WO2011081184A1 - ランチオニン誘導体 - Google Patents

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WO2011081184A1
WO2011081184A1 PCT/JP2010/073720 JP2010073720W WO2011081184A1 WO 2011081184 A1 WO2011081184 A1 WO 2011081184A1 JP 2010073720 W JP2010073720 W JP 2010073720W WO 2011081184 A1 WO2011081184 A1 WO 2011081184A1
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WO
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group
compound
carbon atoms
mmol
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PCT/JP2010/073720
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佐藤　誠一
二木　史恵
礼子 安田
幸聖 江藤
裕美子 鈴木
高穂 田島
譲 江藤
優樹 田原
Original Assignee
味の素株式会社
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Priority to SG2012048252A priority patent/SG181983A1/en
Priority to CA2784310A priority patent/CA2784310C/en
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    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
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    • A23C9/152—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations containing additives
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23L27/20—Synthetic spices, flavouring agents or condiments
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    • C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu

Definitions

  • the present invention relates to a novel compound exhibiting CaSR agonist activity, a food composition containing the compound, and a body taste imparting agent.
  • glutathione has been known as a compound having a rich taste imparting activity for a long time.
  • glutathione contains cysteine, which is a sulfur-containing amino acid, in the molecule, there are problems in terms of stability and odor.
  • many variation compounds having CaSR agonist activity can be searched for, and can have a more excellent body taste imparting action, in particular, a taste-type body taste imparting action, and can be easily produced at low cost with excellent stability. It is desired to find a substance capable of imparting a possible rich taste, to provide a rich taste imparting agent comprising the substance, and to provide a complex rich taste imparting agent comprising the substance in combination with another substance having CaSR agonist activity. It has been.
  • the present invention searches for many variation compounds having CaSR agonist activity, provides a substance having a more excellent body taste imparting action, and provides a body taste imparting agent comprising the substance, and the substance has other CaSR agonist activity. It is an object of the present invention to provide a complex body taste imparting agent that is used in combination with a substance having it. It is another object of the present invention to provide a food composition containing the substance at a certain concentration.
  • the present inventor has high lanthionine derivatives (hereinafter also referred to as compounds of the present invention or lanthionine derivatives of the present invention), which are novel compounds having the structure of the following formula (I). It has been found that it has CaSR agonist activity and an extremely excellent body taste imparting effect. Furthermore, the present inventors have found that by adding the found compound of the present invention, a preferable food composition with enhanced richness can be obtained, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides a compound having the structure of the following formula (I) or an edible salt thereof.
  • (I) (Wherein R1 and R2 each independently represents a hydrogen atom or a lower alkyl group having 1 to 3 carbon atoms; A represents a methylene group or an oxy group (—O—), X represents an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms, provided that one methylene group in the alkylene group is a thio group (—S—), a disulfide group (—S—S—), an oxy group (—O— -), An imino group (—NH—) or an alkylimino group having 1 to 3 carbon atoms (—NRa—, where Ra represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms), and further The alkylene group may be substituted with 1 to 6 alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms.
  • the present invention also provides a food composition containing 10 ppb to 99.9% by mass of the compound represented by the formula (I) or an edible salt thereof (hereinafter also referred to as “the food composition of the present invention”). ).
  • the present invention also provides a richness-imparting agent containing the compound of formula (I) or an edible salt thereof as an active ingredient (hereinafter also referred to as “the richness-imparting agent of the present invention”).
  • the present invention also relates to (a) a compound described in the above formula (I) or an edible salt thereof, (b) ⁇ -Glu-X-Gly (X represents an amino acid or amino acid derivative), ⁇ -Glu- Val-Y (Y represents an amino acid or amino acid derivative), ⁇ -Glu-Abu, ⁇ -Glu-Ala, ⁇ -Glu-Gly, ⁇ -Glu-Cys, ⁇ -Glu-Met, ⁇ -Glu-Thr, ⁇ -Glu-Val, ⁇ -Glu-Orn, Asp-Gly, Cys-Gly, Cys-Met, Glu-Cys, Gly-Cys, Leu-Asp, D-Cys, ⁇ -Glu-Met (O), ⁇ -Glu- ⁇ -Glu-Val, ⁇ -Glu-Val-NH 2 , ⁇ -Glu-Val-ol, ⁇ -Glu-Ser, ⁇ -Glu-Tau, ⁇ -Glu-Cys (S-Me) (O ), ⁇ -
  • R1 ′ and R2 ′ each independently represent a hydrogen atom and an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • R3 ′ represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a benzyl group, or a 9-fluorenylmethyl group
  • R4 ′ represents a t-butoxycarbonyl group, a benzyloxycarbonyl group, or a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group
  • R5 ′ represents a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, a benzyloxy group, an amino group (—NH 2 ) or an alkylamino group having 1 to 3 carbon atoms
  • A represents a methylene group or an oxy group
  • X represents an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms, provided that one methylene group in the alkylene group is substituted with a thio group, a disulfide group,
  • the present invention it is possible to provide a kokumi imparting agent and a complex kokumi imparting agent which have an extremely excellent kokumi imparting action and which are excellent in stability and can be produced simply and at low cost. Moreover, according to this invention, the outstanding food composition which contains the substance which has the outstanding rich taste imparting effect more than a fixed density
  • concentration can be provided.
  • the alkyl group having 1 to 3 carbon atoms represents a linear or branched alkyl group, and specific examples thereof include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, and the like, preferably Examples thereof include a methyl group and an ethyl group.
  • the alkylimino group having 1 to 3 carbon atoms refers to an imino group substituted with the aforementioned alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • R1 and R2 are preferably hydrogen atoms.
  • A is preferably a methylene group.
  • X is preferably a trimethylene group in which one methylene group is substituted with a thio group, and particularly preferably —CH 2 —S—CH 2 —.
  • X is preferably a tetramethylene group in which one methylene group is substituted with a thio group, or a trimethylene group in which one methylene group is substituted with a thio group, which is substituted with an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • X is preferably a trimethylene group.
  • any configuration compound can be used, but the arrangement shown in the following formula (I-1) or (I-2) is preferable. In particular, the arrangement shown in (I-1) is preferable. Also, carbon c is preferably S-configured.
  • the compound represented by the general formula (I) of the present invention or an edible salt thereof is preferably a compound represented by the following or an edible salt thereof.
  • (I-1a) A compound represented by the following formula (IIa).
  • the compound represented by the above formula (IIa) having the following configuration. Any of these compounds 8a to 8d can be used, but 8b is particularly preferable.
  • R1 and R2 are hydrogen atoms
  • A is a methylene group
  • X is a tetramethylene group substituted with a thio group, or one alkyl group substituted with an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • a compound wherein the methylene group is a trimethylene group substituted with a thio group.
  • the edible salt specifically, for the compound of the present invention that is sufficiently acidic, ammonium salts, alkali metal salts (such as sodium salts and potassium salts are preferred, and these are preferred), alkaline earth metal salts ( Calcium salts, magnesium salts and the like are exemplified, and these are preferable), and organic base salts include lysine salts, arginine salts and the like.
  • the compounds of the present invention that are sufficiently basic include inorganic salts such as hydrochloric acid, or organic acid salts such as acetic acid, citric acid, lactic acid, succinic acid, fumaric acid, and malic acid.
  • the above-mentioned edible salt is mentioned, for example.
  • Compound (X) is condensed with glutamic acid derivative (XI) using a condensing agent in the presence of a base to give ⁇ -glutamyl compound (XII). Then, compound (I) is obtained by removing all the protecting groups of the carboxyl group and amino group of compound (XII).
  • the compound represented by the general formula (I) thus obtained can be isolated and purified by known separation means such as concentration under reduced pressure, solvent extraction, crystallization, chromatography and the like.
  • Synthesis Scheme II (In the formula, Prot1 to Prot4 each independently represent a suitable protecting group.)
  • the compound (III) is first reduced with triphenylphosphine or the like to obtain thiol (IV).
  • compound IV and an alkyl halide are reacted in the presence of a base to obtain thioether compound (VI).
  • thioether compound (VI) After removing a part of the protecting group of compound (VI), after leading to cyclic compound (VIII) using a condensing agent in the presence of a base, removing the protecting group of the amino group of VIII and using an appropriate condensing agent Condensed with glutamic acid derivative (X).
  • the compound represented by the general formula (X) thus obtained can be isolated and purified by known separation means such as concentration under reduced pressure, solvent extraction, crystallization, chromatography and the like.
  • the lanthionine derivative of the present invention has an excellent body taste imparting effect, it can be used as a body taste imparting agent.
  • the lanthionine derivative of the present invention is 10 ppb to 99.9%, preferably 0.05 ppm to 99.9%, more preferably 0.1 ppm to 99.9% based on the weight of the food composition imparting a rich taste. , Can be added and used. That is, another aspect of the present invention relates to a food composition containing a lanthionine derivative, preferably a food composition containing 0.05 ppm to 99.9% of a lanthionine derivative.
  • the lanthionine derivatives of the present invention include amino acids such as sodium glutamate (MSG), nucleic acids such as inosine monophosphate (IMP), inorganic salts such as sodium chloride, organic acids such as citric acid, various yeast extracts, etc.
  • amino acids such as sodium glutamate (MSG)
  • nucleic acids such as inosine monophosphate (IMP)
  • inorganic salts such as sodium chloride
  • organic acids such as citric acid, various yeast extracts, etc.
  • concentration in the case where the lanthionine derivative of the present invention is used in combination with the above other seasoning ingredients can be appropriately set by those skilled in the art through examination of sensory evaluation and the like.
  • the lanthionine derivative of the present invention may be contained in an amount of about 0.1 ppm to 500 ppm.
  • the term “kokumi” means five basic tastes represented by sweet taste, salty taste, sour taste, bitter taste, and umami. It means a taste that cannot be expressed in terms of basic taste, as well as thickness, thickness (mounthfulness), continuity, harmony, etc. The taste is also enhanced.
  • “kokumi impartation” means to enhance the five basic tastes expressed by sweetness, salty taste, acidity, bitterness, umami, and to give a taste around the basic tastes such as thickness, spread, and unity. Say. This can also be expressed as a taste enhancing action. Therefore, the compound of this invention can also be expressed as a flavor enhancer (Flavor Enhancer).
  • the compounds of the present invention can be used as sweetness enhancers, salty taste enhancers, sour taste enhancers, bitterness enhancers or umami enhancers.
  • the taste changes with the passage of time after eating, but they are called an initial taste, a middle taste, and an after taste in order from immediately after eating.
  • taste, medium and aftertaste are tastes to be felt from 0 to 2 seconds, from 2 to 5 seconds, and after 5 seconds, respectively, after eating.
  • the initial taste and the middle taste are referred to as “first middle taste”, and the middle taste and aftertaste are referred to as “medium after taste”.
  • the period from 0 to 5 seconds is called “first taste”, and the period from about 2 seconds to about 30 seconds is called “medium after taste”.
  • the evaluation divided into three categories it is difficult to concentrate on the evaluation of the eater, so the evaluation divided into two categories is usually used.
  • the effect of a substance having CaSR activity on kokumi and taste patterns can be confirmed by methods such as a human taste test. Examples of such human taste sensory tests include, but are not limited to, the tests shown in the examples of the present specification.
  • CaSR means a calcium sensing receptor (Calcium® Sensing® Receptor), which belongs to the class C of the 7-transmembrane receptor, and is also referred to as a calcium receptor.
  • the “CaSR agonist” means a substance that binds to the CaSR and activates the CaSR.
  • activate CaSR means that a ligand binds to CaSR and activates a guanine nucleotide-binding protein to transmit a signal. The property of binding to CaSR and activating CaSR is referred to as “CaSR agonist activity”.
  • a test substance is added to a CaSR activity measurement system for measuring CaSR activity, and the CaSR activity is measured.
  • the CaSR activity when the test substance is added is compared with the CaSR activity when the test substance is not added.
  • the measurement of CaSR activity can be performed using, for example, a measurement system using cells that express CaSR.
  • the cell may be a cell that endogenously expresses CaSR or a recombinant cell into which a CaSR gene has been introduced exogenously.
  • the CaSR activity measurement system can detect binding (reaction) between an activator and CaSR when an extracellular ligand (activator) specific to CaSR is added to the cell expressing CaSR. It can be used without particular limitation as long as it can transmit a detectable signal in the cell in response to the binding (reaction) between the activator and CaSR.
