出现检测所述受体的活化。
现有技术不适于显示能够调节二聚体型的C类GPCRs的活化的化合物：当受体与它们的天然配体亲和力很弱(mGlu受体就是这样的情况)时，激动剂作用很难被检测到；对基于细胞内信号转导产生的第二信使的测量的功能试验而言，从这些试验相对难以实施以及偶联至二聚体受体的作用因子通路的复杂性的观点来看，所述功能试验也不适合。由于胞内区室中存在的二聚体产生的高背景噪声，基于胞内(C端)域融合有荧光蛋白的GPCRs的表达的FRET(
Figure BDA0000127409310000041
共振能量转移)技术也不适合。
美国专利US 6 824 990概括描述了研究GPCRs的二聚化作用的方法，该方法基于用能量供体和受体化合物(尤其是荧光蛋白)对能够形成二聚体的GPCRs进行标记以及对FRET变化进行测量。该专利没有描述使得能够选择调节C类GPCR二聚体的化合物的技术方案。此外，所述方法基本上是通过使用荧光蛋白来说明的，由于存在于各种胞内区室中的二聚体产生的高背景噪声，这些荧光蛋白并不适合于本情况。
Maurel等(Nat.Methods，2008年6月，5(6)：561-7)在GABA受体二聚体的研究中采用了FRET技术：他们用铕穴状化合物(铕吡啶-双-联吡啶)和受体荧光团(d2)标记了GABAB受体的各GABAB1和GABAB2亚基。当受体被它的激动剂GABA活化时，这些研究没有观察到FRET信号的任何变化，表明该方法并不适合研究这些二聚体。
本发明意在提供用于显示对含有VFT域的膜蛋白(尤其是C类GPCRs)二聚体的活化状态具有调节作用的化合物的方法和产品，这使确定测试化合物对这些受体是否具有药理学作用成为可能。
由于目前还没有能够有效并容易地筛选该类型的二聚体受体以发现新药物的技术，本发明具有特别的重要性。
附图说明
图1表示mGluR2-mGluR2二聚体发出的FRET信号的变化，该FRET信号的变化作为谷氨酸浓度的函数。
图2表示存在或不存在谷氨酸时，mGluR2-mGluR2二聚体发出的FRET信号的变化，该FRET信号的变化作为LY341495拮抗剂浓度的函数。
图3表示mGluR2-mGluR2二聚体发出的FRET信号的变化，该FRET信号的变化作为谷氨酸或DCG-IV(部分激动剂)浓度的函数。
图4表示存在或不存在4-MPPTS(阳性别构调节剂(positive allostericmodulator))时，mGluR2-mGluR2二聚体发出的FRET信号的变化，该FRET信号的变化作为谷氨酸浓度的函数。
图5表示mGluR2-mGluR2二聚体(各亚基上均标记了Snap-标签)发出的FRET信号的变化，该FRET信号的变化作为谷氨酸或DCG-IV浓度的函数。
图6表示mGluR2-mGluR2、mGluR3-mGluR3和mGluR4-mGluR4二聚体发出的FRET信号的变化，该FRET信号的变化作为谷氨酸浓度的函数。
图7表示mGluR3-mGluR3二聚体发出的FRET信号的变化，该FRET信号的变化作为LY341495浓度的函数。
图8表示mGluR2-mGluR2、mGluR3-mGluR3、mGluR4-mGluR4、mGluR2-mGluR3和mGluR2-mGluR4二聚体发出的FRET信号的变化，该FRET信号的变化作为谷氨酸浓度的函数。
图9表示存在谷氨酸或存在LY341495时或这些化合物均不存在时，mGluR1-mGluR1、mGluR2-mGluR2、mGluR3-mGluR3和mGluR8-mGluR8二聚体发出的FRET比例的变化。
图10表示存在谷氨酸或存在LY341495时或这些化合物均不存在时，mGluR1-mGluR1、mGluR2-mGluR2、mGluR3-mGluR3、mGluR4-mGluR4、mGluR5-mGluR5和mGluR8-mGluR8二聚体发出的FRET比例的变化。
图11表示存在谷氨酸或存在LY341495时或这些化合物均不存在时，mGluR8-mGluR8二聚体发出的FRET比例的变化，该FRET比例的变化作为时窗(time window)的函数。
图12表示存在谷氨酸或存在LY341495时或这些化合物均不存在时，mGluR8-mGluR8和mGluR2-mGluR2二聚体发出的FRET比例的变化，该FRET比例的变化作为时窗的函数。
图13A表示mGluR2的二聚体，各亚基缀合至Snap-标签酶(S)，并含有阻止它们与G蛋白偶联的突变F756P。
图13B表示mGluR2的二聚体，各亚基缀合至Snap-标签酶(S)，并含有阻止它们与G蛋白偶联的突变F756P以及致使这些蛋白对别构调节剂不敏感的突变C234A。
图13C表示mGluR2的二聚体，各亚基从597位氨基酸(第一个胞内环i1的中部)截短，融合至Snap-标签酶(S)，并因此仅包含一个跨膜域以及CRD域和VFT域。
图13D表示mGluR2的二聚体，各亚基在561位氨基酸之后截短(因此仅包含VFT域和CRD域)，融合至Snap-标签酶(S)，GPI锚定信号肽(RRSSSTVLFSSPVILLISFLIFLIVG-SEQ ID No.7)已在富含半胱氨酸域后(CRD，即氨基酸LPQEY后)被插入到各亚基中。
图13E表示mGluR2的二聚体，各亚基从499位氨基酸截短(因此仅包含VFT域)，融合至Snap-标签酶(S)，GPI锚定信号肽(RRSSSTVLFSSPVILLISFLIFLIVG-SEQ ID No.7)已在VFT域后(即，氨基酸GPLPAS后)被插入到各亚基中。
图13F表示嵌合受体的二聚体，各亚基包含(i)融合至Snap-标签蛋白(S)的mGluR2起始的561个氨基酸(VFT+CRD域，结束于氨基酸LPQEY之后)；和(ii)D2多巴胺能受体的短变体起始的414个氨基酸(无甲硫氨酸1)，这414个氨基酸对应于该受体的跨膜域。
图14表示作为时间函数的FRET信号的变化。
发明内容
本发明涉及用于选择对存在于测量介质中的细胞膜内表达的VFT域蛋白的二聚体的活化状态具有调节作用的化合物的方法，所述二聚体由第一蛋白和第二蛋白组成，所述蛋白相同或不同，其中该方法包括下列步骤：
(a)用FRET配偶体对(a pair of FRET partners)的成员在所述第一蛋白和第二蛋白VFT域的N端部分标记所述第一蛋白和第二蛋白；
(b)在不存在及存在测试化合物的情况下，激发所述FRET配偶体并测量FRET信号；
(c)在不存在及存在测试化合物的情况下，如果在步骤(b)中测量到FRET信号的差别，选择该测试化合物作为调节化合物。
令人惊讶地，本发明人等已经证明了现有技术中Maurel等人所观察到的在VFT域蛋白二聚体的活性调节剂存在时FRET信号变化的缺失与测量信号时的时窗选择是有关联的。常规地，FRET信号是在测量介质的光激发后经过一段时间的延迟(delay)、以预定的时间段(积分时间(integration time))测量的。设计了可用于完成基于测量FRET信号的生物学分析的产品和仪器，以避免使用者改变该信号测量时窗。
就VFT域蛋白二聚体的情况而言，本发明人等已经发现，当在参比激动剂化合物存在或不存在的情况下，测量FRET信号随时间减弱时，观察到了反转点(inversion point)，该反转点对应于存在及不存在该参比激动剂化合物时，激发后的FRET值相同的时间。
本发明人等已经确定，在该反转点以前，无参比激动剂化合物时的FRET信号(图14中的灰色曲线)比存在激动剂时测量的FRET信号(图14中的黑色曲线)高。与之相反，在该反转点之后，无激动剂时观察到的FRET信号变为比存在激动剂时测量的FRET信号低。
此外，如果该信号是在包含所述反转点的特定时窗内(例如f1，参照图14)测量的，存在或不存在调节化合物时观察不到FRET信号的变化。换句话说，本发明人等已经确定出用于解释现有技术中观察到的FRET信号变化缺失的问题所在，即在过去使用的时窗中存在反转点。
从该发现得出，当在位于该反转点之前或之后的时窗内测量FRET信号时(f2、f4，参照图14)，存在及不存在参比激动剂化合物时测量的FRET信号总是不同的。有可能选择包含所述反转点的时窗(f3，参照图14)，但在这种情况下，必需确保存在及不存在参比激动剂或拮抗剂化合物时测量到的信号是不同的。
因此，本发明由用于选择对存在于测量介质中的细胞膜内表达的VFT域蛋白二聚体的活化状态具有调节作用的化合物的方法组成，所述二聚体由第一蛋白和第二蛋白组成，所述蛋白相同或不同，其中该方法包括下列步骤：
(a)用FRET配偶体对的成员在所述第一蛋白和第二蛋白VFT域的N端部分标记所述第一蛋白和第二蛋白；
(b)在不存在及存在测试化合物的情况下，激发所述FRET配偶体并测量FRET信号；
(c)在不存在及存在测试化合物的情况下，如果在步骤(b)中测量到FRET信号的差别，选择该测试化合物作为调节化合物；
在步骤(b)中，所述FRET信号是在这样的时窗中测量的：在该时窗内，存在及不存在参比激动剂或拮抗剂化合物时测量到的信号是不同的。
认为如果符合下列情况之一，存在及不存在参比激动剂或拮抗剂化合物时测量到的信号是不同的：
-如果存在及不存在参比激动剂化合物时的信号的平均值之间相差大于20％，或
-如果存在及不存在激动剂化合物时的信号的平均值的差异大于最高标准偏差(无参比激动剂时，测量到的信号的标准偏差；或者存在该化合物时，测量到的信号的标准偏差)的3倍。可通过改变激发后、测量信号前的延迟和测量该信号的时间段(积分时间)实验性地确定所述时窗。用可商购的荧光计可容易地修改这些参数。
在一个特定的实施方式中，本发明所述方法的特征在于步骤(b)中所测量的信号是以激发后180-800μs的延迟及从200μs到2000μs的积分时间测量的。
