CN102686602A

CN102686602A - 羊毛硫氨酸衍生物

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Publication number: CN102686602A
Application number: CN2010800597578A
Authority: CN
Inventors: 佐藤诚一; 二木史惠; 安田礼子; 江藤幸圣; 铃木裕美子; 田岛高穗; 江藤让; 田原优树
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2009-12-28
Filing date: 2010-12-28
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2030-12-28
Also published as: EP2524925A1; EP2524925A4; CA2784310A1; MX2012007508A; KR20120104401A; EP2524925B1; CN102686602B; RU2518890C2; CA2784310C; AU2010339303B2; JP5807843B2; TWI507137B; NZ600832A; US8568814B2; TW201136532A; MY160825A; WO2011081184A1; RU2012132475A; AU2010339303A1; US20120282386A1

Abstract

对具有ＣａＳＲ激动剂活性的多种变体化合物进行探索，发现具有更良好的厚味赋予作用的新化合物，并提供包含该物质的厚味赋予剂、以及包含该物质与其他ＣａＳＲ激动剂活性的物质的复合厚味赋予剂。包含羊毛硫氨酸衍生物的厚味赋予剂、以及将该物质与其他具有ＣａＳＲ激动剂活性的物质组合使用而成的复合厚味赋予剂。

Description

羊毛硫氨酸衍生物

技术领域

本发明涉及显示ＣａＳＲ激动剂活性的新化合物、以及含有其的食品组合物、厚味赋予剂。

背景技术

近年，由于饮食生活的多样化等，消费者对味觉的要求提高，与此相伴，对于能够赋予“厚味”的优良厚味赋予剂的需求提高，所述“厚味”是无法仅用甜味、咸味、酸味、苦味、美味（うま味）代表的5种基本味道表示的、醇厚、充盈、延绵、协调等上述基本味道周边的味道也得以增强的味觉。

另一方面，钙敏感受体（Calcium Sensing Receptor：ＣａＳＲ）也被称作钙受体，该受体信号调节各种生物体内机能，具有ＣａＳＲ激动剂活性的物质能够用作厚味赋予剂（专利文献1、非专利文献1）。

此外，传统上，作为具有厚味赋予活性的化合物已知有谷胱甘肽。但是，谷胱甘肽的分子内含有作为含硫氨基酸的半胱氨酸，因而其在稳定性、气味等方面存在问题。

因此，希望探索具有ＣａＳＲ激动剂活性的多种变体化合物，发现具有更优良的厚味赋予作用、特别是前味型的厚味赋予作用，且稳定性良好、能够简便且低成本生产的能够赋予厚味的物质，提供包含该物质的厚味赋予剂、以及该物质与其它具有ＣａＳＲ激动剂活性的物质组合使用的复合厚味赋予剂。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:国际公开第2007／055393号小册子

非专利文献

非专利文献1:The Journal of Biological Chemistry(2010),285(2),1016-22

发明内容

本发明的课题是：探索具有ＣａＳＲ激动剂活性的多种变体化合物，提供具有更良好厚味赋予作用的物质，提供包含该物质的厚味赋予剂、以及将该物质与其他具有ＣａＳＲ激动剂活性的物质组合使用而成的复合厚味赋予剂。而且，课题还包括提供含有一定浓度的该物质的食品组合物。

本发明人对各种化合物进行了深入探索，结果发现：具有下述式（I）的结构的新化合物——羊毛硫氨酸衍生物（以下也称作本发明的化合物或本发明的羊毛硫氨酸衍生物）具有高的ＣａＳＲ激动剂活性和极良好的厚味赋予效果。而且，发现通过添加发现的本发明的化合物，能够得到厚味（kokumi）增强的优选的食品组合物，从而完成了本发明。

即，本发明提供具有下述式（I）的结构的化合物或其可食用性盐。

[化学式1]

（式中，Ｒ1和Ｒ2彼此独立地表示氢原子或碳原子数1～3的低級烷基，

Ａ表示亚甲基或氧基（－Ｏ－），

Ｘ表示碳原子数1~5的亚烷基，其中，该亚烷基中的1个亚甲基可以被硫基（－Ｓ－）、二硫基（－Ｓ－Ｓ－）、氧基（－Ｏ－）、亚氨基（－ＮＨ－）或碳原子数1～3的烷基亚氨基（－ＮＲa－，其中，Ｒa表示碳原子数1～3的烷基）替代，且该亚烷基可以被1~6个碳原子数1～3的烷基取代。）

此外，本发明还提供含有10ｐｐｂ～99．9质量％所述式（I）所述的化合物或其可食用性盐的食品组合物（以下也称“本发明的食品组合物”。）。

此外，本发明还提供含有所述式（I）所述的化合物或其可食用性盐作为有效成分的厚味赋予剂（以下也称“本发明的厚味赋予剂”。）。此外，本发明提供对（ａ）所述式（I）所述的化合物或其可食用性盐组合使用选自（ｂ）γ－Ｇｌｕ－Ｘ－Ｇｌｙ（Ｘ表示氨基酸或氨基酸衍生物）、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｙ（Ｙ表示氨基酸或氨基酸衍生物）、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ、γ－Ｇｌｕ－Ａｌａ、γ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、γ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ、γ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｏｒｎ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ、Ｃｙｓ－Ｇｌｙ、Ｃｙｓ－Ｍｅｔ、Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、Ｇｌｙ－Ｃｙｓ、Ｌｅｕ－Ａｓｐ、Ｄ－Ｃｙｓ、γ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ（Ｏ）、γ－Ｇｌｕ－γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－ＮＨ2、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－ｏｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ、γ－Ｇｌｕ－Ｔａｕ、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）（Ｏ）、γ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ、γ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ、γ－Ｇｌｕ－ｔ－Ｌｅｕ和γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）中的1种或2种以上的氨基酸或肽而得到的复合厚味赋予剂。

此外，本发明提供作为所述式（I）所述的化合物或其可食用性盐的制造中间体而有用的、具有下述式（IA）的结构的化合物或其化学可接受的盐。

[化学式2]

（式中，Ｒ1’以及Ｒ2’彼此独立地表示氢原子、以及碳原子数1～3的烷基，

Ｒ3’表示氢原子、碳原子数1~4的烷基、苄基、或9－芴基甲基，

Ｒ4’表示叔丁氧基羰基、苄基氧基羰基、或9－芴基甲基氧基羰基，

Ｒ5’表示羟基、碳原子数1～4的烷氧基、苄基氧基、氨基（－ＮＨ₂）或碳原子数1～3的烷基氨基，

Ａ表示亚甲基或氧基，

Ｘ表示碳原子数1~5的亚烷基，其中，该亚烷基中1个亚甲基可以用硫基、二硫基、氧基、亚氨基或碳原子数1～3的烷基亚氨基替代，此外，该亚烷基可以被1~6个碳原子数1～3的烷基取代。）

根据本发明，能够提供具有极良好的厚味赋予作用、稳定性良好、且能够简便、低成本生产的厚味赋予剂、以及复合厚味赋予剂。此外，根据本发明，能够提供含有一定浓度以上的具有良好的厚味赋予作用的物质的良好的食品组合物。

发明的具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。

在本发明中，碳原子数1～3的烷基表示直链或支链的烷基，具体可以列举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基等，优选可以列举出甲基、乙基等。

此外，碳原子数1～3的烷基亚氨基是指被前述的碳原子数1～3的烷基取代的亚氨基。

就本发明而言，通式（I）中，以下是优选的。

作为R1、R2，优选氢原子。

A优选亚甲基。

X优选1个亚甲基用硫基替代的三亚甲基，特别优选－ＣＨ₂－Ｓ－ＣＨ₂－。

此外，Ｘ优选1个亚甲基用硫基替代的四亚甲基，或者被碳原子数1～3的烷基取代的、1个亚甲基用硫基替代的三亚甲基，特别优选－ＣＨ₂－Ｓ－ＣＨ₂－ＣＨ₂－、－ＣＨ（ＣＨ₃）－Ｓ－ＣＨ₂－、－ＣＨ₂－Ｓ－（ＣＨ₃）ＣＨ－。

此外，Ｘ还优选三亚甲基。

对于通式（Ｉ）中的环状结构的下述所示的碳a,b，任何立体构象的化合物均可使用，优选下述式（I-1）、（I-2）所示的构象，特别优选(I-1)所示的构象。此外，对于碳ｃ，优选Ｓ构象。

[化学式3]

[化学式4]

作为本发明的通式（I）所表示的化合物或其可食用性盐，更具体地优选以下所示的化合物或其可食用性盐。

式（Ｉ）中，Ｒ1和Ｒ2为氢原子、Ａ为亚甲基、Ｘ为硫基替代的三亚甲基的化合物。

式（I-1a）所表示的化合物。

[化学式5]

下述式（IIa）所表示的化合物。

[化学式6]

具有以下的立体构象的上述式（ＩＩa）所表示的化合物。这些化合物8 ａ～8ｄ，任何化合物均可使用，特别优选8ｂ。

[化学式7]

[化学式8]

[化学式9]

[化学式10]

式（Ｉ）中，Ｒ1和Ｒ2为氢原子、Ａ为亚甲基、Ｘ为硫基替代的四亚甲基，或被碳原子数1～3的烷基取代的、1个亚甲基用硫基替代的三亚甲基的化合物。

下述式（IIb）以及（IIc）所表示的化合物。

[化学式11]

