CN106796245B - 鉴定钙敏感受体调节剂的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于鉴定调节钙敏感受体的活性和/或表达的化合物的方法，其中所述化合物可以掺入可用于改变宠物食品的厚味和/或适口性的风味组合物中。

Description

鉴定钙敏感受体调节剂的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年10月10日提交的美国临时申请序列号62/062,717的优先权，其全部内容合并于本文中。
技术领域
本发明公开的主题涉及鉴定调节钙敏感受体的活性和/或表达的化合物的方法。
背景技术
可食用组合物的味觉谱(taste profile)包括基本味道，例如甜味、咸味、苦味、酸味、鲜味和厚味(kokumi)。。味觉谱也被描述为包括游离脂肪酸味道。引起这些味道的化合物通常被称为促味剂。在不受理论约束的情况下，假定促味剂由口和咽喉中的味觉受体感知，所述味觉受体将信号传递到脑，在这里记录了促味剂和所产生的味觉谱。味觉受体包括钙敏感受体(CaSR)，其是检测细胞外钙水平的变化的G蛋白偶联受体(GPCR)并且与T1R1、T1R2和T1R3受体(即甜味和鲜味受体)密切相关。钙敏感受体已显示增强甜味、咸味和鲜味，并且作为厚味味道的受体起作用。
宠物食品制造商长期以来希望提供具有高营养价值的宠物食品。此外，特别是对于猫和狗的食品，宠物食品制造商希望获得高度的适口性，使得宠物可以从它们的食品中获得全营养益处。家养动物，尤其是猫，在其食物偏好方面是众所周知的易变，并且经常随着时间拒绝食用其已经接受的宠物食品，或者拒绝食用任何多于最少量的宠物食品。这种现象可能部分地是由于原料的感官特性的细微差异，由于它们的味觉和嗅觉系统，其可以被家养动物感知。因此，宠物主人经常改变宠物食品的类型和品牌，以便使他们的宠物保持健康和满意的状态。
尽管味道和风味技术近来有所进展，但仍然需要能够通过增强或改变宠物食品的味觉谱、质地谱(texture profile)和/或风味谱(flavor profile)来增强或改变宠物食品的适口性的化合物。增强或改变可以是增加所需属性的强度，以替换在宠物食品中不存在或以某种方式丢失的所需属性，或者减少不需要的属性的强度。特别地，期望增加宠物食品中所需促味剂的强度。
因此，本领域仍需要鉴定增强宠物食品的适口性和/或调节其厚味的化合物的方法以及包含这些化合物的风味组合物。
发明内容
目前公开的主题提供了用于鉴定增强、增加和/或调节钙敏感受体的活性的化合物的方法。一旦鉴定，这些化合物可以包含在风味组合物中，其可以加入到各种宠物食品中以增加产品的适口性。例如，在本公开的某些实施方案中，这种风味组合物以有效增加宠物食品的厚味味道和/或适口性的量与宠物食品组合。
在某些实施方案中，一种鉴定增强、增加和/或调节钙敏感受体的活性和/或表达的化合物的方法包括在细胞中表达具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7中所示核苷酸序列的钙敏感受体，或其片段或变体。该方法可以进一步包括使表达钙敏感受体的细胞与测试化合物接触，并且测定与在不存在该化合物的情况下受体的活性和/或表达相比，在该化合物存在下钙敏感受体的活性和/或表达。
在某些实施方案中，一种鉴定增强、增加和/或调节钙敏感受体活性的化合物的方法包括在细胞中表达具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示氨基酸序列或其片段或变体的钙敏感受体。该方法可以进一步包括使表达钙敏感受体的细胞与测试化合物接触，并且测定与在不存在该化合物的情况下受体的活性和/或表达相比，在该化合物存在下钙敏感受体的活性和/或表达。
在某些实施方案中，本公开提供了一种鉴定调节钙敏感受体(CaSR)活性的组合物的方法，包括(a)使测试试剂与CaSR接触，(b)测定CaSR的活性，以及(c)选择增加CaSR活性的测试试剂作为组合物。
在某些实施方案中，本公开提供了一种鉴定调节钙敏感受体(CaSR)活性的组合物的方法，包括(a)使测试试剂与CaSR接触，(b)检测测试试剂与在CaSR的维纳斯捕蝇草结构域(Venus Flytrap domain，VFT)或7跨膜结构域(7transmembrane domain，7TM)中的一个或多个氨基酸之间的相互作用，以及(c)选择与一个或多个氨基酸相互作用的测试试剂作为组合物。
在某些实施方案中，本公开提供了一种鉴定调节钙敏感受体(CaSR)活性的组合物的方法，包括(a)使CaSR激动剂与CaSR接触，(b)测定CaSR的活性，(c)使测试试剂与CaSR接触，(d)测定CaSR的活性，以及(e)当(d)的活性大于(b)的活性时，选择测试试剂作为组合物。
前面已经相当广泛地概述了本申请的特征和技术优点，以便可以更好地理解下面的详细描述。本申请的附加特征和优点将在下文中描述，其形成本申请的权利要求的主题。本领域技术人员应当理解，所公开的概念和具体实施方案可以容易地用作修改或设计用于实现本申请的相同目的的其它结构的基础。本领域技术人员还应该认识到，这样的等同结构不背离所附权利要求中阐述的本申请的精神和范围。从下面的描述中将更好地理解被认为是本申请的特征的新颖特征，关于其组织和操作方法，以及另外的目的和优点。
附图说明
图1示出猫CaSR核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
图2示出犬CaSR核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。
图3示出人CaSR核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。
图4示出猫CaSR氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
图5示出犬CaSR氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
图6示出人CaSR氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。
图7示出猫CaSR和人CaSR氨基酸序列的序列比对。
图8示出犬CaSR和人CaSR氨基酸序列的序列比对。
图9示出猫CaSR和犬CaSR氨基酸序列的序列比对。
图10示出猫、犬和人CaSR的氨基酸序列的序列比对。
图11A-11B示出(A)猫、犬和人CaSR VFT结构域的氨基酸序列的序列比对；以及(B)在VFT结构域内的主要结构差异的3D描绘。
图12A-12B示出(A)猫、犬和人CaSR 7TM结构域的氨基酸序列的序列比对；以及(B)在7TM结构域内的主要结构差异的3D描绘。
图13A-13B示出谷胱甘肽和CaSR之间的相互作用的计算机模拟。显示了潜在相互作用的CaSR残基的子集。
图14示出猫CaSR的蛇形图(snake plot)。
图15示出犬CaSR的蛇形图。
图16示出人CaSR的蛇形图。
图17A-17B示出凯林德奥(calindol)(CaSR激动剂)和CaSR之间的相互作用的计算机模拟。描述了潜在相互作用的CaSR残基的子集。
图18A-18J示出在激动剂模式中通过10种配体激活fCaSR的体外细胞测定中所测定的10种fCaSR配体的剂量反应曲线。
图19A-19B示出在PAM模式中通过2种配体活化fCaSR的体外细胞测定中所测定的2种fCaSR配体的剂量反应曲线。
图20示出包含fCaSR编码区的pcDNA3.1_fCaSR载体克隆。
图21示出包含fCaSR编码区的pcDNA5TO_fCASR载体克隆。
图22示出具有Kozak序列和核苷酸取代Y987T、M1066C、R1269G和S3131G(SEQ IDNO:7)的猫CaSR核苷酸序列。
具体实施方式
本发明公开的主题涉及鉴定调节钙敏感受体的活性和/或表达的化合物的方法，其中所述化合物可以包含在风味组合物中，所述风味组合物可用于增加各种宠物食品例如营养完全的宠物食品或宠物零食的适口性和/或增强或改变其味道。
1.定义
在本说明书中使用的术语在本发明的背景中以及在使用每个术语的特定背景中通常具有其在本领域中的普通含义。某些术语在下文或说明书中的其它地方讨论，以向实施者提供对于描述本发明的方法和组合物以及如何制备和使用它们的额外指导。
如本文所用，当在权利要求和/或说明书中与术语“包括”结合使用时，词语“一个(a)”或“一个(an)”的使用可以表示“一个”，但是它也与“一个或多个”，“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。此外，术语“具有”、“包括”、“含有”和“包含”可互换，并且本领域技术人员认识到这些术语是开放式术语。