在另一个特定的实施方式中，本发明所述方法的特征在于：
(i)所述FRET配偶体对的
Figure BDA0000127409310000081
半径(R0)在20-55
Figure BDA0000127409310000082
之间，步骤(b)中测量的信号是以激发后20-100μs的延迟及从100μs到500μs的积分时间测量的；或者
(ii)所述配偶体对的半径(R0)大于55
Figure BDA0000127409310000084
步骤(b)中测量的信号是以激发后180-800μs的延迟及从200μs到2000μs的积分时间测量的。
本发明的方法相对简单地使以下成为可能：筛选化合物的大文库以评价它们对包含VFT域的膜蛋白、尤其是包含VFT域的C类GPCRs(所述C类GPCRs代表了尤其是用于发现新药物的选择靶标)的作用。
因此，可实施本发明所述的方法以用于发现以下受体的新型调节剂：促代谢型谷氨酸受体(由选自以下亚基的二聚体组成：mGluR1、mGluR2、mGluR3、mGluR4、mGluR5、mGluR6、mGluR7和mGluR8)、γ-氨基丁酸或GABA受体(由一个GB 1亚基和一个GB2亚基组成的GABAB受体)、与甜味知觉相关的受体(TAS1R1-TAS1R3二聚体)或与鲜味知觉相关的受体(TAS 1R2-TAS 1R3二聚体)、胞外钙敏感受体(CaSR亚基的同型二聚体)和碱性氨基酸受体(GPRC6a亚基的同型二聚体)。这些术语包括这些受体的野生型形式以及如下文所述的突变形式、截短形式、嵌合形式或修饰形式。
优选地，利用促代谢型谷氨酸受体或味觉受体实施本发明所述的方法。
当本发明所述的方法在谷氨酸受体上实施时，所述谷氨酸受体可由以下二聚体组成：mGluR1-mGluR1、mGluR1-mGluR2、mGluR1-mGluR3、mGluR1-mGluR4、mGluR1-mGluR5、mGluR1-mGluR6、mGluR1-mGluR7、mGluR2-mGluR2、mGluR2-mGluR3、mGluR2-mGluR4、mGluR2-mGluR5、mGluR2-mGluR6、mGluR2-mGluR7、mGluR3-mGluR3、mGluR3-mGluR4、mGluR3-mGluR5、mGluR3-mGluR6、mGluR3-mGluR7、mGluR4-mGluR4、mGluR4-mGluR5、mGluR4-mGluR6、mGluR4-mGluR7、mGluR5-mGluR5、mGluR5-mGluR6、mGluR5-mGluR7、mGluR6-mGluR6、mGluR6-mGluR7、mGluR7-mGluR7、mGluR8-mGluR1、mGluR8-mGluR2、mGluR8-mGluR3、mGluR8-mGluR4、mGluR8-mGluR5、mGluR8-mGluR6、mGluR8-mGluR7、mGluR8-mGluR8。在一个特别优选的实施方式中，所述二聚体选自：mGluR1同型二聚体、mGluR2同型二聚体、mGluR3同型二聚体、mGluR4同型二聚体、mGluR5同型二聚体、mGluR8同型二聚体、mGluR2-mGluR3异源二聚体和mGluR2-mGluR4异源二聚体。
至于味觉受体，所述的二聚体可选自以下二聚体：TAS1R2-TAS1R3或TAS1R1-TAS1R3。
可用对应于截短的GPCRs、例如在第一个胞内环截短并因此仅包含一个跨膜域的蛋白的蛋白二聚体实施本发明所述的方法(图13C)。在满足如下附带条件时，也可使用不包含跨膜域的VFT域蛋白的剪接变体(Ferraguti等，Cell Tissue Res.，2006年11月，326(2)：483-504)：该变体构成所研究的二聚体的其中一个亚基，另一个亚基包含至少一个跨膜域。
也可用包含VFT域受体的胞外域和其它受体的一个或多个跨膜域的嵌合受体实施本发明所述的方法(参见图13F)。可通过常规的分子生物学技术生产该嵌合受体，所述技术由以下工序组成：生产包含编码所研究的域的DNA的表达载体(所述DNA的核酸序列例如在Genbank数据库中可得到)；并将这些载体转染到细胞中。Malitschek等(MolPharmacol.，1999年8月，56(2)：448-54)已经描述了这样的嵌合受体。
也可用包含VFT域受体的胞外域和替代跨膜域的糖基磷脂酰肌醇锚定子(“GPI锚定子”)(使得将蛋白部分锚定至质膜表面成为可能)的蛋白构建体来实施本发明所述的方法(参见图13D和图13E)。Liu等具体描述了这类蛋白及其生产(J Biol Chem.，2004年4月16日，279(16)：15824-30)。在本发明的另一个特定实施方式中，所使用的二聚体是没有偶联至任何胞内信号通路的突变的GPCRs。这些突变的GPCRs是已知的，包括例如含有一个或多个阻止与G蛋白偶联的突变的GPCRs(如mGluR2的F756P突变体)(参见图13A)。当所述二聚体由细胞稳定表达，从而能够对细胞产生毒性作用时，优选该实施方式。
使用由含有使其对别构调节剂的作用不敏感的突变的GPCRs(如mGluR2的C234A突变体)组成的二聚体(图13B)也是有利的。利用这类突变体来实施本发明使得能够发现不是别构调节剂的调节化合物。
最后，也可用并不是C类GPCRs的其它VFT域受体实施本发明所述的方法，尤其是促离子型谷氨酸受体(通常称作AMPA、NMDA或红藻氨酸盐受体)、心房利钠肽受体家族的受体(NPR-A和NPR-B)及存在于昆虫中的Venus-激酶受体(VKR)。
定义：
“FRET配偶体对”：该表述表示由能量供体荧光化合物(下文为“供体荧光化合物”)和能量受体化合物(下文为“受体化合物”)组成的配偶体对；当它们相距很近并且当它们在供体荧光化合物的激发波长下被激发时，这些化合物发出FRET信号。已知为了使两个荧光化合物成为FRET配偶体，供体荧光化合物的发射光谱必须与受体化合物的激发光谱部分重叠。
“FRET信号”：表示代表供体荧光化合物和受体化合物之间的FRET的任意可测的信号。因此，FRET信号可以是供体荧光化合物或受体化合物(当受体化合物是荧光化合物时)的发光强度或发光寿命的变化。
“时窗”：表示从测量介质的光激发的延迟之后测量FRET信号时开始并到积分时间的结尾结束的时间段。例如，“50-450μs”的时窗则意味着FRET信号是在测量介质的光激发后延迟50μs测量，并持续400μs(积分时间)。
“测量介质”：表示适于将细胞或细胞膜与实施本发明所必需的试剂混合的板的孔、试管或任意其它容器的内含物。
“调节化合物”：表述“对VFT域蛋白二聚体的活化状态具有调节作用的化合物”旨在表示具有活化或去活化作用的化合物。
活化化合物可具体为激动剂化合物、部分激动剂或阳性别构调节剂。所述阳性别构调节剂化合物的作用仅在已被它们的参比激动剂之一活化的二聚体上可观察到：在这种情况下，所述阳性别构调节剂将引起受体的活化增强。无参比激动剂时，所述阳性别构调节剂的作用是观察不到的。
所述去活化化合物降低所述二聚体的活性，在去活化化合物对组成性活性二聚体具有去活化作用的情况下，所述去活化化合物为反向激动剂；或者，当去活化化合物导致此前由其参比激动剂之一活化的二聚体去活化时，所述去活化化合物为阴性别构调节剂或拮抗剂。
将所述调节化合物添加到测量介质中，并根据本发明的方法观察它们对活化状态的作用。对这些调节化合物的化学性质和它们的作用模式都没有限制：本发明事实上使得检测VFT域的构象变化成为可能，这些变化由调节化合物结合至所述二聚体的两个组成亚基或两个组成亚基之一、以及结合至其它膜蛋白引起，所述其它膜蛋白自身会在感兴趣的VFT域二聚体上发挥作用。
具体实施方式
根据一个特定的实施方式，本发明所述的方法包括以下步骤：
(a)用FRET配偶体对在第一蛋白和第二蛋白VFT域的N端部分标记所述第一蛋白和第二蛋白，所述配偶体对的
Figure BDA0000127409310000121
半径(R0)在20-55之间；
(b)在不存在及存在测试化合物的情况下测量FRET信号；
(c)通过对存在或不存在所述测试化合物时FRET信号的变化和存在或不存在所述二聚体的已知调节化合物时测量的FRET信号的变化进行比较，选择作为调节化合物的测试化合物。
在该特定实施方式中，有利地，在步骤(b)中以激发后50μs的延迟和450μs的积分时间测量所述FRET信号。
依赖于所述二聚体的已知调节剂的性质及存在或不存在测试化合物时测量的FRET信号的变化(相比于存在或不存在所述已知调节化合物时观察的FRET信号的变化)，确定测试化合物的性质。
因此，如果所述二聚体的已知调节剂是激动剂，如果在存在及不存在所述测试化合物时测量的FRET信号变化与存在及不存在已知激动剂化合物时观察到的变化处于相同方向，那么测试化合物将为活化化合物；如果所述FRET信号的变化与存在及不存在所述已知激动剂化合物时观察到的变化处于相反方向，那么测试化合物将为去活化化合物。
同样地，如果所述二聚体的调节剂是该二聚体的已知拮抗剂，如果在存在及不存在所述测试化合物时测量的FRET信号变化与存在及不存在所述已知拮抗剂化合物时观察到的变化处于相反方向，那么测试化合物将为活化化合物；如果所述FRET信号的变化与存在及不存在所述已知拮抗剂化合物时观察到的变化处于相同方向，那么测试化合物将为去活化化合物。
实际上，测试化合物的剂量-应答曲线可与那些由已知激动剂或拮抗剂化合物得到的曲线相比较。
应当注意到，在某些情况下，可在存在一定量的参比激动剂化合物的情况下完成有或无测试化合物的FRET信号的测量。当寻找阳性或阴性别构调节剂或拮抗剂时，尤其如此。当寻找激动剂或部分激动剂化合物时，这当然不是必需的。