[化学式12]

（式中，R表示碳原子数1～3的烷基。）

作为可食用性盐，具体例如，对于充分酸性的本发明化合物，可以列举出铵盐、碱金属盐（示例出钠盐、钾盐等，它们是优选的）、碱土金属盐（示例钙盐、镁盐等，它们是优选的），作为有机碱的盐，可以列举出赖氨酸盐、精氨酸盐等。此外，对于充分碱性的本发明化合物，可以列举出盐酸等无机盐、或乙酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸等有机酸盐等。

此外，作为化学可接受的盐，可以列举出例如上述的可食用性盐。

（制造方法）

以下描述本发明的化合物的典型制造方法。

而且，在以下的制造方法中，根据官能团的种类，有些情况下，将该官能团在原料或中间体的阶段替换成适当的保护基团、即能够容易地转化为该官能团的基团，在制造技术上是有效的。这样之后，视需要除去保护基团，可以得到希望的化合物。作为这样的官能团，可以列举出例如氨基、羟基、羧基等，作为它们的保护基团，Protective Groups in Organic Synthesis第3版(T.W.Green、P.G.M.Wuts著、JOHN WILLY&SONS,INC.发行)所述的保护基团等，例如，作为氨基的保护基团，可以列举出叔丁氧基羰基（Ｂｏｃ）、苄基氧基羰基（Ｃｂｚ）、9－芴基甲氧基羰基（Ｆｍｏｃ）等，作为羧基的保护基团，可以列举出叔丁基（ｔ－Ｂｕ）、苄基（Ｂｎ或Ｂｚｌ）等，可以根据反应条件适宜使用它们。保护基团的导入和脱保护可以视情况采用该参考书所述的方法。例如，给出了记载于下述制造方法中的如Prot1,Prot2那样记载的官能团可以用作保护基团，但不限于此。

本发明的化合物（I）可以按照例如下述所示的合成路线Ｉ来制造。

合成路线Ｉ

[化学式13]

（式中的取代基的定义与前述式（I）或（ＩＡ）的定义相同。）

使用缩合剂使化合物（X）在碱存在下与谷氨酸衍生物(XI)缩合，作为γ-谷氨酰化合物（XII）。然后，通过全部除去化合物（XII）的羧基和氨基的保护基团，得到化合物（I）。

这样得到的通式（I）所示的化合物可以采用公知的分离手段、例如减压浓缩、溶剂抽提、结晶化、色谱等来进行分离纯化。

此外，作为出发原料（X）的一例，R1’和R2’为氢原子、X为（-CH2-S-CH2-）的化合物可以按照例如下述所示的合成路线ＩＩ来制造。

合成路线ＩＩ

[化学式14]

（式中，Prot1~Prot4彼此独立地表示适当的保护基团。）

详述如下：将化合物(III)用三苯基膦等还原，得到硫醇（IV）。然后，使化合物IV与卤代烷基在碱存在下反应，作为硫醚化合物（VI）。除去化合物（VI）的一部分保护基团后，在碱存在下使用缩合剂导入环状化合物（VIII），然后除去VIII的氨基的保护基团，使用适当的缩合剂，与谷氨酸衍生物（X）进行缩合。

这样得到的通式（X）所示的化合物可以采用公知的分离手段、例如减压浓缩、溶剂抽提、结晶化、色谱等来进行分离纯化。

Ｘ为硫基替代的四亚甲基的所述出发物质（Ｘ）例如可以按照以下的合成路线ＩＩＩ，像上述化合物那样进行合成。

合成路线ＩＩＩ

[化学式15]

（式中的取代基的定义如前述，n为2。）

Ｘ为被碳原子数1～3的烷基取代的、用硫基替代的三亚甲基的所述出发物质（Ｘ）可以按照以下的合成路线ＩＶ，像上述化合物那样进行合成。

合成路线ＩＶ

[化学式16]

（式中的取代基的定义如前述。）

Ｘ为用氧基替代的三亚甲基的所述出发物质（Ｘ）可以按照例如以下合成路线（Ｖ）进行合成。

合成路线Ｖ

1）使用氮杂环丙烷衍生物的环状化合物合成方法

2）利用分子间醚化的环状化合物合成方法

3）利用分子内醚化的环状化合物合成方法

本发明的羊毛硫氨酸衍生物具有良好的厚味赋予效果，因而可以用作厚味赋予剂。本发明的羊毛硫氨酸衍生物可以以相对于赋予厚味的食品组合物的重量含有10ｐｐｂ～99．9％、优选0．05ｐｐｍ～99．9％、更优选0．1ｐｐｍ～99．9％那样来添加使用。即，根据本发明的其他实施方式，涉及含有羊毛硫氨酸衍生物的食品组合物、优选含有羊毛硫氨酸衍生物0．05ｐｐｍ～99．9％的食品组合物。

此外，本发明的羊毛硫氨酸衍生物通过与选自谷氨酸钠（ＭＳＧ）等氨基酸类、肌苷一磷酸（ＩＭＰ）等核酸类、氯化钠等无机盐类、柠檬酸等有机酸类、各种酵母提取物等中的至少1种其他调味原料组合使用，可以提供与其他调味原料单独使用的情况相比、厚味进一步提升的优选的调味料。将本发明的羊毛硫氨酸衍生物与上述的其他调味原料组合使用时的浓度，本领域技术人员可以经由感官评价等研究适宜设定，作为一例，对于最终浓度而言，可以含有本发明的羊毛硫氨酸衍生物0．1ｐｐｍ～500ｐｐｍ左右。

本发明中，“厚味”意指用甜味（sweet taste）、咸味（salty taste）、酸味（sour taste）、苦味（bitter taste）、美味（umami）所表示的5种基本味道（five basic tastes）无法表示的味道，是不仅基本味道、而且醇厚（thickness）·充盈（growth（mounthfulness））·延绵（continuity）·协调（harmony）等基本味道的周边味道（marginal tastes）也得到增强的味道。这里，“厚味赋予”是指：赋予甜味、咸味、酸味、苦味、美味所表示的5种基本味道的增强以及随之而来的醇厚·充盈·协调等基本味道的周边味道。此外，这也可以表述为呈味增强作用。因此，本发明的化合物也可以表述为呈味增强剂（Flavor Enhancer）。本发明的化合物可以作为甜味增强剂、咸味增强剂、酸味增强剂、苦味增强剂或美味增强剂使用。

此外，味觉随饮食后的时间经过而变化，从刚刚饮食后开始依次称为前味（initial taste）、中味（middle taste）以及后味（after taste）。这些虽是相对概念，但大体上前味、中味以及后味分别是饮食后0~2秒、2秒~5秒、以及5秒以后感觉到的呈味。此外，前味与中味合称“前中味”，中味与后味合称“中后味”。此外，0~5秒作为“前中味”，2秒以后至约30秒前后作为“中后味”。对于分为3等级的评价，饮食者难以在评价上集中，因而通常采用分为2等级的评价。

具有ＣａＳＲ活性的物质对厚味以及呈味模式的效果可以通过由人进行的味觉试验等方法来确认。作为这样的由人进行的味觉感官试验，可以列举出例如本申请说明书的实施例所示的试验，但不限于此。

在本说明书中，“ＣａＳＲ”是指钙敏感受体（Calcium Sensing Receptor），其属于7次跨膜型受体的Ｃ类，也称为钙受体。本说明书中“ＣａＳＲ激动剂”是指：结合于上述ＣａＳＲ、活化ＣａＳＲ的物质。此外，在本说明书中，“活化ＣａＳＲ”是指：配基结合于ＣａＳＲ、活化鸟嘌呤核苷酸结合蛋白质、传导信号。此外，结合于ＣａＳＲ、活化ＣａＳＲ的性质称为“ＣａＳＲ激动剂活性”。

具体给出筛选具有ＣａＳＲ激动剂活性的化合物的方法，但并不限于这些步骤。

1）在用于测定ＣａＳＲ活性的ＣａＳＲ活性测定系统中添加被检物质，测定ＣａＳＲ活性。

2）比较添加被检物质时的ＣａＳＲ活性与未添加被检物质时的ＣａＳＲ活性。

3）选择在添加被检物质时显示ＣａＳＲ激动剂活性的被检物质。

ＣａＳＲ活性的测定例如可以利用使用表达ＣａＳＲ的细胞的测定系统来进行。上述细胞可以是内源性表达ＣａＳＲ的细胞，外源性导入ＣａＳＲ基因的重组细胞。对于上述ＣａＳＲ活性测定系统没有特殊限制，可以是在上述表达ＣａＳＲ的细胞中添加ＣａＳＲ特异性细胞外配基（活化物质）时能够检测活化物质与ＣａＳＲ之间的结合（反应）的测定系统，或者可以传导应答活化物质与ＣａＳＲ之间的结合（反应）而可在细胞内检测的信号的测定系统。在通过与被检物质的反应而检测到ＣａＳＲ活性的情况下，判定该被检物质具有ＣａＳＲ刺激活性。