术语“约”或“大约”是指对于由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，其将部分地取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在3个或多于3个标准偏差内。或者，“约”可以表示给定值的至多20％、优选至多10％、更优选至多5％、和更优选至多1％的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可以表示在值的数量级内，优选在5倍以内，更优选在2倍以内。
如本文所用，“味道”是指由受试者味蕾中受体细胞的活化引起的感觉。在某些实施方案中，味道可以选自由甜味、酸味、咸味、苦味、厚味和鲜味组成的组。在某些实施方案中，“味道”可以包括游离脂肪酸味道。参见，例如Cartoni等人，神经学杂志(J.ofNeuroscience)，30(25):8376-8382(2010)，其内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，味觉通过“促味剂”在受试者中引起。在某些实施方案中，促味剂可以是合成促味剂。在某些实施方案中，促味剂由天然来源制备。
如本文使用，“味觉谱”是指味道的组合，例如甜味、酸味、咸味、苦味、鲜味、厚味和游离脂肪酸味中的一种或多种。在某些实施方案中，味觉谱由存在于组合物中的相同或不同浓度的一种或多种促味剂产生。在某些实施方案中，味觉谱是指由受试者或本领域中已知的任何测定法检测的味道或味道组合，例如甜味、酸味、盐味、苦味、鲜味、厚味和游离脂肪酸味，的强度。在某些实施方案中，修改、改变或变动味觉谱中的促味剂组合可改变受试者的感官体验。
如本文所用，“风味”是指一种或多种感官刺激，例如味道(味觉)、气味(嗅觉)、触感(触觉)和温度(热)刺激中的一种或多种。在某些非限制性实施方案中，暴露于风味的受试者的感官体验可以被分类为特定风味的特征体验。例如，风味可以由受试者识别为但不限于花香、柑橘、浆果、坚果、焦糖、巧克力、胡椒、烟熏、奶酪、肉味等风味。如本文所用，风味组合物可选自液体、溶液、干粉、喷雾剂、糊剂、悬浮剂及它们的任何组合。风味剂可以是天然组合物、人工组合物、性质等同物或它们的任何组合。
如本文可互换使用的，“芳香”和“气味”是指对刺激的嗅觉反应。例如，但不限于，芳香物质可以由被嗅觉系统的气味受体感知的芳香物质产生。
如本文所用，“风味谱(flavor profile)”是指感官刺激的组合，例如味道，诸如甜味、酸味、苦味、咸味、鲜味、厚味、游离脂肪酸味道，和/或嗅觉、触觉和/或热刺激。在某些实施方案中，风味谱包括有助于受试者的感官体验的一种或多种风味。在某些实施方案中，修改、改变或变动风味谱中的刺激的组合可以改变受试者的感官体验。
如本文所用，“适口性”可以指动物食用某种食品的总体意愿。增加宠物食品的“适口性”可以导致伴侣动物享受和接受宠物食品的增加，以确保动物食用“健康量”的宠物食品。如本文所用的术语宠物食物的“健康量”是指使伴侣动物能够维持或实现有助于其在微量营养素、大量营养素和热量方面的总体健康的摄入，例如在“玛氏宠物护理必需营养标准(Mars Petcare Essential Nutrient Standards)”中列出的。在某些实施方案中，“适口性”可以表示动物对于一种食品相对于另一种食品的相对偏好。例如，当动物对两种或更多种食品中的一种显示偏好时，优选的食品更“可口”，并且具有“增强的适口性”。在某些实施方案中，一种食品相对于一种或更多种其它食品的相对适口性，可以例如通过并排的自由选择比较来确定，例如通过食品的相对消耗或者指示适口性的其它适当的偏好测定。适口性可以通过标准测试方案确定，其中动物具有对两种食品的平等获得，例如称为“双碗测试(two-bowl test)”或“对比测试(versus test)”的测试。这种偏好可以来自任何的动物的感觉，但是可以尤其涉及味道、余味、气味、口感和/或质地。
术语“宠物食物”或“宠物食品”是指旨在由伴侣动物(诸如猫、狗、豚鼠、小鼠、兔、鸟和马)食用的产品或组合物。例如但不限于，伴侣动物可以是“家养”的猫诸如家猫(Felisdomesticus)。在某些实施方案中，伴侣动物可以是“家养”的狗，例如家犬(Canis lupusfamiliaris)。“宠物食物”或“宠物食品”可以包括任何食物、饲料、小吃、食品补充剂、液体、饮料、零食、玩具(可咀嚼和/或可食用的玩具)、膳食替代品或膳食替代物。
如本文所用，“营养完全”是指基于例如伴侣动物营养领域中的公认或主管当局的建议以适当的量和比例包含宠物食品的预期接受者的所有已知所需营养物的宠物食品。因此，这样的食物能够用作膳食摄入的唯一来源以维持生命，而无需添加补充营养来源。
如本文所用，“风味组合物”是指在动物或人类中调节(包括增强、增加、加强、减少、抑制或诱导)天然或合成的促味剂、风味剂、味觉谱、风味谱和/或质地谱(textureprofile)的味道、气味、风味和/或质地的至少一种化合物或其生物学上可接受的盐。在某些实施方案中，风味组合物包含化合物或其生物学上可接受的盐的组合。在某些实施方案中，风味组合物包括一种或多种赋形剂。
如本文所用，术语“调节”或“修改”是指受体的量、质量或特定活性的效应的增加或减少和/或受体的表达、活性或功能的增加或减少。本文所用的“调节剂”是指使用例如激动剂、拮抗剂及它们的同源物包括片段、变体和模拟物的计算机模拟(in silico)、体外和/或体内测定鉴定的任何抑制性或活化性化合物。
本文所用的“抑制剂”或“拮抗剂”是指降低、减少、阻断、阻止、延迟激活、失活、脱敏或下调目标受体的生物活性和/或表达或目标途径的调节化合物。
本文所用的“诱导剂”、“激活剂”或“激动剂”是指增加、诱导、刺激、打开、激活、促进、增强激活、敏化或上调目标受体或途径的调节化合物。
如本文所用，术语“载体”和“表达载体”是指线性或环状的DNA分子，其中可以整合适当大小的另一DNA序列片段。这样的一个或多个DNA片段可以包括提供由DNA序列片段编码的基因的转录的额外区段。额外区段可以包括但不限于：启动子、转录终止子、增强子、内部核糖体进入位点、非翻译区、多聚腺苷酸化信号、选择标记物、复制起点等。表达载体通常衍生自质粒、粘粒、病毒载体和酵母人工染色体。载体通常是含有来自几种来源的DNA序列的重组分子。
术语“可操作地连接”当应用于例如表达载体中的DNA序列时，指示序列被排列为使得它们协同作用以实现它们的预期目的，即启动子序列允许启动转录，转录通过连接的编码序列继续直到终止信号。
本文所用的术语“核酸分子”和“核苷酸序列”是指单链或双链共价连接的核苷酸序列，其中每个核苷酸上的3'和5'末端通过磷酸二酯键连接。核酸分子可以包括脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基，并且可以在体外合成制备或从天然来源分离。
本文可互换使用的术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”是指由至少两个氨基酸的连接形成的分子。一个氨基酸残基与下一个氨基酸残基之间的键是酰胺键，并且有时被称为肽键。多肽可以通过本领域已知的合适方法获得，包括从天然来源分离，在重组表达系统中表达，化学合成或酶促合成。该术语可适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
本文所用的术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及随后被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物和衍生物可以指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团键合的碳，所述R基团例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸甲基锍。此类类似物可具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构，但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的结构的化合物。
本文可互换使用的术语“分离的”或“纯化的”是指从与其天然相关的组分中除去的核酸、多肽或其它生物部分。术语“分离的”可以指与整个生物体分离和分开的多肽，该分子天然存在或在基本上不存在相同类型的其它生物大分子的情况下存在。关于多核苷酸的术语“分离的”可以指完全或部分缺乏通常天然与其相关的序列的核酸分子；或天然存在的但具有与其相关的异源序列的序列；或从染色体分离的分子。
如本文所用，术语“重组”可用于描述核酸分子，并且是指基因组、RNA、DNA、cDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸，其由于其来源或操作与其天然相关的全部或部分多核苷酸不相关。
本文所用的术语“融合”是指通过遗传或化学方法连接不同的肽或蛋白质区段，其中肽或蛋白质区段的连接端可以彼此直接相邻，或者可以通过接头或间隔区部分诸如氨基酸残基或其它连接基团分离。
