ES2351094T3 - Procedimiento de cribado para los agentes que confieren el kokumi. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para el cribado de una sustancia que confiere el kokumi, es decir una sustancia que puede potenciar el sabor salado, umami, sabor dulce, sabor ácido o el sabor amargo, que comprende la reacción de un receptor del calcio y una sustancia de prueba y la detección de la actividad del receptor del calcio para indicar un posible efecto que confiere el kokumi a las sustancias de prueba.
Description
Procedimiento de cribado para los agentes que
confieren el kokumi.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la selección de una sustancia que confiere el
kokumi.
El receptor de calcio también denominado
receptor sensible al calcio (CaSR), y es un receptor constituido
por 1078 aminoácidos y está clasificado dentro de la clase C de los
receptores siete transmembrana (receptor acoplado a la proteína G;
GPCR). Se informó de la clonación del gen para este receptor de
calcio en 1993 (documento no patente 1), y es conocido que es el
causante de varias respuestas celulares a través de la elevación del
nivel de calcio intracelular, etc., cuando se activa con calcio,
etc. La secuencia genética del receptor de calcio humano está
registrada con el nº de acceso de GenBank NM_000388, y se conserva
perfectamente en animales.
El receptor de calcio mencionado anteriormente
puede actuar para potenciar o para suprimir funciones biológicas.
Por consiguiente, en la actualidad, se utilizan adecuadamente
agentes terapéuticos que pueden actuar como activadores y como
inhibidores del receptor de calcio para el tratamiento de
enfermedades neurológicas, enfermedades hepáticas, enfermedades
cardiovasculares, enfermedades del sistema digestivo y otras
enfermedades, dependiendo de las patológicas. Por ejemplo, el
receptor de calcio puede detectar el aumento del nivel de calcio en
sangre en la paratiroides y suprimir la secreción de la hormona
paratiroidea (PTH) para corregir el nivel de calcio en sangre. Por
consiguiente, se prevé un efecto de reducción del nivel de calcio en
sangre por parte de un activador del receptor de calcio. En
realidad ya se ha aclarado que cuando se utiliza un activador del
receptor de calcio para el tratamiento de hipertiroidismo
secundario en pacientes en hemodiálisis, se reduce el nivel de PTH
sin que se eleven los niveles de calcio y fósforo.
Como los análisis funcionales del receptor de
calcio se han realizado mayoritariamente para la homeostasis de
calcio, las investigaciones aplicadas están mayoritariamente
enfocadas por consiguiente a las enfermedades metabólicas óseas en
las que está implicada la regulación del calcio. Sin embargo, ha
quedado claro a través de los resultados de los análisis de las
expresiones genéticas que el receptor de calcio está ampliamente
distribuido en otros organismos aparte de la paratiroides y el
riñón. Se han propuesto (Documentos no patentes 2 y 3), y sus
posibilidades de que estén implicados en varias funciones biológicas
y en las causas de enfermedades. Por ejemplo, se ha considerado que
el receptor de calcio está implicado en las funciones del hígado,
corazón, pulmón, canal alimenticio, linfocitos y páncreas. Se ha
confirmado en el contexto de la presente invención que se expresa
en un amplio intervalo de tejidos en organismos mediante análisis
basados en RT-PCR utilizando ARN extraído de
tejidos de rata. A partir de los puntos de vista mencionados
anteriormente, los valores de los activadores y los inhibidores del
receptor de calcio están aumentando rápidamente en la actualidad
para varias aplicaciones.
Además, aparte del calcio, se ha descrito que
otros cationes como el catión gadolinio, péptidos básicos como la
poliarginina, poliaminas como la espermina, aminoácidos como la
fenilalanina, y demás como activadores del receptor de calcio
(Documento no patente 4).
Aunque hasta ahora se han desarrollado muchos
activadores específicos como activadores del receptor de calcio
como se ha descrito anteriormente, existen algunos compuestos
existentes en los organismos entre ellos, y las actividades de los
compuestos existentes en los organismos son muy bajas. Por
consiguiente, los agentes terapéuticos de varias enfermedades que
contienen estos activadores presentan serios problemas en relación
a los efectos secundarios, permeabilidad y actividad. Por ejemplo,
aunque es sabido que los aminoácidos actúan sobre los receptores de
calcio, se considera que su aplicación real como activadores es
difícil ya que la actividad es muy débil. Además, aunque se ha
descrito que otras moléculas como la poliarginina como activadora
como se ha descrito anteriormente, se estima que las funciones se
basan en las acciones como cationes polivalentes que presentan
estructuras irregulares. Esto es, no se sabe que un péptido que
presenta una estructura específica es útil como activador del
receptor de calcio.
Entretanto, en el campo de los alimentos, se han
aplicado durante muchos años sustancias aromatizantes. En
particular, sustancias que presentan los cinco sabores básicos,
concretamente, sabor dulce, sabor salado, sabor ácido, sabor amargo
y sabor umami (sabor delicioso), y se han utilizado ampliamente como
condimentos sustancias que potencia estos sabores. Como concepto de
sabor que no se puede expresar con los sabores mencionados
anteriormente, existe el "kokumi". Kokumi significa un sabor
que no se puede expresar con los cinco sabores básicos, y significa
un sabor que potencia no sólo los sabores básicos sino también los
sabores marginales de los sabores básicos, como la densidad, el
crecimiento (textura en la boca), la continuidad y la armonía.
Hasta la fecha, se han descrito varios procedimientos para conferir
el kokumi y se han descrito el glutatión (Documento patente 1),
productos calientes de gelatina y tropomiosina (Documento patente
2), compuestos que contienen grupos de sulfona (Documento patente
3), un péptido que contiene la secuencia Asn-His
(Documento patente 4) y similares.
Aunque se ha intentado el desarrollo de varias
sustancias que confieren el kokumi como se ha descrito
anteriormente, y se han comercializado principalmente a partir de
productos naturales, existen actualmente muy pocos ejemplos del
aislamiento del componente kokumi puro a partir de un extracto de un
producto natural, como glutatión y
N-(4-metil-5-oxo-1-imidazolin-2-yl)
sarcosina.
Por consiguiente, resulta deseable un desarrollo
altamente eficaz, seguro y barato de sustancias que confieren el
kokumi, y es necesario un procedimiento adecuado y altamente
sensible para el cribado de sustancias que confieren el kokumi para
este propósito.
[Documento no patente 1] Nature., 1993 9
diciembre; 366 (6455): 575-80.
[Documento no patente 2] J. Endocrinol., 2000
mayo, 165(2): 173-7.
[Documento no patente 3] Eur. J. Pharmacol.,
2002, 5 julio, 447(2-3):
271-8.
[Documento no patente 4] Cell Calcium., 2004
marzo, 35(3): 209-16.
[Documento patente 1] Patente japonesa nº
1464928.
[Documento patente 2] Patente japonesa
publicación abierta a inspección (KOKAI) nº
10-276709.
[Documento patente 3] Patente japonesa
publicación abierta a inspección (KOKAI) nº
8-289760.