作为上述ＣａＳＲ，优选可以示例出以GenBank Accession No.NM_000388登录的人ＣａＳＲ基因编码的人ＣａＳＲ。而且，ＣａＳＲ不限于上述序列的基因编码的蛋白质，还可以是与上述序列具有60％以上、优选80％以上、更优选90％以上的同源性的基因（条件是编码具有ＣａＳＲ功能的蛋白质）编码的蛋白质。而且，ＣａＳＲ功能可以通过在细胞中表达这些基因、测定添加钙时的电流变化或细胞内钙离子浓度的变化来考察。

对于上述ＣａＳＲ的来源没有特殊限制，不仅是上述的人的ＣａＳＲ，还可以列举出包含小鼠、大鼠、犬等在内的所有动物来源的ＣａＳＲ。

如上述，ＣａＳＲ活性可以利用表达ＣａＳＲ或其片段的活细胞、表达ＣａＳＲ或其片段的细胞膜、包含ＣａＳＲ或其片段的蛋白质的体外体系等来确认。

以下给出使用活细胞的一例，但不限于此。

将ＣａＳＲ在非洲爪蟾卵母细胞、仓鼠卵巣细胞、人胚胎肾脏细胞等培养细胞中表达。这可以通过以质粒状态导入在保持外源基因的质粒中克隆ＣａＳＲ基因而得到的重组质粒、或者导入以其作为模板而得到的ｃＲＮＡ来实现。反应的检测可以采用电生理学方法、细胞内钙上升的荧光指示试剂。

ＣａＳＲ的表达最初可以通过对钙或特异性活化剂的应答来确认。使用相对于5ｍＭ左右浓度的钙观察到细胞内电流的卵母细胞或观察到荧光指示试剂的荧光的培养细胞。改变钙的浓度，测定浓度依赖性。然后，将被检物质制备成1μＭ～1ｍＭ左右，添加至卵母细胞或培养细胞，通过测定上述被检物质存在下的ＣａＳＲ活性，测定上述被检物质的ＣａＳＲ激动剂活性。

此外，更具体地，作为ＣａＳＲ激动剂活性试验可以列举出例如本申请说明书的试验例所示的试验，但不限于此。

本发明的复合厚味赋予剂中，与本发明的羊毛硫氨酸衍生物组合使用的氨基酸或肽可以是选自γ－Ｇｌｕ－Ｘ－Ｇｌｙ（Ｘ表示氨基酸或氨基酸衍生物）、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｙ（Ｙ表示氨基酸或氨基酸衍生物）、γ-Ｇｌｕ－Ａｂｕ、γ－Ｇｌｕ－Ａｌａ、γ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、γ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ、γ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｏｒｎ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ、Ｃｙｓ－Ｇｌｙ、Ｃｙｓ－Ｍｅｔ、Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、Ｇｌｙ－Ｃｙｓ、Ｌｅｕ－Ａｓｐ、Ｄ－Ｃｙｓ、γ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ（Ｏ）、γ－Ｇｌｕ－γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－ＮＨ2、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－ｏｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ、γ－Ｇｌｕ－Ｔａｕ、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）（Ｏ）、γ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ、γ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ、γ－Ｇｌｕ－ｔ－Ｌｅｕ和γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）中的1种或2种以上的氨基酸或肽，这里，氨基酸包括Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、ｔ－Ｌｅｕ等中性氨基酸，Ａｓｐ、Ｇｌｕ等酸性氨基酸，Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ等碱性氨基酸，Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ等芳香族氨基酸，还包括高丝氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、α－氨基丁酸、正缬氨酸、正亮氨酸、牛磺酸等。此外，还可以是叔亮氨酸、环亮氨酸、α－氨基异丁酸、Ｌ－青霉胺、别苏氨酸、别异亮氨酸等非天然（非构成蛋白质）氨基酸。而且，在肽γ－Ｇｌｕ－Ｘ－Ｇｌｙ中，Ｘ可以是如上述的氨基酸或其衍生物中的任何一个，优选Ｃｙｓ以外的氨基酸或其衍生物。

在本说明书中，氨基酸残基的缩写表示以下的氨基酸。

（1）Ｇｌｙ：甘氨酸

（2）Ａｌａ：丙氨酸

（3）Ｖａｌ：缬氨酸

（4）Ｌｅｕ：亮氨酸

（5）Ｉｌｅ：异亮氨酸

（6）Ｍｅｔ：甲硫氨酸

（7）Ｐｈｅ：苯丙氨酸

（8）Ｔｙｒ：酪氨酸

（9）Ｔｒｐ：色氨酸

（10）Ｈｉｓ：组氨酸

（11）Ｌｙｓ：赖氨酸

（12）Ａｒｇ：精氨酸

（13）Ｓｅｒ：丝氨酸

（14）Ｔｈｒ：苏氨酸

（15）Ａｓｐ：天冬氨酸

（16）Ｇｌｕ：谷氨酸

（17）Ａｓｎ：天冬酰胺

（18）Ｇｌｎ：谷氨酰胺

（19）Ｃｙｓ：半胱氨酸

（20）Ｐｒｏ：脯氨酸

（21）Ｏｒｎ：鸟氨酸

（22）Ｓａｒ：肌氨酸

（23）Ｃｉｔ：瓜氨酸

（24）Ｎ－Ｖａｌ（或、Ｎｖａ）：正缬氨酸（2－氨基戊酸）

（25）Ｎ－Ｌｅｕ（或、Ｎｌｅ）：正亮氨酸

（26）Ａｂｕ：α－氨基丁酸

（27）Ｔａｕ：牛磺酸

（28）Ｈｙｐ：羟基脯氨酸

（29）ｔ－Ｌｅｕ：叔亮氨酸

（30）Ｃｌｅ：环亮氨酸

（31）Ａｉｂ：α－氨基异丁酸（α－aminoisobutyric acid、2－甲基丙氨酸）

（32）Ｐｅｎ：Ｌ－青霉胺（penicillamine）

（33）ａｌｌｏ－Ｔｈｒ：别苏氨酸

（34）ａｌｌｏ－Ｉｌｅ：别异亮氨酸

此外，作为氨基酸衍生物，可以列举出上述氨基酸的各种衍生物，例如，特殊氨基酸、非天然氨基酸、氨基醇、或末端羰基或氨基、半胱氨酸的硫醇基等氨基酸侧链被各种取代基取代而成的氨基酸衍生物。作为取代基，可以列举出烷基、酰基、羟基、氨基、烷基氨基、硝基、磺酰基、各种保护基团等，包括例如Ａｒｇ（ＮＯ₂）：Ｎ－γ－硝基精氨酸、Ｃｙｓ（ＳＮＯ）：Ｓ－硝基半胱氨酸、Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）：Ｓ－甲基半胱氨酸、Ｃｙｓ（Ｓ－allyl）：Ｓ－烯丙基半胱氨酸、Ｖａｌ－ＮＨ2：缬氨酸酰胺、Ｖａｌ－ｏｌ：缬氨醇（2－氨基－3－甲基－1－丁醇）等。而且，在本说明书中，γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（ＳＮＯ）－Ｇｌｙ具有下述的结构式，意味着上述γ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ（Ｏ）和γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）（Ｏ）式中的（Ｏ）是亚砜结构。γ－Ｇｌｕ的（γ）是指通过谷氨酸的γ位羧基与其他氨基酸结合。

[化学式17]

本发明的羊毛硫氨酸衍生物以及与其组合使用的氨基酸或肽在有市售的情况下，可以使用市售品，此外，还可以适宜采用（1）化学合成方法、或（2）酶反应合成方法等公知方法来获得，其中化学合成更为简便。在化学合成本发明的羊毛硫氨酸衍生物以及与其组合使用的氨基酸或肽的情况下，通过使用肽合成仪合成或者半合成该寡肽来进行。作为化学合成方法，可以列举出例如肽固相合成法等。这样合成的肽可以采用常规手段例如离子交换色谱、反相高效液体色谱、亲和色谱等进行纯化。这样的肽固相合成方法以及其后的肽纯化都是本技术领域公知的。

此外，在通过酶反应生产本发明中使用的羊毛硫氨酸衍生物以及与其组合使用的氨基酸或肽的情况下，可以采用例如国际公开小册子ＷＯ2004／011653号所述的方法。即，可以这样来生产：将一方的氨基酸或二肽的羧基末端被酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、与氨基酸处于游离状态的氨基酸（例如羧基保护的氨基酸）在肽合成酶的存在下进行反应，生成生成的二肽或三肽。作为肽合成酶，可以列举出：具有生成肽的能力的微生物的培养物、由该培养物分离的微生物菌体、或该微生物的菌体处理物、或该微生物来源的肽合成酶。

而且，除了上述的酶方法、化学合成方法以外，有些情况下，本发明中使用的肽存在于蔬菜、水果等植物、酵母等微生物、其他天然物中。在天然存在的情况下，还可以从这些之中抽提出来使用。

本发明的厚味赋予剂或者复合厚味赋予剂可以直接、或与饮食品可接受的载体、其他调味原料混合，作为调味料。作为其他调味原料，可以列举出例如香料、糖类、甜味料、食物纤维类、维生素类、谷氨酸钠（ＭＳＧ）等氨基酸类、肌苷一磷酸（ＩＭＰ）等核酸类、氯化钠等无机盐类、柠檬酸等有机酸类，还可以列举出各种酵母提取物。