在本发明所述方法的实施方式中利用的是促代谢型谷氨酸受体(mGluR)的二聚体的特定情况下，并且当以激发后50μs的延迟与450μs的积分时间测量信号时，本发明人等已经发现：
-相对于作为所研究的mGluR二聚体激动剂的化合物不存在时观察到的，将该化合物添加至测量介质使得发出的FRET信号减弱；就部分激动剂(即该激动剂的作用并没有“天然的”激动剂那么强)而言，这种减弱的强度较小；
-相对于作为所研究的mGluR二聚体拮抗剂的化合物不存在时观察到的，将该化合物添加至测量介质使得发出的FRET信号增强。这种作用可在组成性活性二聚体上、或在由激动剂化合物活化的二聚体上观察到；
-相对于具有阳性别构作用的调节剂不存在时观察到的，将该调节剂添加至测量介质使得发出的FRET信号减弱。这种作用仅在测量介质中存在激动剂(如所研究的受体的天然激动剂)时可观察到。
-相对于具有阴性别构作用的调节剂不存在时观察到的，将该调节剂添加至测量介质使得发出的FRET信号增强。这种作用仅在测量介质中存在激动剂(如所研究的受体的天然激动剂)时可观察到。
相反地，当以更长的延迟(例如激发后500μs的延迟)和500μs的积分时间测量信号时，本发明人等已经发现在将作为mGluR二聚体激动剂的化合物添加至测量介质之后所测量到的信号要强于不存在该化合物时所测量到的信号。
非常值得注意的是，本发明所述的方法也使显示具有反式调节作用的化合物成为可能，该化合物是没有结合至VFT域蛋白的二聚体而是结合至另外的膜受体的化合物，该膜受体自身可与所研究的二聚体相互作用：例如，mGluR2受体可由5HT2A 5-羟色胺受体调节(Gonzàlez-Maeso等，Nature，452卷，2008年3月，93-99)，而本发明所述的方法使显示mGluR2二聚体的这类调节成为可能。
因此，本发明所述的方法使显示并未结合至所研究的二聚体、而是结合至另外的膜蛋白的化合物(该膜蛋白对所述受体发挥调节(活化或抑制)作用)成为可能。因此，使显示对所述受体具有间接活化或去活化作用的化合物成为可能。
包含VFT域蛋白二聚体的细胞膜
本发明所述的方法是在含有包含VFT域蛋白二聚体的细胞膜的测量介质中实施的。因此，在添加FRET配偶体化合物时，该测量介质包含活的完整细胞(贴壁的或悬浮的细胞)或悬浮的细胞膜制备物(例如通过细胞裂解及分级离心(fractional centrifugation)得到的细胞膜制备物)。制备膜悬浮剂的技术对本领域技术人员来说是已知的。本发明所述的方法优选在活的完整细胞上实施。
含有VFT域的跨膜蛋白的二聚体由细胞天然地在细胞膜中表达；或利用常规分子生物学技术，通过稳定地或瞬时地导入细胞中的表达载体表达。用于在细胞中稳定地或瞬时地产生异源DNA的试剂是可商购的，编码包含VFT域的跨膜蛋白的DNA序列、尤其是编码上述引用的C类GPCRs的DNA序列在数据库(如Genbank)中可得到。如上所述，当通过细胞稳定表达所述二聚体时，最好使用不偶联至任何G蛋白的突变GPCRs，以避免可能对细胞产生的毒性作用。
FRET配偶体对
本发明的基本特征之一是所研究的二聚体的各组成蛋白都被FRET配偶体对的成员标记。
在本发明所述方法的一个优选实施方式中，所述FRET配偶体对的
Figure BDA0000127409310000141
半径(R0)在20-55
Figure BDA0000127409310000142
之间。在另一个优选的实施方式中，该半径大于55
Figure BDA0000127409310000143
本领域技术人员能从可商购的FRET配偶体化合物中选择出
Figure BDA0000127409310000144
半径包含于该范围的FRET配偶体化合物。事实上，
Figure BDA0000127409310000145
理论教导了怎么确定给定的FRET配偶体对的R0值。
根据这一理论，FRET被定义为由能量供体和能量受体之间的偶极-偶极相互作用引起的非辐射能量的转移。这一物理现象需要这些分子之间的能量协调(energy compatibility)。这意味着供体的发射光谱必须至少部分地与受体的吸收光谱重叠。通过重叠积分J(λ)定义所述光谱的这种重叠：
J(λ)＝∫fD(λ)εA(λ)λ4dλ
其中fD是给定波长下供体发出的荧光强度，εA是受体的摩尔消光系数。因此，因子J反映了一对荧光团在相同波长下发出和吸收能量的能力。
根据
Figure BDA0000127409310000151
理论，如下式所示，FRET是依赖于分开两个分子(供体和受体)的距离的方法：
E = 1 1 + ( R / R 0 ) 6
其中R是分开这两个分子的有效距离，R0是半径。R0对应于能量传递效率为50％的供体/受体距离。用于计算这一距离的数学式为：
R0＝(10-3κ2n-4QDJ)1/6×9730
其中J为重叠积分，n为介质的折射率(n-4通常在1/3-1/5之间)，QD为无受体时供体的量子产额，κ2为取决于供体和受体的偶极相对取向的取向因子。虽然理论上κ2的值在0-4之间，通常用于确定R0的值是2/3。实际上，当供体和受体具有足以在空间中随机取向的自由度时，认为κ2为2/3。因为连接至生物分子的荧光团能够具有一定的旋转自由度，所述荧光团通常满足这种情况。
Maurel等详述了计算铕吡啶-双-联吡啶穴状化合物和d2(由CisbioBioassays公司销售的荧光团)配偶体对的R0的实例(Nature methods，2008年，增补的附图及正文)。在这一实例中，R0为65.5
Figure BDA0000127409310000154
许多能量供体或受体化合物已被记载并且是可商购的。
所述荧光化合物可选自下面的组：别藻蓝蛋白(allophycocyanins)，尤其是已知的商品名为XL665的别藻蓝蛋白；发光有机分子，例如罗丹明(rhodamines)、花青苷(cyanins)、方酸菁(squaraines)、香豆素(coumarins)、原黄素(proflavins)、吖啶(acridines)、荧光素(fluoresceins)、已知名为Bodipy的荧光团、已知名为Atto的荧光团、已知名为Dy的荧光团、已知名为AlexaFluor的化合物、硝基苯并噁二唑、荧光金属配合物(如稀土穴状化合物和稀土螯合物(尤其是铕、铽、钐、镝或钕的螯合物和穴状化合物))；发光无机颗粒，如纳米晶体(量子点)。在FRET体系中，这些荧光化合物既可用作供体荧光化合物，也可用作受体荧光化合物。
使用荧光蛋白作为受体化合物是可能的。另一方面，不推荐使用这些蛋白作为供体，因为这些蛋白可能引起来自多种细胞区室的背景噪声显著增强，这些蛋白在靶向至质膜前在这些细胞区室中表达。
根据本发明，可使用以下荧光蛋白：青色荧光蛋白(cyan fluorescentproteins)(AmCyan1、Midori-Ishi Cyan、mTFP1)、绿色荧光蛋白(greenfluorescent proteins)(EGFP、AcGFP、TurboGFP、Emerald、Azami Green、ZsGreen)、黄色荧光蛋白(yellow fluorescent proteins)(EYFP、Topaz、Venus、mCitrine、YPet、PHiYFP、ZsYellow1、mBanana)、橙色和红色荧光蛋白(orange and red fluorescent proteins)(Orange kusibari、mOrange、tdtomato、DsRed、DsRed2、DsRes-Express、DsRed-Monomer、mTangerine、AsRed2、mRFP1、JRed、mCherry、mStrawberry、HcRed1、mRaspberry、HcRed-Tandem、mPlim、AQ143)以及在远红外范围发荧光的蛋白(mKate、mKate2、tdKatushka2)。
具有长寿命(＞0.1ms，优选在0.5-6ms之间)的能量供体化合物、尤其是稀土螯合物或穴状化合物是有利的，因为它们使得能够实现时间分辨的测量，即在消除由测量介质发出的大部分背景噪声时测量TR-FRET信号。因此，通常优选上述供体化合物来实施本发明所述的方法。尤其是铕螯合物或穴状化合物、或铽螯合物或穴状化合物特别适合作为FRET配偶体对的能量供体成员。
镝(Dy3+)、钐(Sm3+)、钕(Nd3+)、镱(Yb3+)或铒(Er3+)配合物是适合于本发明目的的稀土配合物，特别优选铕(Eu3+)配合物和铽(Tb3+)配合物。
已经记载了大量的稀土配合物，数种配合物目前已被商业开发，尤其是由PerkinElmer、Invitrogen和Cisbio Bioassays公司商业开发。
适合于本发明目的的稀土螯合物或穴状化合物的实例为：
·包含一个或多个吡啶单元的稀土穴状化合物。这类稀土穴状化合物例如已记载于专利EP 0 180 492、EP 0 321 353、EP 0 601 113和国际申请WO 01/96877中。铽(Tb3+)穴状化合物和铕(Eu3+)穴状化合物特别适合于本发明的目的。稀土穴状化合物由Cisbio Bioassays公司销售。铕穴状化合物的非限制性实例可包括具有下式的铕穴状化合物(该穴状化合物可通过反应基团被偶联至待标记的化合物，在该情况下反应基团例如为NHS基团)：
Figure BDA0000127409310000171
Figure BDA0000127409310000181
K-Py-BiPy-四酸-Eu
K-TrisBiPy-五酸-Eu