[Documento patente 4] WO2004/096836.
El documento
EP-A-1 554 939 da a conocer el
suministro de unas sustancias que confieren kokumi como aminoácidos
y péptidos.
El documento
EP-A-0 672 354 da a conocer una
mezcla que confiere kokumi que contiene péptidos y fracciones de
bajo peso molecular de los extractos naturales.
El documento WO 94/22438 A da a conocer unas
composiciones que contienen glutatión y una sal cálcica.
El documento WO 92/07267 A da a conocer una
composición que comprende péptidos.
Un objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar un procedimiento adecuado y altamente sensible para el
cribado de sustancias que confieren el kokumi.
La presente invención proporciona lo
siguiente:
(1) un procedimiento para el cribado de una
sustancia que confiere el kokumi, es decir es capaz de potenciar el
sabor salado, umami, sabor dulce, sabor ácido o sabor amargo que
comprende La primera etapa de reacción del receptor del calcio y
una sustancia de prueba y la detección de la actividad del receptor
del calcio, y la segunda etapa de medición del efecto que confiere
el kokumi de las sustancias de pruebas para las cuales la actividad
de activación del receptor del calcio se detecta en la primera
etapa.
Según la presente invención, se proporciona un
procedimiento adecuado y altamente sensible para el cribado de una
sustancia que confiere el kokumi.
Se introdujo el receptor humano de calcio ARNc
en oocitos de Xenopus laeviis mediante microinyección. Se
registraron los valores de las corrientes de respuesta intracelular
que ocurrían cuando se añadía una solución de cloruro cálcico a una
concentración arbitraria. Los valores máximos de corrientes
intracelulares se consideraron valores de la corriente de
respuesta. Se confirmó que no se observó ninguna respuesta en
oocitos a los que se introdujo agua destilada mediante
microinyección como control.
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Se introdujo el receptor humanos de calcio ARNc
en Xenopus laevis mediante microinyección. Se registraron
los valores de las corrientes de respuesta intracelular que fluían
cuando se añadía una solución de L-aminoácido 10
mM. Los valores máximos de corrientes intracelulares se consideraron
valores de la corriente de respuesta. Se confirmó que no se observó
ninguna respuesta en oocitos en los que se introdujo agua destilada
mediante microinyección como control.
\vskip1.000000\baselineskip
Se introdujo el receptor humanos de calcio ARNc
en Xenopus laevis mediante microinyección. Se registraron
los valores de las corrientes de respuesta intracelular que fluían
cuando se añadía una solución de aminoácido D 10 mM. Los valores
máximos de corrientes intracelulares se consideraron valores de la
corriente de respuesta. Se confirmó que no se observó ninguna
respuesta en oocitos en los que se introdujo agua destilada mediante
microinyección como control.
\vskip1.000000\baselineskip
Se introdujo el receptor humanos de calcio ARNc
en Xenopus laevis mediante microinyección. Se registraron
los valores de las corrientes de respuesta intracelular que fluían
cuando se añadía una solución de péptidos a una concentración
arbitraria. Los valores máximos de corrientes intracelulares se
consideraron valores de la corriente de respuesta. Se confirmó que
no se observó ninguna respuesta en oocitos en los que se introdujo
agua destilada mediante microinyección como control.
A continuación, se explicará con detalle la
presente invención.
En la presente memoria, el "receptor de
calcio" también se denomina receptor sensible al calcio (CaSR), y
pertenece a la clase C de los receptores siete transmembrana. En la
presente memoria, la "actividad del receptor de calcio"
significa la unión del receptor de calcio mencionado anteriormente
para activar la proteína de unión guanina nucleótido y de ese modo
transmitir señales. Además, en la presente memoria, el "activador
del receptor de calcio" es una sustancia que actúa en receptor
de calcio mencionado anteriormente para activar el receptor de
calcio y controlar las funciones de las células que expresan el
receptor de calcio.
En la presente memoria, "kokumi" significa
un sabor que no se puede expresar mediante los cinco sabores
básicos, sabor dulce, sabor salado, sabor ácido, sabor amargo y
sabor umami, en el que no solo se realzan/amplifican los sabores
básicos sino también los sabores marginales de los sabores básicos,
como la densidad, el crecimiento (textura en la boca), la
continuidad y la armonía. Además, el "agente que confiere el
kokumi" o "sustancia que confiere el kokumi" se refiere a
un agente o sustancia que puede potenciar los cinco sabores básicos,
sabor dulce, sabor salado, sabor ácido, sabor amargo y sabor umami,
y transmitir sabores marginales de los sabores básicos, como la
densidad, el crecimiento (textura en la boca), la continuidad y la
armonía acompañando a los sabores básicos. Por consiguiente, el
agente que confiere el kokumi también se puede utilizar como un
agente potenciador del sabor dulce, agente potenciador del sabor
salado, agente potenciador del sabor ácido, agente potenciador del
sabor amargo o agente potenciador del sabor unami. En cuanto a la
intensidad del kokumi, "sabor primero y medio" significa el
sabor que se siente durante el periodo de 0 a 4 segundos después de
comer, y "sabor posterior" significa el sabor que se siente 5
segundos después de comer.
En la presente memoria, todos los aminoácidos y
los residuos de aminoácidos que constituyen los péptidos son
isómeros L, excepto que se indique lo contrario.
El procedimiento para el cribado de una
sustancia que confiere el kokumi de la presente invención (en
adelante se hará referencia al mismo como procedimiento para el
cribado de la presente invención) se caracteriza por el uso de la
actividad del receptor de calcio como un índice. Específicamente, el
procedimiento de cribado de la presente invención comprende la
primera etapa de reacción de un receptor de calcio con la sustancia
de prueba y la detección de la actividad del receptor de calcio, y
la segunda etapa de medición del efecto que confiere el kokumi de
las sustancias de prueba para los que se ha detectado en la primera
etapa la actividad de la activación del receptor de calcio.
\newpage
Las etapas específicas del proceso del
procedimiento de cribado de la presente invención se ejemplifican a
continuación. Sin embargo, las etapas del procedimiento de cribado
de la presente invención no se limitan a estas etapas.
- 1)
- Se añade una sustancia de prueba a un sistema de medición de la actividad del receptor de calcio para medir la actividad del receptor de calcio, y se mide la actividad del receptor de calcio.
- 2)
- Se compara la actividad del receptor de calcio obtenida con la adición de la sustancia de prueba con la actividad del receptor de calcio obtenida sin la adición de la sustancia de prueba.
- 3)
- Se elige una sustancia de prueba que representa una actividad de estimulación del receptor de calcio más elevada cuando se selecciona la sustancia de prueba.
- 4)
- Se mide el efecto que confiere el kokumi de la sustancia de prueba elegida, y se escoge una sustancia de prueba que presenta un efecto que confiere el kokumi.