本发明中使用的羊毛硫氨酸衍生物以及组合使用的氨基酸或肽还包括盐的形态。在本发明的羊毛硫氨酸衍生物以及组合使用的氨基酸或肽能够形成盐的形态的情况下，该盐只要是药理学可接受的、可食用性盐即可，对于羧基等酸性基团，可以列举出例如：与铵盐、钠、钾等碱金属的盐、与钙、镁等碱土金属的盐、铝盐、锌盐、与三乙基胺、乙醇胺、吗啉、吡咯烷、哌啶、哌嗪、二环己胺等有机胺的盐、与精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸的盐。此外，对于碱性基团，可以列举出：与盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、氢溴酸等无机酸的盐，与乙酸、柠檬酸、安息香酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、单宁酸、丁酸、羟基苯甲酰苯甲酸（Hibenzate）、双羟萘酸、庚酸、癸酸、茶氯酸、水杨酸、乳酸、乙二酸、扁桃酸、苹果酸等有机羧酸的盐、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等有机磺酸的盐。

本发明的羊毛硫氨酸衍生物、厚味赋予剂、食品组合物、或者复合厚味赋予剂可以不受物性限制地以干燥粉末、糊剂（paste）、溶液等各种形态使用。

本发明的羊毛硫氨酸衍生物、厚味赋予剂、食品组合物、或者复合厚味赋予剂可以配合在食品、饮料、调味料等各种饮食品中使用。

对于在将本发明的羊毛硫氨酸衍生物、厚味赋予剂、食品组合物、或者复合厚味赋予剂配合在食品、饮料、调味料等各种饮食品中使用的情况下的最终的羊毛硫氨酸衍生物的量以及组合使用的氨基酸或肽的量，没有特殊限制，是能够获得希望的效果的量即可，作为羊毛硫氨酸衍生物的量和／或氨基酸或者肽的量，以食品、饮料或者调味料等的总质量作为基准，分别是10ｐｐｂ～99．9％左右、优选0．05ｐｐｍ～99．9％左右、更优选0．1ｐｐｍ～99．9％左右。

配合有本发明的羊毛硫氨酸衍生物、厚味赋予剂、食品组合物、或者复合厚味赋予剂的食品、饮料、调味料等各种饮食品可以再进一步配合饮食品可接受的任何固体或液体的载体、适当调味原料等。

作为上述载体，可以列举出例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、葡聚糖、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟基乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、明胶、白蛋白、氨基酸、水、生理食盐水等。

对于上述的调味原料没有特殊限制，可以是业界使用的任何调味原料，更具体地可以列举出上述已经提及的。

无论对于上述的载体、还是对于其他调味原料等，对其含量均无特殊限制。

上述调味原料中，就酵母提取物而言，对作为来源的菌体、其培养条件、抽提处理方法均无特殊限制，可以使用任意的酵母提取物，还可以进一步实施加热处理、酶处理、浓缩、粉末化处理等。

以下，给出实施例对本发明进行更具体的说明，但这些不是限定本发明。

实施例

（实施例1）化合物1的合成

(Fmoc-L-Cys-Ot-Bu)₂(N,N’-difluorenylmethoxycarbonyl-L-cystinedi-t-butylester，4.81mmol)溶解于四氢呋喃（58.5mL）和水（1.5mL）中。冰冷下添加三丁基膦(5.28mmol)回到室温，搅拌4小时。将反应液冷却，添加10%柠檬酸水溶液（60mL）。使白浊液回到室温，用乙酸乙酯（60mL）抽提。将有机层用食盐水60mL洗涤后，进行浓缩得到油状残渣。将残渣用硅胶柱(正己烷-乙酸乙酯)纯化，得到作为油状物的化合物1。

收率97%。

ESI MS m/z 422.4(M+Na)⁺

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.50(9H,s),2.99(2H,m),4.23(1H,t,J=6.8Hz),4.41(2H,m),4.54(1H,m),5.68(1H,d,J=7.2Hz),7.32(2H,m),7.41(2H,t,J=7.2Hz),7.61(2H,d,J=7.6Hz),7.77(2H,d,J=7.2Hz).

[化学式18]

（实施例2）化合物2的合成

化合物1(6.04mmol)溶解于二甲基甲酰胺（60mL）中，加入Boc-iodo-D-Ala-OMe (N-t-butoxycarbonyl-3-iodo-D-alanine methylester)(6.20mmol)后，加入碳酸铈(6.02mmol)，室温搅拌过夜。将反应液冷却，加入10%柠檬酸水溶液（50mL）和水（30mL）后，用乙酸乙酯（60mL）抽提，然后再次将水层用乙酸乙酯（60mL）抽提。将有机层合并，用10%柠檬酸水溶液（50mL）、食盐水（50mL）依次洗涤，浓缩有机层。将所得油状残渣用硅胶柱(正己烷-乙酸乙酯)纯化，得到作为油状物的化合物2。

收率66%。

ESI MS m/z 601.2(M+H)⁺

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.45(9H,s),1.49(9H,s),3.01(4H,m),3.73(3H,s),4.24(1H,t,J=7.2Hz),4.39(2H,d,J=7.2Hz),4.48-4.55(2H,m),5.37(1H,brd,J=6.8Hz),5.80(1H,brd,J=6.8Hz),7.32(2H,m),7.40(2H,t,J=7.2Hz),7.63(2H,m),7.77(2H,d,J=7.6Hz).

[化学式19]

（实施例3）化合物4的合成

（步骤1）化合物2(4.01mmol)溶解于二氯甲烷70mL中，加入三氟乙酸（70mL），室温搅拌1小时后，浓缩反应液，得到了含有3的残渣。假定收率100%，直接用于接下来的反应。

[化学式20]

（步骤2）冰冷下，在化合物3（相当于4.01mmol）中加入无水二甲基甲酰胺（60mL），形成均一液体，向其中滴加二异丙基乙基胺(8.04mmol)。回到室温，加入羰基双咪唑(8.10mmol)，该状态搅拌过夜。冷却搅拌条件下，在反应液中加入10%柠檬酸水溶液（50mL），回到室温后，用乙酸乙酯（100mL）抽提，将水层再次用乙酸乙酯抽提，合并有机层。将该有机层用10%柠檬酸水溶液（50mLｘ2）、食盐水洗涤1次后，进行浓缩，得到油状残渣。将所得残渣用硅胶柱(正己烷-乙酸乙酯)纯化，得到作为油状物的化合物4。

收率39%（2步骤）。

ESI MS m/z 448.5(M+Na)⁺

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ2.71(1H,dd,J=9.2,14.4Hz),2.78-2.90(2H,m),3.02(1H,d,J=14.4Hz),3.86(3H,s),4.20(1H,t,J=6.8Hz),4.40(2H,d,J=6.8Hz),4.56(1H,dd,J=5.6,9.2Hz),4.68(1H,m),6.30(1H,d,J=5.6Hz),7.32(2H,t,J=7.6Hz),7.40(2H,t,J=7.6Hz),7.60(2H,d,J=7.6Hz),7.77(2H,d,J=7.6Hz).

[化学式21]

（实施例4）化合物6的合成

（步骤1）在化合物4(1.54mmol)中加入10%吗啉－二甲基甲酰胺溶液（14mL），室温搅拌30分钟。将反应液浓缩，得到含化合物5的残渣。假定收率100%，直接用于接下来的反应。

[化学式22]

（步骤2）将Boc-L-Glu-OtBu(N-t-butoxycarbonyl-L-glutamic acidα-t-butylester)(1.70mmol)溶解于无水二甲基甲酰胺（9mL），加入HOBt·H2O(1-hydroxybenzotriazole hydrate)(1.85mmol)和WSC·HCl(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-Ethoxycarbodiimide hydrochloride)(1.90mmol)，室温搅拌15分钟。向其中加入悬浮于二甲基甲酰胺（20mL）中的化合物5(相当于1.54mmol)，室温下反应过夜。浓缩反应液后，向残渣加入乙酸乙酯（50mL）和水（50mL）进行分液，将水层再次用乙酸乙酯（50mL）抽提。合并有机层，用碳酸氢钠水（50mL）和食盐水（50mL）洗涤后进行浓缩。将所得糊剂状残渣用硅胶柱(正己烷-乙酸乙酯)纯化，得到作为油状物的6。

收率81%(2步骤)。

ESI MS m/z 490.0(M+H)⁺

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.44(9H,s),1.46(9H,s),1.90(1H,m),2.17(1H,m),2.32(2H,m),2.60(1H,dd,J=10.5,14.1Hz),2.92-2.98(2H,m),3.18(1H,dd,J=6.0,14.7Hz),3.84(3H,s),4.46(1H,m),4.80(1H,m),5.19(1H,d,J=8.1Hz),6.32(1H,d,J=8.1Hz),7.09(1H,brs).