由于Py-BiPy-四酸-Eu铕穴状化合物在生物学介质中抗荧光猝灭的性质，它特别适合于实施本发明。
·尤其是记载在专利US 4 761 481、US 5 032 677、US 5 055 578、US 5 106 957、US 5 116 989、US 4 761 481、US 4 801 722、US 4 794 191、US 4 637 988、US 4 670 572、US 4 837 169和US 4 859 777中的稀土螯合物。专利EP 0 403 593、US 5 324 825、US 5 202 423和US 5 316 909记载了由九齿(nonadentate)配体(如三联吡啶)组成的螯合物。这些稀土螯合物由PerkinElmer公司销售。
·也可使用由螯合剂(如四氮杂环十二烷)组成的稀土配合物，所述配合物用含有芳环的发色团取代(如Poole R.等在Biomol.Chem，2005，3，1013-1024“Synthesis and characterization of highly emissive andkinetically stable lanthanide complexes suitable for usage in cellulo”中记载的稀土配合物)。还可使用申请WO 2009/10580中记载的配合物。
·具有下式的铽穴状化合物Tb(KR)(该穴状化合物可通过反应基团被偶联至待标记的化合物，在该情况下反应基团例如为NHS基团)：
Figure BDA0000127409310000191
其合成记载于国际申请WO 2008/063721中的铽穴状化合物是最适合于实施本发明的铽穴状化合物之一。
·来自Lumiphore公司、由Cisbio Bioassays销售的铽穴状化合物Lumi4-Tb。
·来自Research Organics公司的具有下式的“量子染料”(该染料可通过反应基团被偶联至待标记的化合物，在该情况下反应基团为NCS)：
·由Invitrogen公司销售的具有下式的铽螯合物DTPA-cs124 Tb(该螯合物可通过反应基团R被偶联至待标记的化合物)，其合成记载在美国专利US 5 622 821中。
Figure BDA0000127409310000201
根据所选择的供体，通过应用上述总结的
Figure BDA0000127409310000202
理论的原理，本领域技术人员能够确定根据本发明所使用的FRET配偶体对的
Figure BDA0000127409310000203
半径。
作为非限制性实例，下表列举了半径在20-55
Figure BDA0000127409310000204
之间的FRET配偶体对：
Figure BDA0000127409310000211
在这些配偶体对中，优选Tb(KR)/荧光黄和Lumi4-Tb/荧光黄配偶体对。
Alexa和Oregon绿化合物由Invitrogen公司销售；Atto化合物由Attotec公司销售；Dy化合物由Dyomics公司销售；Cy化合物由AmershamBiosciences公司销售；其它化合物由多个化学试剂供应商销售(如Sigma、Aldrich或Acros公司)。
在上述配偶体对中，为了本发明的目的，优选R0在21-48
Figure BDA0000127409310000222
之间的配偶体对。
通过非限制性实例的方式，下表列举了
Figure BDA0000127409310000223
半径大于55的FRET配偶体对，所述配偶体对由此需要以激发后180-800μs的延迟及从200μs到2000μs的积分时间读取其FRET信号。
Figure BDA0000127409310000241
特别优选Tb(KR)/Dy648、Lumi4-Tb/Dy648、Tb(KR)/Dy647和Lumi4-Tb/Dy647配偶体对。
用FRET配偶体对的成员标记跨膜蛋白
本发明的另一个基本特征在于用能量供体或能量受体对含有VFT域的跨膜蛋白的标记是在构成所述二聚体的两个亚基的各亚基的VFT域的N端位置完成。
数种技术、尤其是下文中的任意技术可用于用供体或受体标记所述VFT域蛋白：
(a)间接地(非共价地)将VFT域蛋白与供体或受体偶联
可通过结合配偶体对(a pair of binding partners)将供体或受体与VFT域蛋白偶联，所述结合配偶体对中至少一个具有蛋白性质。在这一方法中，通过常规分子生物学技术(构建包含编码所述VFT域蛋白的核苷酸序列的表达载体，其中，所述核苷酸序列与编码蛋白结合配偶体的核苷酸序列融合；以及将该表达载体导入细胞)将VFT域蛋白与具有蛋白性质的结合配偶体融合。根据本发明，所述结合配偶体存在于VFT域蛋白的N端部分，优选在其末端。
所述供体或受体共价缀合至另一种结合配偶体，该结合配偶体在本文中称为偶联剂，随后会被添加到胞外介质中。结合配偶体的识别使得能够用供体或受体间接标记所述VFT域蛋白。
特别适合于实施本发明的结合配偶体的非限制性实例可包括如下结合配偶体：
·由序列半胱氨酸-半胱氨酸-X-X-半胱氨酸-半胱氨酸(SEQ ID No.1)(其中X是任意氨基酸)和二砷化合物组成的对。这类二砷化合物可容易地用荧光黄或罗丹明类型的有机分子标记(技术细节参见B.A.Griffin等，(1998)，Science，1998，281，269-271和S.A.Adams等，(2002)，J.Am.Chem.Soc.，2002，124，6063-6076)。
·银环蛇毒素(bungarotoxin(BTX))识别的、由13个氨基酸组成的BTX(银环蛇毒素)肽可偶联至荧光分子(参见C.M.McCann等，(2005)，Biotechnique(2005)，38，945-952)。
·链霉亲和素(或亲和素)/生物素对：链霉亲和素结合序列(SBP-标签)是由38个氨基酸组成的序列，该序列对生物素具有高亲和力，所述生物素可用供体或受体预标记(参见C.M.McCann等，(2005)，Biotechnique(2005)，38，945-952)。
·E.coli二氢叶酸还原酶(eDHFR)的序列，该酶特异地并高亲和力地结合配体(如三甲氧苄氨嘧啶)，可根据来自Active Motif公司的被称为“配体连接通用标记技术”的技术将供体或受体移植到所述配体上。
·标签/抗标签对是常用于标记蛋白的结合配偶体。术语“标签”表示由氨基酸序列组成的小的蛋白“标记”，该氨基酸序列通常但并非必需要十分短(少于15个氨基酸)，并且该氨基酸序列被融合至VFT域蛋白或天然地存在于这一蛋白中。术语“抗标签”表示特异性结合至所述“标签”的抗体。在该实施方式中，“抗标签”抗体共价键合至供体或受体。当这样标记的抗体被添加到胞外介质时，该抗体结合至与VFT域蛋白缀合的“标签”，“标签/抗标签”相互作用使得能够用供体或受体间接标记该蛋白。
“标签/抗标签”对的非限制性实例可包括下列对，这些对的成员是可商购的：GST/抗GST抗体，其中GST代表谷胱甘肽S转移酶或其片段；6HIS/抗6HIS抗体，其中6HIS是由6个组氨酸组成的肽；Myc/抗Myc抗体，其中Myc是由人Myc蛋白的410-419位氨基酸组成的肽；FLAG/抗FLAG抗体，在该情况下FLAG是具有8个氨基酸DYKDDDDK(SEQ ID No.2)的肽；HA/抗HA抗体，其中HA是由9个氨基酸YPYDVPFYA(SEQ ID No.3)组成的流感血球凝集素表位。很明显所述标签的确切性质对本发明的实施不是必要的。
(b)直接地(共价地)将VFT域蛋白与供体或受体偶联
在这一方法中，供体或受体通过共价键合偶联至VFT域蛋白；已经记载了数种技术并且其实施所必需的试剂是可商购的。对于该偶联，可使用下文的任意技术：
·与存在于VFT域蛋白上的反应基团形成共价键，尤其是与下述基团之一形成共价键：氨基末端基团、天冬氨酸和谷氨酸的羧化物基团、赖氨酸的胺基团、精氨酸的胍基团、半胱氨酸的硫醇基团、酪氨酸的苯酚基团、色氨酸的吲哚环、甲硫氨酸的硫醚基团和组氨酸的咪唑基团。
存在于VFT域蛋白上的这些基团可与供体或受体携带的反应基团形成共价键。适合的反应基团对本领域技术人员来说是已知的：例如，用顺丁烯二酰亚胺基团官能化的供体或受体将能够与蛋白的半胱氨酸携带的硫醇基团共价键合。同样地，带有N-羟基琥珀酰亚胺酯的供体/受体将能够共价键合至VFT域蛋白的胺。
·自杀酶的使用
自杀酶是具有由特定突变改变的酶促活性的蛋白，所述突变赋予它们快速地、共价地键合底物的能力。这些酶被称为自杀酶是因为各个酶仅可键合一个荧光分子，与底物的结合阻断了该酶的活性。因此，这些酶构成了以一个荧光分子标记一个蛋白的比例对感兴趣的蛋白进行特异性标记的可选工具。所述自杀酶的非限制性实例可包括下列酶：
-O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶(AGT)突变体。由NEB公司销售的Snap-标签(Juillerat等，Chemistry & biology，第10卷，313-317，2003年4月)和Clip-标签(Gautier等，Chemistry & Biology，15，128-136，2008年2月)酶是人AGT的突变体，其底物分别为O6-苄基鸟嘌呤(下文缩写成BG)和O2-苄基胞嘧啶(下文缩写成BC)。N-AGT酶(Gronemeyer等，Protein engineering，design & selection，第19卷，第7期，309-316页，2006年)是该酶的另一突变体，该突变体与O6-苄基鸟嘌呤的反应性优于Snap-标签酶与O6-苄基鸟嘌呤的反应性。优选的自杀酶为O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶突变体；