La actividad del receptor de calcio se mide
utilizando, por ejemplo, un sistema de medición que utilizando
células que expresan el receptor de calcio. Las células pueden ser
células que expresen el receptor de calcio endógenamente, o células
recombinantes introducidas con un gen de receptor de calcio externo.
Al igual que el sistema de medición de la actividad del receptor de
calcio mencionada anteriormente, también se puede utilizar
cualquier sistema sin limitaciones en particular siempre y cuando se
elija un sistema en el que cuando un ligando extracelular
(activador) específico del receptor de calcio se puede detectar o se
transmite una señal detectable en respuesta a la unión (reacción)
del activador y del receptor de calcio. Cuando la reacción del
compuesto a prueba resulta en una actividad del receptor de calcio,
se determina que este compuesto a prueba presenta una actividad de
activación del receptor de calcio y un compuesto que confiere el
kokumi.
El efecto que confiere el kokumi mencionado
anteriormente se puede confirmar mediante una prueba de sabor
realizada por un individuo, o similar. Además, las sustancia de
prueba utilizada para el cribado no está particularmente limitada,
y también se pueden utilizar compuestos con pocas moléculas,
sacáridos, péptidos, proteínas, y similares.
En cuanto al receptor de calcio mencionado
anteriormente, el receptor humano de calcio codificado por el gen
humano del receptor de calcio registrado con el nº de acceso de
GenBank NM_000388 se puede ejemplificar como el ejemplo preferido.
Además, el receptor de calcio no está limitado a la proteína que
codifica para el gen de la secuencia mencionada anteriormente, y
puede ser una proteína codificada por un gen que presenta una
homología del 60% o superior, preferentemente 80% o superior, más
preferentemente 90% o superior, con respecto a la secuencia
mencionada anteriormente, siempre y cuando la proteína presente la
función de receptor del calcio. El receptor GPRC6A y el receptor
5.24 son también conocidos como subtipos del receptor de calcio, y
también se pueden utilizar para la presente invención. La función
del receptor de calcio se puede examinar mediante la expresión de
un gen de interés en una célula y midiendo los cambios en la
corriente eléctrica, o la concentración intracelular de ión de
calcio en el momento de la adición de calcio.
El origen del receptor de calcio no está
particularmente limitado, y los ejemplos incluyen, además del
receptor humano de calcio mencionado anteriormente, receptores de
calcio derivados de animales como ratón, rata y perro.
Tal como se ha descrito anteriormente, la
actividad del receptor de calcio se puede confirmar utilizando
células libres que expresan un receptor de calcio o uno de sus
fragmentos, membranas celulares que expresan un receptor de calcio
o uno de sus fragmentos, un sistema in vitro que contiene una
proteína de un receptor de calcio o uno de sus fragmentos, o
similares.
A continuación se representa un ejemplo
utilizando células vivas. Sin embargo, la confirmación de la
actividad del receptor de calcio no está limitada a este
ejemplo.
El receptor de calcio se puede expresar en
células cultivadas como oocitos de Xenopus laevis, células
de ovarios de hámster, y células fetales de riñón humano. El
receptor de calcio se puede expresar mediante la clonación de un
gen de receptor de calcio en un plásmido que puede contener un gen
extraño y la introducción del plásmido o ARNc obtenido utilizando
el plásmido como una plantilla. Para detectar la reacción, se pueden
utilizar técnicas electrofisiológicas, reactivos indicadores de
fluorescencia que indican la elevación del nivel intracelular de
calcio, y similares.
La expresión del receptor de calcio se confirma
primero sobre la base de la respuesta al calcio o a un activador
específico. Se utilizaron los oocitos que mostraban corriente
intracelular con calcio a una concentración de aproximadamente 5 mM
o células de cultivo que mostraban fluorescencia del reactivo
indicador fluorescente con calcio a una concentración de
aproximadamente 5 mM. La dependencia de la concentración de calcio
se determinó mediante el cambio de la concentración de calcio.
Después, se prepara una sustancia de prueba como un péptido a una
concentración de aproximadamente 1 \muM a 1 mM y se añade a los
oocitos o células cultivadas y se mide la actividad del receptor de
calcio de la sustancia de prueba como un péptido como se ha indicado
anteriormente.
\newpage
A continuación, la presente invención se
explicará con mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos.
(Sólo
referencia)
El gen del receptor de calcio se preparó de la
siguiente forma. Se diseñaron sobre la base de la secuencia de ADN
registrada en NCBI (receptor de calcio: NM_000388), oligo ADN
sintéticos (primer de inicio (N) y primer de final (C) utilizados
para la PCR (Tabla 1, SEC. ID nº 1 y 2).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando cADN de riñón humano (Clontech) como
material, se sintetizaron los cebadores representados en la Tabla 1
(hCASR_N (SEC ID nº: 1) y hCASR_C (SEC ID nº:2)), y se realizó una
PCR utilizando ultra Pfu ADN Polimerasa (Stratagene) bajo las
siguientes condiciones. Después de una reacción a 94ºC durante 3
minutos, se repitió 35 veces un ciclo de reacciones a 94ºC durante
30 segundos, a 55ºC durante 30 segundos, y a 72ºC durante 2
minutos, y después se realizó la reacción a 72ºC durante 7 minutos.
Se detectó mediante PCR si se había realizado la amplificación
mediante la realización de electroforesis en agarosa, tinción con un
reactivo de tinción de ADN, y irradiación ultravioleta. Las
longitudes de la cadena de los productos de PCR se confirmaron
mediante la comparación con marcadores de ADN de tamaños conocidos
sometidos simultáneamente a la electroforesis. El vector plásmido
pBR322 (Takara) fue digerido con la enzima de restricción EcoVR. El
fragmento de gen amplificado por la PCR se ligó al sitio de corte
del plásmido utilizando Ligation Kit (Promega). La cepa de la
Escherichia coli DH5\alpha se transformó con cada solución
de reacción de ligación, y se seleccionó un punto de transformación
que albergaba el plásmido en el que se clonó el producto de
amplificación de PCR. El producto de amplificación de la PCR se
confirmó mediante el análisis de la secuencia de ADN. Mediante la
utilización de este plásmido recombinante como molde junto con el
equipo de preparación de ARNc (Ambion), se preparó el ARNc del gen
receptor de calcio.