[化学式23]

（实施例5）化合物8a和8b的合成

（步骤1）将化合物6(1.25mmol)溶解于四氢呋喃（30mL），冰冷搅拌下，加入0.2M氢氧化锂水溶液(2.50mmol)。30分钟后，用10%柠檬酸水溶液中和至约pH6。回到室温，将反应液浓缩后，进行乙酸乙酯抽提（20mLｘ3）。将水层再次用乙酸乙酯抽提（20mLｘ3），并将有机层合并，用食盐水（10mL）洗涤后，浓缩有机层，得到了化合物7。假定收率100%，直接用于接下来的反应。

[化学式24]

（步骤2）在化合物7(相当于1.25mmol)中加入4N盐酸／二氧杂环己烷溶液（25mL），室温下反应过夜后，将反应液浓缩。对于所得的糊剂状残渣，使用强碱性离子交换树脂（Amberlite IRA400 OH AG）进行纯化，得到2个级分。通过对先洗脱的级分的一部分进一步用反相分配HPLC（柱：野村化学公司制造Develosil RPAQUEOUS-AR-5、流动相：含0.1%甲酸的水／乙腈系线性梯度）进行纯化，以饴状物质的形式得到了化合物8a。另一方面，通过对后洗脱的级分进行浓缩，得到了白色固体，进一步将该固体溶解在水中后，冷冻干燥，将所得残渣用少量的水浆料洗涤，以白色固体的形式得到了化合物8b。

化合物8a

ESI MS m/z 318.3(M-H)^-

¹H NMR(600MHz,D₂O)δ2.13(2H,m),2.50(2H,t,J=7.8Hz),2.64(1H,d,J=15.0Hz),2.83(1H,dd,J=10.8,15.0Hz),3.02(1H,dd,J=2.4,15.0Hz),3.15(1H,dd,J=5.4,15.0Hz),3.83(1H,t,J=6.0Hz),4.55(1H,dd,J=2.4,5.4Hz),4.91(1H,dd,J=2.4,10.8Hz).

化合物8b

收率26%(2步骤)

ESI MS m/z 318.0(M-H)^-

¹H NMR(600MHz,D₂O)δ2.12(2H,m),2.48(2H,t,J=7.2Hz),2.72(1H,d,J=14.4Hz),2.76(1H,dd,J=10.2,14.4Hz),2.89(1H,dd,J=9.6,14.4Hz),3.05(1H,d,J=14.4Hz),3.78(1H,t,J=6.0Hz),4.42(1H,d,J=9.6Hz),4.91(1H,d,J=10.2Hz).

[化学式25]

[化学式26]

（实施例6）化合物9的合成

将D-胱氨酸(5.20mmol)溶解于60%高氯酸水溶液（2.1mL），滴加乙酸叔丁基酯（12.6mL），室温搅拌2天后，对反应液进行冰冷，使用4N氢氧化钠水溶液调整至约pH11。回到室温，用乙酸乙酯（50mL）抽提6次，将有机层合并，用硫酸钠干燥后进行浓缩，从而得到作为油状物的化合物9。

收率72%。

ESI MS m/z 353.2(M+H)⁺

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.48(18H,s),2.88(2H,dd,J=8.0,13.2Hz),3.14(2H,dd,J=4.4,13.2Hz),3.69(2H,dd,J=4.4,8.0Hz).

[化学式27]

（实施例7）化合物9的合成

将化合物9(3.70mmol)溶解于四氢呋喃（40mL），加入Fmoc-OSc(N-(9-fluorenylmethoxycarbonyloxy)-succinimide)(7.40mmol)。将反应液冰冷，搅拌下滴加N-甲基吗啉(7.46mmol)，直接搅拌过夜。向反应液中加入乙酸乙酯（50mL）和10%柠檬酸水溶液（25mL）进行分配。将有机层进一步用10%柠檬酸水溶液（25mL）和食盐水（25mL）洗涤2次后，进行浓缩，将得到的浆料状残渣用硅胶柱(正己烷-乙酸乙酯)进行纯化，以白色固体的形式得到了化合物10。

收率54%。

ESI MS m/z 819.1(M+Na)⁺

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.48(18H,s),3.21(4H,m),4.20(2H,m),4.35(4H,m),4.56(2H,m),5.72(2H,d,J=7.2Hz),7.28(4H,m),7.38(4H,m),7.28(4H,d,J=7.6Hz),7.28(4H,d,J=7.6Hz).

[化学式28]

（实施例8）化合物8c和8d的制造

以实施例7所述的化合物10作为原料，采用实施例1～5的方法合成了化合物8c和8d。

化合物8c

ESI MS m/z 317.9(M-H)^-

¹H NMR(600MHz,D₂O)δ2.10(2H,m),2.44(2H,m),2.59(1H,brd,J=14.4Hz),2.79(1H,dd,J=10.4,14.4Hz),2.98(1H,dd,J=2.8,14.8Hz),3.11(1H,dd,J=6.0,14.8Hz),3.80(1H,t,J=6.0Hz),4.50(1H,dd,J=2.8,6.0Hz),4.81(1H,dd,J=2.0,10.4Hz).

化合物8d

ESI MS m/z 317.8(M-H)^-

¹H NMR(600MHz,D₂O)δ2.09(2H,m),2.43(2H,m),2.67(1H,dd,J=1.6,14.4Hz),2.72(1H,dd,J=9.6,14.4Hz),2.84(1H,dd,J=9.6,14.4Hz),3.02(1H,d,J=14.4Hz),3.77(1H,t,J=6.0Hz),4.42(1H,dd,J=1.6,9.6Hz),4.87(1H,dd,J=2.4,9.6Hz).

[化学式29]

[化学式30]

（实施例9）化合物11的合成

在H-D-Asp-OMe(D-aspartic acidα-methylester)(6.81mmol)中加入四氢呋喃（14mL）和水（14mL）进行溶解。冰冷下，加入将Boc2O (dit-butyldicarbonate)(8.38mmol)溶于四氢呋喃（5mL）而得到的溶液、三乙基胺(13.63mmol)、DMAP（N,N-dimethyl-4-aminopyridine）(1.36mmol)。回到室温，搅拌6小时后，浓缩反应液，除去四氢呋喃。向残留的反应液中加入1～2N盐酸调整至约pH 2后，用乙酸乙酯（50mL）进行抽提。将有机层用食盐水（25mL）洗涤后，进行浓缩，得到了饴状的目的化合物11。

收率76%。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.48(9H,s)，2.91(1H,dd,J=4.4,8.0Hz),3.10(1H,dd,J=3.6,8.0Hz),3.79(3H,s),4.61(1H,m),5.52(1H,brd,J=8.8Hz)．

[化学式31]

（实施例10）化合物13的合成

（步骤1）将化合物11(5.19mmol)溶解于乙酸乙酯（21mL）中，加入HOSu(N-hydroxysuccinimide)(5.73mmol)。冰冷下，加入DCC（dicyclohexylcabodiimide）(5.71mmol)后，使反应液回到室温，搅拌4小时。对析出的不溶物进行过滤后，浓缩过滤液，得到了含有12的凝胶状残渣。假定收率100%，直接用于接下来的反应。

[化学式32]

（步骤2）对四氢呋喃（20mL）和水（5mL）的混合液进行冰冷，向其中加入硼氢化钠(9.47mmol)并搅拌10分钟后，缓慢滴加化合物12（5.19mmol相当）的四氢呋喃溶液（20mL）。10分钟后加入饱和氯化铵水溶液（12mL），使反应液回到室温。用乙酸乙酯（30mLx3）进行抽提，浓缩有机层后，将所得残渣用硅胶柱(二氯甲烷-甲醇)进行纯化，得到了凝胶状的化合物13。

收率67%（2步骤）。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.47(9H,s),1.63(1H,m),2.17(1H,m),3.73(2H,m),3.80(3H,s),4.50(1H,m),5.39(1H,m).

[化学式33]

（实施例11）化合物14的合成

将化合物13(3.47mmol)溶解于无水二氯甲烷（10mL）后，滴加到三苯基膦(4.18mmol)、咪唑(4.17mmol)和碘(4.16mmol)的无水二氯甲烷溶液（10mL）中。室温搅拌2小时后，向将反应液浓缩而得到的残渣中加入乙酸乙酯（35mL）。在浆料状态下搅拌1小时后，过滤不溶物，浓缩过滤液，从而得到褐色的油。将其用硅胶柱(正己烷-乙酸乙酯)进行纯化，得到了油状的化合物14。

收率56%。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.47(9H,s),2.20(1H,m),2.45(1H,m),3.20(2H,t,J=7.6Hz),3.79(3H,s),4.38(1H,m),5.13(1H,brs).

[化学式34]

（实施例12）化合物15的合成

将Fmoc-Cys-Ot-Bu(N-fluorenylmethoxycarbonyl-L-cysteinet-butylester)(1.90mmol)溶解于无水二甲基甲酰胺（10mL），向其中加入化合物14(1.94mmol)的无水二甲基甲酰胺溶液（10mL）。然后再加入碳酸铈(1.92mmol)，室温下搅拌5小时后，向反应液中加入乙酸乙酯（20mL）和10%柠檬酸水溶液（10mL）进行分配。将水层用乙酸乙酯（20mL）进行再抽提，将有机层合并，再用10%柠檬酸水溶液（10mL）和饱和食盐水（10mL）进行洗涤。将浓缩有机层而得到的油状残渣用硅胶柱(正己烷-乙酸乙酯)进行纯化，得到了油状的化合物15。

收率62%。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.45(9H,s),1.51(9H,s),1.92(1H,m),2.12(1H,m),2.63(2H,m),2.99(2H,m),3.74(3H,s),4.26(1H,t,J=7.2Hz),4.41(2H,m),4.50(1H,m),5.17(1H,br),7.34(2H,m),7.43(2H,t,J=7.2Hz),7.65(2H,d,J=7.2Hz),7.79(2H,d,J=7.6Hz).