-也产生自杀类型的酶促反应的脱卤素酶的突变体(如由Promega销售的HaloTag酶)(参见WO 04/072232 A2)，该突变体的一些底物为氯烷烃家族的化合物，尤其是包含
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-(CH2)6-Cl基序的氯烷烃。在这种情况下，供体/受体将缀合至这类基序；
-在磷酸泛酰巯基乙胺转移酶存在的情况下，辅酶A的4′-磷酸泛酰巯基乙胺残基转移至其丝氨酸上的ACP蛋白(酰基载体蛋白)(N.George等，Journal of the American Chemical Society，126，(2004年)，8896-8897页)。当使用这一方法用供体或受体标记VFT域蛋白时，有必要添加磷酸泛酰巯基乙胺转移酶至反应介质。NEB公司销售商品名为“ACP-Tag”的ACP片段用于标记蛋白。
在这一方法中，通过常规分子生物学技术将自杀酶融合在VFT域蛋白的N端部分(生产包含编码自杀酶的核酸序列和编码VFT域蛋白的核酸序列的表达载体，并将这一载体导入细胞)，并将共价键合至供体/受体的该酶的底物导入胞外介质中。酶促反应使得标记的底物共价键合至该酶，从而用所述供体或受体标记VFT域蛋白。
特别优选使用自杀酶以实施本发明：在这种情况下，包含VFT域的膜蛋白以融合蛋白的形式表达，所述融合蛋白包含VFT域蛋白和在其N末端的自杀酶或自杀酶片段，所述自杀酶或自杀酶片段能够与其底物共价键合；可通过在测量介质中添加FRET配偶体对成员的化合物之一完成VFT域蛋白的标记，所述化合物与所述自杀酶的底物共价键合。
在一个甚至更优选的实施方式中，构成二聚体的各亚基以与自杀酶融合的融合蛋白形式表达。在这种情况下，用于各亚基的自杀酶可以不同或相同。
Maurel等已经记载了制备编码融合蛋白的质粒并将所述质粒转染入细胞(Nature Methods，2008年，Supplementary methods)，所述融合蛋白包含位于VFT域蛋白(GABA B1、GABA B2、mGlu1)N端部分的自杀酶(Snap-标签)。所使用的方法是常规分子生物学技术。
测量FRET信号
通常使用荧光计测量FRET信号，该荧光计使得能够在能量供体的吸收波长下激发测量介质，并能够在供体化合物和/或受体化合物(如果所述受体化合物是荧光化合物)的发射波长下测量由测量介质发出的荧光。
介质发出的荧光在激发后延迟并持续一定的时间段(称为积分时间)进行检测，在可商购的荧光计上能调节这两个参数。
在一个优选的实施方式中，尤其是当FRET配偶体对的
Figure BDA0000127409310000281
半径(R0)包含于
Figure BDA0000127409310000282
的范围内时，以激发后20-100μs的延迟及从100μs到500μs的积分时间测量信号。分别地，下列时窗为优选的时窗：50-300μs、50-400μs、50-450μs、40-250μs、100-300μs。在另一个优选的实施方式中，不考虑FRET配偶体对的
Figure BDA0000127409310000283
半径(R0)，在激发后以180-800μs的延迟及从200μs到2000μs的积分时间测量信号。分别地，下列时窗为优选的时窗：300-650μs、500-1000μs、500-1500μs、800-1800μs。如上所述，当FRET配偶体对的
Figure BDA0000127409310000284
半径(R0)大于
Figure BDA0000127409310000285
时，必须采用这种实施方式。
能量供体和受体化合物彼此更加靠近引起能量传递增强(FRET增强)，这将导致：
-在受体(如果它发荧光)的发射波长下，发光增强；
-在供体的发射波长下，发光减弱；供体化合物的荧光寿命缩短。
因此，可通过检测供体的发光或受体的发光来测量FRET信号的变化。优选地，通过检测受体化合物的发光来测量所述FRET信号。
甚至更优选地，通过检测供体化合物在其发射波长的发光及受体在其发射波长的发光(但并非必须同时测量)，然后通过用针对供体得到的信号校正针对受体得到的信号(例如通过计算这两个值的比例)来测量FRET变化。在这种情况下，“FRET增强”将对应于受体/供体比例的增强。荧光计通常包括允许这一读取类型的模式。此外，供体和受体化合物的发光不是必需在同一时窗内测量。
由于时间分辨的FRET(TR-FRET)类型的测量使消除大量干扰成为可能，以时间分辨的FRET进行FRET测量是特别有利的，该测量能采用具有长寿命的能量供体化合物。虽然本发明所述的方法能够以FRET的模式实施，但更优选TR-FRET模式。
试剂盒
本发明还涉及用于实施本发明所述方法的组分的试剂盒，即包含如上所述的试剂，任选地附有所述试剂根据本发明的使用说明书。具体地，所述试剂盒包含：
-包含VFT域蛋白二聚体的细胞膜，所述二聚体由第一蛋白和第二蛋白组成，所述蛋白相同或不同；
-FRET配偶体对；
-用所述FRET配偶体对的一个成员标记所述第一蛋白的VFT域N端部分的工具；以及用所述FRET配偶体对的另一个成员标记所述第二蛋白的VFT域N端部分的工具；
-说明书，根据该说明书，FRET信号必须在这样的时窗内测量：在该时窗内，存在及不存在参比激动剂或拮抗剂化合物时测量到的信号是不同的。
后面的说明书可由对如上所述的用于本发明方法的合适时窗的叙述组成。
在一个特定的实施方式中，这些试剂盒包含：
(i)
Figure BDA0000127409310000291
半径(R0)在
Figure BDA0000127409310000292
之间的FRET配偶体对和说明书，根据该说明书，FRET信号必须以激发后20-100μs的延迟及从100μs到500μs的积分时间测量；或者
(ii)
Figure BDA0000127409310000301
半径(R0)大于
Figure BDA0000127409310000302
的FRET配偶体对和说明书，根据该说明书，FRET信号必须以激发后180-800μs的延迟及从200μs到2000μs的积分时间测量。
在一个特别优选的实施方式中，所述标记工具由使用自杀酶来共价标记所述二聚体的组成蛋白构成。在这一实施方式中，所述第一蛋白和第二蛋白各自以与自杀酶融合的融合蛋白形式表达，并且FRET配偶体对的成员各自共价键合至所述自杀酶的底物。
有可能的是，本发明所述试剂盒的组分仅形成一种产品，例如，如果所研究的二聚体的所述第一组成蛋白和第二组成蛋白各自用所述FRET配偶体对的成员标记。因此，本发明还涉及含有包含VFT域蛋白二聚体的细胞膜的试剂盒，所述二聚体由第一蛋白和第二蛋白组成，所述蛋白相同或者不同，用FRET配偶体对的成员标记各蛋白VFT域的N端部分，所述试剂盒还包含说明书，根据该说明书，所述FRET信号在这样的时窗中检测：在该时窗中，存在或不存在参比激动剂或拮抗剂化合物时测量到的信号是不同的。
实施例
下列产品用于实施例1-12：
试剂：
调节剂(激动剂、拮抗剂、别构调节剂)：
DCG IV、L-谷氨酸和LY341495可在Tocris Biosciences产品目录中得到。4-MPPTS(mGluR2受体的阳性别构调节剂，也称作LY487379)由Addex Pharmaceuticals赠予，其合成记载在美国专利US 6 800 651中。培养基：
DMEM、DMEM+Glutamax、MEM-NEAA、MEM-青霉素/链霉素、胰蛋白酶/EDTA在Gibco产品目录中可得到。所使用的胎牛血清是Lonza品牌、南美型(批次7SB0017)。
荧光缀合物：
BG-Lumi4-Tb：苄基鸟嘌呤-Lumi4-Tb缀合物，由Cisbio Bioassays销售(
Figure BDA0000127409310000303
SNAP-Lumi4Tb)。BG是该Snap-标签酶的底物。
BC-荧光黄：苄基胞嘧啶-荧光黄缀合物，由NEB公司销售，商品名为CLIP-Vista Green。BC是该Clip-标签酶的底物。
BG-荧光黄：苄基鸟嘌呤-荧光黄缀合物，由NEB(New EnglandBiolabs)公司销售，商品名为SNAP-Vista Green。
Figure BDA0000127409310000311
SNAP-Green：苄基鸟嘌呤-荧光黄缀合物，由CisbioBioassays公司销售。
Figure BDA0000127409310000312
SNAP-red：苄基鸟嘌呤-花青苷衍生物缀合物，该缀合物的激发峰在670nm，由Cisbio Bioassays销售。
其它试剂：
DMSO、Tris(Trizma Base)、NaCl、KH2PO4、MgSO4、KCl和CaCl2可在Sigma-Aldrich产品目录得到。
用于GPCR1-GPCR2二聚体表达的质粒：
包含编码HA-Snaptag-[GPCR1]和Flag-Cliptag-[GPCR2]融合蛋白的DNA的表达载体是通过常规分子生物学技术由prK5载体制备而得，其中，GPCR1和GPCR2代表意欲通过细胞表达的GPCRs，通过测序验证了载体序列。prK5的序列为SEQ ID No.4，包含4661个碱基对。该质粒中唯一的限制性酶切位点的位置在下文标明：
  SpeI   28
  NdeI   263
  SacII   684
  EagI   684
  ClaI   913
  EcoRI   919
  SmaI   927
  BamHI   930
  XbaI   936
  SalI   942
  PstI   952