  • CaSR activity is detected by reaction with the test substance, it is determined that the test substance has CaSR stimulating activity.
  • CaSR examples include human CaSR encoded by the human CaSR gene registered under GenBank Accession No. NM_000388.
  • CaSR is not limited to the protein encoded by the gene of the above sequence, and as long as it encodes a protein having a CaSR function, it is 60% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more. It may be a protein encoded by a homologous gene.
  • the CaSR function can be examined by expressing these genes in cells and measuring changes in current and intracellular calcium ion concentration when calcium is added.
  • the origin of the CaSR is not particularly limited, and examples include CaSR derived from any animal including mice, rats, dogs and the like as well as the human CaSR.
  • the CaSR activity can be confirmed using a living cell expressing CaSR or a fragment thereof, a cell membrane expressing CaSR or a fragment thereof, an in vitro system containing a protein of CaSR or a fragment thereof, or the like.
  • An example using living cells is shown below, but is not limited thereto.
  • CaSR is expressed in cultured cells such as Xenopus oocytes, hamster ovary cells, and human fetal kidney cells. This can be achieved by introducing a plasmid carrying a foreign gene into which a CaSR gene has been cleaned and introducing the plasmid state or cRNA using it as a template.
  • an electrophysiological technique or a fluorescent indicator reagent for increasing intracellular calcium can be used.
  • CaSR expression is first confirmed by a response with calcium or a specific activator.
  • An oocyte in which an intracellular current is observed or a cultured cell in which fluorescence of a fluorescent indicator reagent is observed is used with respect to calcium having a concentration of about 5 mM. The concentration dependence is measured by changing the calcium concentration.
  • the test substance is prepared to about 1 ⁇ M to 1 mM, added to the oocyte or cultured cell, and the CaSR activity of the test substance is measured by measuring the CaSR activity in the presence of the test substance. taking measurement.
  • examples of the CaSR agonist activity test include, but are not limited to, the tests shown in the test examples of the present specification.
  • the amino acid or peptide used in combination with the lanthionine derivative of the present invention in the complex rich taste imparting agent of the present invention is ⁇ -Glu-X-Gly (X represents an amino acid or amino acid derivative), ⁇ -Glu-Val-Y (Y Represents an amino acid or an amino acid derivative), ⁇ -Glu-Abu, ⁇ -Glu-Ala, ⁇ -Glu-Gly, ⁇ -Glu-Cys, ⁇ -Glu-Met, ⁇ -Glu-Thr, ⁇ -Glu-Val , ⁇ -Glu-Orn, Asp-Gly, Cys-Gly, Cys-Met, Glu-Cys, Gly-Cys, Leu-Asp, D-Cys, ⁇ -Glu-Met (O), ⁇ -Glu- ⁇ - Glu-Val, ⁇ -Glu-Val-NH 2 , ⁇ -Glu-Val-ol, ⁇ -Glu-Ser, ⁇ -Glu-Tau, ⁇ -Glu-Cys (S-M
  • amino acids such as Lys, Arg and His
  • aromatic amino acids such as Phe, Tyr and Trp
  • homoserine citrulline, ornithine
  • ⁇ -aminobutyric acid norvaline
  • norleucine norleucine
  • taurine may be a non-natural (non-protein constituent) amino acid such as tert-leucine, cycloloincin, ⁇ -aminoisobutyric acid, L-penicillamine, arosleonine, and alloisoleucine.
  • X may be any of the above amino acids or derivatives thereof, but an amino acid other than Cys or a derivative thereof is preferred.
  • an amino acid residue means the following amino acids.
  • amino acid derivatives are various derivatives of the above amino acids.
  • amino acids side chains such as special amino acids, unnatural amino acids, amino alcohols, terminal carbonyl groups, amino groups, cysteine thiol groups, and the like are substituted with various substituents. Substituted ones are mentioned.
  • substituents include an alkyl group, an acyl group, a hydroxyl group, an amino group, an alkylamino group, a nitro group, a sulfonyl group, and various protective groups.
  • Val-NH 2 Valinamide
  • Val-ol Valinol (2-amino- 3-methyl-1-butanol) and the like.
  • ⁇ -Glu-Cys (SNO) -Gly has the following structural formula
  • ⁇ -Glu-Met (O) and ⁇ -Glu-Cys (S-Me) (O (O) in the formula means a sulfoxide structure.
  • ( ⁇ ) of ⁇ -Glu means that another amino acid is bonded via a carboxyl group at the ⁇ position of glutamic acid.
  • the lanthionine derivative of the present invention and the amino acid or peptide used in combination with the lanthionine derivative may be a commercially available product, in addition, (1) a chemical synthesis method, or (2) an enzymatic method. Although it can be obtained by appropriately using a known method such as a method of synthesis by a reaction, chemical synthesis is simpler.
  • the oligopeptide can be synthesized by synthesis or semi-synthesis using a peptide synthesizer. Examples of the chemical synthesis method include a peptide solid phase synthesis method.
  • the peptide thus synthesized can be purified by conventional means such as ion exchange chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, affinity chromatography and the like. Such peptide solid phase synthesis methods, and subsequent peptide purification, are well known in the art.
  • the peptide-forming enzyme examples include a culture of a microorganism having the ability to produce a peptide, a microbial cell separated from the culture, a treated product of the microorganism, or a peptide-generating enzyme derived from the microorganism.
  • the peptides used in the present invention may be present in plants such as vegetables and fruits, microorganisms such as yeast, and other natural products. If they exist in nature, they can be extracted from these and used.
  • the kokumi imparting agent or the complex kokumi imparting agent of the present invention can be used as a seasoning as it is or by mixing it with a carrier and other seasoning ingredients that are acceptable for food and drink.
  • seasoning materials include, for example, flavorings, sugars, sweeteners, dietary fibers, vitamins, amino acids such as sodium glutamate (MSG), nucleic acids such as inosine monophosphate (IMP), and inorganic substances such as sodium chloride. Examples thereof include organic acids such as salts and citric acid, and various yeast extracts.
  • the lanthionine derivative used in the present invention and the amino acid or peptide used in combination also include a salt form.
  • the salt may be a pharmacologically acceptable edible salt, for example, an acidic group such as a carboxyl group.
  • salts with alkali metals such as sodium and potassium
  • salts with alkaline earth metals such as calcium and magnesium
  • aluminum salts such as calcium and magnesium
  • zinc salts triethylamine, ethanolamine, morpholine, pyrrolidine, piperidine, piperazine
  • organic amines such as dicyclohexylamine and salts with basic amine acids such as arginine and lysine.
  • salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, hydrobromic acid, acetic acid, citric acid, benzoic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, succinic acid, Salts with organic carboxylic acids such as tannic acid, butyric acid, hibenzic acid, pamoic acid, enanthic acid, decanoic acid, teocric acid, salicylic acid, lactic acid, oxalic acid, mandelic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p And salts with organic sulfonic acids such as toluenesulfonic acid.
  • inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, hydrobromic acid, acetic acid, citric acid, benzoic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, succin
  • the lanthionine derivative, rich taste imparting agent, food composition, or complex rich taste imparting agent of the present invention can be used in any form without limitation on physical properties such as dry powder, paste, and solution.
  • the lanthionine derivative, rich taste imparting agent, food composition, or complex rich taste imparting agent of the present invention can be used in various foods and beverages such as foods, beverages and seasonings.
  • the amount of the final lanthionine derivative and the combined use of the lanthionine derivative, richness imparting agent, food composition, or complex richness imparting agent of the present invention in various foods and beverages such as foods, beverages and seasonings are used.
  • the amount of the amino acid or peptide is not particularly limited as long as the desired effect is obtained, but the amount of the lanthionine derivative and / or the amount of the amino acid or peptide, based on the total mass of the food, beverage, seasoning, etc. For each, it is about 10 ppb to 99.9%, preferably 0.05 ppm to 99.9%, more preferably 0.1 ppm to 99.9%.
  • Various foods and beverages such as foods, beverages, seasonings and the like in which the lanthionine derivative, rich taste imparting agent, food composition, or complex rich taste imparting agent of the present invention is blended are all solids or liquids that are acceptable as food or drink. These carriers, suitable seasoning ingredients and the like may be further blended.
  • the carrier include glucose, lactose, sucrose, starch, mannitol, dextrin, fatty acid glyceride, polyethylene glycol, hydroxyethyl starch, ethylene glycol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, gelatin, albumin, amino acid, water, and physiological saline. Water etc. are mentioned.
  • the seasoning raw material may be any seasoning raw material used in the art and is not particularly limited, but more specifically, the above-mentioned ones are already mentioned.
  • the content of any of the above carriers and other seasoning ingredients is not particularly limited.
  • the yeast extract is not particularly limited in any of the cells from which it is derived, its culture conditions, and the extraction treatment method, and any yeast extract can be used. Further, heat treatment, enzyme treatment, concentration, powder It may be one that has been processed.
  • the present invention will be described in more detail with reference to examples, but these do not limit the present invention.
  • Example 3 Synthesis of Compound 4 (Step 1) Compound 2 (4.01 mmol) was dissolved in 70 mL of dichloromethane, trifluoroacetic acid (70 mL) was added and stirred at room temperature for 1 hour, and then the reaction solution was concentrated. A residue containing 3 was obtained. Assuming a yield of 100%, it was used in the next reaction as it was.
  • Step 2 Under ice-cooling, dehydrated dimethylformamide (60 mL) was added to compound 3 (equivalent to 4.01 mmol) to make a homogeneous solution, and diisopropylethylamine (8.04 mmol) was added dropwise thereto. After returning to room temperature, carbonylbisimidazole (8.10 mmol) was added and the mixture was stirred as it was overnight. Under cooling and stirring conditions, 10% aqueous citric acid solution (50 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was allowed to return to room temperature, extracted with ethyl acetate (100 mL), the aqueous layer was further extracted with ethyl acetate, and the organic layers were combined. .
  • Example 4 Synthesis of Compound 6 (Step 1) A 10% morpholine-dimethylformamide solution (14 mL) was added to compound 4 (1.54 mmol) and stirred at room temperature for 30 minutes. When the reaction solution was concentrated, a residue containing Compound 5 was obtained. Assuming a yield of 100%, it was used in the next reaction as it was.
  • Boc-L-Glu-OtBu Nt-butoxycarbonyl-L-glutamic acid ⁇ -t-butylester
  • Dissolve (1.70 mmol) in dehydrated dimethylformamide (9 mL) and add HOBt ⁇ H2O (1-hydroxybenzotriazole hydrate) (1.85 mmol) and WSC ⁇ HCl (1- (3-dimethylaminopropyl) -3-Ethoxycarbodiimide hydrochloride) (1.90 mmol ) was added and stirred at room temperature for 15 minutes.
  • Compound 5 (equivalent to 1.54 mmol) suspended in dimethylformamide (20 mL) was added thereto, and the mixture was reacted at room temperature overnight.
  • the reaction mixture was concentrated, ethyl acetate (50 mL) and water (50 mL) were added to the residue and the phases were separated, and the aqueous layer was further extracted with ethyl acetate (50 mL). The organic layers were combined, washed with aqueous sodium bicarbonate (50 mL) and brine (50 mL), and concentrated. The obtained pasty residue was purified with a silica gel column (n-hexane-ethyl acetate) to obtain 6 as an oily substance. Yield 81% (2 steps).
  • Example 5 Synthesis of Compounds 8a and 8b (Step 1)
  • Compound 6 (1.25 mmol) was dissolved in tetrahydrofuran (30 mL), and 0.2M aqueous lithium hydroxide solution (2.50 mmol) was added with stirring under ice cooling. After 30 minutes, the solution was neutralized to about pH 6 using a 10% aqueous citric acid solution.
  • the reaction solution was returned to room temperature and concentrated, followed by extraction with ethyl acetate (20 mL ⁇ 3). The aqueous layer was further extracted with ethyl acetate (20 mL ⁇ 3), the organic layers were combined, washed with brine (10 mL), and then the organic layer was concentrated to obtain compound 7 . Assuming a yield of 100%, it was used in the next reaction as it was.
  • Step 2 4N hydrochloric acid / dioxane solution (25 mL) was added to compound 7 (corresponding to 1.25 mmol) and reacted at room temperature overnight, and then the reaction solution was concentrated.
  • the obtained paste-like residue was purified using a strongly basic ion exchange resin (Amberlite IRA400 OH AG) to obtain two fractions.
  • a strongly basic ion exchange resin Amberlite IRA400 OH AG
  • By further purifying a part of the fraction eluted earlier by reverse-phase preparative HPLC columnumn: Develosil RPAQUEOUS-AR-5, manufactured by Nomura Chemical Co., Ltd., mobile phase: water / acetonitrile linear gradient containing 0.1% formic acid
  • Compound 8a was obtained as a candy-like substance.
  • Example 6 Synthesis of Compound 9 D-cystine (5.20 mmol) was dissolved in a 60% aqueous perchloric acid solution (2.1 mL), t-butyl acetate (12.6 mL) was added dropwise, and the mixture was stirred at room temperature for 2 days. The reaction solution was ice-cooled and adjusted to about pH 11 using 4N aqueous sodium hydroxide solution. The mixture was returned to room temperature and extracted six times with ethyl acetate (50 mL). The organic layers were combined, dried over sodium sulfate, and concentrated to give compound 9 as an oil. Yield 72%.
  • Example 8 Production of Compounds 8c and 8d Using the compound 10 described in Example 7 as a starting material, compounds 8c and 8d were synthesized using the methods of Examples 1-5.
  • Step 2 A mixture of tetrahydrofuran (20 mL) and water (5 mL) was ice-cooled, sodium borohydride (9.47 mmol) was added thereto, and the mixture was stirred for 10 min. Compound 12 (equivalent to 5.19 mmol) in tetrahydrofuran The solution (20 mL) was slowly added dropwise. After 10 minutes, a saturated aqueous solution of ammonium chloride (12 mL) was added, and the reaction solution was returned to room temperature. After extraction with ethyl acetate (30 mL ⁇ 3) and concentration of the organic layer, the obtained residue was purified with a silica gel column (dichloromethane-methanol) to obtain a gel compound 13 .