[化学式35]

（实施例13）化合物16的合成

（步骤1）将化合物15(0.55mmol)溶解于无水二氯甲烷（8mL）中，加入三氟乙酸（4mL），室温下搅拌2小时。浓缩反应液，通过用无水二甲基甲酰胺（4mL）进行共沸，得到了含化合物16的二甲基甲酰胺溶液。假定收率100％，直接用于接下来的反应。

[化学式36]

（步骤2）在含化合物16（相当于0.55mmol）的二甲基甲酰胺溶液中追加无水二甲基甲酰胺（24mL），搅拌下加入PyBOP(benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphoniumhexafluorophosphate)(0.82mmol)和WSC·HCl(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethoxycarbodiimide hydrochloride)(0.83mmol)。然后，添加三乙基胺(0.65mmol)，室温下反应24小时后，浓缩反应液。在其他容器中加入水（10mL）和乙酸乙酯（10mL）进行搅拌，向其中添加浓缩后的反应液。再用乙酸乙酯（10mL）进行清洗，对有机层进行抽提。将水层用乙酸乙酯（10ｍLx2）进行抽提，将有机层合并，用饱和碳酸氢钠水（10mL）和饱和食盐水（10mL）进行洗涤。在对有机层进行浓缩而得到的白色固体中加入乙酸乙酯、并在浆料状态下进行搅拌后，通过过滤除去不溶物。将对过滤液进行浓缩而得到的油状残渣用硅胶柱(正己烷-乙酸乙酯)进行纯化，以白色固体的形式得到了化合物17。

收率15%（2步骤）。

ESI MS m/z 257.5(M+H)⁺.

[化学式37]

（实施例14）化合物19的合成

（步骤1）在化合物17(0.08mmol)中加入5%吗啉/二甲基甲酰胺溶液（0.70mL），室温下搅拌1小时后，浓缩反应液，得到了含化合物18的溶液。假定收率100%，直接用于接下来的反应。

[化学式38]

（步骤2）将Boc-Glu-Ot-Bu(N-t-butoxycarbonyl-L-glutamic acidα-t-butylester)(0.096mmol)溶解于无水二甲基甲酰胺（1mL）中。然后，加入HOBt·H2O(1-hydroxybenzotriazole hydrate)(0.12mmol)とWSC·HCl(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethoxycarbodiimide hydrochloride)(0.12mmol)，室温下搅拌10分钟。在该反应液中加入化合物18（相当于0.08mmol）的无水二甲基甲酰胺（2mL）溶液，室温下反应过夜。在浓缩反应液而得到的残渣中加入乙酸乙酯（20mL）和水（10mL）进行分配。将有机层用饱和碳酸氢钠水（10mL）和饱和食盐水（10mL）进行洗涤后，进行浓缩。将残渣用硅胶柱(正己烷-乙酸乙酯)纯化，得到了饴状的化合物19。

收率90%。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.46(9H,s),1.48(9H,s),1.88(1H,m),2.40-2.15(5H,m),2.50(1H,m),2.78(1H,dd,J=10.0,14.4Hz),3.09(1H,dd,J=4.8,15.6Hz),3.37(1H,dd,J=4.8,14.4Hz),3.68(1H,t,J=4.8Hz),3.79(3H,s),4.18(1H,m),4.51(1H,m),5.01(1H,m),5.20(1H,brd,J=6.8Hz).

[化学式39]

（实施例15）化合物21的合成

（步骤1）将化合物19(0.092mmol)溶解于四氢呋喃（1.84mL），冰冷下加入0.2M氢氧化锂水溶液(0.18mmol)，回到室温，搅拌1小时。用TLC确认原料的消失后，添加0.2N盐酸，使反应液的pH成为弱酸性，进行浓缩，除去四氢呋喃。将残留溶液用乙酸乙酯（10mLx3）抽提，将有机层用饱和食盐水（3mL）洗涤。浓缩有机层，从而以非对映异构体混合物的形式得到了饴状的化合物20。假定收率100%，直接用于接下来的反应。

[化学式40]

（步骤2）化合物20(相当于0.092mmol)中加入4N盐酸/二氧杂环己烷溶液（1.8mL），室温下搅拌过夜。将浓缩反应液而得到的残渣溶解于水中，通入阴离子交换树脂(AmberliteIRA 400 OH AG)。用离子交换水洗涤后，用1～3N乙酸洗脱，然后通过进行冷冻干燥以对映异构体混合物的形式得到了化合物21。

收率56%（2步骤）。

ESI MS m/z 334.0(M+H)+；¹H NMR(400MHz,D₂O)δ2.07(2H,m),2.42(2H,m),2.86-3.17(2H,m),3.75(1H,t,J=6.0Hz),4.27～4.41(1H,m),4.75～5.24(1H,m).

[化学式41]

（实施例16）化合物22的合成

将(Boc-L-Cys-OH)₂(N,N’-dit-butoxycarbonyl-L-cystine)(2.51mmol)溶解于四氢呋喃（29.2mL）和水（0.8mL）中，冰冷下加入三丁基膦(2.76mmol)。回到室温，搅拌1.5小时，浓缩反应液。向残渣中加入乙酸乙酯（20mL）和10%柠檬酸水溶液（10mL）进行分配，将有机层用饱和食盐水（10mL）进行洗涤。浓缩有机层，将所得残渣用硅胶柱(正己烷-乙酸乙酯)纯化，得到了油状的化合物22。

收率99%。

ESI MS m/z 220.1(M-H)-;¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.47(1H,brs),4.65(1H,brs),3.09-2.97(2H,m),1.48(9H,s).

[化学式42]

（实施例17）化合物23的合成

将化合物18(4.97mmol)与无水乙酸(49.90mmol)混合并进行冰冷，将其中滴加将碳酸氢钾(5.93mmol)溶于水（2.4mL）而得到的溶液。回到室温，搅拌2小时后加入水（5mL）和乙酸乙酯（20mL）进行抽提。将水层用乙酸乙酯（20mL）再抽提，将有机层合并，用饱和食盐水（5mL）进行洗涤。浓缩有机层，将所得残渣用硅胶柱(正己烷-乙酸乙酯)进行纯化，得到了饴状的化合物23。

收率76%。

ESI MS m/z 261.9(M-H)-;¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.33(1H,d,J=6.4Hz),4.53(1H,m),3.47(1H,dd,J=4.0,14.0Hz),3.34(1H,dd,J=6.8,14.0Hz),2.40(3H,s),1.48(9H,s).

[化学式43]

（实施例18）化合物24的合成

将化合物23(3.76mmol)溶解于无水二甲基甲酰胺（30mL）中，加入HOBt·H₂O(1-hydroxybenzotriazole hydrate)(4.14mmol)和CMC(1-cyclohexyl-3-(2-morphorinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)(4.13mmol)，室温下搅拌15分钟。然后，加入L-Thr-OMe·HCl（L-threoninemethylester·HCl）(3.77mmol)和三乙基胺(3.80mmol)，室温下搅拌2小时。浓缩反应液，向所得残渣中加入水（20mL）和乙酸乙酯（40mL）进行抽提。将有机层用碳酸氢钠水（20mL）和饱和食盐水（20mL）洗涤后进行浓缩。将所得残渣用硅胶柱(二氯甲烷-甲醇)纯化，以白色固体的形式得到了化合物24。

收率74%。

ESI MS m/z 401.3(M+Na)+;¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.14(1H,d,J=7.6Hz),5.37(1H,d,J=7.2Hz),4.60(1H,dd,J=2.8,8.8Hz),4.37(2H,m),3.80(3H,s),3.39(1H,dd,J=4.4,14.0Hz),3.24(1H,dd,J=8.0,14.0Hz),2.40(3H,s),1.47(9H,s),1.24(3H,d,J=6.4Hz).

[化学式44]

（实施例19）化合物25a和25b的合成

将化合物24(4.20mmol)溶解于无水二氯甲烷（5mL）中，加入二异丙基乙基胺(8.38mmol)和甲基磺酰氯(8.00mmol)。室温下搅拌1.5小时后，浓缩反应液，得到了油状的残渣。另一方面，冰冷下在无水四氢呋喃（50mL）中加入氢化锂铝(33.6mmol)。然后缓慢滴加无水甲醇(101.48mmol)。向反应液中追加无水四氢呋喃（50mL）并进一步搅拌。10分钟后，滴加刚才得到的残渣的无水四氢呋喃溶液（15mL）并反应2小时。将该反应液一点一点地加入到乙酸乙酯（150mL）和0.5N盐酸（120mL）的混合液中。将通过分液而得到的有机层进一步用0.5N盐酸（120mL）和饱和食盐水（120mL）洗涤后进行浓缩。将残渣用硅胶柱(正己烷-乙酸乙酯)进行纯化，得到了作为异构体的2个化合物25a和25b。

25a：收率13%。ESI MS m/z 341.1(M+Na)+;¹H NMR (400MHz,CDCl₃)δ6.50(1H,d,J=5.6Hz),6.01(1H,d,J=5.2Hz),4.87(1H,dd,J=1.2,6.0Hz),4.61(1H,m),3.87(3H,s),3.30(1H,m),2.95(1H,dd,J=10.0,14.8Hz),2.76(1H,dd,J=1.2,14.8Hz),1.47(9H,s),1.24(3H,d,J=6.8Hz).