  HindIII   954
  KpnI   1173
  StuI   1518
  HpaI   1542
  NarI   1710
所述载体(以下称为prK5-HA-Snaptag-[GPCR1]或prK5-Flag-Cliptag-[GPCR2])包含CMV启动子；ATG起始密码子；编码mGluR5的信号肽、流感血球凝集素表位(HA)或FLAG表位的DNA序列；编码Snap-标签酶或Clip-标签酶的DNA序列；除[GPCR1]或[GPCR2]受体的起始密码子和编码[GPCR1]或[GPCR2]受体的信号肽(如果有的话)的序列外的、编码[GPCR1]或[GPCR2]受体的DNA序列；以及终止密码子。
编码实施例1中所使用的HA-Snaptag-mGluR2和Flag-Cliptag-mGluR2融合蛋白的质粒序列是序列SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6。
在序列SEQ ID No.5中，编码区的位置分别为：
mGluR5的信号肽：937-1002；
HA表位：1009-1035；
Snap-tag：1042-1590；
mGluR2：1597-4149。
在序列SEQ ID No.6中，编码区的位置分别为：
mGluR5的信号肽：937-1002；
FLAG：1015-1038；
Clip-tag：1045-1593；
mGluR2：1600-4152。
除了编码感兴趣的受体的区域，包含其他受体的序列的质粒之间是彼此相同的。所使用的各受体的序列可在Genbank数据库中得到。
本领域技术人员将可通过从已经记载在文献中的质粒(Maurel等，如上所述)亚克隆或者直接通过基因合成容易地构建这些质粒。
细胞：使用可商购的Cos-7细胞系。
完全培养基：DMEM+10％胎牛血清+MEM-NEAA+MEM-青霉素/链霉素。
电穿孔缓冲液：50mM KH2PO4、20mM CH3COOK、20mM KOH、50mMMgSO4。
标记缓冲液：DMEM+GlutaMax。
漂洗和读取缓冲液：20mM Tris、118mM NaCl、1.2mM KH2PO4、1.2mMMgSO4、4.7mM KCl、1.8mM CaCl2；pH调至7.4。
实施例1：对mGluR2-mGluR2二聚体具有激动剂作用的活化化合物的显示(所用FRET配偶体对的R0：
Figure BDA0000127409310000331
)
方案：
通过电穿孔转染：
将Cos-7细胞于37℃下和5％CO2中在完全培养基中培养。在汇合(confluence)时，用PBS漂洗1次，并用胰蛋白酶-EDTA溶液于37℃下分离细胞10min。将10兆个细胞的悬浮液与5μg总DNA(3.5μg prK5质粒、1.2μg prK5 Flag-Cliptag-mGluR2质粒和0.3μg prK5 HA-Snaptag-mGluR2质粒)混合在终体积为300μl的电穿孔缓冲液中，然后利用Gene-Pulser II电穿孔仪(BIO-RAD)，在4mm电穿孔杯(Eurogentec)中施加280V、900μF的电击。然后以150000细胞/孔的量将这些细胞接种至96孔板(Greiner CellStar 96孔板)中，各孔中完全培养基的终体积为100μl，然后孵育24h。
标记
转染24h后，在存在50μl标记缓冲液+0.3μM BG-Lumi4-Tb和1μMBC-荧光黄的情况下将细胞于37℃下孵育2h。
随后将细胞用100μl的漂洗缓冲液漂洗4次，并在100μl的漂洗缓冲液中完成读取。
读取
在AnalystAD酶标仪(Molecular Devices)上读取在荧光黄(受体)的波长下发出的荧光，所述读取在TRF模式，延迟50μs，积分时间450μs，激发滤波片320nm带宽(BW)25，BB/UV分色镜，发射滤波片520nm BP10下进行。下文中将该FRET信号表示为TRF520。
在不存在谷氨酸时，首次读取该板。
然后，将20μl谷氨酸溶液添加到100μl读取缓冲液中，以便在孔中得到316μM、100μM、31.6μM、10μM、3.16μM、1μM或0.316μM的终浓度(总体积为120μl)。
在添加谷氨酸后，再次读取该板。
结果
图1表示作为谷氨酸浓度函数的TRF520信号。这一信号表示为首次读取(即，添加谷氨酸前读取)时读取的TRF520的百分数，即：
存在激动剂(谷氨酸)时，观察到了TRF520的减弱，这既不可归因于穴状化合物荧光的减弱，也不可归因于受体荧光的减弱。这表明了在供体和受体化合物间的能量转移(FRET)效率方面的变化，这尤其可归因于荧光团间距离的变化。
这一变化是剂量依赖性的，即它取决于谷氨酸激动剂的浓度。该曲线为S形曲线的形状；产生等于TRF520半最大变化的变化所需的浓度非常接近谷氨酸对mGluR2受体的药理学EC50值。这强烈表明在TRF520变化期间观察到的现象为受体的活化。
该实施例表明，本发明所述的方法使显示活化二聚体的化合物、尤其是激动剂化合物成为可能。就mGluR2同型二聚体而言，活化化合物引起TRF520信号减弱。
实施例2：对mGluR2-mGluR2二聚体具有竞争性拮抗剂作用的去活化化合物的显示(所用FRET配偶体对的R0：
Figure BDA0000127409310000342
)
试剂和质粒
使用如在实施例1中记载的相同试剂和质粒。使用已知的拮抗剂化合物LY341495(Tocris Bioscience)。
方案
使用如在实施例1中记载的相同方案。终浓度为[谷氨酸]＝100μM(所有孔中)；和[LY341495]＝1000nM、316nM、100nM、31.6nM、10nM、3.16nM或1nM。
结果
图2表示存在固定浓度的谷氨酸时，作为拮抗剂LY341495浓度函数的TRF520信号(对照曲线：不存在谷氨酸时)。
存在谷氨酸而不存在竞争性拮抗剂LY341495时，受体是活化的，并观察到了TRF52050％的变化。拮抗剂的存在阻止了谷氨酸对TRF520的这一作用，并且在拮抗剂浓度增加时测量到的信号增强，这与激动剂浓度增加时观察到的情况(实施例1)相反。当拮抗剂的浓度在最大值(1μM)时，由激动剂诱导的FRET变化被完全抑制(100％)。在这种情况下，抑制由谷氨酸诱导的FRET的50％变化所需的浓度为150nM，这与抑制谷氨酸50％的药理作用所需的浓度(IC50)相差不是很大。
这一实施例显示出：本发明所述的方法用于显示已知拮抗剂化合物的去活化作用的有效性。通过以类似方式用测试化合物进行该方法，可以确定该化合物是否具有拮抗剂作用。
实施例3：对mGluR2-mGluR2二聚体具有部分激动剂作用的活化化合物的显示(所用FRET配偶体对的R0：
Figure BDA0000127409310000351
)
试剂和质粒
使用如记载在实施例1中的相同试剂和质粒。使用的已知的部分激动剂化合物为DCG-IV(Tocris Bioscience)；与参比的完全激动剂谷氨酸相比较。
方案
使用实施例1的方案。[DCG-IV]的终浓度为下述：100μM、31.6μM、10μM、3.16μM、1μM、0.316μM或0.1μM。
结果
图3表示作为谷氨酸(完全激动剂)浓度或DCG-IV(部分激动剂)浓度函数的TRF520信号。
如同谷氨酸一样，DCG-IV能够以剂量依赖的方式抑制TRF520信号。得到等于半最大变化的变化所需的浓度接近DCG-IV的药理学EC50(0.4μM)。尽管如此，由DCG-IV得到的最大变化为30％，而用谷氨酸得到的最大变化为50％。这一结果证实了DCG-IV的部分激动剂性质，DCG-IV所引起的FRET的最大变化小于由参比激动剂所得到的最大变化。
这一实施例表明本发明所述的方法可被用于选择对mGluR2二聚体具有部分激动剂型活化作用的化合物。
实施例4：对mGluR2-mGluR2二聚体具有阳性别构调节剂(PAM)作用的活化化合物的显示(所用FRET配偶体对的R0：
Figure BDA0000127409310000361
)
试剂和质粒
使用实施例1的试剂和质粒。使用已知的阳性别构调节剂化合物4-MPPTS(＝mGluR2PAM，也称作LY487379)。
方案
使用在实施例1中记载的方案。
终浓度为[4-MPPTS]＝10μM；[谷氨酸]＝1000μM、316μM、100μM、31.6μM、10μM、3.16μM或1μM。
结果
图4表示存在或不存在(对照)4-MPPTS时，作为谷氨酸浓度函数的TRF520信号的变化。
对于给定的谷氨酸浓度，存在4-MPPTS时比不存在4-MPPTS时观察到了更强的信号减弱。
这一实施例表明本发明所述的方法可用于显示具有阳性变构调节作用的化合物。
实施例5：不需要用两种不同的自杀酶标记(所用FRET配偶体对的R0：
Figure BDA0000127409310000362
)
在该实施例中，使用一种质粒prK5-HA-Snaptag-mGluR2来表达mGluR2同型二聚体。方案与实施例3中使用的相同，唯一的区别为转染的DNA的量为：4μg prK5+1μg prK5-HA-Snaptag-mGluR2。
使用下列荧光缀合物：标记介质中的浓度为0.1μM的BG-Lumi4-Tb；以及0.02μM的BG-荧光黄。
图5显示出作为谷氨酸增加浓度和DGC-IV增加浓度的函数的FRET信号的变化，并显示出形成二聚体的各蛋白(在该情况下为形成同型二聚体的各个mGluR2)能够以同样的方法进行标记(在该情况下为通过BG/Snap-标签方法标记)。因此，使用两种不同的自杀酶不是必需的。