  • a silica gel column dichloromethane-methanol
  • Example 11 Synthesis of Compound 14
  • Compound 13 (3.47 mmol) was dissolved in dehydrated dichloromethane (10 mL), and then triphenylphosphine (4.18 mmol), imidazole (4.17 mmol) and iodine (4.16 mmol) in dehydrated methylene chloride. (10 mL) was added dropwise. After stirring at room temperature for 2 hours, the reaction mixture was concentrated, and ethyl acetate (35 mL) was added to the resulting residue. After stirring in the slurry state for 1 hour, insoluble matters were filtered off, and the filtrate was concentrated to obtain a brown oil.
  • Example 12 Synthesis of Compound 15 Fmoc-Cys-Ot-Bu (N-fluorenylmethoxycarbonyl-L-cysteine t-butylester) (1.90 mmol) was dissolved in dehydrated dimethylformamide (10 mL), and Compound 14 (1.94) was dissolved therein. mmol) in dehydrated dimethylformamide (10 mL) was added. Next, cesium carbonate (1.92 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 5 hours. Then, ethyl acetate (20 mL) and 10% aqueous citric acid solution (10 mL) were added to the reaction solution, and the mixture was partitioned.
  • Fmoc-Cys-Ot-Bu N-fluorenylmethoxycarbonyl-L-cysteine t-butylester
  • the aqueous layer was re-extracted with ethyl acetate (20 mL), the organic layers were combined, and further washed with 10% aqueous citric acid solution (10 mL) and saturated brine (10 mL).
  • the oily residue obtained by concentrating the organic layer was purified by silica gel column (n-hexane-ethyl acetate) to obtain oily compound 15 . Yield 62%.
  • Example 13 Synthesis of Compound 16 (Step 1)
  • Compound 15 (0.55 mmol) was dissolved in dehydrated dichloromethane (8 mL), trifluoroacetic acid (4 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours.
  • the reaction solution was concentrated and azeotroped with dehydrated dimethylformamide (4 mL) to obtain a dimethylformamide solution containing Compound 16 . Assuming a yield of 100%, it was used in the next reaction as it was.
  • Step 2 PyBOP (benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate) (24 mL) is added to a dimethylformamide solution containing compound 16 (equivalent to 0.55 mmol) with stirring. 0.82 mmol) and WSC ⁇ HCl (1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethoxycarbodiimide hydrochloride) (0.83 mmol) were added. Next, triethylamine (0.65 mmol) was added and reacted at room temperature for 24 hours, and then the reaction solution was concentrated.
  • Example 14 Synthesis of Compound 19 (Step 1) 5% morpholine / dimethylformamide solution (0.70 mL) was added to compound 17 (0.08 mmol) and stirred at room temperature for 1 hour, and then the reaction mixture was concentrated to give compound 18 A solution containing was obtained. Assuming a yield of 100%, it was used in the next reaction as it was.
  • Step 2 Boc-Glu-Ot-Bu (Nt-butoxycarbonyl-L-glutamic acid ⁇ -t-butylester) (0.096 mmol) was dissolved in dehydrated dimethylformamide (1 mL). Next, HOBt ⁇ H 2 O (1-hydroxybenzotriazole hydrate) (0.12 mmol) and WSC ⁇ HCl (1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethoxycarbodiimide hydrochloride) (0.12 mmol) were added and stirred at room temperature for 10 minutes. To this reaction solution, a solution of compound 18 (corresponding to 0.08 mmol) in dehydrated dimethylformamide (2 mL) was added and reacted at room temperature overnight.
  • the reaction mixture was concentrated and partitioned by adding ethyl acetate (20 mL) and water (10 mL) to the resulting residue.
  • the organic layer was washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate (10 mL) and saturated brine (10 mL), and concentrated.
  • the residue was purified by silica gel column (n-hexane-ethyl acetate) to obtain candy-like compound 19 . Yield 90%.
  • Step 2 4N hydrochloric acid / dioxane solution (1.8 mL) was added to compound 20 (corresponding to 0.092 mmol), and the mixture was stirred overnight at room temperature. The residue obtained by concentrating the reaction solution was dissolved in water and passed through an anion exchange resin (Amberlite IRA 400 OH AG). After washing with ion exchange water, elution with 1 to 3N acetic acid and lyophilization, Compound 21 was obtained as a diastereomeric mixture. Yield 56% (2 steps).
  • Example 18 Synthesis of Compound 24
  • Compound 23 (3.76 mmol) was dissolved in dehydrated dimethylformamide (30 mL), and HOBt ⁇ H 2 O (1-hydroxybenzotriazole hydrate) (4.14 mmol) and CMC (1-cyclohexyl-3- ( 2-morphorinoethyl) carbodiimide metho-p-toluenesulfonate) (4.13 mmol) was added and stirred at room temperature for 15 minutes. Next, L-Thr-OMe ⁇ HCl (L-threonine methylester ⁇ HCl) (3.77 mmol) and triethylamine (3.80 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours.
  • HOBt ⁇ H 2 O (1-hydroxybenzotriazole hydrate) (4.14 mmol)
  • CMC 1-cyclohexyl-3- ( 2-morphorinoethyl) carbodiimide metho
  • Example 19 Synthesis of Compounds 25a and 25b
  • Compound 24 (4.20 mmol) was dissolved in dehydrated dichloromethane (5 mL), and diisopropylethylamine (8.38 mmol) and methanesulfonyl chloride (8.00 mmol) were added. After stirring at room temperature for 1.5 hours, the reaction solution was concentrated to obtain an oily residue.
  • lithium aluminum hydride (33.6 mmol) was added to dehydrated tetrahydrofuran (50 mL) under ice cooling. Then dehydrated methanol (101.48 mmol) was slowly added dropwise. Dehydrated tetrahydrofuran (50 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was further stirred.
  • Example 20 Synthesis of Compound 27 (Step 1) To a compound 25a (0.45 mmol) was added 4N hydrochloric acid / dioxane solution (2.26 mL), and the mixture was stirred overnight at room temperature. The residue containing compound 26 was obtained by concentrating the reaction solution. Assuming a yield of 100%, it was used in the next reaction as it was.
  • Step 2 4N hydrochloric acid / dioxane solution (7.2 mL) was added to compound 28 (corresponding to 0.38 mmol), and the mixture was stirred overnight at room temperature. The reaction mixture was concentrated, and the resulting residue was dissolved in water and passed through an anion exchange resin (Amberlite IRA 400 OH AG). After washing with ion-exchanged water, elution with 1 to 3N acetic acid and lyophilization gave Compound 29 as a white solid. Yield 65% (2 steps).
  • CaSR expression plasmid was prepared as follows. Based on the DNA sequence registered in NCBI (CaSR (calcium receptor): NM_000388, SEQ ID NO: 1, 2), synthetic oligo DNA (forward primer (SEQ ID NO: 3: ACTAATACGACTCACTATAGGGACCATGGCATTTTATAGCTGCTGCTGG)) and reverse primer (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1) 4: TTATGAATTCACTACGTTTTCTGTAACAG) was synthesized.
  • PCR was carried out under the following conditions using cDNA derived from human kidney (manufactured by Clontech) as a material and the above primers and Pfu Ultra DNA Polymerase (manufactured by Stratagene). After 3 minutes at 94 ° C., 35 times of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 2 minutes were repeated 35 times, followed by reaction at 72 ° C. for 7 minutes. After agarose electrophoresis and staining with a DNA staining reagent, it was detected whether or not amplification was performed by UV irradiation. In addition, the chain length of the PCR product was confirmed by comparison with a DNA marker of known size that was electrophoresed simultaneously.
  • Plasmid vector pBR322 was cleaved with restriction enzyme EcoRV (Takara), and the gene fragment amplified by PCR was ligated to the cleavage site using Ligation kit (Promega).
  • the Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed with this reaction solution, and a transformant carrying a plasmid in which the PCR amplification product was cloned was selected, and the PCR amplification product was further confirmed by DNA nucleotide sequence analysis.
  • a human CaSR expression plasmid hCaSR / pcDNA3.1 was prepared.
  • Example 24 Evaluation of CaSR agonist activity (1) 293E cells (EBNA1-expressing HEK293 cells, ATCC No. CRL-10852), DMEM / Ham's-F12 (Dulbecco's modified Eagle containing 3.15 / ml Glucose containing 10% fetal bovine serum in the presence of 200 ⁇ g / ml G418 (Geneticin) medium, Nacalai Tesque).
  • DMEM / Ham's-F12 Dulbecco's modified Eagle containing 3.15 / ml Glucose containing 10% fetal bovine serum in the presence of 200 ⁇ g / ml G418 (Geneticin) medium, Nacalai Tesque.
  • Assay Buffer 146 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO 4 , 1 mg / ml Glucose, 20 mM HEPES (pH 7.2) 200 ul / well of Ca 2+ fluorescent indicator Calcium 4 Assay Kit (Molecular Devices) dissolved in 0.75 to 1.25 mM CaCl 2 ) was added and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour and then at room temperature for 10 minutes to incorporate the indicator. .
  • a test compound dissolved in 0.1% BSA-containing assay buffer was added to the 96-well plate at 50 ⁇ l / well, and the change in fluorescence intensity was measured with FLEX Station (Molecular Devices) for 3 minutes.
  • the difference (RFU (Max-Min)) between the maximum value and the minimum value of the fluorescence intensity before and after the compound addition was determined by automatic calculation of FLEX Station. Calculate the activity rate by defining the RFU (Max-Min) at the time of adding the maximum compound concentration as 100%, and the RFU (Max-Min) as 0% when using 0.1% BSA-containing assay buffer that does not contain the test compound. Curve fitting was performed with the calculation software Xfit or the graph pad prism, and the EC 50 value, which is the compound concentration when the activity rate was 50%, was determined.
  • Example 25 Evaluation of CaSR agonist activity (2) 293E cells (EBNA1-expressing HEK293 cells, ATCC No. CRL-10852), DMEM / Ham's-F12 (Dulbecco's modified Eagle containing 3.15 / ml Glucose containing 10% fetal bovine serum in the presence of 200 ⁇ g / ml G418 (Geneticin) medium, Nacalai Tesque).
  • DMEM / Ham's-F12 Dulbecco's modified Eagle containing 3.15 / ml Glucose containing 10% fetal bovine serum in the presence of 200 ⁇ g / ml G418 (Geneticin) medium, Nacalai Tesque.
  • Assay Buffer 146 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO 4 , 1 mg / ml Glucose, 20 mM HEPES (pH 7.2)
  • Assay Buffer 146 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO 4 , 1 mg / ml Glucose, 20 mM HEPES (pH 7.2)
  • Add 40 ⁇ l / well of Ca 2+ fluorescence indicator Calcium 5 Assay Kit (Molecular Devices) dissolved in 0.75 to 1.25 mM CaCl 2 , 2.5 mM Probenecid (SIGMA), and leave at 37 ° C. for 45 minutes and then at room temperature for 15 minutes
  • the indicator was taken in.
  • 10 ⁇ l / well of a test compound dissolved in 0.1% BSA-containing assay buffer was added, and a change in fluorescence intensity was measured with FLIPR (Molecular Devices) for 3 minutes.
  • All the compounds of the present invention showed CaSR activity.
  • compound 8b which is a preferred lanthionine derivative of the present invention, showed excellent CaSR action activity, and its activity was very high, about 9 times that of ⁇ -Glu-Cys known to have CaSR action activity. .
  • Example 26 Evaluation of kokumi imparting activity The strength of kokumi imparting activity was examined for compound 8b by a quantitative sensory evaluation test.
  • the quantitative sensory evaluation test was performed as follows. The test compound was added to 0.0001 to 0.0005 g / distilled water containing sodium glutamate (0.05 g / dl), inosinic acid monophosphate (0.05 g / dl), and sodium chloride (0.5 g / dl). The strength of the kokumi imparting activity when mixed in dl was measured. It was used according to the range of pH ⁇ 0.2 relative to the additive-free control.
  • the sensory score is equal to 0 for control, strong: 3 points, very strong: 5 points, and 2.5 points for the ⁇ -Glu-Val-Gly tip content to make the scale clearer.
  • the rich taste intensity of 0.001 g / dl ⁇ -Glu-Val-Gly corresponds to the rich taste intensity of 0.01 g / dl ⁇ -Glu-Cys-Gly (glutathione) (3.0 points in the previous taste, 3.0 points in the aftertaste). .
  • a linear scale method was used, and a method of entering the corresponding scoring as a position on a straight line showing positions of ⁇ 5 to 0 to 5 points was used.
  • the “first taste” refers to a taste of 0 to 5 seconds after the mouth, and the aftertaste is a taste after that.
  • a wide range of richness-imparting activity was exhibited at the above-mentioned added concentrations.
  • Table 2 shows the results of typical concentrations. Table 2 also shows the results of the same evaluation for ⁇ -Glu-Val-Gly.
  • the compound of the present invention can be an excellent kokumi imparting agent having an excellent kokumi imparting activity from a low concentration, which is very useful industrially.
  • Example 27 Evaluation of activity for imparting rich taste in bonito extract The strength of the rich taste imparting activity of compound 8b was examined by a quantitative sensory evaluation test.
  • the quantitative sensory evaluation test was performed as follows. A commercially available bonito extract (corresponding to 50% bonito soup) was diluted with hot water to 20.0 g / dl, and a test compound was added to the bonito extract solution to which sodium chloride (0.5 g / dl) was added. The strength of the kokumi imparting activity when mixed at .0005 g / dl was measured. It was used according to the range of pH ⁇ 0.2 relative to the additive-free control.
  • the sensory score is equal to 0 for control, strong: 3 points, very strong: 5 points, and 2.5 points for the ⁇ -Glu-Val-Gly tip content to make the scale clearer.
  • the rich taste intensity of 0.001 g / dl ⁇ -Glu-Val-Gly corresponds to the rich taste intensity of 0.01 g / dl ⁇ -Glu-Cys-Gly (glutathione) (3.0 points in the previous taste, 3.0 points in the aftertaste). .
  • the lanthionine derivative of the present invention can be an excellent kokumi imparting agent having an excellent kokumi imparting activity from a low concentration.
  • Bonito is widely used in miso soup, somenyuyu, udontsuyu, noodle soup, etc., and the compound of the present invention can improve foods using bonito at a lower cost and in a very small amount. Useful.
  • Example 28 Evaluation of kokumi imparting activity in milk
  • the rich taste intensity of 0.001 g / dl ⁇ -Glu-Val-Gly corresponds to the rich taste intensity of 0.01 g / dl ⁇ -Glu-Cys-Gly (glutathione) (3.0 points in the previous taste, 3.0 points in the aftertaste).
  • a linear scale method was used, and a method of entering the corresponding scoring as a position on a straight line showing positions of ⁇ 5 to 0 to 5 points was used.
  • the lanthionine derivative of the present invention can be an excellent body taste imparting agent having an excellent body taste imparting activity from a low concentration.
  • Milk is widely used as a raw material for foods, beverages, confectionery, fermented foods, etc., and the compounds of the present invention can improve foods using milk at a lower cost and in a very small amount. Useful for.