25b：收率20%。ESI MS m/z 341.4(M+Na)+;¹H NMR (400MHz,CDCl₃)δ6.05(1H,d,J=8.8Hz),5.99(1H,brs),4.63(1H,m),4.15(1H,m),3.87(3H,s),3.48(1H,m),2.73(2H,m),1.49(3H,d,J=7.2Hz),1.47(9H,s).

[化学式45]

[化学式46]

（实施例20）化合物27的合成

（步骤1）在化合物25a (0.45mmol)中加入4N盐酸/二氧杂环己烷溶液（2.26mL），室温搅拌过夜。通过对反应液进行浓缩，得到了含化合物26的残渣。假定收率100%，直接用于接下来的反应。

[化学式47]

（步骤2）

将Boc-Glu-Ot-Bu(N-t-butoxycarbonyl-L-glutamic acidα-t-butylester)(0.52mmol)溶解于无水二甲基甲酰胺（4mL）中，加入HOBt·H2O(1-hydroxybenzotriazole hydrate)(0.65mmol)和WSC·HCl(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethoxycarbodiimide hydrochloride)(0.66mmol)室温下搅拌10分钟。向其中加入化合物26（相当于0.45mmol）的无水二甲基甲酰胺溶液（2.5mL）后，添加三乙基胺(0.77mmol)，室温下搅拌2小时。浓缩反应液后，向残渣中加入乙酸乙酯（40mL）和水（20mL）进行分配，将有机层用饱和碳酸氢钠水（20mL）和饱和食盐水（20mL）进行洗涤。将浓缩有机层而得到的残渣用硅胶柱(二氯甲烷-甲醇)进行纯化，得到了化合物27。

收率98%（2步骤）。

ESI MS m/z 526.1(M+Na)+;¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.02(1H,m),6.53(1H,d,J=6.0Hz),5.18(1H,d,J=7.6Hz),4.88(1H,dd,J=1.2,5.6Hz),4.81(1H,m),4.19(1H,m),3.87(3H,s),3.32(1H,m),2.90(1H,dd,J=10.0,14.8Hz),2.78(1H,dd,J=2.0,14.8Hz),2.33(2H,m),2.21(1H,m),1.90(1H,m),1.49(9H,s),1.46(9H,s),1.25(3H,d,J=6.8Hz).

[化学式48]

（实施例21）化合物29的合成

（步骤1）将化合物27(0.38mmol)溶解于四氢呋喃（7.6mL），冰冷下加入0.2M氢氧化锂水溶液(0.76mmol)并搅拌2小时。加入0.5N盐酸，使反应液为弱酸性，然后回到室温，进行浓缩除去四氢呋喃。将残留的溶液用乙酸乙酯（20mLx3）进行抽提，将有机层用饱和食盐水（20mL）洗涤后，进行浓缩，得到了化合物28。假定收率100%，直接用于接下来的反应。

[化学式49]

（步骤2）在化合物28(相当于0.38mmol)中加入4N盐酸/二氧杂环己烷溶液（7.2mL），室温搅拌过夜。浓缩反应液，将所得残渣溶解于水中，通入阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400 OH AG)。用离子交换水洗涤后，用1～3N乙酸洗脱，进行冷冻干燥，以白色固体的形式得到了化合物29。

收率65%（2步骤）。

ESI MS m/z 333.6(M+H)+;¹H NMR(400MHz,D₂O)δ4.86(1H,dd,J=2.8,9.6Hz),4.81(1H,d,J=1.6Hz),3.82(1H,t,J=6.4Hz),3.40(1H,m),2.95(1H,dd,J=9.6,15.2Hz),2.60(1H,dd,J=2.8,15.2Hz),2.46(2H,t,J=7.2Hz),2.08(2H,m),1.14(3H,d,J=7.2Hz).

[化学式50]

（实施例22）化合物35的合成

（1）化合物31

将2，6－二氨基庚二酸（5．0ｇ、26．3ｍｍｏｌ）溶解于甲醇42ｍＬ中，冰浴下缓慢滴加亚硫酰氯（4．2ｍＬ、57．9ｍｍｏｌ）。滴加结束后，自然升温至室温，搅拌过夜。反应结束后，通过蒸馏除去溶剂，定量地得到了化合物31。

（2）化合物32

将化合物31（0．582ｇ、2．0ｍｍｏｌ）溶解于水10ｍＬ和甲醇10ｍＬ的混合溶剂，加入氧化银（0．730ｇ、3．2ｍｍｏｌ），室温下搅拌过夜。反应结束后，通过硅藻土（Celite）过滤除去氧化银，蒸馏除去溶剂，从而得到了化合物32的粗产物。

（3）化合物33

将Ｂｏｃ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ（0．303ｇ、1．0ｍｍｏｌ）、1-羟基苯并三唑一水合物（0．169ｇ、1．1ｍｍｏｌ）、1-乙基-3－（3－二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐（0．211ｇ、1．1ｍｍｏｌ）、化合物32（0．205ｇ、1．1ｍｍｏｌ）溶解于Ｎ，Ｎ－二甲基甲酰胺5ｍＬ，加入三乙基胺（0．198mＬ、1．4ｍｍｏｌ），室温搅拌过夜。反应结束后，蒸馏除去溶剂，加入乙酸乙酯进行稀释。用5％柠檬酸水溶液洗涤2次，用饱和食盐水洗涤1次后，用10％饱和碳酸氢钠水洗涤2次，最后用饱和食盐水洗涤1次。将有机层用硫酸镁干燥，进行过滤后，蒸馏除去溶剂，得到了化合物33的粗产物。

（4）化合物34

将化合物33（0．277ｇ、0．59ｍｍｏｌ）溶解于四氢呋喃5ｍＬ中，加入1Ｍ氢氧化锂水溶液4ｍＬ，室温搅拌2小时。反应结束后，加入1Ｍ盐酸，将ｐＨ调整至约2，加入乙酸乙酯，进行抽提。将所得有机层用饱和食盐水洗涤，用硫酸镁进行干燥后过滤，通过蒸馏除去溶剂，得到了化合物34。

（5）化合物35

在化合物34（0．181ｇ、0．38ｍｍｏｌ）中加入4M盐酸－二氧杂环己烷溶液4m Ｌ，室温反应过夜。反应结束后，蒸馏除去溶剂，通过将含化合物35的残渣的一部分用反相分配HPLC（柱：野村化学公司制造Develosil RPAQUEOUS-AR-5、流动相：含0.1%七氟丁酸的水／乙腈系线性梯度）进行纯化，以非对映异构体混合物的形式得到了化合物35。

¹H NMR(D₂O)δ=1.41-1.78(m,3H),1.80-1.91(m,2H),1.99-2.03(m,1H),2.08-2.22(m,2H),2.42-2.51(m,2H),3.97-4.02(m,1H),4.31-4.34(m,1H),4.45-4.49(m,1H)

MS(ESI)m/z:302.0(M+1)

（实施例23）ＣａＳＲ表达质粒的制备

ＣａＳＲ表达质粒的制备如下进行。

以ＮＣＢＩ上登录的ＤＮＡ序列（ＣａＳＲ（钙受体）：NM_000388、SEQ ID NO:1、2）为基础，合成了ＰＣＲ使用的合成寡ＤＮＡ（正向引物（SEQ ID NO:3：ACTAATACGACTCACTATAGGGACCATGGCATTTTATAGCTGCTGCTGG）、以及反向引物（SEQ ID NO:4:TTATGAATTCACTACGTTTTCTGTAACAG）。

以人肾脏来源的ｃＤＮＡ（Clontech公司制造）作为材料，使用所述引物以及Pfu Ultra DNA Polymerase（Stratagene公司制造）按以下条件实施ＰＣＲ。94℃3分钟后、（94℃30秒、55℃30秒、72℃2分钟）循环35次，然后72℃反应7分钟。进行琼脂糖电泳，用ＤＮＡ染色试剂进行染色后，通过紫外线照射检测是否进行了ＰＣＲ扩增。此外，通过与同时进行电泳的大小已知的ＤＮＡ标记进行比较，确认了ＰＣＲ产物的链长。

将质粒载体ｐＢＲ322用限制酶ＥｃｏＲＶ（Takara公司制造）进行切割，在该切割位点上使用Ligation kit（Promega公司制造）连接通过ＰＣＲ扩增的基因片段。用该反应溶液转化大肠杆菌ＤＨ5α株，选择保持克隆有ＰＣＲ扩增产物的质粒的转化体，进一步通过ＤＮＡ碱基序列解析确认了ＰＣＲ扩增产物。

使用该重组质粒制作了人ＣａＳＲ表达质粒hCaSR/pcDNA3.1。

（实施例24）CaSR激动剂活性的评价（1）

在200μg/ml的G418（遗传霉素）存在下，将293E细胞（EBNA1表达HEK293细胞、ATCC No.CRL-10852）用含10%胎牛血清的DMEM/Ham's-F12（含3.15/ml葡萄糖的Dulbecco's modified Eagle medium、Nacalai Tesque）进行培养。以3×10⁶细胞/10ml接入F25烧瓶，CO₂培养箱（5%CO₂、37℃）中静置24小时后，用转染试剂Fugene6（Roche）转染人CaSR表达质粒hCaSR/pcDNA3.1。在CO₂培养箱中放置6～7小时后，将细胞用含10%胎牛血清的DMEM/Ham's-F12回收，以70,000细胞/孔播种于聚D-赖氨酸包被96孔板（BD-Biocoat）。