实施例6：对mGluR2-mGluR2、mGluR3-mGluR3或mGluR4-mGluR4同型二聚体具有激动剂作用的活化化合物的显示(所用FRET配偶体对的R0：
Figure BDA0000127409310000371
)
用能够表达mGluR3-mGluR3同型二聚体或mGluR4-mGluR4同型二聚体的质粒重复实施例1。用于得到prK5-HA-Snaptag-mGluR3、prK5-Flag-Cliptag-mGluR3、prK5-HA-Snaptag-mGluR4和prK5-Flag-Cliptag-mGluR4质粒的步骤记载在“所用质粒”部分。遵循记载在实施例1中的方案，唯一的区别为所转染的DNA的量为：
-对于mGluR2：和实施例1相同；
-对于mGluR3：3.5μg prK5质粒、1.2μg prK5Flag-Cliptag-mGluR3质粒和0.3μg prK5 HA-Snaptag-mGluR3质粒；
-对于mGluR4：3.5μg prK5质粒、1.2μg prK5 Flag-Cliptag-mGluR4质粒和0.3μg prK5 HA-Snaptag-mGluR4质粒。
图6表示得到的剂量-应答曲线。尽管用mGluR4-mGluR4和mGluR3-mGluR3受体观察到的信号变化不如在其它情况下测量的大，仍然用mGluR4-mGluR4和mGluR3-mGluR3证实了用mGluR2-mGluR2同型二聚体在实施例1中得到的结果。
这一实施例显示出本发明所述的方法可用多种促代谢型谷氨酸受体实施。
实施例7：mGluR3传感器的情况：对拮抗剂敏感、对激动剂不是非常敏感(所用FRET配偶体对的R0：
Figure BDA0000127409310000372
)
在这一实施例中，以下文的质粒和量使用实施例1的方案：
-使用3.5μg prK5质粒、1.2μg prK5 Flag-Cliptag-mGluR3质粒和0.3μg prK5-HA-Snaptag-mGluR3质粒以表达标记的mGluR3同型二聚体。
-使用增加的LY341495拮抗剂的浓度以得到终浓度：1μM、320nM、100nM、32nM、10nM、3.2nM和1nM。
结果
图7表示作为LY341495浓度函数的TRF520信号。
该拮抗剂的添加引起TRF520信号以剂量依赖的方式增强。
这一实施例显示出本发明所述的方法能够用于筛选使感兴趣的受体去活化的分子。
实施例8：对mGluR2-mGluR2、mGluR3-mGluR3或mGluR4-mGluR4同型二聚体以及mGluR2-mGluR3和mGluR2-mGluR4异源二聚体具有激动剂作用的活化化合物的显示(所用FRET配偶体对的R0：
Figure BDA0000127409310000381
)
用能够表达mGluR2-mGluR2、mGluR3-mGluR3或mGluR4-mGluR4同型二聚体或mGluR2-mGluR3和mGluR2-mGluR4异源二聚体的质粒重复实施例1。图8表示得到的剂量-应答曲线。证实了在实施例1和实施例6中得到的结果。
这一实施例显示出本发明所述的方法不仅可用促代谢型谷氨酸受体的同型二聚体实施，而且可用促代谢型谷氨酸受体的亚型间(inter-subtype)异源二聚体实施。
实施例9：调节化合物对mGluR1-mGluR1和mGluR8-mGluR8同型二聚体作用的显示(所用FRET配偶体对的R0：
Figure BDA0000127409310000382
)
根据类似于记载在实施例5中的方法制备表达mGluR1-mGluR1、mGluR2-mGluR2、mGluR3-mGluR3和mGluR8-mGluR8同型二聚体的细胞，各mGluR受体以与Snap-标签酶融合的融合蛋白形式表达。
用下文的荧光缀合物完成标记：标记介质中的浓度为0.1μM的BG-Lumi4-Tb(供体)；以及浓度为0.1μM的BG-荧光黄(受体)。
在Infinit 500酶标仪上，以50μs的延迟和400μs的积分时间测量在荧光黄的波长(520nm)下发出的荧光和在铽的波长(620nm)下发出的荧光。
这些测量在存在标记缓冲液或激动剂(1mM谷氨酸)或拮抗剂(0.1mM LY341495)时完成。
计算在520nm和620nm下发出的信号的比例，下文中称之为“FRET比例”。
图9表示存在激动剂(谷氨酸)或存在拮抗剂(LY341495)时或这些化合物均不存在时(缓冲液)观察到的FRET比例的变化。将存在拮抗剂时观察到的值强制选作100％的值。
这些结果证实了对于mGluR2和mGluR3同型二聚体的先前的实施例中得到的结果，并且也显示出当使mGluR8和mGluR1同型二聚体接触激动剂或拮抗剂时，本发明所述的方法使观察FRET信号的变化成为可能。
实施例10：调节化合物对mGluR1、mGluR2、mGluR3、mGluR4、mGluR5和mGluR8同型二聚体作用的显示(所用FRET配偶体对的R0：)
用mGluR1、mGluR2、mGluR3、mGluR4、mGluR5和mGluR8同型二聚体重复实施例9，此次以500μs的延迟和1000μs的积分时间测量荧光。
图10的结果证实了先前观察到的那些结果，即本发明所述的方法适合于显示调节大多数mGluR受体的化合物。
实施例11：调节化合物对mGluR8同型二聚体作用的显示(所用FRET配偶体对的R0：)
用表达mGluR8-mGluR8二聚体的细胞重复实施例9，但是所用荧光化合物的
Figure BDA0000127409310000393
在这种情况下，用BG-Lumi4-Tb(供体，0.1μM)和
Figure BDA0000127409310000394
SNAP-red(受体，0.25μM)完成标记。
在Rubystar酶标仪上于665nm(受体)和620nm(供体)下、在下列时窗内测量荧光：50-450μs、50-150μs和500-1500μs(图11)。
当在常规使用的时窗(即50-450μs)内测量信号时，存在调节化合物(激动剂或拮抗剂)时，观察不到信号的显著变化。当在50-150μs的时窗内测量荧光时，在有激动剂的情况下，观察到了显著的变化。当在500-1500μs的时窗内测量荧光时，在有激动剂或拮抗剂的情况下均观察到了非常显著的变化。
实施例12：用的FRET配偶体对(BG-TrisBiPy-五酸-Eu和
Figure BDA0000127409310000402
SNAP-Red)显示调节化合物对mGluR8和mGluR2同型二聚体的作用(所用FRET配偶体对的R0：
Figure BDA0000127409310000403
)
用表达mGluR8-mGluR8二聚体或mGluR2-mGluR2二聚体的细胞重复实施例9，但是所用荧光化合物的
Figure BDA0000127409310000404
在这种情况下，用偶联至苄基鸟嘌呤的铕穴状化合物(BG-TrisBiPy-五酸-Eu，供体，0.2μM)和SNAP-red(受体，0.25μM)完成标记。
在Rubystar酶标仪上于665nm(受体)和620nm(供体)下、在下列时窗内测量荧光：50-450μs和300-650μs(图12)。
当在常规使用的时窗(即50-450μs)内测量信号时，存在调节化合物(激动剂或拮抗剂)时，观察不到信号的显著变化。当在300-650μs的时窗内测量荧光时，在有激动剂或拮抗剂的情况下，观察到了信号的显著变化。

Claims (29)

1.用于选择对存在于测量介质中的细胞膜内表达的VFT域蛋白二聚体的活化状态具有调节作用的化合物的方法，所述二聚体由第一蛋白和第二蛋白组成，所述蛋白相同或不同，其中该方法包括下列步骤：
(a)用FRET配偶体对的成员在所述第一蛋白和第二蛋白VFT域的N端部分标记所述第一蛋白和第二蛋白；
(b)在不存在及存在测试化合物的情况下，激发所述FRET配偶体并测量FRET信号；
(c)在不存在及存在测试化合物的情况下，如果在步骤(b)中测量到FRET信号的差别，选择该测试化合物作为调节化合物；
在步骤(b)中，所述FRET信号是在这样的时窗中测量的：在该时窗内，存在及不存在参比激动剂或拮抗剂化合物时测量到的信号是不同的。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中测量的信号是以激发后180-800μs的延迟及从200μs到1000μs的积分时间完成的。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
(i)所述FRET配偶体对的
Figure FDA0000127409300000011
半径(R0)在
Figure FDA0000127409300000012
之间，步骤(b)中测量的信号是以激发后20-100μs的延迟及从100μs到500μs的积分时间测量的；或者
(ii)所述配偶体对的
Figure FDA0000127409300000013
半径(R0)大于
Figure FDA0000127409300000014
步骤(b)中测量的信号是以激发后180-800μs的延迟及从200μs到1000μs的积分时间测量的。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，存在及不存在测试化合物时的FRET测量是在存在所述二聚体的已知激动剂的情况下完成的。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述第一蛋白和第二蛋白为含有VFT域的C类G-蛋白偶联受体。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述VFT域蛋白二聚体选自：促代谢型谷氨酸受体、γ-氨基丁酸受体、与甜味知觉相关的受体、与鲜味知觉相关的受体、胞外钙敏感受体和碱性氨基酸受体。