Abstract

　ＣａＳＲアゴニスト活性を有する多くのバリエーション化合物を探索してより優れたコク味付与作用を有する新規化合物を見出し、該物質からなるコク味付与剤、及び該物質と他のＣａＳＲアゴニスト活性を有する物質からなる複合コク味付与剤を提供すること。　ランチオニン誘導体からなるコク味付与剤、及び該物質に他のＣａＳＲアゴニスト活性を有する物質を併用してなる複合コク味付与剤。

Description

ランチオニン誘導体
　本発明は、ＣａＳＲアゴニスト活性を示す新規化合物、および、それを含有する食品組成物、コク味付与剤に関する。
　近年、食生活の多様化等により味覚に対する消費者の要求が高まってきており、これに伴い、甘味、塩味、酸味、苦味、うま味で表される５基本味だけでは表すことのできない、厚み・ひろがり・持続性・まとまりなど上記基本味の周辺の味をも増強した味覚である「コク味」を付与することのできる優れたコク味付与剤へのニーズが高まっている。
　一方、カルシウムセンシング受容体（Calcium Sensing Receptor：ＣａＳＲ）は、カルシウム受容体とも呼ばれるが、当該受容体シグナルは種々の生体内機能を調節し、ＣａＳＲアゴニスト活性を有する物質はコク味付与剤として用いることができる（特許文献１、非特許文献１）。
　また、古くからコク味付与活性を有する化合物としてグルタチオンが知られている。しかし、グルタチオンは含硫アミノ酸であるシステインを分子内に含むため、安定性や臭いなどの面で課題がある。
　従って、ＣａＳＲアゴニスト活性を有する多くのバリエーション化合物を探索し、より優れたコク味付与作用、特に先味型のコク味付与作用を有し、かつ安定性に優れ簡便かつ低コストで生産することが可能なコク味を付与するこのできる物質を見出し、該物質からなるコク味付与剤、及び該物質を他のＣａＳＲアゴニスト活性を有する物質と併用してなる複合コク味付与剤を提供することが求められている。
国際公開第２００７／０５５３９３号パンフレット
The Journal of Biological Chemistry (2010), 285 (2), 1016-22
　本発明は、ＣａＳＲアゴニスト活性を有する多くのバリエーション化合物を探索してより優れたコク味付与作用を有する物質を提供し、該物質からなるコク味付与剤、及び該物質を他のＣａＳＲアゴニスト活性を有する物質と併用してなる複合コク味付与剤を提供することを課題とする。更に、一定濃度の該物質を含有する食品組成物を提供することを課題とする。
　本発明者は、種々の化合物を鋭意探索した結果、下記式（I）の構造を有する新規化合物であるランチオニン誘導体（以下、本発明の化合物、または本発明のランチオニン誘導体ともいう。）が、高いＣａＳＲアゴニスト活性と極めて優れたコク味付与効果を有することを見出した。さらに、見出された本発明の化合物を添加することにより、コク味の増強した、好ましい食品組成物が得られることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、下記式（I）の構造を有する化合物またはその可食性塩を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （I）
　（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～３の低級アルキル基を示し、
　Ａは、メチレン基又はオキシ基（－Ｏ－）を示し、
　Ｘは、炭素数１から５のアルキレン基を示し、ただし、該アルキレン基中の１つのメチレン基が、チオ基（－Ｓ－）、ジスルフィド基（－Ｓ－Ｓ－）、オキシ基（－Ｏ－）、イミノ基（－ＮＨ－）または炭素数１～３のアルキルイミノ基（－ＮＲa－，ここでＲaは炭素数１～３のアルキル基を示す）で置換されていても良く、また更に、該アルキレン基は、１から６個の、炭素数１～３のアルキル基で置換されていても良い。）
　また、本発明は前記式（I）に記載の化合物またはその可食性塩を１０ｐｐｂ～９９．９質量％含有する食品組成物をも提供する（以下、「本発明の食品組成物」ともいう。）。
　また、本発明は前記式（I）に記載の化合物またはその可食性塩を有効成分として含有するコク味付与剤をも提供する（以下、「本発明のコク味付与剤」ともいう。）。
　また、本発明は、（ａ）前記式（I）に記載の化合物またはその可食性塩に、（ｂ）γ－Ｇｌｕ－Ｘ－Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｙ（Ｙはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ、γ－Ｇｌｕ－Ａｌａ、γ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、γ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ、γ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｏｒｎ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ、Ｃｙｓ－Ｇｌｙ、Ｃｙｓ－Ｍｅｔ、Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、Ｇｌｙ－Ｃｙｓ、Ｌｅｕ－Ａｓｐ、Ｄ－Ｃｙｓ、γ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ（Ｏ）、γ－Ｇｌｕ－γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－ＮＨ2、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－ｏｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ、γ－Ｇｌｕ－Ｔａｕ、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）（Ｏ）、γ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ、γ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ、γ－Ｇｌｕ－ｔ－Ｌｅｕおよびγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）からなる群より選択される１種又は２種以上のアミノ酸又はペプチド、を併用してなる複合コク味付与剤を提供する。
　また、本発明は前記式（I）に記載の化合物またはその可食性塩の製造中間体として有用な、下記式（IA）の構造を有する化合物、又はその化学的に許容しうる塩を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　（IA）
　（式中、Ｒ１’及びＲ２’は、それぞれ独立して、水素原子、及び炭素数１～３のアルキル基を示し、
　Ｒ３’は、水素原子、炭素数１から４のアルキル基、ベンジル基、又は９－フルオレニルメチル基を示し、
　Ｒ４’は、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、又は９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基を示し、
　Ｒ５’は、水酸基、炭素数１～４のアルコキシ基、ベンジルオキシ基、アミノ基（－ＮＨ2）又は炭素数１～３のアルキルアミノ基を示し、
　Ａは、メチレン基又はオキシ基を示し、
Ｘは、炭素数１から５のアルキレン基を示し、ただし、該アルキレン基中１つのメチレン基が、チオ基、ジスルフィド基、オキシ基、イミノ基、または炭素数１～３のアルキルイミノ基で置換されていても良く、また、該アルキレン基は、１から６個の、炭素数１～３のアルキル基で置換されていても良い。）
　本発明によれば、極めて優れたコク味付与作用を有し、かつ安定性に優れ簡便かつ低コストで生産することが可能なコク味付与剤、及び複合コク味付与剤を提供することができる。又、本発明によれば、優れたコク味付与作用を有する物質を一定濃度以上含有する、優れた食品組成物を提供することができる。
　以下、本発明について詳述する。
　本発明において、炭素数１～３のアルキル基とは、直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基を示し、具体的に例えばメチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、イソプロピル基などがあげられ、好ましくはメチル基、エチル基などがあげられる。
　また、炭素数１～３のアルキルイミノ基とは、前述の炭素数１～３のアルキル基により置換されたイミノ基をいう。
　本発明で一般式（I）中、以下のものが好ましい。
　R1、R2としては水素原子好ましい。
　Aは、メチレン基が好ましい。
　Xは、１つのメチレン基がチオ基で置換されたトリメチレン基が好ましく、特に、－ＣＨ2－Ｓ－ＣＨ2－が好ましい。
　又、Ｘが１つのメチレン基がチオ基で置換されたテトラメチレン基、又は炭素数１～３のアルキル基で置換された、１つのメチレン基がチオ基で置換されたトリメチレン基が好ましく、特に、－ＣＨ2－Ｓ－ＣＨ2－ＣＨ2－、－ＣＨ（ＣＨ3）－Ｓ－ＣＨ2－や－ＣＨ2－Ｓ－（ＣＨ3）ＣＨ－が好ましい。
　又、Ｘはトリメチレン基であることも好ましい。
　一般式（Ｉ）中の環状構造の下記に示した炭素a,bについて、いずれの立体配置の化合物も使用できるが、下記式（I-1）や（I-2）に示した配置が好ましく、特に(I-1)に示した配置が好ましい。又、炭素ｃについてＳ配置のものが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　本発明の一般式（I）で表される化合物、又はその可食性塩としては、より具体的には以下で表される化合物、又はその可食性塩が好ましい。
　式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が水素原子であり、Ａがメチレン基であり、Ｘがチオ基で置換されたトリメチレン基である化合物。
　式（I-1a）で表される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （I-1a）
　下記式（IIa）で表される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 (IIa)
　以下の立体配置を有する、上記式（ＩＩa）で表される化合物。これら化合物8ａ～8ｄ、いずれの化合物であっても使用できるが、特に8ｂが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が水素原子であり、Ａがメチレン基であり、Ｘがチオ基で置換されたテトラメチレン基、又は炭素数１～３のアルキル基で置換された、１つのメチレン基がチオ基で置換されたトリメチレン基である化合物。
　下記式（IIb）及び（IIc）で表される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 (IIb)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 (IIc)
（式中、Rは炭素数１～３のアルキル基を示す。）
　可食性塩としては、具体的に例えば、十分に酸性である本発明化合物については、アンモニウム塩、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩などが例示され、これらが好ましい）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩などが例示され、これらが好ましい）、有機塩基の塩としては、リジン塩、アルギニン塩などが挙げられる。さらに十分に塩基性である本発明化合物については、塩酸などの無機塩、または酢酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸などの有機酸塩などが挙げられる。
　また、化学的に許容しうる塩としては、たとえば上述の可食性塩が挙げられる。
（製造方法）
　以下に、本発明の化合物の代表的な製造方法を述べる。
　なお、以下の製造法において、官能基の種類によっては、当該官能基を原料ないし中間体の段階で適当な保護基、すなわち容易に当該官能基に転化可能な基に置き換えておくことが製造技術上効果的な場合がある。しかるのち、必要に応じて保護基を除去し、所望の化合物を得ることができる。このような官能基としては例えばアミノ基、水酸基、カルボキシル基等を挙げることができ、それらの保護基としては例えば、アミノ基の保護基としてｔ-ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）やベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）など、カルボキシル基の保護基としてｔ－ブチル（ｔ－Ｂｕ）やベンジル（ＢｎまたはＢｚｌ）など、Protective Groups in Organic Synthesis 第３版(T.W.Green、P.G.M.Wuts著、JOHN WILLY & SONS,INC.発行)に記載の保護基等を挙げることができ、これらを反応条件に応じて適宜用いればよい。保護基の導入および脱保護は当該参考書記載の方法を適時適応できる。例えば下記製造法に記したProt1, Prot2の様に記した官能基が保護基として用いられている事を示すが、これに限定されるものではない。
　本発明の化合物（I）は、例えば下記に示す合成スキームＩに従い製造することが出来る。
合成スキームＩ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 （式中の置換基の定義は、前述の式（I）又は（ＩＡ）の定義と同じである。）
　化合物（X）を塩基存在下、縮合剤を用いてグルタミン酸誘導体(XI)と縮合させ、γ-グルタミル化合物（XII）とする。その後、化合物（XII）のカルボキシル基およびアミノ基の保護基をすべて除去することにより、化合物（I）が得られる。
　このようにして得られる一般式（I）で示される化合物は、公知の分離手段、例えば減圧濃縮、溶媒抽出、晶析、クロマトグラフィーなどにより単離精製することができる。
　また、出発原料（X）の一例として、R１’およびR２’が水素原子、Xが（-CH2-S-CH2-）である化合物は、例えば下記に示す合成スキームＩＩに従い製造することが出来る。
合成スキームＩＩ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （式中、Prot1からProt4は、それぞれ独立して適当な保護基を示す。）
　詳述すると、まず化合物(III)をトリフェニルホスフィンなどで還元してチオール（IV）を得る。次に化合物IVとハロゲン化アルキルを塩基存在下反応させ、チオエーテル化合物（VI）とする。化合物（VI）の一部保護基を除去後、塩基存在下、縮合剤を用いて環状化合物（VIII）に導いた後、VIIIのアミノ基の保護基を除去し、適当な縮合剤を用いてグルタミン酸誘導体（X）と縮合させる。
　このようにして得られる一般式（X）で示される化合物は、公知の分離手段、例えば減圧濃縮、溶媒抽出、晶析、クロマトグラフィーなどにより単離精製することができる。
　Ｘがチオ基で置換されたテトラメチレン基である前記の出発物質（Ｘ）は、例えば、以下の合成スキームＩＩＩに従って、上記の化合物と同様にして合成することができる。
合成スキームＩＩＩ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （式中の置換基の定義は、前述した通りであり、nは２である。）
　Ｘが炭素数１～３のアルキル基で置換された、チオ基で置換されたトリメチレン基である前記の出発物質（Ｘ）は、以下の合成スキームＩＶに従って、上記の化合物と同様にして合成することができる。
合成スキームＩＶ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 （式中の置換基の定義は、前述した通りである。）
　Ｘがオキシ基で置換されたトリメチレン基である前記の出発物質（Ｘ）は、例えば、以下の合成スキーム（Ｖ）に従って、合成することができる。
合成スキームＶ
１）アジリジン誘導体を用いる環状化合物の合成法
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
２）分子間エーテル化による環状化合物の合成法
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
３）分子内エーテル化による環状化合物の合成法
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
　本発明のランチオニン誘導体は、優れたコク味付与効果を有するため、コク味付与剤として用いることができる。本発明のランチオニン誘導体は、コク味を付与する食品組成物の重量に対して、１０ｐｐｂ～９９．９％、好ましくは０．０５ｐｐｍ～９９．９％、より好ましくは０．１ｐｐｍ～９９．９％、含有するように添加して用いることができる。すなわち、本発明の別の態様は、ランチオニン誘導体を含有する食品組成物、好ましくは、ランチオニン誘導体を０．０５ｐｐｍ～９９．９％含有する食品組成物に関する。
　また、本発明のランチオニン誘導体は、グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）などのアミノ酸類、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）などの核酸類、塩化ナトリウムなどの無機塩類、クエン酸などの有機酸類、種々の酵母エキスなどから選択される少なくとも１種の他の調味原料と組み合わせて用いることにより、他の調味原料を単独で用いる場合に比べて、よりコク味の増した、好ましい調味料を提供することができる。本発明のランチオニン誘導体を上記の他の調味原料と組み合わせて用いる場合の濃度は、当業者であれば官能評価等の検討を経て適宜設定することができるが、一例を挙げると、最終濃度に対して、本発明のランチオニン誘導体を０．１ｐｐｍ～５００ｐｐｍ程度含有させればよい。