在CO₂培养箱中静置24小时后，从播种了该细胞的96孔板除去培养基，添加200μl/孔的溶解于Assay Buffer(146mM NaCl、5mM KCl、1mMMgSO₄、1mg/ml葡萄糖、20mM HEPES(pH 7.2)、0.75～1.25mM CaCl₂)中的Ca²⁺荧光指示剂Calcium 4 Assay Kit（Molecular Devices），37℃1小时，然后室温下静置10分钟，摄入指示剂。

在该96孔板中添加50μl/孔的溶解于含0.1%BSA的Assay Buffer中的被验化合物，用FLEX Station（Molecular Devices）测定3分钟荧光强度变化。

（EC₅₀计算方法）

采用FLEX Station的自动计算求出化合物添加前后的荧光强度的最大值与最小值之差(RFU(Max-Min)）。计算将化合物最大浓度添加时的RFU(Max-Min)定义为100%、将使用不含被验化合物的含0.1%BSA的AssayBuffer时的RFU(Max-Min)定义为0%的活性率，用表计算软件Xfit或GraphPad Prism进行曲线拟合，求出作为活性率50%时的化合物浓度的EC₅₀值。

（实施例25）CaSR激动剂活性的评价（2）

将293E细胞（EBNA1表达HEK293细胞、ATCC No.CRL-10852）在200μg/ml的G418（遗传霉素）存在下用含10%胎牛血清的DMEM/Ham's-F12（含3.15/ml葡萄糖的Dulbecco's modified Eagle medium、Nacalai Tesque）进行培养。以3×10⁶细胞/10ml接入F25烧瓶，于CO₂培养箱（5%CO₂、37℃）静置24小时后，用转染试剂Fugene6（Roche）转染人CaSR表达质粒hCaSR/pcDNA3.1。CO₂培养箱中放置6～7小时后，将细胞用含10%胎牛血清的DMEM/Ham's-F12回收，以2×10⁶细胞/孔播种于聚D-赖氨酸包被384孔板（BD-Biocoat）。

于CO₂培养箱静置24小时后，从播种了该细胞的384孔板除去培养基，添加40μl/孔的溶解于Assay Buffer(146mM NaCl、5mM KCl、1mM MgSO₄、1mg/ml葡萄糖、20mM HEPES(pH 7.2)、0.75～1.25mM CaCl₂、2.5ｍMProbenecid(SIGMA)中的Ca²⁺荧光指示剂Calcium 5 Assay Kit（MolecularDevices），37℃45分钟，然后室温下静置15分钟，摄入指示剂。

在该384孔板中添加10μl/孔的溶解于含0.1%BSA的Assay Buffer中的被验化合物，用FLIPR（Molecular Devices）测定3分钟荧光强度变化。

（EC₅₀计算方法）

采用FLIPR的自动计算求出化合物添加前后的荧光强度的最大值与最小值之差(RFU(Max-Min)）。计算将化合物最大浓度添加时的RFU(Max-Min)定义为100%、将使用不含被验化合物的含0.1%BSA的Assay Buffer时的RFU(Max-Min)定义为0%的活性率，用表计算软件Xfit或GraphPad Prism进行曲线拟合，求出作为活性率50%时的化合物浓度的EC₅₀值。

通过上述（1）或（2）测定得到的结果示于表1。

表1

本发明的化合物的任何一个均显示CaSR作用活性。其中，作为优选的本发明的羊毛硫氨酸衍生物的化合物8b显示良好的CaSR作用活性，其活性为极高活性，是已知具有CaSR作用活性的γ-Glu-Cys的约9倍。

（实施例26）厚味赋予活性的评价

对于化合物8b，通过定量感官评价试验考察了厚味赋予活性的强度。

定量感官评价试验如下实施。在含有谷氨酸钠（0．05ｇ／ｄｌ）、肌苷酸一磷酸（0．05ｇ／ｄｌ）、氯化钠（0．5ｇ／ｄｌ）的蒸馏水中以0．0001～0．0005ｇ／ｄｌ混合被验化合物，测定了该情况下的厚味赋予活性的强度。相对于无添加对照，在ｐＨ±0．2的幅度内使用。关于感官评分，相对于对照，同等：0分、强：3分、非常强：5分，同时为了使尺度更加明确，将评分基准设定为γ-Glu-Val-Gly的前中味为2.5分、后味为3.0分，评价以ｎ＝5实施。而且，0.001g/dlγ-Glu-Val-Gly的厚味强度相当于0.01g/dlγ-Glu-Cys-Gly(谷胱甘肽)的厚味强度（前中味3.0分、后味3.0分）。关于采分，采用直线尺度法，采用了相对于示出－5～0～5分的位置的直线，将相应的采分作为位置进行记录的方法。此外，以在食品的调味开发方面累积具有半年以上经验、能够将美味咸味溶液中添加的γ-Glu-Cys-Gly与γ-Glu-Val-Gly的效价差判定为10倍左右的人（定期确认）作为测试员。而且，“前中味”是口含后0～5秒的呈味、后味此后的呈味。上述添加浓度显示出宽泛的厚味赋予活性，典型的浓度的结果如表2所示。

此外，对γ-Glu-Val-Gly也同样进行评价，结果也示于表2。

表2

可知：本发明的化合物能够成为从低浓度起即具有良好的厚味赋予活性的、良好的厚味赋予剂，其在产业上非常有用。

（实施例27）干制柴鱼刨花（かつぉ節）提取物中厚味赋予的活性评价

定量感官评价试验如下实施。在将市售的干制柴鱼刨花提取物（相当于50％干制柴鱼刨花调味汁）用热水稀释至20．0ｇ／ｄｌ、并加入食盐（0．5ｇ／ｄｌ）而得到的干制柴鱼刨花提取物溶液中，以0．0001～0．0005ｇ／ｄｌ混合被验化合物，测定此时的厚味赋予活性的强度。相对于无添加对照，在ｐＨ±0．2的幅度内使用。关于感官评分，相对于对照，同等：0分、强：3分、非常强：5分，同时为了使尺度更加明确，将评分基准设定为γ-Glu-Val-Gly的前中味为2.5分、后味为3.0分，评价以ｎ＝5实施。而且，0.001g/dlγ-Glu-Val-Gly的厚味强度相当于0.01g/dlγ-Glu-Cys-Gly(谷胱甘肽)的厚味强度（前中味3.0分、后味3.0分）。关于采分，采用直线尺度法，采用了相对于示出－5～0～5分的位置的直线，将相应的采分作为位置进行记录的方法。此外，以在食品的调味开发方面累积具有半年以上经验、能够将美味咸味溶液中添加的γ-Glu-Cys-Gly与γ-Glu-Val-Gly的效价差判定为10倍左右的人（定期确认）作为测试员。而且，“前中味”是口含后0～5秒的呈味、后味是此后的呈味。上述添加浓度显示出宽泛的厚味赋予活性，典型的浓度的结果示于表3。

此外，对于γ-Glu-Val-Gly，同样进行了评价，结果也示于表3。

表3

可知：在干制柴鱼刨花提取物中，本发明的羊毛硫氨酸衍生物也能够成为从低浓度起即具有良好的厚味赋予活性的、良好的厚味赋予剂。干制柴鱼刨花广泛应用于味增汤、挂面汤、馄饨汤、面汤等，本发明的化合物可以以更低成本和微量改善使用干制柴鱼刨花的食品，产业上也是非常有用的。

（实施例28）牛乳中厚味赋予活性的评价

定量感官评价试验如下实施。在市售牛乳（脂肪分3．6％）中以0．0001～0．0005ｇ／ｄｌ混合被验化合物，测定了此时厚味赋予活性的强度。相对于无添加对照，在ｐＨ±0．2的幅度内使用。关于感官评分，相对于对照，同等：0分、强：3分、非常强：5分，同时为了使尺度更加明确，将评分基准设定为γ-Glu-Val-Gly的前中味为2.5分、后味为3.0分，评价以ｎ＝5实施。而且，0.001g/dlγ-Glu-Val-Gly的厚味强度相当于0.01g/dlγ-Glu-Cys-Gly(谷胱甘肽)的厚味强度（前中味3.0分、后味3.0分）。关于采分，采用直线尺度法，采用了相对于示出-5～0～5分的位置的直线，将相应的采分作为位置进行记录的方法。此外，以在食品的调味开发方面累积具有半年以上经验、能够将美味咸味溶液中添加的γ-Glu-Cys-Gly与γ-Glu-Val-Gly的效价差判定为10倍左右的人（定期确认）作为测试员。而且，“前中味”是口含后0～5秒的呈味、后味是此后的呈味。上述添加浓度显示宽泛的厚味赋予活性，典型的浓度的结果如表4所示。

此外，对于γ-Glu-Val-Gly同样进行了评价，结果也示于表4。

表4

可知：在牛乳中，本发明的羊毛硫氨酸衍生物也能够成为从低浓度起即具有良好的厚味赋予活性的、良好的厚味赋予剂。牛乳广泛应用于食品、饮料、点心、发酵食品的原料等，本发明的化合物能够以更低成本和微量改善使用牛乳的食品，在产业上也是非常有用的。