\vskip1.000000\baselineskip
(Únicamente como
referencia)
Como muestras de aminoácido L, se utilizaron 23
tipos amino ácidos de calidad pura alanina, arginina, asparagina,
ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina,
histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina,
prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina, ornitina,
taurina (todos estos a partir del Ajinomoto), y hidroxiprolina
(Nakarai Tesque). Como D-Cys y D-Trp
(Nakarai Tesque) y cloruro de calcio, se utilizaron los de especial
calidad. Además, como muestras de péptidos, se utilizaron
\gamma-Glu-Cys-Gly
(Sigma Aldrich Japan),
\gamma-Glu-Cys(SNO)-Gly
(Dojin Chemical laboratory),
\gamma-Glu-Ala (Bachem
Feinchemikalien AG),
\gamma-Glu-Gly (Bachem
Feinchemikalien AG),
\gamma-Glu-Cys (Sigma Aldrich
Japan), \gamma-Glu-Met (Bachem
Feinchemikalien AG),
\gamma-Glu-Abu-Gly
(Abu: ácido \alpha-aminobutírico, Bachem
Feinchemikalien AG),
\gamma-Glu-Thr (Kokusan Chemical),
\gamma-Glu-Val (Kokusan Chemical),
\gamma-Glu-Leu (producto
fabricado contratado),
\gamma-Glu-Ile (producto fabricado
contratado), \gamma-Glu-Orn
(Kokusan Chemical), Asp-Gly (producto fabricado
contratado), Cys-Gly (producto fabricado
contratado), Cys-Met (producto fabricado
contratado), Glu-Cys (producto fabricado
contratado), Gl\gamma-Cys (producto fabricado
contratado), Leu-Asp (producto fabricado
contratado),
\gamma-Glu-Val-Val
(producto fabricado contratado),
\gamma-Glu-Val-Glu
(producto fabricado contratado),
\gamma-Glu-Val Lys (producto
fabricado contratado),
\gamma-Glu-\gamma-Glu-Val
(producto fabricado contratado),
\gamma-Glu-Gl\gamma-Gly
(producto fabricado contratado),
\gamma-Glu-Val-Phe
(producto fabricado contratado),
\gamma-Glu-Val-Ser
(producto fabricado contratado),
\gamma-Glu-Val Pro (producto
fabricado contratado),
\gamma-Glu-Val-Arg
(producto fabricado contratado),
\gamma-Glu-Val Asp (producto
fabricado contratado),
\gamma-Glu-Val-Met
(producto fabricado contratado),
\gamma-Glu-Val-Thr
(producto fabricado contratado),
\gamma-Glu-Val-His
(producto fabricado contratado),
\gamma-Glu-Val-Asn
(producto fabricado contratado),
\gamma-Glu-Val-Gln
(producto fabricado contratado),
\gamma-Glu-Val-Cys
(producto fabricado contratado),
\gamma-Glu-Val-Orn
(producto fabricado contratado), y
\gamma-Glu-Ser-Gly
(producto fabricado contratado). La glutamina y la cisterna se
prepararon en el momento de su utilización y las otras muestras se
almacenaron a -20ºC después de su preparación. En cuanto a los
péptidos, se utilizaron los que presentaban una pureza de 90% o
superior. En cuanto al
\gamma-Glu-Cys, se utilizó uno que
presentaba una pureza de 80% o superior. Cuando la solución que
disuelve cada muestra, mostró un pH ácido o alcalino, la solución
se ajustó hasta un pH aproximadamente neutro mediante la utilización
de NaOH o HCl. La solución utilizada para la disolución de
aminoácidos y péptidos, la preparación de oocitos de Xenopus
laevis, y el cultivo de los oocitos presentaba la siguiente
composición: NaCl 96 mM, KCl 2 mM, MgCl_{2} 1 mM, CaCl_{2} 1,8
mM, Hepes 5 mM, pH 7,2.
\vskip1.000000\baselineskip
(Únicamente como
referencia)
Se disolvieron
Boc-Val-OH (8,69 g, 40,0 mmoles) y
Gl\gamma-OBzl\cdotHCl (8,07 g. 40,0 mmoles) en
cloruro de metileno (100 ml) y la solución se guardó a 0ºC. Se
añadió a la solución tietrilamina (6,13 ml, 44,0 mmoles), HOBt
(1-hidroxibenzotriazol, 6,74 g, 44,0 mmoles) y
WSC\cdotHCl
(1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)
hidrocloruro de carbodiimida, 8,44 g, 44,0 mmoles) y la mezcla se
agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de
reacción se concentró bajo presión reducida, y el residuo se
disolvió en acetato de etilo (200 ml). La solución se lavó con agua
(50 ml), una solución acuosa de ácido cítrico al 5% (50 ml x dos
veces), salmuera saturada (50 ml), una solución acuosa con
hidrógeno carbonato sódico al 5% (50 ml x dos veces) y salmuera
saturada (50 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio
anhidra, se extrajo el sulfato de magnesio mediante filtración y el
filtrado se concentró bajo presión reducida. El residuo se
recristalizó a partir de acetato de etilo/n-hexano
para obtener
Boc-Val-Gl\gamma-OBzl
(13,2 g, 36,2 mmoles) como cristales blancos.
Se añadió
Boc-Val-Gl\gamma-OBzl
(5,47 g, 15,0 mmoles) a una solución de 4 N HCl/dioxano (40 ml), y
la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 50 minutos. Se
extrajo el dioxano mediante concentración bajo presión reducida, se
añadió n-hexano (30 ml) al residuo y la mezcla se
concentró bajo presión reducida. Este proceso se repitió 3 veces
para obtener cuantitativamente
H-Val-Gl\gamma-OBzl\cdotHCl.
Los productos anteriores
H-Val-Gl\gamma-OBzl\cdotHCl
y Z-Glu-OBzl (5,57 g, 15,0 mmoles)
se disolvieron en cloruro de metileno (50 ml), y la solución se
guardó a 0ºC. Se añadió a la solución de tietilamina (2,30 ml, 16,5
mmoles), HOBt (1-hidroxibenzotriazol, 2,53 g, 16,5
mmoles) y WSC\cdotHCl
(1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)
hidrocloruro de carbodiimida, 3,16 g, 16,5 mmoles) y la mezcla se
agitó durante 2 días a temperatura ambiente. La mezcla de reacción
se concentró bajo presión reducida, y el residuo se disolvió en
acetato de etilo calentado (1.500 ml). La solución se lavó con agua
(200 ml), una solución acuosa con ácido cítrico al 5% (200 ml x dos
veces), salmuera saturada (150 ml), una solución acuosa con
hidrógeno carbonato sódico al 5% (200 ml x dos veces) y salmuera
saturada (150 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato de
magnesio anhidra, se extrajo el sulfato de magnesio mediante
filtración y el filtrado se concentró bajo presión reducida. Se
extrajeron los cristales depositados mediante filtración, y se
secaron bajo presión reducida para obtener
Z-Glu(Val-Gl\gamma-OBzl)-OBzl
(6,51 g, 10,5 mmoles) como cristales blancos.
El producto anterior
Z-Glu(Val-Gl\gamma-OBzl)-OBzl
(6,20 g, 10,3 mmoles) se suspendió en etanol, (200 ml) y se añadió
paladio/carbono al 10% (1,50 g) y se realizó la reacción de
reducción a 55ºC durante 5 horas bajo una atmósfera de hidrógeno.
Durante la reacción, se añadieron gradualmente un total de 100 ml de
agua. Se extrajo el catalizador mediante filtración utilizando un
embudo Kiriyama, y el filtrado se concentró bajo presión reducida
hasta el medio volumen. La mezcla de reacción se filtró después a
través de un filtro de membrana, y el filtrado se concentró bajo
presión reducida. El residuo se disolvió en un volumen pequeño de
agua, y se añadió etanol para depositar los cristales, y se
extrajeron los cristales mediante filtración, y se secaron bajo
presión reducida para obtener un polvo blanco de
\gamma-Glu-Val-Gly
(2,85 g, 9,40 mmoles).