　本発明において「コク味」とは、甘味（sweet taste）、塩味（salty taste）、酸味（sour taste）、苦味（bitter taste）、うま味（umami）で表される５基本味（five basic tastes）では表すことのできない味を意味し、基本味だけでなく、厚み（thickness）・ひろがり（growth（mounthfulness））・持続性（continuity）・まとまり（harmony）など基本味の周辺の味（marginal tastes）をも増強した味をいう。ここで、「コク味付与」とは、甘味、塩味、酸味、苦味、うま味で表される５基本味の増強と、それに伴う厚み・ひろがり・まとまりなど基本味の周辺の味を付与することをいう。また、これを呈味増強作用と表現することもできる。したがって、本発明の化合物は、呈味増強剤（Flavor Enhancer）と表現することもできる。本発明の化合物は、甘味増強剤、塩味増強剤、酸味増強剤、苦味増強剤またはうま味増強剤として使用することができる。
　また、味覚は喫食後の時間経過とともに変化するが、喫食直後から順に、先味（initial taste）、中味（middle taste）及び後味（after taste）と呼ぶ。これらは相対的な概念であるが、概して、先味、中味及び後味は、それぞれ喫食後０から２秒まで、２秒から５秒まで、及び５秒以降に感じる呈味である。また、先味と中味を合わせて「先中味」といい、中味と後味を合わせて「中後味」という。また、０から５秒までを「先中味」といい、２秒以降約３０秒前後までを「中後味」とする。３区分に分けた評価について、喫食者の評価への集中が困難なため、ふつう２区分に分けた評価を常用する。
　コク味及び呈味パターンに対するＣａＳＲ活性を有する物質の効果は、ヒトによる味覚試験などの方法によって確認することができる。このようなヒトによる味覚官能試験としては例えば本願明細書の実施例で示される試験が挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「ＣａＳＲ」とは、カルシウムセンシング受容体（Calcium Sensing Receptor）を意味し、７回膜貫通型受容体のクラスＣに属するものであり、カルシウム受容体とも呼ばれる。本明細書において「ＣａＳＲアゴニスト」とは、上記ＣａＳＲに結合し、ＣａＳＲを活性化する物質を意味する。また、本明細書において、「ＣａＳＲを活性化する」とは、ＣａＳＲにリガンドが結合し、グアニンヌクレオチド結合タンパク質を活性化して、シグナルを伝達することを意味する。また、ＣａＳＲに結合し、ＣａＳＲを活性化する性質を「ＣａＳＲアゴニスト活性」という。
　ＣａＳＲアゴニスト活性を有する化合物をスクリーニングする方法を具体的に示すが、これらのステップに限定されるものではない。
１）ＣａＳＲ活性を測定するためのＣａＳＲ活性測定系に被検物質を添加して、ＣａＳＲ活性を測定する。
２）被検物質を添加したときのＣａＳＲ活性と、被検物質を添加しなかったときのＣａＳＲ活性を比較する。
３）被検物質を添加したときにＣａＳＲアゴニスト活性を示す被検物質を選択する。
　ＣａＳＲ活性の測定は、例えば、ＣａＳＲを発現する細胞を用いた測定系を用いて行うことができる。上記細胞は、ＣａＳＲを内在的に発現する細胞であっても、外来的にＣａＳＲ遺伝子を導入した組み換え細胞であってもよい。上記ＣａＳＲ活性測定系は、上記ＣａＳＲを発現する細胞に、ＣａＳＲに特異的な細胞外リガンド（活性化物質）を加えたときに、活性化物質とＣａＳＲとの結合（反応）を検出することができるか、又は、活性化物質とＣａＳＲとの結合（反応）に応答して細胞内に検出可能なシグナルを伝達するものであれば、特に制限なく用いることができる。被検物質との反応によりＣａＳＲ活性が検出された場合、当該被検物質はＣａＳＲ刺激活性を有すると判定される。
　上記ＣａＳＲとしては、GenBank Accession No. NM_000388で登録されているヒトＣａＳＲ遺伝子によってコードされるヒトＣａＳＲが好ましく例示できる。尚、ＣａＳＲは、上記配列の遺伝子によってコードされるタンパク質に制限されず、ＣａＳＲ機能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有する遺伝子によってコードされるタンパク質であってもよい。なお、ＣａＳＲ機能はこれらの遺伝子を細胞に発現させ、カルシウム添加時の電流の変化や細胞内カルシウムイオン濃度の変化を測定することによって調べることができる。
　上記ＣａＳＲは、その由来は特に制限されず、上記ヒトのＣａＳＲのみならず、マウス、ラット、イヌなどを含むあらゆる動物由来のＣａＳＲが挙げられる。
　上述の如く、ＣａＳＲ活性は、ＣａＳＲ又はその断片を発現した生きた細胞、ＣａＳＲ又はその断片を発現した細胞膜、ＣａＳＲ又はその断片のタンパク質を含むインビトロの系などを利用して確認することができる。
　以下に生きた細胞を用いた一例を示すが、これに限定されるものではない。
　ＣａＳＲは、アフリカツメガエル卵母細胞やハムスター卵巣細胞やヒト胎児腎臓細胞等の培養細胞に発現させる。これは外来遺伝子を保持するプラスミドにＣａＳＲ遺伝子をクリーニングしたものを、プラスミドの状態もしくはそれを鋳型にしたｃＲＮＡを導入することで可能となる。反応の検出には電気生理学的手法や細胞内カルシウム上昇の蛍光指示試薬を用いることができる。
　ＣａＳＲの発現は、初めにカルシウムもしくは特異的活性化剤による応答で確認する。５ｍＭ程度の濃度のカルシウムに対して、細胞内電流が観察された卵母細胞もしくは蛍光指示試薬の蛍光が観察された培養細胞を使用する。カルシウムの濃度を変えて濃度依存性を測定する。次に、被検物質を１μＭ～１ｍＭ程度に調製し、卵母細胞もしくは培養細胞に添加し、上記被検物質存在下でのＣａＳＲ活性を測定することで、上記被検物質のＣａＳＲアゴニスト活性を測定する。
　又、より具体的には、ＣａＳＲアゴニスト活性試験としては例えば本願明細書の試験例で示される試験が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の複合コク味付与剤において本発明のランチオニン誘導体と併用されるアミノ酸又はペプチドは、γ－Ｇｌｕ－Ｘ－Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｙ（Ｙはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Ｇｌｕ－Ａｂｕ、γ－Ｇｌｕ－Ａｌａ、γ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、γ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ、γ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｏｒｎ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ、Ｃｙｓ－Ｇｌｙ、Ｃｙｓ－Ｍｅｔ、Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、Ｇｌｙ－Ｃｙｓ、Ｌｅｕ－Ａｓｐ、Ｄ－Ｃｙｓ、γ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ（Ｏ）、γ－Ｇｌｕ－γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－ＮＨ2、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－ｏｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ、γ－Ｇｌｕ－Ｔａｕ、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）（Ｏ）、γ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ、γ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ、γ－Ｇｌｕ－ｔ－Ｌｅｕおよびγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）からなる群より選択される１種又は２種以上のアミノ酸又はペプチドであるが、ここで、アミノ酸とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、ｔ－Ｌｅｕ等の中性アミノ酸、Ａｓｐ、Ｇｌｕ等の酸性アミノ酸、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ等の塩基性アミノ酸、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ等の芳香族アミノ酸や、ホモセリン、シトルリン、オルニチン、α－アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、タウリン等も含まれる。また、ｔｅｒｔ－ロイシン、シクロロインシン、α－アミノイソブチル酸、Ｌ－ペニシラミン、アロスレオニン、アロイソロイシン等の非天然（非タンパク質構成）アミノ酸であってもよい。尚、ペプチドγ－Ｇｌｕ－Ｘ－Ｇｌｙにおいては、Ｘは上記のようなアミノ酸又はその誘導体のいずれでもよいが、Ｃｙｓ以外のアミノ酸又はその誘導体が好ましい。
　本明細書において、アミノ酸残基の略号は以下のアミノ酸を意味する。
（１）Ｇｌｙ：グリシン
（２）Ａｌａ：アラニン
（３）Ｖａｌ：バリン
（４）Ｌｅｕ：ロイシン
（５）Ｉｌｅ：イソロイシン
（６）Ｍｅｔ：メチオニン
（７）Ｐｈｅ：フェニルアラニン
（８）Ｔｙｒ：チロシン
（９）Ｔｒｐ：トリプトファン
（10）Ｈｉｓ：ヒスチジン
（11）Ｌｙｓ：リジン
（12）Ａｒｇ：アルギニン
（13）Ｓｅｒ：セリン
（14）Ｔｈｒ：スレオニン
（15）Ａｓｐ：アスパラギン酸
（16）Ｇｌｕ：グルタミン酸
（17）Ａｓｎ：アルパラギン
（18）Ｇｌｎ：グルタミン
（19）Ｃｙｓ：システイン
（20）Ｐｒｏ：プロリン
（21）Ｏｒｎ：オルニチン
（22）Ｓａｒ：サルコシン
（23）Ｃｉｔ：シトルリン
（24）Ｎ－Ｖａｌ（又は、Ｎｖａ）：ノルバリン（２－アミノ吉草酸）
（25）Ｎ－Ｌｅｕ（又は、Ｎｌｅ）：ノルロイシン
（26）Ａｂｕ：α－アミノ酪酸
（27）Ｔａｕ：タウリン
（28）Ｈｙｐ：ヒドロキシプロリン
（29）ｔ－Ｌｅｕ：ｔｅｒｔ－ロイシン
（30）Ｃｌｅ：シクロロイシン
（31）Ａｉｂ：α－アミノイソブチル酸（α－aminoisobutyric acid、２－メチルアラニン）
（32）Ｐｅｎ：Ｌ－ペニシラミン（penicillamine）
（33）ａｌｌｏ－Ｔｈｒ：アロスレオニン
（34）ａｌｌｏ－Ｉｌｅ：アロイソロイシン
　また、アミノ酸誘導体とは、上記アミノ酸の各種誘導体であって、例えば、特殊アミノ酸や非天然アミノ酸、アミノアルコール、或いは末端カルボニル基やアミノ基、システインのチオール基等のアミノ酸側鎖が各種置換基により置換したものが挙げられる。置換基としては、アルキル基、アシル基、水酸基、アミノ基、アルキルアミノ基、ニトロ基、スルホニル基や各種保護基等が挙げられ、例えば、Ａｒｇ（ＮＯ2）：Ｎ－γ－ニトロアルギニン、Ｃｙｓ（ＳＮＯ）：Ｓ－ニトロシステイン、Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）：Ｓ－メチルシステイン、Ｃｙｓ（Ｓ－allyl）：Ｓ－アリルシステイン、Ｖａｌ－ＮＨ2：バリンアミド、Ｖａｌ－ｏｌ：バリノール（２－アミノ－３－メチル－１－ブタノール）等が含まれる。尚、本明細書において、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（ＳＮＯ）－Ｇｌｙは下記の構造式を有するものであり、上記γ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ（Ｏ）およびγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）（Ｏ）式中の（Ｏ）はスルホキシド構造であることを意味する。γ－Ｇｌｕの（γ）とは、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基を介して他のアミノ酸が結合していることを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　本発明のランチオニン誘導体及びこれと併用されるアミノ酸又はペプチドは、市販されている場合には市販品を用いることもでき、その他、（１）化学的に合成する方法、又は（２）酵素的な反応により合成する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得することができるが、化学的な合成がより簡便である。本発明のランチオニン誘導体及びこれと併用されるアミノ酸又はペプチドを化学的に合成する場合には、該オリゴペプチドを、ペプチド合成機を用いて合成あるいは半合成することにより行うことができる。化学的に合成する方法としては、例えばペプチド固相合成法等が挙げられる。そのようにして合成したペプチドは通常の手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等によって精製することができる。このようなペプチド固相合成法、およびそれに続きペプチド精製はこの技術分野においてよく知られたものである。
　また、本発明において用いられるランチオニン誘導体及びこれと併用されるアミノ酸又はペプチドを酵素的な反応により生産する場合には、例えば、国際公開パンフレットＷＯ２００４／０１１６５３号に記載の方法を用いてもよい。すなわち、一方のアミノ酸又はジペプチドのカルボキシル末端をエステル化又はアミド化したアミノ酸又はジペプチドと、アミノ酸がフリーの状態であるアミノ酸（例えば、カルボキシル基が保護されたアミノ酸）とを、ペプチド生成酵素の存在下において反応させ、生成したジペプチド又はトリペプチドを生成することによっても生産することが可能である。ペプチド生成酵素としては、ペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、又は該微生物の菌体処理物、又は該微生物に由来するペプチド生成酵素が挙げられる。
　さらに、上述したような酵素的な方法や化学的合成方法以外にも本発明において用いられるペプチドが、野菜や果物等の植物、酵母等の微生物、その他の天然物中に存在する場合がある。天然に存在する場合には、これらから抽出して用いることも可能である。
　本発明のコク味付与剤あるいは複合コク味付与剤は、そのままで、又は飲食品的に許容しうる担体や他の調味原料と混合して、調味料とすることができる。他の調味原料としては、例えば、香料、糖類、甘味料、食物繊維類、ビタミン類、グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）などのアミノ酸類、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）などの核酸類、塩化ナトリウムなどの無機塩類、クエン酸などの有機酸類が挙げられ、更には種々の酵母エキスも挙げられる。
　本発明において用いられるランチオニン誘導体及び併用されるアミノ酸又はペプチドは塩の形態をも包含する。本発明のランチオニン誘導体及び併用されるアミノ酸又はペプチドが塩の形態を形成し得る場合、その塩は薬理学的に許容される、可食性の塩であればよく、例えば、カルボキシル基等の酸性基に対しては、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロヘキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミン酸との塩を挙げることができる。また、塩基性基に対しては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩を挙げることができる。
　本発明のランチオニン誘導体、コク味付与剤、食品組成物、あるいは複合コク味付与剤は、乾燥粉末、ペースト、溶液などの物性に制限なしにあらゆる形態で用いることができる。
　本発明のランチオニン誘導体、コク味付与剤、食品組成物、あるいは複合コク味付与剤は、食品、飲料、調味料等の各種飲食品に配合して用いることができる。
　本発明のランチオニン誘導体、コク味付与剤、食品組成物、あるいは複合コク味付与剤を食品、飲料、調味料等の各種飲食品に配合して用いる場合の最終的なランチオニン誘導体の量及び併用されるアミノ酸又はペプチドの量は所望の効果が得られる量であれば特に制限されないが、ランチオニン誘導体の量及び／又はアミノ酸若しくはペプチドの量として、食品、飲料あるいは調味料等の全質量を基準として、それぞれについて１０ｐｐｂ～９９．９％、好ましくは０．０５ｐｐｍ～９９．９％、より好ましくは０．１ｐｐｍ～９９．９％、程度である。
　本発明のランチオニン誘導体、コク味付与剤、食品組成物、あるいは複合コク味付与剤が配合された食品、飲料、調味料等の各種飲食品には、飲食品的に許容しうるあらゆる固体又は液体の担体、適当な調味原料等をさらに配合させてもよい。
　上記担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ゼラチン、アルブミン、アミノ酸、水、生理食塩水等が挙げられる。
　上記の調味原料は、当業界で用いられるいずれの調味原料であってもよく特に制限されないが、より具体的には既に上述のものが挙げられる。
　上記の担体、他の調味原料等はいずれもその含有量は特に制限されない。
　上記調味原料のうち、酵母エキスは、由来となる菌体・その培養条件・抽出処理方法のいずれも特に限定されず任意の酵母エキスを用いることができ、更に加熱処理、酵素処理、濃縮、粉末化処理等が施されたものでも良い。
　以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
（実施例１）化合物1の合成
　(Fmoc-L-Cys-Ot-Bu)2  (N,N’-difluorenylmethoxycarbonyl-L-cystine di-t-butylester，4.81 mmol)をテトラヒドロフラン（58.5 mL）と水（1.5 mL）に溶解した。氷冷下トリブチルホスフィン(5.28 mmol)を加えて室温に戻し、４時間攪拌した。反応液を冷却し、10%クエン酸水溶液 （60 mL）を加えた。白濁液を室温に戻し、酢酸エチル（60 mL）で抽出した。有機層を食塩水 60 mLで洗浄後、濃縮し油状残渣を得た。残渣をシリカゲルカラム(n-ヘキサン-酢酸エチル)にて精製し、化合物1を油状物として得た。
収率 97%。
ESI MS m/z 422.4 (M+Na)+ 