2.钙敏感受体
本发明公开的主题提供用于所公开的方法中的钙敏感受体(CaSR)。本公开的钙敏感受体可以包括哺乳动物钙敏感受体，例如但不限于猫、犬和人。
在某些实施方案中，用于本公开主题的钙敏感受体包括具有SEQ ID NO：1或SEQID NO：7所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的猫钙敏感受体，包括其片段(例如，其功能片段)及其变体。
在某些实施方案中，用于本公开主题的钙敏感受体包括具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的犬钙敏感受体，包括其片段(例如，其功能片段)及其变体。
在某些实施方案中，用于本公开主题的钙敏感受体包括具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的人钙敏感受体，包括其片段(例如，其功能片段)及其变体。
在某些实施方案中，用于本发明公开的主题的钙敏感受体可包括受体，所述受体包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：7具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的核苷酸序列。
在某些实施方案中，用于本发明公开的主题的钙敏感受体可以包括受体，所述受体包含与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
两个氨基酸序列或两个核苷酸序列的同一性百分比可以通过为了最佳比较目的比对序列来确定(例如，可以在第一序列中引入缺口以与序列最佳比对)，并比较在相应位置的氨基酸残基或核苷酸。同一性百分比可以通过所比较的序列中相同的氨基酸残基或核苷酸的数目来确定(例如，同一性％＝相同位置的数目/位置的总数×100)。
两个序列之间百分比同一性的测定可以使用本领域技术人员已知的数学算法来确定。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是Karlin与Altschul(1990)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87:2264-2268的算法，其修改为Karlin与Altschul(1993)美国国家科学院院刊90:5873-5877，其公开内容通过引用整体并入本文。Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序已经并入了这样的算法。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序进行，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的氨基酸序列同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的间隙比对(gapped alignment)，可以按Altschul等人(1997)核酸研究(Nucleic Acids Res.)25:3389-3402中所述使用Gapped BLAST，其公开内容通过引用整体并入本文。或者，PSI-Blast可用于执行迭代搜索，其检测分子之间的距离关系。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于比较序列的数学算法的另外的非限制性实例是Myers和Miller,CABIOS(1989)的算法，其公开内容通过引用整体并入本文。作为CGC序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(版本2.0)已经并入了这样的算法。本领域已知的用于序列分析的算法的其它非限制性实例包括ADVANCE和ADAM，如Torellis和Robotti(1994)(生物科学的计算机应用)Comput.Appl.Biosci.)，10:3-5；和Pearson和Lipman(1988)国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)85:2444-8中所描述，其公开内容通过引用整体并入本文。在FASTA中，ktup是设置搜索的灵敏度和速度的控制选项。
在某些实施方案中，所公开的主题提供了分离的或纯化的钙敏感受体和/或其变体和片段的用途。所公开的主题还包括序列变体的用途。在某些实施方案中，变异可以发生在钙敏感受体的核苷酸序列的编码区和非编码区之一或两者中。变体可以包括在生物体中由相同遗传基因座编码的基本上同源的蛋白质，即等位基因变体。变体还包括来自生物体例如猫中其它遗传基因座的蛋白质，但是与钙敏感受体具有基本的同源性，即同源物。变体还可以包括与钙敏感受体基本上同源但来源于另一生物体的蛋白质，即直系同源物。变体还包括与通过化学合成产生的钙敏感受体基本上同源的蛋白质。变体还包括与通过重组方法产生的钙敏感受体基本上同源的蛋白质。
可以使用本领域熟知的方法鉴定直系同源物、同源物和等位基因变体。这些变体可以包括编码受体的核苷酸序列，其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列或它们的片段至少约60-65％、约65-70％、约70-75％、约80-85％、约90-95％、约95-99％或以上同源。这样的核酸分子可以容易地鉴定为能够在严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列或它们的片段杂交。在某些实施方案中，当氨基酸序列与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或它们的片段至少约60-65％、约65-70％、约70-75％、约80-85％、约90-95％、约95-99％或以上同源时，两个多肽(或其区域)基本上同源的。根据所公开的主题，基本上同源的氨基酸序列将由与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的核酸序列或其部分杂交的核酸序列在严格条件下编码。
用于所公开主题的方法中的钙敏感受体包括具有添加、缺失或取代的氨基酸残基(变体)的钙敏感受体，其基本上不改变受体的生物活性。可以改变而不影响生物活性的钙敏感受体的那些单个位点或区域可以通过例如钙敏感受体胞外结构域的结构的检查来确定。或者和/或另外，可以根据经验通过丙氨酸扫描诱变确定容许氨基酸取代的那些受体区域(Cunningham等人，科学(Science)244，1081-1085(1989)，其公开内容通过引用并入本文)。在丙氨酸扫描诱变方法中，所选择的氨基酸残基分别被中性氨基酸(例如丙氨酸)取代，以确定对生物活性的影响。
通常认为保守型氨基酸变化最不可能干扰多肽的结构和/或功能。因此，所公开的主题包括钙敏感受体内的一个或多个保守型氨基酸变化。保守型氨基酸变化通常涉及用结构和/或功能相似的一种氨基酸取代另一种氨基酸(例如，具有大小、电荷和形状类似的侧链的氨基酸)。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已经定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。在某些实施方案中，钙敏感受体内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的蛋白质的保留功能。可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变，将修饰引入本公开的钙敏感受体。如果这种取代导致生物活性的保留，则可以引入更多的实质性变化和/或可以进行其它添加/缺失并筛选所得产物。在某些实施方案中，缺失或添加可以是5-10个残基，或者2-5个氨基酸残基或1-2个残基。
所公开的主题还提供了包含钙敏感受体或其片段的融合蛋白。在某些实施方案中，所公开的主题提供钙敏感受体或其功能片段与免疫球蛋白重链恒定区的融合蛋白。在某些实施方案中，本公开的融合蛋白可以包括可检测标记物，官能团例如载体、标记、稳定序列或可以检测钙敏感受体激动剂结合的机制。标记的非限制性实施方案包括FLAG标签、His标签、MYC标签、麦芽糖结合蛋白和本领域已知的其它标签。本发明公开的主体还提供了编码这种融合蛋白的核酸，含有编码融合蛋白的核酸的载体和包含这种核酸或载体的宿主细胞。在某些实施方案中，可以在钙敏感受体的氨基末端(N-末端)或钙敏感受体的羧基末端(C-末端)进行融合。
在某些实施方案中，本文公开的钙敏感受体可以在序列的N末端和/或C末端包含额外的氨基酸，例如当用于本公开主题的方法中时。在某些实施方案中，额外的氨基酸可以帮助固定多肽用于筛选目的，或允许多肽成为融合蛋白的一部分，如上所述，以便于检测生物活性。
3.鉴定CaSR调节化合物的方法