ESI-MS: (M+H)^{+}=
304,1.
^{1}H-RMN (400 MHz, D_{2}O)
\delta (ppm): 0,87 (3H, d, J = 6,8 Hz), 0,88 (3H, d, J = 6,8 Hz),
1,99-2,09 (3H, m), 2,38-2,51 (2H,
m) 3,72 (1H, t, J = 6,35 Hz), 3,86 (1H, d, J = 17,8 Hz), 3,80 (1H,
d, J = 17,8 Hz), 4,07 (1H, d, J = 6,8 Hz).
\vskip1.000000\baselineskip
(Únicamente como
referencia)
Glutatión reducida (15,0 g, 48,8 mmoles) se
añadió a agua (45 ml) y se añadió hidróxido sódico (4,52 g, 2,2
equivalentes, 107 mmoles) en porciones a la mezcla mientras la
mezcla se burbujeaba con nitrógeno. Se añadió yoduro de metilo
(4,56 ml, 1,5 equivalentes, 73 mmoles) a la mezcla, y la mezcla se
selló y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla
de reacción se ajustó a un pH de 2 a 3 con ácido clorhídrico
concentrado se añadió etanol (150 ml), y se introdujo durante la
noche en un refrigerador. Como se separó la fase oleosa, se extrajo
el sobrenadante. Cuando la fase oleosa restante se disolvió en agua
y se le añadió etanol gradualmente, se depositó la fase oleosa
parcialmente cristalizada. Por consiguiente, el líquido supernadante
se extrajo otra vez. El residuo se disolvió en agua (300 ml), se
absorbió en una resina de intercambio de iones (Dowex
1-acetato, 400 ml) rellenado en una columna, y
después de lavarlo con agua, se eluyó con una solución acuosa de
ácido acético 1 N. La elución se concentró bajo presión reducida, y
se precipitó a partir de agua/etanol para obtener un polvo blanco
de
\gamma-Glu-Cys(S-Me)-Gly
(5,08 g, 15,8 mmoles).
FAB-MS: (M+H)^{+} =
322
^{1}H-RMN (400 MHz, D_{2}O)
\delta (ppm): 2,14 (3H, s), 2,15-2,22 (2H, m),
2,50-2,58 (2H, m), 2,86 (1H, dd, J = 9,0 Hz, J =
14,0 Hz), 3,03 (1H, dd, J = 5,0 Hz, J = 14,0 Hz), 3,84 (1H, t, J =
6,5 Hz), 3,99 (2H, S), 4,59 (1H, dd, J = 5,0 Hz, J = 9,0 Hz)
\vskip1.000000\baselineskip
(Únicamente como
referencia)
\gamma-Glu-Met-(O),
\gamma-Glu-Val-NH_{2},
\gamma-Glu-Val-ol,
\gamma-Glu-Ser,
\gamma-Glu-Tau,
\gamma-Glu-Cys(S-Me)(O),
\gamma-Glu-t-Leu,
\gamma-Glu-Cys(S-alilo)-Gly,
y
\gamma-Glu-Cys(S-Me)
se sintetizaron de forma similar a los Ejemplos 3 y 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la evaluación de la actividad de activación
del receptor de calcio se utilizó un procedimiento de medición de
la corriente iónica Cl dependiente de la concentración de ión Ca
utilizando un sistema de expresión de oocito de Xenopus
laevis. Si se añade a los oocitos de la Xenopus laevis
cada activador que expresan para el receptor de calcio, los iones
Ca intracelulares aumentan. Entonces, el canal de de ión Ca
dependiente de la concentración Cl se abre, y el valor de la
corriente intracelular cambia a una corriente iónica. Mediante la
medición del valor de esta corriente intracelular, se puede saber si
existe una actividad de la activación del receptor de calcio.
Específicamente, se abrió el abdomen de la
Xenopus laevis y se extrajo una bolsa de huevos que se
trataron con una solución de 1% de colagenasa a 20ºC durante 2
horas para obtener oocitos individuales. En el interior de los
oocitos, se introdujeron 50 nl de 1 \mug/\mul de receptor de
ARNc o 50 nl de agua esterilizada por oocito utilizando un
microcapilar de cristal, y los oocitos se cultivaron a 18ºC durante
2 ó 3 días. Para el cultivo se utilizó una solución obtenida
mediante la adición ce ácido pirúvico 2 mM, 10 U/ml de penicilina,
y 10 \mug/ml de estreptomicina a la solución mencionada en el
Ejemplo 2. Después del cultivo, se añadió una solución de prueba a
los oocitos a los que se introdujo ARNc o agua esterilizada. Se
realizó una medición electrofisiológica utilizando un amplificador,
Geneclamp500 (Axon), y un sistema de grabación, AxoScope 9.0
(Axon). Los oocitos se acoplan a un voltaje a -70 mV mediante el
procedimiento de acoplamiento de voltaje de doble electrodo, y se
midió la corriente intracelular a través del canal de la
concentración de ión Ca dependiente de del ión Cl. El valor máximo
de la corriente intracelular se consideró como el valor de la
corriente de la respuesta.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de activación del receptor del
calcio se realizó utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo
6, es decir, se prepararon los oocitos a los cuales se introdujo
ARNc del receptor del calcio o agua esterilizada y se acoplan a un
voltaje a -70 mV mediante el procedimiento de acoplamiento de
voltaje de doble electrodo, A los oocitos que reciben voltaje, se
les añade calcio (2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM) y se calcula la
concentración del ión calcio dependiente de la respuesta a la
corriente de Cl. Los resultados se presentan en la figura 1. A
partir de estos resultados, se confirmó que el ARNc del receptor del
calcio introducido en los oocitos se expresaba funcionalmente.
Además, puesto que lo oocitos a los que se introdujo agua no
respondieron ni a altas concentraciones de calcio, confirmó que el
receptor del calcio no se expresa en los oocitos por sí solos.