7.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述VFT域蛋白二聚体为促代谢型谷氨酸受体或选自TAS1R2-TAS1R3或TAS1R1-TAS1R3。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，用FRET配偶体对的成员对所述第一蛋白和所述第二蛋白进行的标记是通过结合配偶体对间接标记或者通过共价键合直接标记。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一蛋白和所述第二蛋白各自以与自杀酶融合的融合蛋白形式表达，其特征还在于，所述第一蛋白和所述第二蛋白的标记是通过向测量介质添加所述FRET配偶体对成员完成，所述FRET配偶体对的各成员共价键合至所述自杀酶的底物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一蛋白和所述第二蛋白各自以与不同自杀酶融合的融合蛋白形式表达。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一蛋白和所述第二蛋白各自以与相同自杀酶融合的融合蛋白形式表达。
12.如权利要求9-11任一项所述的方法，其特征在于，所述自杀酶选自：酰基载体蛋白的片段、O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶突变体或脱卤素酶突变体。
13.如权利要求1-12任一项所述的方法，其特征在于，所述FRET配偶体对由选自下述组中的荧光供体化合物和受体荧光化合物组成：
(i)首先，所述荧光供体化合物选自：铕螯合物、铽螯合物、铕穴状化合物和铽穴状化合物；
(ii)其次，所述受体荧光化合物为选自下列物质的荧光有机分子：罗丹明、花青苷、方酸菁、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硝基苯并噁二唑、青色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色和红色荧光蛋白及在远红外范围发荧光的蛋白。
14.用于实施如权利要求1-13任一项所述方法的试剂盒，该试剂盒包含：
-包含VFT域蛋白二聚体的细胞膜，所述二聚体由第一蛋白和第二蛋白组成，所述蛋白相同或不同；
-FRET配偶体对；
-用所述FRET配偶体对的一个成员标记所述第一蛋白的VFT域N端部分的工具；以及用所述FRET配偶体对的另一个成员标记所述第二蛋白的VFT域N端部分的工具；
-说明书，根据该说明书，FRET信号必须在这样的时窗内测量：在该时窗内，存在及不存在参比激动剂或拮抗剂化合物时测量到的信号是不同的。
15.如权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含说明书，根据该说明书，所述FRET信号必须以激发后180-800μs的延迟及从200μs到2000μs的积分时间测量。
16.如权利要求14所述的试剂盒，其特征在于：
(i)所述FRET配偶体对的
Figure FDA0000127409300000031
半径(R0)在
Figure FDA0000127409300000032
之间，所述试剂盒包含说明书，根据该说明书，所述FRET信号必须以激发后20-100μs的延迟及从100μs到500μs的积分时间测量；或者
(ii)所述配偶体对的
Figure FDA0000127409300000033
半径(R0)大于
Figure FDA0000127409300000034
所述试剂盒包含说明书，根据该说明书，所述FRET信号必须以激发后180-800μs的延迟及从200μs到2000μs的积分时间测量。
17.如权利要求14-16任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一蛋白和第二蛋白为含有VFT域的C类G-蛋白偶联受体。
18.如权利要求14-17任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述VFT域蛋白二聚体选自：促代谢型谷氨酸受体、γ-氨基丁酸受体、与甜味知觉相关的受体、与鲜味知觉相关的受体、胞外钙敏感受体和碱性氨基酸受体，优选选自促代谢型谷氨酸受体、TAS1R2-TAS1R3或TAS1R1-TAS1R3。
19.如权利要求14-18任一项所述的试剂盒，其特征在于，用于用FRET配偶体对的成员标记所述第一蛋白和第二蛋白的所述工具由实施间接标记的结合配偶体对组成或者由共价标记工具组成。
20.如权利要求14-18任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一蛋白和第二蛋白各自以与自杀酶融合的融合蛋白形式表达，其特征还在于，所述FRET配偶体对的各成员共价键合至所述自杀酶的底物。
21.如权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述第一蛋白和第二蛋白各自以与不同自杀酶融合的融合蛋白形式表达，或各自以与相同自杀酶融合的融合蛋白形式表达。
22.如权利要求20或21所述的试剂盒，其特征在于，所述自杀酶选自：酰基载体蛋白的片段、O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶突变体和脱卤素酶突变体。
23.如权利要求14-22任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述FRET配偶体对由选自下述组中的荧光供体化合物和受体荧光化合物组成：
(i)首先，所述荧光供体化合物选自铕螯合物、铽螯合物、铕穴状化合物和铽穴状化合物；
(ii)其次，所述受体荧光化合物为选自下列物质的荧光有机分子：罗丹明、花青苷、方酸菁、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硝基苯并噁二唑、青色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色和红色荧光蛋白及在远红外范围发荧光的蛋白。
24.用于实施如权利要求1-13任一项所述方法的试剂盒，该试剂盒包含：
-包含VFT域蛋白二聚体的细胞膜，所述二聚体由第一蛋白和第二蛋白组成，所述蛋白相同或不同，各蛋白VFT域的N端部分被FRET配偶体对的成员标记；
-说明书，根据该说明书，所述FRET信号必须在这样的时窗内测量：在该时窗内，存在及不存在参比激动剂或拮抗剂化合物时测量到的信号是不同的。
25.如权利要求24所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含说明书，根据该说明书，所述FRET信号必须以激发后180-800μs的延迟及从200μs到2000μs的积分时间测量。
26.如权利要求24所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含说明书，根据该说明书，
(i)所述FRET配偶体对的
Figure FDA0000127409300000051
半径(R0)在
Figure FDA0000127409300000052
之间，所述试剂盒包含说明书，根据该说明书，所述FRET信号必须以激发后20-100μs的延迟及从100μs到500μs的积分时间测量；或者
(ii)所述配偶体对的
Figure FDA0000127409300000053
半径(R0)大于
Figure FDA0000127409300000054
所述试剂盒包含说明书，根据该说明书，所述FRET信号必须以激发后180-800μs的延迟及从200μs到2000μs的积分时间测量。
27.如权利要求24-26任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一蛋白和第二蛋白为含有VFT域的C类G-蛋白偶联受体。
28.如权利要求24-26任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述VFT域蛋白二聚体选自：促代谢型谷氨酸受体、γ-氨基丁酸受体、与甜味知觉相关的受体、与鲜味知觉相关的受体、胞外钙敏感受体和碱性氨基酸受体，优选选自促代谢型谷氨酸受体、TAS1R2-TAS1R3或TAS1R1-TAS1R3。
29.如权利要求24-28任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述FRET配偶体对由选自下述组中的荧光供体化合物和受体荧光化合物组成：
(i)首先，所述荧光供体化合物选自铕螯合物、铽螯合物、铕穴状化合物和铽穴状化合物；
(ii)其次，所述受体荧光化合物为选自下列物质的荧光有机分子：罗丹明、花青苷、方酸菁、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硝基苯并噁二唑、青色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色和红色荧光蛋白及在远红外范围发荧光的蛋白。
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