本公开还提供了用于鉴定调节钙敏感受体的活性和/或表达的化合物的方法。例如，但不作为限制，调节剂可以是激动剂或拮抗剂。本发明公开的主题提供了用于鉴定调节上述钙敏感受体的活性和/或表达的化合物的计算机模拟和体外方法。
3.1计算机模拟方法
本发明公开的主题还提供了用于鉴定可能与钙敏感受体相互作用和/或调节钙敏感受体的活性和/或表达的化合物的计算机模拟方法。
在某些实施方案中，所述方法可包括预测钙敏感受体的三维结构(3D)，并用推定的钙敏感受体调节化合物(即，测试化合物)筛选预测的3D结构。该方法还可包括通过分析与推定的化合物和受体的氨基酸的潜在相互作用来预测推定的化合物是否将与受体的结合位点相互作用。该方法可以进一步包括通过确定化合物的3D结构是否适合受体的3D结构的结合位点来鉴定可结合和/或调节钙敏感受体的生物活性的测试化合物。
在某些实施方案中，用于所公开的方法的钙敏感受体可以具有SEQ ID NO:4、SEQID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其片段或变体。在某些实施方案中，用于本发明公开的主题的钙敏感受体可包括受体，所述受体包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6或其片段或变体具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，用于所公开的方法的钙敏感受体可以具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的核苷酸序列或其片段或变体。在某些实施方案中，用于本发明公开的主题的钙敏感受体可包括受体，所述受体包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7或其片段或变体具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的核苷酸序列。
可使用所公开的方法测试的化合物(例如可能的钙敏感受体调节剂)的非限制性实例包括任何小的化合物或任何生物实体，诸如本领域已知的肽、盐、氨基酸和厚味化合物，例如谷胱甘肽。在某些实施方案中，测试化合物可以是小化学分子。
在某些实施方案中，钙敏感受体的结构模型可以使用其它GPCR的晶体结构作为同源建模的模板来构建。例如，而不是作为限制，可以使用C组GPCR的晶体结构产生结构模型。在某些实施方案中，钙敏感受体的结构模型可以基于已知的GPCRs的晶体结构或其组合。(参见例如Lee等人，欧洲药理学杂志(Eur J Pharmacol)，2015年5月14日，pii:S0014-2999(15)30012-1，其通过引用整体并入本文)。在某些实施方案中，可以基于mGluR蛋白的晶体结构产生钙敏感受体的结构模型。例如，但不作为限制，可以基于具有蛋白质数据库(PDB)ID No.1EWK的晶体结构产生钙敏感受体的维纳斯捕蝇草结构域(VFT)的结构模型。在某些实施方案中，钙敏感受体的7跨膜结构域(7TM)的结构模型可以基于具有PDB ID No.4OR2和PDB ID No.4OO9的mGluR蛋白的晶体结构产生。图13描绘了可以在所公开的计算机模拟方法中使用的钙敏感受体的结构模型。可以使用本领域已知的任何合适的建模软件。在某些实施方案中，建模器软件包可用于产生三维蛋白质结构。
在某些实施方案中，鉴定结合钙敏感受体的化合物的计算机模拟方法包括测定测试化合物是否与钙敏感受体相互作用结构域的一个或多个氨基酸相互作用，如本文所述。
通过本公开的计算机模拟方法鉴定的化合物可以使用本文公开的体外方法进一步测试。
3.2钙敏感受体结合位点
本申请提供了筛选调节钙敏感受体(例如猫科动物、犬科动物或人钙敏感受体)的活性的化合物的方法，其中所述化合物与钙敏感受体的一种或多种氨基酸相互作用。在某些实施方案中，钙敏感受体的结合位点包括受体的7跨膜结构域(7TM)或受体的维纳斯捕蝇草结构域(VFT)结构域内的氨基酸，并且可以通过使用如本文所述的计算机模拟建模产生该受体的相互作用图来鉴定。在一个非限制性实例中，7TM或VFT相互作用图中氨基酸的存在意味着残基位于配体结合环境附近，并与配体相互作用。
在某些实施方案中，化合物与本文所述钙敏感受体的一个或多个氨基酸之间的相互作用可以包含一个或多个氢键、共价键、非共价键、盐桥、物理相互作用及它们的组合。相互作用也可以是本领域已知的配体受体相互作用的任何相互作用特征。这样的相互作用可以通过例如定点诱变、x射线晶体学、x射线或其它光谱方法、核磁共振(NMR)、交联评估、质谱或电泳、低温显微镜法(cryo-microscopy)、置换分析基于已知的激动剂、结构测定及它们的组合来确定。在某些实施方案中，例如通过理论手段，例如使用分子对接、分子建模、分子模拟或本领域普通技术人员已知的其它手段将化合物对接到猫或犬钙敏感受体结合袋中，通过计算机模拟测定相互作用。
在某些实施方案中，相互作用是氢键相互作用。
在某些实施方案中，相互作用是疏水相互作用。
在某些实施方案中，根据本文描述的调节钙敏感受体的活性的方法鉴定的化合物与钙敏感受体的VFT结构域中的一个或多个氨基酸相互作用。在某些实施方案中，化合物相互作用的氨基酸包含钙敏感受体的ASN64、PHE65、ASN102、THR145、SER169、SER170、ASP190、GLN193、ASP216、TYR218、SER271、SER272、GLY273、GLU297、ALA298、TRP299、ALA300、SER301、SER302、LEU304、ALA321、TYR411、THR412和HIS413中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23个或更多个，例如，所述钙敏感受体包括SEQ ID NO：4所述的猫钙敏感受体，SEQ ID NO：5所述的犬钙敏感受体或SEQ ID NO：6所述的人钙敏感受体。
在某些实施方案中，根据本文描述的调节钙敏感受体的活性的方法鉴定的化合物与钙敏感受体的跨膜结构域例如七跨膜结构域(7TM)中的一个或多个氨基酸相互作用。在某些实施方案中，化合物相互作用的氨基酸包含钙敏感受体的ARG680、PHE684、GLY685、PHE688、Helix 3上的VAL689、Helix 4上的GLN735、ALA772、PHE775、LEU776、THR780、Helix5上的CYS781、PHE814、VAL817、TRP818、Helix 6上的PHE821、GLU837、ALA840、ILE841、Helix7上的ALA844，以及EC2环上的MET771和GLU767中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个，例如，所述钙敏感受体包括SEQ ID NO：4所述的猫钙敏感受体，SEQ ID NO：5所述的犬钙敏感受体，或SEQ ID NO：6所述的人钙敏感受体。
3.3体外方法
本发明还提供了用于鉴定可以调节钙敏感受体的活性和/或表达的化合物的体外方法。
用于本发明公开方法的钙敏感受体可以包括本文公开的分离的或重组的钙敏感受体或表达钙敏感受体的细胞。在某些实施方案中，用于所公开的方法的钙敏感受体可以具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其片段或变体。在某些实施方案中，用于本公开方法的钙敏感受体可以与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其片段或变体具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在某些实施方案中，用于所公开的方法的钙敏感受体可以具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7的核苷酸序列或其片段或变体。在某些实施方案中，用于本发明公开的主题的钙敏感受体可包括受体，所述受体包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7或其片段或变体具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的核苷酸序列。
在某些实施方案中，用于鉴定调节钙敏感受体的活性和/或表达的化合物的方法包括在不存在和/或存在测试化合物的情况下测量钙敏感受体的生物活性。在某些实施方案中，该方法可以包括在不同浓度的测试化合物存在下测量钙敏感受体的生物活性。该方法可以进一步包括鉴定与在不存在测试化合物的情况下钙敏感受体的活性和/或表达相比导致钙敏感受体的活性和/或表达的调节的测试化合物。
在某些实施方案中，根据本文所述方法鉴定的化合物将钙敏感受体的生物活性与当化合物不存在时的钙敏感受体的生物活性相比增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。