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.50 (9H, s), 2.99 (2H, m), 4.23 (1H, t, J=6.8 Hz), 4.41 (2H, m), 4.54 (1H, m), 5.68 (1H, d, J=7.2 Hz), 7.32 (2H, m), 7.41 (2H, t, J=7.2 Hz), 7.61 (2H, d, J=7.6 Hz), 7.77 (2H, d, J=7.2 Hz).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
（実施例２）化合物2の合成
　化合物1(6.04 mmol)を脱水ジメチルホルムアミド（60 mL）に溶解し、Boc-iodo-D-Ala-OMe (N-t-butoxycarbonyl-3-iodo-D-alanine methylester)(6.20 mmol)を加えた後、炭酸セシウム (6.02 mmol)を加え、室温で一晩攪拌した。反応液を冷却し10%クエン酸水溶液（50 mL）および水（30 mL）を加えた後、酢酸エチル（60 mL）で抽出後、再び水層を酢酸エチル（60 mL）で抽出した。有機層を合わせ、10%クエン酸水溶液（50 mL）、食塩水（50 mL）で順次洗浄し、有機層を濃縮した。得られた油状残渣をシリカゲルカラム(n-ヘキサン-酢酸エチル)を用いて精製し、化合物2を油状物として得た。
収率 66%。
ESI MS m/z 601.2 (M+H)+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.45 (9H, s), 1.49 (9H, s), 3.01 (4H, m), 3.73 (3H, s), 4.24 (1H, t, J=7.2 Hz), 4.39 (2H, d, J=7.2 Hz), 4.48-4.55 (2H, m), 5.37 (1H, brd, J=6.8 Hz), 5.80 (1H, brd, J=6.8 Hz), 7.32 (2H, m), 7.40 (2H, t, J=7.2 Hz), 7.63 (2H, m), 7.77 (2H, d, J=7.6 Hz).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
（実施例３）化合物4の合成
（工程１）化合物2(4.01 mmol)をジクロロメタン 70 mLに溶解し、トリフルオロ酢酸（70 mL）を加えて室温で１時間攪拌後、反応液を濃縮し、3を含む残渣が得られた。収率 100%と仮定してそのまま次の反応に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
（工程２）氷冷下、化合物3（4.01 mmol相当）に脱水ジメチルホルムアミド（60 mL）を加えて均一液とし、そこへジイソプロピルエチルアミン(8.04 mmol)を滴下した。室温に戻してカルボニルビスイミダゾール(8.10 mmol)を加えそのまま一晩攪拌した。冷却攪拌条件下、反応液に10%クエン酸水溶液（50 mL）を加え、室温に戻した後、酢酸エチル（100 mL）で抽出、水層を更に酢酸エチルで抽出して有機層を合わせた。この有機層を10%クエン酸水溶液（50 mL ｘ ２）、食塩水で１回洗浄後濃縮し油状残渣を得た。得られた残渣をシリカゲルカラム(n-ヘキサン-酢酸エチル)を用いて精製し、化合物4を油状物として得た。
収率 39%（２工程）。
ESI MS m/z 448.5 (M+Na)+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.71 (1H, dd, J=9.2, 14.4 Hz), 2.78-2.90 (2H, m), 3.02 (1H, d, J=14.4 Hz), 3.86 (3H, s), 4.20 (1H, t, J=6.8 Hz), 4.40 (2H, d, J=6.8 Hz), 4.56 (1H, dd, J=5.6, 9.2 Hz), 4.68 (1H, m), 6.30 (1H, d, J=5.6 Hz), 7.32 (2H, t, J=7.6 Hz), 7.40 (2H, t, J=7.6 Hz), 7.60 (2H, d, J=7.6 Hz), 7.77 (2H, d, J=7.6 Hz).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
（実施例４）化合物6の合成
（工程１）化合物4(1.54 mmol)に10%モルホリン－ジメチルホルムアミド溶液（14 mL）を加えて室温にて３０分攪拌した。反応液を濃縮すると化合物5を含む残渣が得られた。収率 100%と仮定してそのまま次の反応に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
（工程２）Boc-L-Glu-OtBu (N-t-butoxycarbonyl-L-glutamic acid α-t-butylester)
(1.70 mmol)を脱水ジメチルホルムアミド（9 mL）に溶解し、HOBt・H2O (1-hydroxybenzotriazole hydrate)(1.85 mmol)とWSC・HCl(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-Ethoxycarbodiimide hydrochloride)(1.90 mmol)を加えて室温で１５分攪拌した。そこへジメチルホルムアミド（20 mL）に懸濁した化合物5 (1.54 mmol相当)を加え、室温で一晩反応させた。反応液を濃縮後、残渣に酢酸エチル（50 mL）と水（50 mL）を加えて分液し、水層を更に酢酸エチル（50 mL）で抽出した。有機層を合わせて重曹水（50 mL）と食塩水（50 mL）で洗浄後、濃縮した。得られたペースト状残渣をシリカゲルカラム(n-ヘキサン-酢酸エチル)にて精製し、6を油状物として得た。
収率 81% (２工程)。
ESI MS m/z 490.0 (M+H)+
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.44 (9H, s), 1.46 (9H, s), 1.90 (1H, m), 2.17 (1H, m), 2.32 (2H, m), 2.60 (1H, dd, J=10.5, 14.1 Hz), 2.92-2.98 (2H, m), 3.18 (1H, dd, J=6.0, 14.7 Hz), 3.84 (3H, s), 4.46 (1H, m), 4.80 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=8.1 Hz), 6.32 (1H, d, J=8.1 Hz), 7.09 (1H, brs).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
（実施例５）化合物8aおよび8bの合成
（工程１）化合物6 (1.25 mmol)をテトラヒドロフラン（30 mL）に溶解し、氷冷攪拌下、0.2M水酸化リチウム水溶液(2.50 mmol)を加えた。３０分後、10%クエン酸水溶液を用いて約pH6に中和した。室温に戻して反応液を濃縮後、酢酸エチル抽出（20 mL ｘ ３）を行った。水層を更に酢酸エチル抽出（20 mL ｘ ３）して有機層を合わせ、食塩水（10 mL）で洗浄した後、有機層を濃縮し化合物7を得た。収率 100%と仮定してそのまま次の反応に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
（工程２）化合物7(1.25 mmol相当)に4N塩酸／ジオキサン溶液（25 mL）を加え室温で一晩反応させた後、反応液を濃縮した。得られたペースト状の残渣は強塩基性イオン交換樹脂（アンバーライト IRA400 OH AG）を用いて精製を行い２つの画分を得た。先に溶出した画分の一部を更に逆相分取HPLC（カラム：野村化学社製Develosil RPAQUEOUS-AR-5、移動相：0.1%蟻酸を含む水／アセトニトリル系リニアグラジエント）で精製することにより化合物8aをあめ状物質として得た。一方、後から溶出した画分を濃縮することにより白色の固体が得られ、さらにこの固体を水に溶解後、凍結乾燥することにより得られた残渣を、少量の水でスラリー洗浄し、化合物8bを白色固体として得た。
化合物8a
ESI MS m/z 318.3 (M-H)-
1H NMR (600 MHz, D2O) δ 2.13 (2H, m), 2.50 (2H, t, J=7.8 Hz), 2.64 (1H, d, J=15.0 Hz), 2.83 (1H, dd, J=10.8, 15.0 Hz), 3.02 (1H, dd, J=2.4, 15.0 Hz), 3.15 (1H, dd, J=5.4, 15.0 Hz), 3.83 (1H, t, J=6.0 Hz), 4.55 (1H, dd, J=2.4, 5.4 Hz), 4.91 (1H, dd, J=2.4, 10.8 Hz).
化合物8b
収率 26%(２工程)
ESI MS m/z 318.0 (M-H)-
1H NMR (600 MHz, D2O) δ 2.12 (2H, m), 2.48 (2H, t, J=7.2 Hz), 2.72 (1H, d, J=14.4 Hz), 2.76 (1H, dd, J=10.2, 14.4 Hz), 2.89 (1H, dd, J=9.6, 14.4 Hz), 3.05 (1H, d, J=14.4 Hz), 3.78 (1H, t, J=6.0 Hz), 4.42 (1H, d, J=9.6 Hz), 4.91 (1H, d, J=10.2 Hz).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
（実施例６）化合物9の合成
　D-cystine (5.20 mmol)を60%過塩素酸水溶液（2.1 mL）に溶解し、t-ブチルアセテート（12.6 mL）を滴下し室温にて２日間攪拌後、反応液を氷冷し、4N水酸化ナトリウム水溶液を用いて約pH11に調整した。室温に戻して酢酸エチル（50 mL）で６回抽出し、有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮することにより化合物9を油状物として得た。
収率 72%。
ESI MS m/z 353.2 (M+H)+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.48 (18H, s), 2.88 (2H, dd, J=8.0, 13.2 Hz), 3.14 (2H, dd, J=4.4, 13.2 Hz), 3.69 (2H, dd, J=4.4, 8.0 Hz).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
（実施例７）化合物9の合成
　化合物9(3.70 mmol)をテトラヒドロフラン（40 mL）に溶解し、Fmoc-OSc (N-(9-fluorenylmethoxycarbonyloxy)-succinimide)(7.40 mmol)を加えた。反応液を氷冷し、攪拌下N-メチルモルホリン(7.46 mmol)を滴下し、そのまま一晩撹拌した。反応液に酢酸エチル（50 mL）と10%クエン酸水溶液（25 mL）を加えて分配した。有機層をさらに10%クエン酸水溶液（25 mL）と食塩水（25 mL）で２回洗浄後濃縮して得られたスラリー状の残渣を、シリカゲルカラム(n-ヘキサン-酢酸エチル)にて精製し、化合物10を白色固体として得た。
収率 54%。
ESI MS m/z 819.1 (M+Na)+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.48 (18H, s), 3.21 (4H, m), 4.20 (2H, m), 4.35 (4H, m), 4.56 (2H, m), 5.72 (2H, d, J=7.2 Hz), 7.28 (4H, m), 7.38 (4H, m), 7.28 (4H, d, J=7.6 Hz), 7.28 (4H, d, J=7.6 Hz).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
（実施例８）化合物8cおよび8dの製造
　実施例７記載の化合物10を原料に、実施例１～５の方法を用いて化合物8cおよび8dを合成した。
化合物8c
ESI MS m/z 317.9 (M-H)-  
1H NMR (600 MHz, D2O) δ 2.10 (2H, m), 2.44 (2H, m), 2.59 (1H, brd, J=14.4 Hz), 2.79 (1H, dd, J=10.4, 14.4 Hz), 2.98 (1H, dd, J=2.8, 14.8 Hz), 3.11 (1H, dd, J=6.0, 14.8 Hz), 3.80 (1H, t, J=6.0 Hz), 4.50 (1H, dd, J=2.8, 6.0 Hz), 4.81 (1H, dd, J=2.0, 10.4 Hz).
化合物8d
ESI MS m/z 317.8 (M-H)-
1H NMR (600 MHz, D2O) δ 2.09 (2H, m), 2.43 (2H, m), 2.67 (1H, dd, J=1.6, 14.4 Hz), 2.72 (1H, dd, J=9.6, 14.4 Hz), 2.84 (1H, dd, J=9.6, 14.4 Hz), 3.02 (1H, d, J=14.4 Hz), 3.77 (1H, t, J=6.0 Hz), 4.42 (1H, dd, J=1.6, 9.6 Hz), 4.87 (1H, dd, J=2.4, 9.6 Hz).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
（実施例９）化合物11の合成
　H-D-Asp-OMe (D-aspartic acid α-methylester) (6.81 mmol)にテトラヒドロフラン（14 mL）と水（14 mL）を加えて溶解した。氷冷下、Boc2O (dit-butyl dicarbonate)(8.38 mmol)をテトラヒドロフラン（5 mL）に溶かした溶液、トリエチルアミン (13.63 mmol)、DMAP（N,N-dimethyl-4-aminopyridine）(1.36 mmol)を加えた。室温に戻して６時間攪拌後、反応液を濃縮し、テトラヒドロフランを除去した。残った反応液に1～2N 塩酸を加えて約pH 2に調整した後、酢酸エチル（50 mL）で抽出した。有機層を食塩水（25 mL）で洗浄後、濃縮してあめ状の目的化合物11を得た。
収率 76%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.48 (9H, s)，2.91 (1H, dd, J=4.4, 8.0 Hz), 3.10 (1H, dd, J=3.6, 8.0 Hz), 3.79 (3H, s), 4.61 (1H, m), 5.52 (1H, brd, J=8.8 Hz)．
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
（実施例１０）化合物13の合成
　（工程１）化合物11 (5.19 mmol)を酢酸エチル（21 mL）に溶解し、HOSu (N-hydroxysuccinimide) (5.73 mmol)を加えた。氷冷下、DCC（dicyclohexylcabodiimide） (5.71 mmol)を加えた後、反応液を室温に戻し４時間攪拌した。析出した不溶物をろ別後、ろ過液を濃縮して12を含むゲル状残渣を得た。収率 100%と仮定してそのまま次の反応に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　（工程２）テトラヒドロフラン（20 mL）と水（5 mL）の混合液を氷冷し、そこへ水素化ホウ素ナトリウム (9.47 mmol)を加えて10分間攪拌後、化合物12（5.19 mmol相当）のテトラヒドロフラン溶液 （20 mL）をゆっくり滴下した。10分後に飽和塩化アンモニウム水溶液（12 mL）を加えて、反応液を室温に戻した。酢酸エチル（30 mL x 3）で抽出し、有機層を濃縮した後、得られた残渣をシリカゲルカラム (ジクロロメタン-メタノール)にて精製を行い、ゲル状の化合物13を得た。
収率67%（２工程）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.47 (9H, s), 1.63 (1H, m), 2.17 (1H, m), 3.73 (2H, m), 3.80 (3H, s), 4.50 (1H, m), 5.39 (1H, m).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
（実施例１１）化合物14の合成
　化合物13 (3.47 mmol)を脱水ジクロロメタン（10 mL）に溶解後、トリフェニルホスフィン (4.18 mmol)、イミダゾール(4.17 mmol)およびヨウ素(4.16 mmol)の脱水塩化メチレン溶液（10 mL）に滴下した。室温にて2時間撹拌後、反応液を濃縮して得られた残渣に酢酸エチル（35 mL）を加えた。スラリー状態で1時間攪拌後、不溶物をろ別し、ろ過液を濃縮すると褐色のオイルが得られた。これをシリカゲルカラム (n-ヘキサン-酢酸エチル)で精製し、オイル状の化合物14を得た。
収率56%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.47 (9H, s), 2.20 (1H, m), 2.45 (1H, m), 3.20 (2H, t, J=7.6 Hz), 3.79 (3H, s), 4.38 (1H, m), 5.13 (1H, brs).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
（実施例１２）化合物15の合成
　Fmoc-Cys-Ot-Bu (N-fluorenylmethoxycarbonyl-L-cysteine t-butylester)(1.90 mmol)を脱水ジメチルホルムアミド（10 mL）に溶解し、そこへ化合物14(1.94 mmol)の脱水ジメチルホルムアミド溶液（10 mL）を加えた。次に炭酸セシウム (1.92 mmol)を加え、室温で5時間攪拌した後、反応液に酢酸エチル（20 mL）と10%クエン酸水溶液（10 mL）を加えて分配した。水層を酢酸エチル（20 mL）で再抽出して有機層を合わせ、更に10%クエン酸水溶液（10 mL）と飽和食塩水（10 mL）で洗浄した。有機層を濃縮して得られたオイル状残渣を、シリカゲルカラム (n-ヘキサン-酢酸エチル)で精製し、オイル状の化合物15を得た。