\newpage
La actividad de activación del receptor del
calcio de los L-aminoácidos se realizó utilizando el
procedimiento descrito en el Ejemplo 6. Es decir, se prepararon los
oocitos a los cuales se introdujo ARNc del receptor del calcio o
agua esterilizada y se acoplan a un voltaje a -70 mV mediante el
procedimiento de acoplamiento de voltaje de doble electrodo, A los
oocitos que reciben voltaje, se les añade alanina (10 mM), arginina
(10 mM), asparagina (10 mM), ácido aspártico (10 mM), cisteína (10
mM), glutamina (10 mM), ácido glutámico (10 mM), glicina (10 mM),
histidina (10 mM), isoleucina (10 mM), leucina (10 mM), lisina (10
mM), metionina (10 mM), fenilalanina (10 mM), prolina (10 mM),
serina (10 mM), treonina (10 mM), triptófano (10 mM), tirosina (10
mM), valina (10 mM), ornitina (10 mM), taurina (10 mM) o
hidroxiprolina (10 mM) y se calculó la concentración del ión Ca
dependiente de la respuesta a la corriente de Cl. Los resultados se
presentan en la figura 2. A partir de estos resultados, se confirmó
que cisteína, hisidina, fenilalanina, triptófano y tirosina
presentan una actividad de activación del receptor del calcio
definida. Para los aminoácidos indicados anteriormente, la
actividad de activación se ha descrito en Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 2000, 25 abril, 97 (9): 4814-9.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de activación del receptor del
calcio de D-cisteína se realizó utilizando el
procedimiento descrito en el Ejemplo 6. Es decir, se prepararon los
oocitos a los cuales se introdujo ARNc del receptor del calcio o
agua esterilizada y se acoplan a un voltaje a -70 mV mediante el
procedimiento de acoplamiento de voltaje de doble electrodo. A los
oocitos que reciben voltaje, se les añade D-cisteína
(10 mM), L-cisteína (10 mM),
D-triptófano (10 mM) o L-triptófano
(10 mM) y se calculó la concentración del ión Ca dependiente de la
respuesta a la corriente de Cl. Los resultados se presentan en la
figura 3. A partir de estos resultados, se confirmó que la
D-cisteína presenta una actividad definida de
activación del receptor del calcio.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de activación del receptor del
calcio de péptidos se realizó utilizando el procedimiento descrito
en el Ejemplo 6. Es decir, se prepararon los oocitos a los cuales se
introdujo ARNc del receptor del calcio o agua esterilizada y se
acoplan a un voltaje a -70 mV mediante el procedimiento de
acoplamiento de voltaje de doble electrodo, A los oocitos que
reciben voltaje, se les añade
\gamma-Glu-Cys-Gly
(50 \muM), \gamma-Glu-Cys
(SNO)-Gly (50 \muM),
\gamma-Glu-Ala (50 \muM),
\gamma-Glu- Gly (500 \muM),
\gamma-Glu-Cys (50 \muM),
\gamma-Glu-Met (500 \muM),
\gamma-Glu-Thr (50 \muM),
\gamma-Glu-Val (50 \muM),
\gamma-Glu-Orn (500 \muM),
Asp-Gly (1 mM), Cys-Gly (1 mM),
Cys-Met (1 mM), Glu-Cys (50 \muM),
Gly-Cys (500 \muM) o Leu-Asp (1
mM), y se calculó la concentración del ión calcio dependiente de la
respuesta a la corriente de Cl. Los resultados se presentan en la
figura 4. A partir de estos resultados, se demostró que los péptidos
mencionados anteriormente presentan una actividad definida de
activación del receptor del calcio.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de activación del receptor del
calcio de péptidos se evaluó de la misma manera que en el Ejemplo
10. Cada uno de los péptidos que se representan en la tabla 2 se
añadió a unos oocitos que reciben voltaje a una concentración de
1.000 \muM, 300 \muM, 100 \muM, 30 \muM, 10 \muM, 3
\muM, 1 \muM, 0,3 \muM y 0,1 \muM y se calculó la
concentración del ión calcio dependiente de la respuesta a la
corriente de Cl. La concentración más baja a la que se detecta
corriente se representa en la Tabla 2 como actividad. A partir de
estos resultados, resulta evidente que estos 32 péptidos presentan
actividad de activación del receptor del calcio.
(Únicamente como
referencia)
Los ejemplos habituales se seleccionan de entre
los péptidos y aminoácidos cuya actividad de activación del
receptor del calcio se ha confirmado:
\gamma-Glu-X-Gly
(X representa Cys (SNO)), Cys (S-alilo), Gly, Cys
(S-Me), Abu o Ser),
\gamma-Glu-Val-Y
(Y representa Gly, Val, Glu, Lys, Phe, Ser, Pro, Arg, Asp, Met, Thr,
His, Orn, Asn, Cys o Gln), \gamma-Glu- Ala,
\gamma-Glu-Gly,
\gamma-Glu-Cys,
\gamma-Glu-Met,
\gamma-Glu-Thr,
\gamma-Glu-Val,
\gamma-Glu-Orn,
Asp-Gly, Cys-Gly,
Cys-Met, Glu-Cys,
Gl\gamma-Cys, Leu-Asp,
D-Cys,
\gamma-Glu-Met (O),
\gamma-Glu-\gamma-Glu-Val,
\gamma-Glu-Val-NH_{2},
\gamma-Glu-Val-ol
, \gamma-Glu-Ser,
\gamma-Glu-Tau,
\gamma-Glu-Cys
(S-Me) (O),
\gamma-Glu-Leu,
\gamma-Glu-Ile,
\gamma-Glu-t-Leu y
\gamma-Glu-Cys
(S-Me), y se determinó si presentan actividad que
confiere kokumi o no mediante un ensayo de evaluación sensorial.
El ensayo de evaluación sensorial se llevó a
cabo, como se explica a continuación. En agua destilada que contiene
glutamato sódico (0,05 g/dl), inosina monofosfato (0,05 g/dl),
cloruro cálcico (1 mM), aliina
(S-alil-cisteína sulfóxido:
experimento control de la actividad que confiere Kokumi),
\gamma-Glu-Cys-Gly,
\gamma-Glu-Cys,
\gamma-Glu-Ala o
\gamma-Glu-Val se mezclan como
muestra en una cantidad de 0,2 g/dl, y se determina si presentaban
o no actividad que confiere kokumi. Las soluciones de muestra que se
vuelven ácidas después de la disolución de las muestras se ajustan
a un pH de 6,8 a 7,2 con NaOH antes de su uso. Los resultados son
representados en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
(Únicamente como
referencia)
Se midió la intensidad de la actividad que
confiere kokumi de cada péptido, aquellos cuya actividad de
activación del receptor del calcio se confirmó, mediante un ensayo
de evaluación sensorial cuantitativo.
El ensayo de evaluación sensorial cuantitativo
se llevó a cabo, como se explica a continuación. En agua destilada
que contiene glutamato sódico (0,05 g/dl), inosina monofosfato (0,05
g/dl) y cloruro sódico (0,5 g/dl),
\gamma-Glu-Cys-Gly
(glutatión), \gamma-Glu-Ala,
\gamma-Glu-Met o
\gamma-Glu-Val se mezclan como
muestra en una cantidad de 0,1 g/dl, y se determinó si tenían o no
actividad que confiere kokumi. Las soluciones de muestra que se
vuelven ácidas después de la disolución de las muestras se ajustan a
un pH de 6,8 a 7,2 con NaOH antes de su uso. La evaluación se
representó mediante unas escalas de evaluación sensorial basadas en
la muestra control (0 puntos) y las muestras a las que se ha
añadido (glutatión (3 puntos) y el ensayo se llevó a cabo con n=3.