在某些实施方案中，所述方法可以进一步包括组合分析两种或更多种、三种或更多种或者四种或更多种测试化合物。在某些实施方案中，两种或更多种、三种或更多种或者四种或更多种测试化合物可以来自不同类别的化合物，例如氨基酸和小的化合物。例如，但不作为限制，该方法可以包括在一种或多种氨基酸测试化合物存在下分析一种或多种小的化学测试化合物对钙敏感受体的生物活性和/或表达的影响。在某些实施方案中，用于鉴定钙敏感受体的化合物活性和/或表达的方法包括在盐(例如钙盐)存在下分析测试化合物对钙敏感受体的生物活性和/或表达的影响。
在某些实施方案中，用于鉴定调节钙敏感受体的活性和/或表达的化合物的方法包括确定化合物是否例如作为激动剂或拮抗剂直接调节受体。在某些实施方案中，该方法包括确定化合物是否例如通过增强或降低其它化合物对激活或抑制受体活性的作用间接调节受体的活性(例如作为变构调节剂)。
在某些实施方案中，用于鉴定调节钙敏感受体的活性和/或表达的化合物的方法包括在细胞系中表达钙敏感受体，并在存在和/或不存在测试化合物时测量受体的生物活性。该方法可以进一步包括通过确定在测试化合物存在下受体活化与测试化合物不存在时受体的活性相比是否存在差异来鉴定调节受体活性的测试化合物。在某些实施方案中，推定的钙敏感受体调节剂的选择性可以通过比较其对其它GPCR(G蛋白偶联受体)或味觉受体(例如鲜味、脂肪酸、T1R等)受体的作用来评价。
在所公开的方法中的受体的活化可以通过使用标记化合物和/或试剂来检测。在某些实施方案中，钙敏感受体的活性可以通过检测第二信使例如但不限于cAMP、cGMP、IP3、DAG或钙来确定。在某些实施方案中，钙敏感受体的活性可以通过检测细胞内钙水平来确定。监测可以通过发光或荧光检测，例如通过钙敏感性荧光染料的方式。在某些实施方案中，细胞内钙水平可以使用细胞染料，例如荧光钙指示剂如钙4(Calcium 4)测定。在某些实施方案中，细胞内钙水平可以通过测量钙结合到钙结合蛋白例如钙调蛋白的水平来确定。或者和/或另外，可以通过检测钙敏感受体的一个或多个下游蛋白靶的磷酸化、转录水平和/或蛋白水平来确定钙敏感受体的活性。
在所公开的方法中使用的细胞系可以包括能够表达钙敏感受体的任何细胞类型。可用于所公开的方法的细胞的非限制性实例包括HeLa细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(COS细胞)、非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocyte)，HEK-293细胞和鼠3T3成纤维细胞。在某些实施方案中，所述方法可包括在HEK-293细胞中表达钙敏感受体。在某些实施方案中，所述方法可以包括在COS细胞中表达钙敏感受体。在某些实施方案中，细胞组成型表达钙敏感受体。在另一个实施方案中，细胞对CaSR的表达是诱导型的。
在某些实施方案中，细胞表达钙结合光蛋白，其中光蛋白在结合钙时发光。在某些实施方案中，钙结合光蛋白包含蛋白质clytin。在某些实施方案中，所述clytin是重组clytin。在某些实施方案中，所述clytin包括分离的clytin，例如从Clytia gregarium分离的clytin。在某些实施方案中，钙结合光蛋白包含蛋白质水母发光蛋白(aequorin)，例如重组水母发光蛋白或分离的水母发光蛋白，例如从维多利亚多管发光水母(Aequoreavictoria)分离的水母发光蛋白。在某些实施方案中，钙结合光蛋白包含蛋白质奥贝林(obelin)，例如重组奥贝林(obelin)或分离的奥贝林(obelin)，例如从薮枝螅(Obelialongissima)分离的奥贝林(obelin)。
在某些实施方案中，细胞中钙敏感受体的表达可以通过将编码钙敏感受体的核酸引入细胞中来进行。例如，但不作为限制，可以将具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的核酸或其片段导入细胞。在某些实施方案中，将核酸引入细胞可以通过本领域已知的任何方法进行，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。本领域已知用于将外源基因导入细胞的多种技术(参见例如Loeffler和Behr，酶学方法(Meth.Enzymol)，217:599-618(1993)；Cohen等人，酶学方法，217:618-644(1993)，Cline，药学治疗(Pharmac.Ther.)29:69-92(1985)，其公开内容通过引用其整体并入本文)，并且可以根据所公开的主题来使用。在某些实施方案中，该技术可以提供核酸向细胞的稳定转移，使得核酸可被细胞表达，并且是可遗传的并且可通过其后代表达。在某些实施方案中，该技术可以提供核酸向细胞的瞬时转移，使得核酸可被细胞表达，其中遗传力和表达力在细胞后代的后续世代中降低。
在某些实施方案中，编码钙敏感受体的核酸包含在导入细胞中的克隆载体中，例如pcDNA3.1载体或pcDNA5 TO载体。
在某些实施方案中，该方法可以包括鉴定结合钙敏感受体的化合物。该方法可以包括使钙敏感受体与测试化合物接触，并测量化合物和钙敏感受体之间的结合。例如，但不作为限制，该方法可以包括在无细胞系统中提供分离的或纯化的钙敏感受体，并使受体与无细胞系统中的测试化合物接触，以确定测试化合物是否结合钙敏感受体。在某些实施方案中，该方法可以包括使在细胞表面上表达的钙敏感受体与候选化合物接触，并检测候选化合物与钙敏感受体的结合。结合可以直接测量，例如通过使用标记的测试化合物，或者可以间接测量。在某些实施方案中，检测包括检测由化合物与钙敏感受体的结合引起的细胞中的生理事件，例如细胞内钙水平的增加。例如，但不作为限制，可以通过荧光检测，如钙敏感性荧光染料，通过发光检测，或本领域已知的任何其它检测方法进行检测。
在某些非限制性实施方案中，体外测定包括表达对细胞天然的钙敏感受体的细胞。这种表达天然钙敏感受体的细胞的实例包括例如但不限于狗(犬科动物)和/或猫(猫科动物)味觉细胞(例如初级味觉受体细胞)。在某些实施方案中，从狗和/或猫分离表达钙敏感受体的狗和/或猫味觉细胞，并在体外培养。在某些实施方案中，味觉感受器细胞可以是永生化的，例如，使得从狗和/或猫分离的细胞可以在培养物中增殖。
在某些实施方案中，可通过基因编辑来诱导细胞中钙敏感受体的表达，例如通过使用CRISPR基因编辑系统将钙敏感受体基因并入细胞的基因组中，或者编辑或修饰对细胞天然的钙敏感受体基因。
在某些实施方案中，鉴定结合钙敏感受体的化合物的体外方法包括测定测试化合物是否如本文所述地与钙敏感受体相互作用结构域的一个或多个氨基酸相互作用。
在某些实施方案中，鉴定为钙敏感受体调节剂的化合物可以在其它分析方法中进一步测试，包括但不限于体内测定，以确认或定量它们的调节活性。
在某些实施方案中，本文所述的方法可以包括确定钙敏感受体调节剂是否是厚味增强化合物，例如钙敏感受体激动剂。
在某些实施方案中，鉴定钙敏感受体调节剂的方法可以包括比较测试化合物对钙敏感受体激动剂的作用。例如，当与钙敏感受体激动剂接触时，与受体的活性相比，增加受体活性的测试化合物可以被选用作为钙敏感受体调节化合物(例如作为激动剂)。
在某些实施方案中，鉴定钙敏感受体调节剂的方法可包括确定当受体与激动剂接触时测试化合物是否调节受体的活性，或测试化合物是否可调节正变构调节剂(positiveallosteric modulator，PAM)的活性。增加或降低所述激动剂或PAM对受体的作用的测试化合物可以被选用作为钙敏感受体调节化合物(例如作为变构调节剂)。
可以根据所述方法使用的钙传感受体激动剂和PAM可以包含表1所述的一种或多种化合物。
表1.CaSR激动剂和PAM
Figure BDA0001266161520000211
Figure BDA0001266161520000221
在某些实施方案中，本发明的钙敏感受体调节剂包含钙敏感受体调节剂的盐，例如但不限于乙酸盐或甲酸盐。在某些实施方案中，钙敏感受体调节剂盐包含阴离子(-)(例如但不限Cl-、O2-、CO3 2-、HCO3 -、OH-、NO3 -、PO4 3-、SO4 2-、CH3COO-、HCOO-和C2O4 2-)，其通过离子键与阳离子(+)(例如但不限于Al3+、Ca2+、Na+、K+、Cu2+、H+、Fe3+、Mg2+、NH4 +和H3O+)键合。在其它实施方案中，钙敏感受体激动剂盐包含通过离子键与阴离子(-)键合的阳离子(+)。
在某些实施方案中，本申请的钙敏感受体调节剂通过钙敏感受体(“厚味感受器”)例如猫或犬钙敏感受体的计算机模拟建模来鉴定，其中本申请的钙敏感受体激动剂包含适合在钙敏感受体的结合位点内的结构。在某些实施方案中，计算机模拟方法包括上文和本申请的实施例部分中描述的计算机模拟方法。
在某些实施方案中，本申请的钙敏感受体调节剂通过体外方法鉴定，其中钙敏感受体激动剂化合物激活和/或调节本文公开的由体外细胞表达的钙敏感受体。在某些实施方案中，体外方法包括上文和本申请的实施例部分中描述的体外方法。
实施例
通过参考以下实施例将更好地理解本发明公开的主题，这些实施例作为本发明的示例提供，而非用于限制。