収率62%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.45 (9H, s), 1.51 (9H, s), 1.92 (1H, m), 2.12 (1H, m), 2.63 (2H, m), 2.99 (2H, m), 3.74 (3H, s), 4.26 (1H, t, J=7.2 Hz), 4.41 (2H, m), 4.50 (1H, m), 5.17 (1H, br), 7.34 (2H, m), 7.43 (2H, t, J=7.2 Hz), 7.65 (2H, d, J=7.2 Hz), 7.79 (2H, d, J=7.6 Hz).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
（実施例１３）化合物16の合成
（工程１）化合物15(0.55 mmol)を脱水ジクロロメタン（8 mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（4 mL）を加えて室温で2時間攪拌した。反応液を濃縮し、脱水ジメチルホルムアミド （4 mL）で共沸することにより、化合物16を含むジメチルホルムアミド溶液を得た。収率 100%と仮定してそのまま次の反応に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
（工程２）化合物16（0.55 mmol相当）を含むジメチルホルムアミド溶液に、脱水ジメチルホルムアミド（24 mL）を追加して攪拌下、PyBOP(benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate) (0.82 mmol)とWSC・HCl(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethoxycarbodiimide hydrochloride) (0.83 mmol)を加えた。次にトリエチルアミン (0.65 mmol)を添加して室温で24時間反応した後、反応液を濃縮した。別の容器に水（10 mL）と酢酸エチル（10 mL）を入れて攪拌し、そこへ濃縮した反応液を添加した。さらに酢酸エチル（10 mL）で洗いこみ、有機層を抽出した。水層を酢酸エチル（10 ｍL x 2）で抽出し、有機層を合わせ、飽和重曹水（10 mL）と飽和食塩水（10 mL）で洗浄した。有機層を濃縮して得られた白色固体に酢酸エチルを加えてスラリー状態で攪拌後、ろ過により不溶物を除去した。ろ過液を濃縮して得られたオイル状残渣をシリカゲルカラム(n-ヘキサン-酢酸エチル)で精製し、化合物17を白色固体として得た。
収率15%（２工程）。
ESI MS m/z 257.5 (M+H)+.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
（実施例１４）化合物19の合成
（工程１）化合物17 (0.08 mmol)に5%モルホリン/ジメチルホルムアミド溶液（0.70 mL）を加えて室温で1時間攪拌した後、反応液を濃縮し、化合物18を含む溶液を得た。収率 100%と仮定してそのまま次の反応に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
（工程２）Boc-Glu-Ot-Bu(N-t-butoxycarbonyl-L-glutamic acid α-t-butylester) (0.096 mmol)を脱水ジメチルホルムアミド（1 mL）に溶解した。次にHOBt・H2O (1-hydroxybenzotriazole hydrate)(0.12 mmol)とWSC・HCl (1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethoxycarbodiimide hydrochloride)(0.12 mmol)を加え室温で10分攪拌した。この反応液に、化合物18（0.08 mmol相当）の脱水ジメチルホルムアミド（2 mL）溶液を加え、室温で一晩反応した。反応液を濃縮して得られた残渣に酢酸エチル（20 mL）と水（10 mL）を加えて分配した。有機層を飽和重曹水（10 mL）と飽和食塩水（10 mL）で洗浄後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラム (n-ヘキサン-酢酸エチル)で精製し、あめ状の化合物19を得た。
収率90%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.46 (9H, s), 1.48 (9H, s), 1.88 (1H, m), 2.40-2.15 (5H, m), 2.50 (1H, m), 2.78 (1H, dd, J=10.0, 14.4 Hz), 3.09 (1H, dd, J=4.8, 15.6 Hz), 3.37 (1H, dd, J=4.8, 14.4 Hz), 3.68 (1H, t, J=4.8 Hz), 3.79 (3H, s), 4.18 (1H, m), 4.51 (1H, m), 5.01 (1H, m), 5.20 (1H, brd, J=6.8 Hz).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
（実施例１５）化合物21の合成
（工程１）化合物19 (0.092 mmol)をテトラヒドロフラン（1.84 mL）に溶解し、氷冷下、0.2 M 水酸化リチウム水溶液  (0.18 mmol)を加え、室温に戻して1時間攪拌した。TLCで原料の消失を確認後、0.2 N 塩酸を添加して反応液のpHを弱酸性にし、濃縮してテトラヒドロフランを除去した。残溶液を酢酸エチル（10 mL x 3）で抽出し、有機層を飽和食塩水（3 mL）で洗浄した。有機層を濃縮するとあめ状の化合物20がジアステレオマー混合物として得られた。収率 100%と仮定してそのまま次の反応に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
（工程２）化合物20(0.092 mmol相当)に、4N 塩酸/ジオキサン溶液（1.8 mL）を加え、室温で一晩間攪拌した。反応液を濃縮して得られた残渣を水に溶解し、陰イオン交換樹脂 (アンバーライトIRA 400 OH AG)に通した。イオン交換水で洗浄後、1～3N 酢酸で溶出後、凍結乾燥を行うことにより化合物21をジアステレオマー混合物として得た。
収率56%（２工程）。
ESI MS m/z 334.0 (M+H)+；1H NMR (400 MHz, D2O) δ 2.07 (2H, m), 2.42 (2H, m), 2.86-3.17 (2H, m), 3.75 (1H, t, J=6.0 Hz), 4.27～4.41 (1H, m), 4.75～5.24 (1H, m).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
（実施例１６）化合物22の合成
　(Boc-L-Cys-OH)2 (N,N’-dit-butoxycarbonyl-L-cystine)(2.51 mmol)をテトラヒドロフラン（29.2 mL）と水（0.8 mL）に溶解し、氷冷下、トリブチルホスフィン (2.76 mmol)を加えた。室温に戻して1時間半攪拌し、反応液を濃縮した。残渣に酢酸エチル（20 mL）と10%クエン酸水溶液（10 mL）を加えて分配し、有機層を飽和食塩水（10 mL）で洗浄した。有機層を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラム (n-ヘキサン-酢酸エチル)で精製し、オイル状の化合物22を得た。
収率99%。
ESI MS m/z 220.1 (M-H)-; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.47 (1H, brs), 4.65 (1H, brs), 3.09-2.97 (2H, m), 1.48 (9H, s).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
（実施例１７）化合物23の合成
　化合物18 (4.97mmol)と無水酢酸 (49.90 mmol)を合わせて氷冷し、そこへ炭酸水素カリウム (5.93 mmol)を水（2.4 mL）に溶かした溶液を滴下した。室温に戻して2時間攪拌後、水（5 mL）と酢酸エチル（20 mL）を加えて抽出した。水層を酢酸エチル（20 mL）で再抽出して有機層を合わせ、飽和食塩水（5 mL）で洗浄した。有機層を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラム (n-ヘキサン-酢酸エチル)で精製し、あめ状の化合物23を得た。
収率76%。
ESI MS m/z 261.9 (M-H)-; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.33 (1H, d, J=6.4 Hz), 4.53 (1H, m), 3.47 (1H, dd, J=4.0, 14.0 Hz), 3.34 (1H, dd, J=6.8, 14.0 Hz), 2.40 (3H, s), 1.48 (9H, s).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
（実施例１８）化合物24の合成
　化合物23 (3.76 mmol)を脱水ジメチルホルムアミド（30 mL）に溶解し、HOBt・H2O(1-hydroxybenzotriazole hydrate) (4.14 mmol)とCMC (1-cyclohexyl-3-(2-morphorinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate) (4.13 mmol)を加えて室温で15分攪拌した。次にL-Thr-OMe・HCl（L-threonine methylester・HCl）(3.77 mmol)とトリエチルアミン (3.80 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣に水（20 mL）と酢酸エチル（40 mL）を加えて抽出した。有機層を重曹水（20 mL）および飽和食塩水（20 mL）で洗浄後、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラム (ジクロロメタン-メタノール)で精製し、化合物24を白色固体として得た。
収率74%。
ESI MS m/z 401.3 (M+Na)+; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.14 (1H, d, J=7.6 Hz), 5.37 (1H, d, J=7.2 Hz), 4.60 (1H, dd, J=2.8, 8.8 Hz), 4.37 (2H, m), 3.80 (3H, s), 3.39 (1H, dd, J=4.4, 14.0 Hz), 3.24 (1H, dd, J=8.0, 14.0 Hz), 2.40 (3H, s), 1.47 (9H, s), 1.24 (3H, d, J=6.4 Hz).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
（実施例１９）化合物25aおよび25bの合成
　化合物24 (4.20 mmol)を脱水ジクロロメタン（5 mL）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(8.38 mmol)および塩化メタンスルホニル(8.00 mmol)を加えた。室温で1時間半攪拌後、反応液を濃縮してオイル状の残渣を得た。一方、脱水テトラヒドロフラン（50 mL）に氷冷下、水素化リチウムアルミニウム (33.6 mmol)を加えた。次に脱水メタノール (101.48 mmol)をゆっくりと滴下した。反応液に脱水テトラヒドロフラン（50 mL）を追加してさらに撹拌した。10分後、先ほど得られた残渣の脱水テトラヒドロフラン溶液（15 mL）を滴下して2時間反応した。この反応液を、酢酸エチル（150 mL）と0.5 N 塩酸（120 mL）の混合液に少しずつ加えた。分液により得られた有機層を、更に0.5 N 塩酸（120 mL）と飽和食塩水（120 mL）で洗浄後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラム (n-ヘキサン-酢酸エチル)で精製し、異性体である２つ化合物25aおよび25bを得た。
25a：収率13%。 ESI MS m/z 341.1 (M+Na)+; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.50 (1H, d, J=5.6 Hz), 6.01 (1H, d, J=5.2 Hz), 4.87 (1H, dd, J=1.2, 6.0 Hz), 4.61 (1H, m), 3.87 (3H, s), 3.30 (1H, m), 2.95 (1H, dd, J=10.0, 14.8 Hz), 2.76 (1H, dd, J=1.2, 14.8 Hz), 1.47 (9H, s), 1.24 (3H, d, J=6.8 Hz).
25b：収率20%。ESI MS m/z 341.4 (M+Na)+; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.05 (1H, d, J=8.8 Hz), 5.99 (1H, brs), 4.63 (1H, m), 4.15 (1H, m), 3.87 (3H, s), 3.48 (1H, m), 2.73 (2H, m), 1.49 (3H, d, J=7.2 Hz), 1.47 (9H, s).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
（実施例２０）化合物27の合成
　（工程１）化合物25a (0.45 mmol)に4N 塩酸/ジオキサン溶液（2.26 mL）を加え室温で一晩攪拌した。反応液を濃縮することにより化合物26を含む残渣が得られた。収率 100%と仮定してそのまま次の反応に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
（工程２）
　Boc-Glu-Ot-Bu (N-t-butoxycarbonyl-L-glutamic acid α-t-butylester)(0.52 mmol)を脱水ジメチルホルムアミド（4 mL）に溶解し、HOBt・H2O (1-hydroxybenzotriazole hydrate) (0.65 mmol)とWSC・HCl (1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethoxycarbodiimide hydrochloride) (0.66 mmol)を加えて室温で10分攪拌した。そこに、化合物26（0.45 mmol相当）の脱水ジメチルホルムアミド溶液（2.5 mL）を加えた後、トリエチルアミン (0.77 mmol)を添加し、室温で2時間攪拌した。反応液を濃縮後、残渣に酢酸エチル（40 mL）と水（20 mL）を加えて分配し、有機層を飽和重曹水（20 mL）および飽和食塩水（20 mL）で洗浄した。有機層を濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラム(ジクロロメタン-メタノール)で精製し、化合物27を得た。
収率98%（2工程）。
ESI MS m/z 526.1 (M+Na)+; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.02 (1H, m), 6.53 (1H, d, J=6.0 Hz), 5.18 (1H, d, J=7.6 Hz), 4.88 (1H, dd, J=1.2, 5.6 Hz), 4.81 (1H, m), 4.19 (1H, m), 3.87 (3H, s), 3.32 (1H, m), 2.90 (1H, dd, J=10.0, 14.8 Hz), 2.78 (1H, dd, J=2.0, 14.8 Hz),2.33 (2H, m), 2.21 (1H, m), 1.90 (1H, m), 1.49 (9H, s), 1.46 (9H, s), 1.25 (3H, d, J=6.8 Hz).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
（実施例２１）化合物29の合成
　（工程１）化合物27(0.38 mmol)をテトラヒドロフラン（7.6 mL）に溶解し、氷冷下、0.2M 水酸化リチウム水溶液(0.76 mmol)を加えて2時間攪拌した。0.5N 塩酸を加えて反応液を弱酸性にしてから室温に戻し、濃縮してテトラヒドロフランを除去した。残った溶液を酢酸エチル（20 mL x 3）で抽出し、有機層を飽和食塩水（20 mL）で洗浄後、濃縮して化合物28を得た。収率 100%と仮定してそのまま次の反応に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
（工程２）化合物28(0.38 mmol相当)に、4N 塩酸/ジオキサン溶液（7.2 mL）を加え室温で一晩攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を水に溶解し、陰イオン交換樹脂 (アンバーライト IRA 400 OH AG)に通した。イオン交換水で洗浄後、1～3N 酢酸で溶出、凍結乾燥を行い化合物29を白色固体として得た。
収率65%（２工程）。
ESI MS m/z 333.6 (M+H)+; 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 4.86 (1H, dd, J=2.8, 9.6 Hz), 4.81 (1H, d, J=1.6 Hz), 3.82 (1H, t, J=6.4 Hz), 3.40 (1H, m), 2.95 (1H, dd, J=9.6, 15.2 Hz), 2.60 (1H, dd, J=2.8, 15.2 Hz), 2.46 (2H, t, J=7.2 Hz), 2.08 (2H, m), 1.14 (3H, d, J=7.2 Hz).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
（実施例２２）化合物35の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000058