Los resultados son representados en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
(Únicamente como
referencia)
Se midió la intensidad de la actividad que
confiere kokumi de cada péptido, aquellos cuya actividad de
activación del receptor del calcio se confirmó, mediante un ensayo
de evaluación sensorial cuantitativo.
El ensayo de evaluación sensorial cuantitativo
se llevó a cabo, como se explica a continuación. En agua destilada
que contiene glutamato sódico (0,05 g/dl), inosina monofosfato (0,05
g/dl) y cloruro sódico (0,5 g/dl),
\gamma-Glu-Cys-Gly
(glutatión), \gamma-Glu-Cys,
\gamma-Glu-Val o
\gamma-Glu-Val-Gly
se mezclan como muestra en una cantidad de 0,1 g/dl o 0,01 g/dl
según se necesite y se midió la intensidad de la actividad que
confiere kokumi. Las soluciones de muestra que se vuelven ácidas
después de la disolución de las muestras se ajustan a un pH de 6,8
a 7,2 con NaOH antes de su uso. La evaluación se representó mediante
unas escalas de evaluación sensorial basadas en la muestra control
(0 puntos) y las muestras a las que se ha añadido (glutatión (3
puntos) y el ensayo se llevó a cabo con n=5. Los resultados son
representados en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Únicamente como
referencia)
Se midió la intensidad de la actividad que
confiere kokumi de cada péptido, aquellos cuya actividad de
activación del receptor del calcio se confirmó, mediante un ensayo
de evaluación sensorial cuantitativo.
El ensayo de evaluación sensorial cuantitativo
se llevó a cabo, como se explica a continuación. En agua destilada
que contiene glutamato sódico (0,05 g/dl), inosina monofosfato (0,05
g/dl) y cloruro sódico (0,5 g/dl),
\gamma-Glu-Cys-Gly
(glutatión),
\gamma-Glu-Ala-Gly
o
\gamma-Glu-Val-Gly
se mezclan como muestra en una cantidad de 0,1 g/dl o 0,01 g/dl
según se necesite y se midió la intensidad de la actividad que
confiere kokumi. Las soluciones de muestra que resultan ácidas
después de la disolución de las muestras se ajustan a un pH de 6,8 a
7,2 con NaOH antes de su utilización. La evaluación se representó
mediante unas escalas de evaluación sensorial basadas en la muestra
control (0 puntos) y las muestras a las que se ha añadido glutatión
(3 puntos) y el ensayo se llevó a cabo con n=12. Los resultados se
representan en la Tabla 6.
(Únicamente como
referencia)
Se midió la intensidad de la actividad que
confiere kokumi de cada péptido, aquellos cuya actividad de
activación del receptor del calcio se confirmó, mediante un ensayo
de evaluación sensorial cuantitativo.
El ensayo de evaluación sensorial cuantitativo
se llevó a cabo, como se explica a continuación. En agua destilada
que contiene glutamato sódico (0,2 g/dl) como una solución estándar
umami, sacarosa (5 g/dl) como solución estándar de sabor dulce,
cloruro sódico (0,7 g/dl) como solución estándar de gusto salado o
ácido cítrico (0,05 g/dl) como solución estándar de gusto ácido,
\gamma-Glu-Cys-Gly
(glutatión), o
\gamma-Glu-Val-Gly
se mezclan como muestra a una concentración de 0,0001 g/dl a 1 g/dl
y se midió la intensidad de la actividad sobre gustos ácidos.
Las soluciones de muestra que resultan ácidas
después de la disolución de las muestras con respecto a las
soluciones estándar sin las muestras se ajustan con NaOH a un pH no
superior o inferior en 0,2 en relación con las soluciones estándar
antes de su utilización. La evaluación se representó mediante las
escalas siguientes de evaluación sensorial: 0 para la muestra
control, 1 punto para la actividad ligeramente intensa del control,
y 2 puntos para una actividad intensa del control y el ensayo se
realizó con n=12. Las muestras presentaron una actividad que
potencia el gusto ácido a unas concentraciones dentro del amplio
intervalo de concentraciones mencionados anteriormente. Los
resultados para las concentraciones generales se representan en la
Tabla 7.
(Únicamente como
referencia)
Se midió la intensidad de la actividad que
transmite kokumi a la sopa de consomé de cada péptido, aquellos
cuya actividad de activación del receptor del calcio se confirmó,
mediante un ensayo de evaluación sensorial cuantitativo.
El ensayo de evaluación sensorial cuantitativo
se llevó a cabo, como se explica a continuación. La sopa de consomé
se preparó disolviendo polvos de sopa de consomé (35% de cloruro
sódico, 18% de glutamato sódico, 0,2% de inopina monofosfato, 0,3%
de pimienta blanca en polvo, 0,5% de pimienta negra en polvo, 8,0%
de extracto de buey en polvo, 3,0% de vino blanco en polvo, 2,0% de
polvo de apio, 8,0% de extracto de col china en polvo, 2,5% de
extracto de cebolla en polvo, 25,5% de lactosa) a una concentración
de 5 g/dl. Se mezcló en esta sopa de consomé
\gamma-Glu-Cys-Gly
(glutatión) o
\gamma-Glu-Val-Gly
como una muestra a una concentración de 0,0001 a 1 g/dl, y se midió
la intensidad de la actividad que confiere el kokumi para cada
muestra. La sopa de consomé con las muestras que resultan ácidas
después de la disolución de las muestras con respecto a la sopa de
consomé sin las muestras se ajustaron con NaOH a un a un pH no
superior o inferior en 0,2 en relación con las soluciones
estándares antes de su utilización. La evaluación se representó
mediante las escalas siguientes de evaluación sensorial: 0 para la
muestra control, 3 puntos para la actividad intensa del control y 5
puntos para una actividad extremadamente intensa del control y el
ensayo se realizó con n=12. Las muestras presentaron una actividad
que confiere kokumi a unas concentraciones dentro del amplio
intervalo de concentraciones mencionados anteriormente. Los
resultados para las concentraciones generales se representan en la
Tabla 8.
(Únicamente como
referencia)
Se midió la intensidad de la actividad para
conferir kokumi a la sopa ligera japonesa de cada péptido, aquellos
cuya actividad de activación del receptor del calcio se confirmó,
mediante un ensayo de evaluación sensorial cuantitativo.
El ensayo de evaluación sensorial cuantitativo
se llevó a cabo, como se explica a continuación. La sopa ligera
Japonesa se preparó añadiendo 0,5 g/dl de salsa de soja y 0,6 g/dl
de cloruro sódico de un reservorio de alga bonito (una solución que
se obtiene añadiendo 5 g de algas secas a 3 litros de agua, se
calienta el agua, se añaden 25 g de copos secos de bonito justo
antes de hervirlo y después se filtra el agua que contiene el alga
y los copos de boniato). En esta sopa ligera,
\gamma-Glu-Cys-Gly
(glutatión), o
\gamma-Glu-Val-Gly
se mezclan como muestra a una concentración de 0,0001 g/dl a 1 g/dl
y se midió la intensidad de la actividad que confiere kokumi. La
sopa ligera con las muestras que resultan ácidas después de la
disolución de las muestras con respecto a la sopa ligera sin las
muestras se ajustaron con NaOH a un pH no superior o inferior en 0,2
all pH de la sopa ligera sin las muestras antes de su utilización.