实施例1-使用计算机模拟测定法鉴定CaSR调节剂。
本实施例描述了猫和犬钙敏感受体(CaSR)的计算机建模以鉴定推定的化合物调节剂。
使用计算机方法分析钙敏感受体的三维结构以鉴定可用于选择性调节钙敏感受体的多肽区域。基于C类GPCR的结构产生钙敏感受体的各个结构域的结构同源性模型(参见Binet等人，生物学和化学杂志(J.Biol.Chem)，282(16):12154-63(2007)；Wu等人，科学(Science)，344(6179):58-64(2014)；以及Dore等人，自然(Nature)511:557-562(2014)，其各自通过引用其整体并入本文)。同源性模型是使用来自Accelrys的Discovery Studio(DS)程序套件构建的。具体地，使用来自DS的Modeller程序(参见Eswar等人，现有生物信息学方法(Current Protocols in Bioinformatics)，增刊15:5.6.1-5.6.30(2006)，其通过引用其整体并入本文)。“计算机模拟”筛选用于鉴定与钙敏感受体的结构域相互作用的化合物。
GPCR蛋白家族C组包括T1R1、T1R2、T1R3、CaSR、GabaB和mGlu蛋白。C组蛋白具有：(1)大的外部结构域，称为维纳斯捕蝇草结构域(VFT)，(2)7跨膜结构域(7TM)，和(3)连接VFT和7TM的富含半胱氨酸的结构域。进行猫和犬CaSR的氨基酸序列的序列比对，并显示出总体95％的序列同一性(图9)。进行猫、犬和人CaSR的氨基酸序列的序列比对，并显示出总体93.2％的序列同一性(图10)。CaSR的VFT结构域由氨基酸1-523组成，7TM结构域由氨基酸601-865组成。猫、犬和人VFT结构域的活性位点和它们的7TM结构域的变构位点几乎相同(图11和图12)。在猫和人CaSR VFT的活性位点附近仅观察到两处差异(图11)。图12显示在Corey-Pauling-Koltun(CPK)表示中的结构上显示7TM结构域内的氨基酸差异。在CaSR的变构位点的组成中没有观察到差异。
基于从蛋白质数据库(PDB)获得的mGlu的许多晶体结构产生CaSR受体的VFT结构域的同源性模型。在mGluR1的VFT结构域(来自PDB的1EWK结构)和VFT结构域的CaSR比对之间存在27％的序列同一性。谷胱甘肽，一种已知的CaSR激动剂，对接在CaSR的铰链区(图13)。不受特定理论的约束，似乎谷胱甘肽结合CaSR的VFT结构域的铰链区，其中谷胱甘肽的羧基端与CaSR的主链结合形成氢键(图13)。观察到谷胱甘肽与氨基酸ASN64、PHE65、ASN102、THR145、SER169、SER170、ASP190、GLN193、ASP216、TYR218、SER271、SER272、GLY273、GLU297、ALA298、TRP299、ALA300、SER301、SER302、LEU304、ALA321、TYR411、THR412和HIS413具有潜在的相互作用(图13)。
苯丙氨酸，一种可结合CaSR的化合物，与钙(Ca2+)一起在计算机模拟模型中对接，钙对接在CaSR的铰链区。Ca2+与ASP216和GLU297形成盐桥，苯丙氨酸的羧基与CaSR的铰链区和钙形成相互作用。以下氨基酸显示与苯丙氨酸具有相互作用：TYR218、THR145、SER147、SER170和SER272。
基于来自PDB的4OR2和4OO9的晶体结构产生猫和犬CaSR 7M结构域的同源性模型(参见图14的螺旋图；还参见图14、15和16的犬、猫和人CaSR的螺旋图)。4OR2是结合至负变构调节剂(NAM)的C组GPCR的mGluR1的跨膜结构域的晶体结构(参见Wu等人，科学(Science)，344(6179):58-64(2014)，其通过引用其整体并入本文)。4OO9是来自结合NAM的C组GPCR的mGluR5的跨膜结构域的晶体结构(参见Dore等人，自然(Nature)511:557-562(2014)，其通过引用其整体并入本文)。在mGluR1的7TM结构域(来自PDB的4OR2结构)和CaSR7TM结构域之间存在约30％的序列同一性。已知的有效正变构调节剂calindol对接至人、犬和猫CaSR的跨膜结构域的变构位点中(图17)。使用来自BioPredict的对接程序BioDock。观察到calindol与人、犬和猫CaSR的变构位点的以下氨基酸具有潜在相互作用：ARG680、PHE684、GLY685、PHE688、Helix 3上的VAL689、Helix 4上的GLN735、ALA772、PHE775、LEU776、THR780、Helix 5上的CYS781、PHE814、VAL817、TRP818、Helix 6上的PHE821、GLU837、ALA840、ILE841、Helix 7上的ALA844，和在CaSR的EC2环上的MET771和GLU767。
实施例2-使用体外测定法鉴定猫CaSR激动剂。
本实施例描述了用于鉴定调节猫钙敏感受体的活化的化合物的体外测定。
选择通过用如上文实施例1中详细描述的钙敏感受体进行的计算机模拟建模鉴定的化合物作为推定的钙敏感受体调节剂，用于进一步的体外测试。所选激动剂化合物的体外功能表征用于评价推定的激动剂化合物在激活钙敏感受体中的有效性。
稳定表达钙敏感受体的HEK293细胞暴露于推定的化合物以调节钙敏感受体的活性和/或表达。钙敏感受体的激活通过使用钙敏感性荧光染料的细胞内钙水平的变化来检测。不表达钙敏感受体或不与该化合物接触的细胞用作对照。使用
Figure BDA0001266161520000251
Tetra或
Figure BDA0001266161520000252
3进行数据采集。
对于每个推定的钙敏感受体调节剂，产生剂量反应曲线，并且确定推定的钙敏感受体调节剂的EC50值。术语半最大有效浓度(EC50)是指在指定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间一半处的响应的化合物的浓度。
实施例3-使用体外测定鉴定犬CaSR激动剂。
本实施例描述了用于鉴定调节犬钙敏感受体的活化的化合物的体外测定。
选择通过用如上文实施例1中详述的钙敏感受体进行计算机模拟建模而鉴定的化合物，作为推定的钙敏感受体调节剂，用于进一步的体外测试。所选调节剂的体外功能表征用于评价推定的激动剂化合物在激活钙敏感受体中的有效性。
稳定表达犬CaSR的HEK293细胞暴露于推定的化合物以调节钙敏感受体的活性和/或表达。钙敏感受体的激活通过使用钙敏感性荧光染料的细胞内钙水平的变化来检测。不表达钙敏感受体或不与该化合物接触的细胞用作对照。使用
Figure BDA0001266161520000253
Tetra或
Figure BDA0001266161520000254
3进行数据采集。
对于每个推定的钙传感受体调节剂，产生剂量反应曲线，并且确定推定的钙敏感受体调节剂的EC50值。术语半最大有效浓度(EC50)是指在指定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间一半处的响应的化合物的浓度。
实施例4-用于鉴定猫CaSR调节剂的体外测定
本实施例描述了用于鉴定调节猫钙敏感受体的活化的化合物的体外测定。
小结。合成了来自具有SEQ ID NO:7所述序列的家猫(Felis catus)(fCaSR)的钙敏感受体(CaSR、GPCR(3、C或谷氨酸家族)，其天然地偶联到Gαq/11和Gαi(配体导向的信号传导))的全长编码序列，并亚克隆到合适的表达载体中。在两种哺乳动物细胞系(HEK-natClytin和HEK T-Rex/natClytin)中稳定转染猫CaSR表达构建体，两种细胞系允许通过发光检测细胞内钙水平的变化。使用纯的所选克隆(K 5.1)在激动剂和正变构调节剂(PAM)效应的高通量筛选(HTS)多板测试中分析12种CaSR配体(包括钙作为参考激动剂对照)。7个测试的配体(包括钙对照)被鉴定为激动剂，2个被鉴定为CaSR的PAM，表明本研究描述的体外细胞测定是适合HTS的猫CaSR受体的可靠的、可重复的和稳定的基于功能细胞的测定。
结果。用包含fCaSR的载体转染HEK-NatClytin和HEK T-Rex/natClytin细胞。平行进行模拟转染作为阴性对照。在抗生素选择后，进行两个转染的靶和模拟池(mock pool)的1°有限稀释，然后用钙作为参照激动剂并使用
Figure BDA0001266161520000261
Tetra筛选系统从活化的fCaSR读出的发光光蛋白进行分析。基于克隆库分析结果，选择HEK T-Rex/natClytin应答克隆用于进一步评估。进行所选克隆的2°有限稀释。表征了4个2°有限稀释克隆，并且对于细胞生长、细胞密度和细胞接种时间条件，对于DMSO敏感性，对于随时间的信号稳定性，以及对于冷冻细胞用途，彻底优化两个反应性克隆(K1.5，K10.3)。
在HTS多板测试中分析最终的纯的所选克隆(K 5.1)的12个CaSR配体(包括钙作为参照激动剂对照)的激动剂或正变构调节剂(PAM)作用。将10.000cw的K 5.1接种在含有1μg/mL多西环素的培养基中的聚-D-赖氨酸包被的384孔MTP上。24小时后进行12个配体(包括钙对照)的筛选。在激动剂模式测试中通过配体激活CaSR的剂量反应曲线显示在图18中。在PAM模式测试中由西那卡塞和calindol的配体激活CaSR的剂量反应曲线显示在图19中。如表2所述，7个测试的配体(包括钙对照)活化的CaSR作为激动剂，和2个(西那卡塞和calindol)活化的CaSR作为PAM。对于作为激动剂或PAM激活CaSR的每种配体，测定配体的EC50值。术语半最大有效浓度(EC50)是指在指定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间一半处的响应的化合物的浓度。
表2.CaSR配体作为激动剂或PAM对CaSR激活的影响
化合物 最大剂量 激动剂EC<sub>50</sub> 强化剂(PAM)EC<sub>50</sub>
钙(Ca<sup>2+</sup>) 15mM 1.5mM 未活化
镁(Mg<sup>2+</sup>) 30mM 6.1mM 未活化
精胺 3mM 0.5mM 未活化
亚精胺 3mM 1.3mM 未活化
腐胺 30mM 未活化 未活化
L-谷胱甘肽 30mM 8.2mM 未活化
新霉素 30mM 10mM 未活化
聚-L-精氨酸 60μg/mL 4.6μg/mL 未活化
西那卡塞 100μM 未活化 1.0μM
Calindol 100μM 未活化 1.9μM
方法
将猫钙敏感受体克隆到组成型表达载体中。家猫CaSR基因(fCaSR)由GenBank登录号：NM_001164654.1编码，并表达由GenBank登录号NP_001158126描述的蛋白。通过GeneArt(构建体15AAQ7BP_fCaSR_pMK)，用Kozak序列Y987T、M1066C、R1269G和S3131G合成fCaSR编码序列(SEQ ID NO:7)。从具有5'NotI-3'ApaI的构建体中切下编码序列，并插入用相同限制酶打开的pcDNA3.1载体中。在用BamHI酶进行限制性分析以筛选阳性构建体后，选择具有正确DNA片段化(6217+2781pb)的克隆K4。通过测序证实了整个fCaSR编码区的存在。包含fCaSR编码区的pcDNA3.1_fCaSR载体克隆显示于图20中。
将猫钙敏感受体克隆到T-REx TM系统的可诱导表达载体中。将上述fCaSR编码序列(SEQ ID NO:7)插入用相同限制酶打开的pcDNA5 TO载体中。在用BamHI酶进行限制性分析以筛选阳性构建体后，选择具有正确DNA片段化(5888+2781pb)的克隆K14。通过测序证实了整个fCaSR编码区的存在。包含fCaSR编码区的pcDNA5TO_fCASR载体克隆显示于图21中。
HEK-natClytin和HEK-293T-REx细胞系的转染。通过电穿孔进行转染。通过使用Gene Pulser II电穿孔仪(伯乐(Biorad))(参数：300伏，950μF)，用总量为10μg的DNA构建体转染从铺满60-70％的培养瓶中分离的2x106个细胞。将转染的细胞立即在野生型完全培养基中稀释并接种在T75培养瓶中。48小时后，将适当的抗生素浓度加入培养基中，并将细胞在37℃5％CO2下培养约3周以产生稳定的池(pool)。
CaSR受体活化的检测。通过检测Ca2+敏感性光蛋白发光，分析转染的细胞对参照激动剂(钙)或各种CaSR配体的响应。根据以下程序之一在384孔格式(384well format)中进行实验：
·将7.500cw涂布在聚-D-赖氨酸涂覆的384孔微量滴定板(MTP)上。24小时后，手动弃去培养基并用含有1μg/mL多西环素的新鲜培养基替换。然后，在接种后48小时进行实验。
·将10.000cw涂布在含有1μg/mL多西环素的培养基中的聚-D-赖氨酸包被的384孔MTP上。24小时后进行实验。
在实验当天，通过平板翻转和在纸巾上轻敲除去培养基。然后将细胞在37℃下用溶解在2mM Ca2+或不含Ca2+的台氏(Tyrode)缓冲液(20μL)中的10μM腔肠素培养3-4小时。将细胞暴露于钙对照和/或配体，并使用
Figure BDA0001266161520000281
Tetra筛选系统监测1分钟期间的发光变化(35.000倍的灵敏度)。对于激动剂评价，应用单一暴露方案(配体1°注射，20μL-2x)，而对于PAM评价，应用如下的双注射方案：
·1°注射：配体剂量反应(20μL-2x)
·2°注射：参照激动剂EC20(20μL-3x)
数据分析。使用
Figure BDA0001266161520000282
软件(Molecular Devices，版本3.0.1.4)分析
Figure BDA0001266161520000283
Tetra测量，并且将数据作为在化合物注射后计算的绝对响应的最大统计量(RLU)输出。RLU是通过应用“减去样品n上的偏差”(其中n＝化合物注射的时间点)获得的。使用Excel软件对导出的数据计算平均值和标准偏差值，然后使用GraphPad
Figure BDA0001266161520000296
软件(版本6)，用上述值产生S形剂量-反应(sigmoidal dose-response)曲线(可变斜率)或直方图。使用获得的EC50/IC50值根据下式计算EC50/IC100值：
ECX＝[(X/100–X)1/斜率(HillSlope)]*EC50
由于计算的IC100值将是无限的，所以计算IC99值作为近似值。根据以下公式计算最小(对照参考，CR)孔信号和最大(信号参考，SR)孔信号的稳健Z质数(robust Z prime，RZ')、板内变量(Intraplate Variability)和板间变量(Interplate Variability)：
Figure BDA0001266161520000291
Figure BDA0001266161520000292
Figure BDA0001266161520000293
Figure BDA0001266161520000294
Figure BDA0001266161520000295
细胞系、培养基和培养条件。使用分别通过将光蛋白natClytin稳定转染到HEK-293或HEK-293 T-Rex(HEK T-Rex，英杰公司(Invitrogen))细胞系中而产生的HEK-natClytin或HEK T-Rex/natClytin报告细胞系进行实验。
培养基：HEK-natClytin细胞系。含有Earle盐的最小必需培养基Eagle(EMEM，百威泰克(BioWhittaker)目录号BE12-125F)；10％FBS(胎牛血清，西格玛(Sigma)目录号F7524)；1％青霉素-链霉素(BioWhittaker目录号DE17-602E)；2mM超谷氨酰胺(Ultraglutamine)1(BioWhittaker目录号BE17-605E/U1)，0.2μg/mL嘌呤霉素(Puromicin)(InvivoGen目录号ant-pr-1)。HEK-natClytin/fCaSR细胞培养基补充有0.8mg/mL G418(InvivoGen目录号ant-gn-5)。
培养基：HEK-293T-REx细胞系。补充有胎牛血清TET-FREE(Euroclone目录号ECS0182L；50mL)、青霉素-链霉素(BioWhittaker，目录号DE17-602E；5mL的100x溶液)、杀稻瘟菌素5μg/ml(InvivoGen，目录号ant-bl-1)的DMEM高葡萄糖(Lonza BioWhittaker目录号BE12-604F/U1；500mL)。HEK T-Rex/natClytin细胞培养基补充有1μg/mL的嘌呤霉素(InvivoGen目录号ant-pr-1)。在选择期间向HEK T-Rex/natClytin-fCaSR细胞培养基中补充0.5μg/mL的嘌呤霉素和50μg/mL的潮霉素(InvivoGen目录号ant-hg-5)，然后保持在补充有0.25μg/mL嘌呤霉素和25μg/mL潮霉素的培养基中。
培养和接种条件。通过用PBS温和洗涤，每3-4天分裂细胞，随后在37℃下用胰蛋白酶培养5分钟。分离的细胞用完全培养基稀释并使用Becman Coulter Z1 TM粒子计数器计数。将所需数目的细胞接种到新的培养瓶中或用于贴壁实验。将1.5-2.0×106个细胞每周两次接种在T75培养瓶中，3-4天后在铺满～80％时回收约10-12×106个细胞。作为替代方案，铺满80％的培养瓶可以1:5-1:10稀释，每周两次。
对于实验条件，根据以下条件之一将细胞涂布在聚-D-赖氨酸包被的384孔MTP上：
·7.500cw。24小时后，手动弃去培养基并用含有1μg/mL多西环素的新鲜培养基替换。接种后48小时进行实验。
·在含有1μg/mL多西环素的培养基中为10.000cw。然后，24小时后进行实验。
缓冲液和配体。在本研究中使用以下缓冲液和配体：