La evaluación se representó mediante las escalas siguientes de
evaluación sensorial: 0 para la muestra control, 3 puntos para la
actividad intensa del control y 5 puntos para una actividad
extremadamente intensa del control y el ensayo se realizó con n=12.
Las muestras presentaron una actividad que confiere kokumi a unas
concentraciones dentro del amplio intervalo de concentraciones
mencionados anteriormente. Los resultados para las concentraciones
generales son representados en la Tabla 9.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Únicamente como
referencia)
Se midió la intensidad de la actividad que
confiere kokumi a la sopa de maíz de cada péptido, aquellos cuya
actividad de activación del receptor del calcio se confirmó,
mediante un ensayo de evaluación sensorial cuantitativo.
El ensayo de evaluación sensorial cuantitativo
se llevó a cabo, como se explica a continuación. En una sopa de
maíz disponible comercialmente,
\gamma-Glu-Cys-Gly
(glutatión), o
\gamma-Glu-Val-Gly
se mezclan como muestra a una concentración de 0,0001 g/dl a 1 g/dl
y se midió la intensidad de la actividad que confiere kokumi. La
sopa de maíz con las muestras que resultan ácidas después de la
disolución de las muestras con respecto a la sopa de maíz sin las
muestras se ajustaron con NaOH a un pH no superior o inferior en 0,2
al pH de la sopa de maíz sin muestras antes de su utilización. La
evaluación se representó mediante las escalas siguientes de
evaluación sensorial: 0 para la muestra control, 3 puntos para la
actividad intensa del control y 5 puntos para una actividad
extremadamente intensa del control y el ensayo se realizó con n=12.
Las muestras presentaron una actividad que transmite kokumi a unas
concentraciones dentro del amplio intervalo de concentraciones
mencionados anteriormente. Los resultados para las concentraciones
generales se representan en la Tabla 10.
\vskip1.000000\baselineskip
(Únicamente como
referencia)
Se midió la intensidad de la actividad que
confiere kokumi a una salsa de curry de cada péptido, aquellos cuya
actividad de activación del receptor del calcio se confirmó,
mediante un ensayo de evaluación sensorial cuantitativo.
El ensayo de evaluación sensorial cuantitativo
se llevó a cabo, como se explica a continuación. En la salsa de
curry que se prepara de la forma convencional utilizando una salsa
de harina y grasa de curry disponible comercialmente,
\gamma-Glu-Cys-Gly
(glutatión), o
\gamma-Glu-Val-Gly
se mezclan como muestra a una concentración de 0,0001 g/dl a 1 g/dl
y se midió la intensidad de la actividad que confiere kokumi. La
salsa de curry con las muestras que se vuelven ácidas después de la
disolución de las muestras con respecto a la salsa de curry sin las
muestras se ajustaron con NaOH a un pH no superior o inferior en 0,2
al pH de la salsa de curry sin muestras antes de su utilización. La
evaluación se representó mediante las escalas siguientes de
evaluación sensorial: 0 para la muestra control, 3 puntos para la
actividad intensa del control y 5 puntos para una actividad
extremadamente intensa del control y el ensayo se realizó con n=12.
Las muestras presentaron una actividad que confiere kokumi a unas
concentraciones dentro del amplio intervalo de concentraciones
mencionados anteriormente. Los resultados para las concentraciones
generales se representan en la Tabla 11.
\vskip1.000000\baselineskip
(Únicamente como
referencia)
Se midió la intensidad de la actividad que
confiere kokumi cada péptido cuya actividad de activación del
receptor del calcio se confirmó, utilizando en combinación con un
aditivo como los activadores conocidos del receptor del calcio,
mediante un ensayo de evaluación sensorial cuantitativo.
El ensayo de evaluación sensorial cuantitativo
se llevó a cabo como se explica a continuación. En agua destilada
que contiene glutamato sódico (0,05 g/dl), inosina monofosfato (0,05
g/dl) y cloruro sódico (0,5 g/dl), se mezclan 0,0001 a 1 g/dl de
\gamma-Glu-Cys-Gly
(glutatión) o
\gamma-Glu-Val-Gly
o uno de estos péptidos y otro activador del receptor del calcio
(lactato cálcico, protamina o polilisina) o GABA (concentración de
adición: 0,0001 a 1 g/dl) y se midió la intensidad de la actividad
que confiere kokumi. Las soluciones de muestra que se vuelven
ácidas después de la disolución de las muestras se ajustan a un pH
de 6,8 a 7,2 con NaOH antes de su utilización. La evaluación se
representó mediante las escalas siguientes de evaluación sensorial:
0 para la muestra control, 3 puntos para una actividad intensa (tan
intensa como 0,05 g/dl de
\gamma-Glu-Cys-Gly
y 0,005 g/dl de
\gamma-Glu-Val-Gly)
y 6 puntos para una intensidad extremadamente intensa (como el doble
de la intensidad de 0,05 g/dl de
\gamma-Glu-Cys-Gly
y 0,005 g/dl de
\gamma-Glu-Val-Gly)
y el ensayo se llevó a cabo con n=12. Las muestras presentaron una
actividad que confiere kokumi a unas concentraciones dentro del
amplio intervalo de concentraciones mencionadas anteriormente. Los
resultados para las concentraciones típicas son representados en la
tabla 12. A modo de resultado, un compuesto existente que presenta
una actividad que confiere kokumi, glutatión, representa también
una actividad que confiere kokumi así como el agente que confiere
kokumi de la presente invención cuando se utiliza con un activador
existente del receptor de calcio o similares como el calcio.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante la invención presente, se ha
desarrollado un procedimiento para el cribado de una sustancia que
confiere el kokumi que utiliza la activación del receptor de calcio
como índice. Por consiguiente, se puede utilizar el denominado
cribado de alto rendimiento y de este modo es posible el desarrollo
de una sustancia con gusto kokumi incluso más altamente
eficiente.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Agente que confiere el kokumi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> C565-C6200
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2005-325300
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2005-11-09
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/738562
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2005-11-22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2006-188458
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2006-07-07
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/807831
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2006-07-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador hCASR_N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactaatacga ctcactatag ggaccatggc attttatagc tgctgctgg
\hfill49
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<210> 2
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<223> cebador hCASR_C
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<400> 2
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Claims (1)
1. Procedimiento para el cribado de una
sustancia que confiere el kokumi, es decir una sustancia que puede
potenciar el sabor salado, umami, sabor dulce, sabor ácido o el
sabor amargo, que comprende la reacción de un receptor del calcio y
una sustancia de prueba y la detección de la actividad del receptor
del calcio para indicar un posible efecto que confiere el kokumi a
las sustancias de prueba.
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