·PBS：不含钙和镁的D-PBS；EuroClone，目录号ECB4004L。
·胰蛋白酶：在PBS中的胰蛋白酶-0.05％EDTA 0.02％：EuroClone，目录号ECB3052D。
·多西环素：西格玛(Sigma)，目录号D9891；在水中制备20mg/mL储备溶液，并在-20℃下避光储存。
·2mM Ca2+Tyrode缓冲液：130mM NaCl，5mM KCl，2mM CaCl2，5mM NaHCO3，1mMMgCl2，20mM HEPES，pH 7.4，无菌过滤并高压灭菌。
·不含Ca2+的台氏缓冲液(Tyrode's Buffer)：130mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl2，5mM NaHCO3，20mM HEPES；pH 7.4，无菌过滤并高压灭菌。
·二甲亚砜(DMSO)：西格玛(Sigma)，目录号34869。
·腔肠素：(Biosynth，目录号C-7001)，5mg/mL，在DMSO-谷胱甘肽30μM(Sigma G-6529)中制备，以等分试样储存在-20℃。
·氯化钙(二水合物)：西格玛(Sigma)，目录号223506，1M储备溶液，在水中制备并在室温下储存。
·精胺：西格玛(Sigma)，目录号S3256，100mM储备溶液，在100％DMSO中制备，以等分试样储存在-20℃。
·亚精胺：西格玛(Sigma)，目录号S2626，100mM储备溶液，在100％DMSO中制备，以等分试样储存在-20℃。
·腐胺：西格玛(Sigma)，目录号P7505，100mM储备溶液，在水中制备并以等分试样在-20℃下储存。
·L-谷胱甘肽(γ-Glu-Cys-Gly)：西格玛(Sigma)，目录号G6013，100mM储备溶液，在水中制备并以等分试样在-20℃下储存。
·新霉素：英杰公司(InvivoGen)目录号ant-gn-1，50mg/mL G418溶胶，储存于4℃。
·聚-L-精氨酸(盐酸盐)：西格玛(Sigma)，目录号P7762，100μg/mL储备溶液，在100％DMSO中制备，以等分试样储存在-20℃。
·西那卡塞(盐酸盐)：开曼化工(Cayman Chemical)，目录号16042，100mM储备溶液，在100％DMSO中制备，以等分试样储存在-20℃。
·Calindol(盐酸盐)：圣克鲁兹生物技术(SantaCruzBiotech)(DBA)，目录号sc-211006，100mM储备溶液，在100％DMSO中制备，以等分试样储存在-20℃。
·氯化镁(六水合物)：西格玛(Sigma)，目录号M2393，1M储备溶液，在水中制备并在室温下储存。
仪器和一次性用品。使用ICCD照相机
Figure BDA0001266161520000321
Tetra(MDC)进行实验。在384孔聚苯乙烯测定板中进行分析。
·测试板：聚-D-赖氨酸包被的384孔测定板(MTP)，黑色/透明底，MATRIX，目录号CPL-4332。
·复合板：384孔聚丙烯测定板，V型底，MATRIX，目录号4312。
***
虽然已经详细描述了本发明公开的主题及其优点，但是应当理解，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以在此进行各种改变、替换和变更。此外，本申请的范围不旨在限于说明书中描述的过程、机器、制造和物质组成、装置、方法和步骤的特定实施方案。如本领域普通技术人员从本发明公开的主题的公开内容中容易理解的，可以根据本发明公开的主题使用目前存在或以后开发的与本文所描述的对应实施方案执行基本上相同的功能或实现基本相同的结果的过程、机器、制造、物质组成、装置、方法或步骤。因此，所附权利要求旨在将这些过程、机器、制造、物质组成、装置、方法或步骤包括在其范围内。
在本申请中引用了专利、专利申请、出版物、产品描述和方案，其公开内容通过引用整体并入本文用于所有目的。

Claims (11)

1.一种用于鉴定调节钙敏感受体(CaSR)活性的组合物的方法，所述方法包括：
(a)使测试试剂与CaSR接触，
(b)检测测试试剂与CaSR的维纳斯捕蝇草结构域(VFT)或7跨膜结构域(7TM)中的一个或多个氨基酸之间的相互作用，以及
(c)选择与一种或多种所述氨基酸相互作用的测试试剂作为组合物；
其中所述CaSR选自由包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的猫CaSR和包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的犬CaSR组成的组；
其中所述维纳斯捕蝇草结构域(VFT)中的一个或多个氨基酸选自由ASN64、PHE65、ASN102、THR145、SER169、SER170、ASP190、GLN193、ASP216、TYR218、SER271、SER272、GLY273、GLU297、ALA298、TRP299、ALA300、SER301、SER302、LEU304、ALA321、TYR411、THR412和HIS413组成的组；
其中所述7跨膜结构域(7TM)中的一个或多个氨基酸选自由ARG680、PHE684、GLY685、PHE688、Helix 3上的VAL689、Helix 4上的GLN735、ALA772、PHE775、LEU776、THR780、Helix5上的CYS781、PHE814、VAL817、TRP818、Helix 6上的PHE821、GLU837、ALA840、ILE841、Helix7上的ALA844，以及EC2环上的MET771和GLU767组成的组。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括检测所述测试试剂与VFT的铰链区或骨架区中的一个或多个氨基酸之间的相互作用。
3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括在步骤(a)之后测定所述CaSR的活性。
4.如权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括使CaSR配体与所述CaSR接触。
5.如权利要求3所述的方法，所述方法还包括使CaSR配体与所述CaSR接触。
6.如权利要求3所述的方法，其中步骤(c)还包括选择增加CaSR活性的测试试剂作为组合物。
7.如权利要求4所述的方法，其中步骤(c)还包括选择增加CaSR活性的测试试剂作为组合物。
8.如权利要求5所述的方法，其中步骤(c)还包括选择增加CaSR活性的测试试剂作为组合物。
9.一种用于鉴定调节钙敏感受体(CaSR)活性的组合物的方法，所述方法包括：
(a)使CaSR激动剂与CaSR接触，
(b)测定CaSR的活性，
(c)使测试试剂与CaSR接触，
(d)测定CaSR的活性，以及
(e)当(d)的活性大于(b)的活性时，选择测试试剂作为组合物，
其中所述CaSR选自由包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的猫CaSR和包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的犬CaSR组成的组；
其中所述方法还包括(b’)检测测试试剂与CaSR的维纳斯捕蝇草结构域(VFT)或7跨膜结构域(7TM)中的一个或多个氨基酸之间的相互作用，以及(c’)选择与一种或多种所述氨基酸相互作用的测试试剂作为组合物的步骤；
其中所述维纳斯捕蝇草结构域(VFT)中的一个或多个氨基酸选自由ASN64、PHE65、ASN102、THR145、SER169、SER170、ASP190、GLN193、ASP216、TYR218、SER271、SER272、GLY273、GLU297、ALA298、TRP299、ALA300、SER301、SER302、LEU304、ALA321、TYR411、THR412和HIS413组成的组；
其中所述7跨膜结构域(7TM)中的一个或多个氨基酸选自由ARG680、PHE684、GLY685、PHE688、Helix 3上的VAL689、Helix 4上的GLN735、ALA772、PHE775、LEU776、THR780、Helix5上的CYS781、PHE814、VAL817、TRP818、Helix 6上的PHE821、GLU837、ALA840、ILE841、Helix7上的ALA844，以及EC2环上的MET771和GLU767组成的组。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述CaSR由细胞表达，并且其中所述测试试剂与所述细胞接触。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述细胞表达钙结合光蛋白。
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