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000059

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000060
（１）化合物31
　２，６－ジアミノピメリン酸（５．０ｇ、２６．３ｍｍｏｌ）をメタノール４２ｍＬに溶解し、氷浴下で塩化チオニル（４．２ｍＬ、５７．９ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。滴下終了後、室温まで自然昇温し、終夜撹拌した。反応終了後、溶媒を留去することで、化合物31を定量的に得た。
（２）化合物32
　化合物31（０．５８２ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を水１０ｍＬとメタノール１０ｍＬの混合溶媒に溶解し、酸化銀（０．７３０ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で終夜撹拌した。反応終了後、セライト濾過で酸化銀を除去し、溶媒を留去することで、化合物32の粗生成物を得た。
（３）化合物33
　Ｂｏｃ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ（０．３０３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（０．１６９ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．２１１ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、化合物32（０．２０５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、トリエチルアミン（０．１９８mＬ、１．４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて終夜撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し、酢酸エチルを加え、希釈した。５％クエン酸水溶液で２回洗浄し、飽和食塩水で１回洗浄した後、１０％飽和重曹水で２回洗浄し、最後に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した後、溶媒を留去し、化合物33の粗生成物を得た。
（４）化合物34
　化合物33（０．２７７ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン５ｍＬに溶解し、１Ｍ水酸化リチウム水溶液を４ｍＬ加え、室温にて２時間撹拌した。反応終了後、１Ｍ塩酸を加え、ｐＨを約２に調整し、酢酸エチルを加え、抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、ろ過し、溶媒を留去することで化合物34を得た。
（５）化合物35
　化合物34（０．１８１ｇ、０．３８ｍｍｏｌ）に４M塩酸－ジオキサン溶液４mＬを加え、室温にて終夜反応させた。反応終了後、溶媒を留去し、化合物35を含む残渣の一部を、逆相分取HPLC（カラム：野村化学社製Develosil RPAQUEOUS-AR-5、移動相：0.1%ヘプタフルオロ酪酸を含む水／アセトニトリル系リニアグラジエント）で精製することにより、化合物35をジアステレオマー混合物として得た。
1H NMR (D2O) δ= 1.41-1.78 (m, 3H), 1.80-1.91 (m, 2H), 1.99-2.03 (m, 1H), 2.08-2.22 (m, 2H), 2.42-2.51 (m, 2H), 3.97-4.02 (m, 1H), 4.31-4.34 (m, 1H), 4.45-4.49 (m, 1H)
MS(ESI) m/z: 302.0 (M+1)
（実施例２３）ＣａＳＲ発現プラスミドの調製
　ＣａＳＲ発現プラスミドの調製を以下のように行った。
　ＮＣＢＩに登録されたＤＮＡ配列（ＣａＳＲ（カルシウム受容体）：NM_000388、配列番号１、２）を元に、ＰＣＲに使う合成オリゴＤＮＡ（フォワードプライマー（配列番号３：ACTAATACGACTCACTATAGGGACCATGGCATTTTATAGCTGCTGCTGG）、及びリバースプライマー（配列番号４:TTATGAATTCACTACGTTTTCTGTAACAG）を合成した。
　ヒト腎臓由来のｃＤＮＡ（Clontech社製）を材料として、前記プライマー、及びPfu Ultra DNA Polymerase（Stratagene社製）を用い、以下の条件でＰＣＲを実施した。９４℃で３分の後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分を３５回繰り返した後、７２℃で７分反応させた。アガロース電気泳動を行い、ＤＮＡ染色試薬で染色した後、紫外線照射によってＰＣＲによって増幅がなされたか否かを検出した。又、同時に電気泳動したサイズ既知のＤＮＡマーカーと比較することで、ＰＣＲ産物の鎖長を確認した。
　プラスミドベクターｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲＶ（Takara社製）によって切断し、その切断部位にＰＣＲによって増幅された遺伝子断片をLigation kit（Promega社製）を用いて連結した。この反応溶液でエシェリヒア・コリＤＨ５α株を形質転換し、ＰＣＲ増幅産物がクローニングされたプラスミドを保持する形質転換体を選抜し、更にＰＣＲ増幅産物をＤＮＡ塩基配列解析によって確認した。
　この組換えプラスミドを用いてヒトＣａＳＲ発現プラスミドhCaSR/pcDNA3.1を作製した。
（実施例２４）CaSRアゴニスト活性の評価（１）
　293E細胞（EBNA1発現HEK293細胞、ATCC No.CRL-10852）を、200μg/mlのG418（ジェネティシン）存在下、10%のウシ胎児血清を含むDMEM/Ham's-F12（3.15/ml Glucose含有Dulbecco's modified Eagle medium、ナカライテスク）にて培養した。3×106cells/10mlでF25フラスコに撒き、CO2インキュベータ（5%CO2、37℃）に24時間静置した後、トランスフェクション試薬Fugene6（Roche）にてヒトCaSR発現プラスミドhCaSR/pcDNA3.1をトランスフェクションした。CO2インキュベータに6～7時間置いた後、細胞を10%ウシ胎児血清含有DMEM/Ham's-F12にて回収し、70,000cells/wellでpoly-D-lysine coat 96well plate（BD-Biocoat）に播種した。
　CO2インキュベータにて24時間静置した後、この細胞を播種した96 well plateから培地を除去し、Assay Buffer (146mM NaCl、5mM KCl、1mM MgSO4、1mg/ml Glucose、20mM HEPES(pH 7.2)、0.75～1.25 mM CaCl2)に溶解したCa2+蛍光指示薬Calcium 4 Assay Kit（Molecular Devices）を200μl/well添加し、37℃で1時間、次いで室温で10分静置し指示薬を取り込ませた。
　この96well plateに、0.1%BSA含有Assay Bufferに溶解した被験化合物を50μl/well添加し、FLEX Station（Molecular Devices）で3分間蛍光強度変化を測定した。
（EC50算出法）
　化合物添加前後の蛍光強度の最大値と最小値の差(RFU(Max-Min)）をFLEX Stationの自動計算にて求めた。化合物最大濃度添加時のRFU(Max-Min)を100%、被験化合物を含まない0.1%BSA含有Assay Bufferを使用時のRFU(Max-Min)を0%と定義した活性率を計算し、表計算ソフトXfitもしくはグラフパッドプリズムにてカーブフィッティングし、活性率50%時の化合物濃度であるEC50値を求めた。
（実施例２５）CaSRアゴニスト活性の評価（２）
　293E細胞（EBNA1発現HEK293細胞、ATCC No.CRL-10852）を、200μg/mlのG418（ジェネティシン）存在下、10%のウシ胎児血清を含むDMEM/Ham's-F12（3.15/ml Glucose含有Dulbecco's modified Eagle medium、ナカライテスク）にて培養した。3×106 cells /10ml でF25フラスコに撒き、CO2インキュベータ（5%CO2、37℃）に24時間静置した後、トランスフェクション試薬Fugene6（Roche）にてヒトCaSR発現プラスミドhCaSR/pcDNA3.1をトランスフェクションした。CO2インキュベータに6～7時間置いた後、細胞を10%ウシ胎児血清含有DMEM/Ham's-F12にて回収し、2×106cells/wellでpoly-D-lysine coat 384well plate（BD-Biocoat）に播種した。
　CO2インキュベータにて24時間静置した後、この細胞を播種した384 well plateから培地を除去し、Assay Buffer (146mM NaCl、5mM KCl、1mM MgSO4、1mg/ml Glucose、20mM HEPES(pH 7.2)、0.75～1.25 mM CaCl2、2.5ｍM Probenecid(SIGMA)に溶解したCa2+蛍光指示薬Calcium 5 Assay Kit（Molecular Devices）を40μl/well添加し、37℃で45分間、次いで室温で15分静置し指示薬を取り込ませた。
　この384well plateに、0.1%BSA含有Assay Bufferに溶解した被験化合物を10μl/well添加し、FLIPR（Molecular Devices）で3分間蛍光強度変化を測定した。
（EC50算出法）
　化合物添加前後の蛍光強度の最大値と最小値の差(RFU(Max-Min)）をFLIPRの自動計算にて求めた。化合物最大濃度添加時のRFU(Max-Min)を100%、被験化合物を含まない0.1%BSA含有Assay Bufferを使用時のRFU(Max-Min)を0%と定義した活性率を計算し、表計算ソフトXfitもしくはグラフパッドプリズムにてカーブフィッティングし、活性率50%時の化合物濃度であるEC50値を求めた。
上記（１）もしくは（２）により測定した結果を表１に示した。
　　　　　　表１
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000061
　本発明の化合物はいずれもCaSR作用活性を示した。中でも、好ましい本発明のランチオニン誘導体である化合物8bは、優れたCaSR作用活性を示し、その活性はCaSR作用活性を有することが既知のγ-Glu-Cysの約９倍ときわめて高活性であった。
（実施例２６）　コク味付与活性の評価
　化合物8bについて、定量的な官能評価試験によりコク味付与活性の強度を調べた。
　定量的官能評価試験は以下のように実施した。グルタミン酸ナトリウム（０．０５ｇ／ｄｌ）、イノシン酸一リン酸（０．０５ｇ／ｄｌ）、塩化ナトリウム（０．５ｇ／ｄｌ）を含有する蒸留水に、被験化合物を０．０００１～０．０００５ｇ／ｄｌにて混合した場合の、コク味付与活性の強度を測定した。無添加コントロールに対しｐＨ±０．２の幅に合わせて使用した。官能評点について、コントロールに対し、同等：０点、強い：３点、非常に強い：５点とするとともに、尺度をより明確にするため、γ-Glu-Val-Glyの先中味を2.5点、後味を3.0点とした評点を基準にし、評価は、ｎ＝５で実施した。なお、0.001g/dl γ-Glu-Val-Glyのコク味強度は、0.01g/dl γ-Glu-Cys-Gly(グルタチオン)のコク味強度（先中味3.0点、後味3.0点）に相当する。採点については、直線尺度法を用い、－５～０～５点の位置を示した直線に対し、該当する採点を位置として記入する方法を用いた。また、食品の調味開発を累積で半年以上経験し、うま味塩味溶液に添加したγ-Glu-Cys-Glyとγ-Glu-Val-Glyの力価の差が１０倍前後と判定できる者（定期的に確認）をパネラーとした。尚、「先中味」とは、口含み後、0～5秒の呈味、後味はそれ以降の呈味である。上記添加濃度で幅広くコク味付与活性を示したが、代表的な濃度の結果を表２に示した。
　又、γ-Glu-Val-Glyについて同様に評価した結果も表２に示した。
　　　　　　　　　　　　　　　　　表２
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000062
　本発明の化合物が低濃度から優れたコク味付与活性を有する、優れたコク味付与剤となりえることがわかり、これは、産業上も非常に有用である。
（実施例２７）　かつお節エキスにおけるコク味付与の活性評価
　化合物8bについて、定量的な官能評価試験によりコク味付与活性の強度を調べた。
　定量的官能評価試験は以下のように実施した。市販のかつお節エキス（５０％かつお節だし相当）を２０．０ｇ／ｄｌになるように熱水希釈し、食塩（０．５ｇ／ｄｌ）を加えたかつお節エキス溶液に、被験化合物を０．０００１～０．０００５ｇ／ｄｌにて混合した場合の、コク味付与活性の強度を測定した。無添加コントロールに対しｐＨ±０．２の幅に合わせて使用した。官能評点について、コントロールに対し、同等：０点、強い：３点、非常に強い：５点とするとともに、尺度をより明確にするため、γ-Glu-Val-Glyの先中味を2.5点、後味を3.0点とした評点を基準にし、評価は、ｎ＝５で実施した。なお、0.001g/dl γ-Glu-Val-Glyのコク味強度は、0.01g/dl γ-Glu-Cys-Gly(グルタチオン)のコク味強度（先中味3.0点、後味3.0点）に相当する。採点については、直線尺度法を用い、－５～０～５点の位置を示した直線に対し、該当する採点を位置として記入する方法を用いた。また、食品の調味開発を累積で半年以上経験し、うま味塩味溶液に添加したγ-Glu-Cys-Glyとγ-Glu-Val-Glyの力価の差が１０倍前後と判定できる者（定期的に確認）をパネラーとした。尚、「先中味」とは、口含み後、0～5秒の呈味、後味はそれ以降の呈味である。上記添加濃度で幅広くコク味付与活性を示したが、代表的な濃度の結果を表３に示した。
　又、γ-Glu-Val-Glyについて同様に評価した結果も表３に示した。
　　　　　　　　　　　　　表３
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000063
　かつお節エキスにおいても、本発明のランチオニン誘導体が低濃度から優れたコク味付与活性を有する、優れたコク味付与剤となりえることがわかった。かつお節は味噌汁、そうめんつゆ、うどんつゆ、めんつゆなどに広く使用されており、本発明の化合物は、より低コストおよび微量で、かつお節を使用した食品を改善する事を可能とし、産業上も非常に有用である。
（実施例２８）　牛乳におけるコク味付与活性の評価
　化合物8bについて、定量的な官能評価試験によりコク味付与活性の強度を調べた。
　定量的官能評価試験は以下のように実施した。市販牛乳（脂肪分３．６％）に、被験化合物を０．０００１～０．０００５ｇ／ｄｌにて混合した場合の、コク味付与活性の強度を測定した。無添加コントロールに対しｐＨ±０．２の幅に合わせて使用した。官能評点について、コントロールに対し、同等：０点、強い：３点、非常に強い：５点とするとともに、尺度をより明確にするため、γ-Glu-Val-Glyの先中味を2.5点、後味を3.0点とした評点を基準にし、評価は、ｎ＝５で実施した。なお、0.001g/dl γ-Glu-Val-Glyのコク味強度は、0.01g/dl γ-Glu-Cys-Gly(グルタチオン)のコク味強度（先中味3.0点、後味3.0点）に相当する。採点については、直線尺度法を用い、－５～０～５点の位置を示した直線に対し、該当する採点を位置として記入する方法を用いた。また、食品の調味開発を累積で半年以上経験し、うま味塩味溶液に添加したγ-Glu-Cys-Glyとγ-Glu-Val-Glyの力価の差が１０倍前後と判定できる者（定期的に確認）をパネラーとした。尚、「先中味」とは、口含み後、0～5秒の呈味、後味はそれ以降の呈味である。上記添加濃度で幅広くコク味付与活性を示したが、代表的な濃度の結果を表４に示した。
　又、γ-Glu-Val-Glyについて同様に評価した結果も表４に示した。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　表４
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000064
　牛乳においても、本発明のランチオニン誘導体が低濃度から優れたコク味付与活性を有する、優れたコク味付与剤となりえることがわかった。牛乳は食品・飲料・菓子・醗酵食品の原料などに広く使用されており、本発明の化合物は、より低コストおよび微量で、牛乳を使用した食品を改善する事を可能とし、産業上も非常に有用である。

Claims (11)

  1. 　下記式（I）の構造を有する化合物、又はその可食性塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （I）
    　（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１から３のアルキル基を示し、
    　Ａは、メチレン基又はオキシ基を示し、
    　Ｘは、炭素数１から５のアルキレン基を示し、ただし、該アルキレン基中１つのメチレン基が、チオ基、ジスルフィド基、オキシ基、イミノ基、または炭素数１～３のアルキルイミノ基で置換されていても良く、また更に、該アルキレン基は、１から６個の、炭素数１～３のアルキル基で置換されていても良い。）
  2. 　式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が水素原子である、請求項１記載の化合物、又はその可食性塩。
  3. 　式（Ｉ）において、Ａがメチレン基である、請求項１又は２に記載の化合物、又はその可食性塩。
  4. 　式（Ｉ）において、Ｘが１つのメチレン基がチオ基で置換されたトリメチレン基である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物、又はその可食性塩。
  5. 　下記式（IIa）の構造を有する、請求項１記載の化合物、又はその可食性塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     (IIa)
  6. 　下記式（8b）の構造を有する、請求項５記載の化合物、又はその可食性塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  7. 　式（Ｉ）において、Ｘが、１つのメチレン基がチオ基で置換されたテトラメチレン基、又は、炭素数１～３のアルキル基で置換された、１つのメチレン基がチオ基で置換されたトリメチレン基である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物、又はその可食性塩。
  8. 　式（Ｉ）において、Ｘがトリメチレン基である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物、又はその可食性塩。
  9. 　請求項１～８記載のいずれか１項記載の化合物またはその可食性の塩を１０ｐｐｂ～９９．９％有する食品組成物。
  10. 　請求項１～８記載のいずれか１項記載の化合物またはその可食性の塩を有効成分として含有するコク味付与剤。
  11. 　下記式（IA）の構造を有する化合物、又はその化学的に許容しうる塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     　（IA）
    　（式中、Ｒ１’及びＲ２’は、それぞれ独立して、水素原子、及び炭素数１～３のアルキル基を示し、
    　Ｒ３’は、水素原子、炭素数１から４のアルキル基、ベンジル基、又は９－フルオレニルメチル基を示し、
    　Ｒ４’は、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、又は９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基を示し、
    　Ｒ５’は、水酸基、炭素数１～４のアルコキシ基、ベンジルオキシ基、アミノ基（－ＮＨ2）又は炭素数１～３のアルキルアミノ基を示し、
    　Ａは、メチレン基又はオキシ基を示し、
    　Ｘは、炭素数１から５のアルキレン基を示し、ただし、該アルキレン基中１つのメチレン基が、チオ基、ジスルフィド基、オキシ基、イミノ基、または炭素数１～３のアルキルイミノ基で置換されていても良く、また、該アルキレン基は、１から６個の、炭素数１～３のアルキル基で置換されていても良い。）
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013002329A1 (ja) * 2011-06-28 2013-01-03 味の素株式会社 ランチオニン誘導体の製造方法
US8568814B2 (en) 2009-12-28 2013-10-29 Ajinomoto Co., Inc. Lanthionine derivatives

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112012021657B8 (pt) * 2010-03-04 2022-06-07 Ea Pharma Co Ltd Composto, agente farmacêutico, agente para conferir kokumi , e, tempero

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004011653A1 (ja) 2002-07-26 2004-02-05 Ajinomoto Co., Inc. 新規ペプチド生成酵素遺伝子
WO2007055393A1 (en) 2005-11-09 2007-05-18 Ajinomoto Co., Inc. Kokumi-imparting agent

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0095320A1 (en) * 1982-05-21 1983-11-30 Beecham Group Plc A process for the preparation of beta-lactam compounds
GB9907055D0 (en) * 1999-03-29 1999-05-19 British Biotech Pharm Antibacterial agents
RU2365585C2 (ru) * 2003-12-01 2009-08-27 Кембридж Энтерпрайз Лимитед Противовоспалительные средства
EP1734836B1 (en) * 2004-04-06 2016-12-07 Givaudan S.A. Taste improving substances
GB2423085C (en) * 2005-02-11 2011-11-09 Cambridge Entpr Ltd Ligands for G-protein coupled receptors
JP2007117082A (ja) 2005-09-27 2007-05-17 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
GB0520912D0 (en) * 2005-10-14 2005-11-23 Hofmann Thomas F Kokumi flavour compounds and use
GB0520872D0 (en) * 2005-10-14 2005-11-23 Hofmann Thomas F Onion flavour compounds and use
US8420144B2 (en) 2005-11-09 2013-04-16 Ajinomoto Co., Inc. Kokumi-imparting agent, method of using, and compositions containing same
CN101305281B (zh) * 2005-11-09 2014-10-29 味之素株式会社 赋予kokumi的作用剂
WO2007055388A2 (en) 2005-11-09 2007-05-18 Ajinomoto Co., Inc. Calcium receptor activator
JP5367377B2 (ja) * 2006-01-09 2013-12-11 オクラホマ メディカル リサーチ ファウンデーション 炎症性疾患治療のためのランチオニン関連化合物
CA2686805C (en) 2007-05-08 2015-11-24 Ajinomoto Co., Inc. A sweetener comprising a calcium receptor
JP5321452B2 (ja) 2007-05-08 2013-10-23 味の素株式会社 下痢の予防又は治療剤
CA2686795C (en) 2007-05-08 2015-11-24 Ajinomoto Co., Inc. Low-fat food comprising a calcium receptor
EP2269646A4 (en) 2008-02-25 2011-06-29 Ajinomoto Kk PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC AGENT FOR DIABETES OR OBESITY
WO2009122319A2 (en) * 2008-04-04 2009-10-08 Firmenich Sa Taste modifying product
US20110020518A1 (en) * 2008-04-04 2011-01-27 Estelle Delort Taste modifying product
WO2009128523A1 (ja) 2008-04-17 2009-10-22 味の素株式会社 免疫賦活剤
CN102239136B (zh) * 2008-10-03 2014-09-17 味之素株式会社 CaSR激动剂
AU2010232296B2 (en) 2009-04-01 2014-06-19 Ajinomoto Co., Inc. Use of peptide for imparting body taste
CA2784310C (en) 2009-12-28 2015-10-13 Ajinomoto Co., Inc. Lanthionine derivatives

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004011653A1 (ja) 2002-07-26 2004-02-05 Ajinomoto Co., Inc. 新規ペプチド生成酵素遺伝子
WO2007055393A1 (en) 2005-11-09 2007-05-18 Ajinomoto Co., Inc. Kokumi-imparting agent
JP2009514791A (ja) * 2005-11-09 2009-04-09 味の素株式会社 コク味付与剤

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DUGAVE CHRISTOPHE ET AL.: "Synthesis of natural and non natural orthogonally protected lanthionines from N-tritylserine and allo- threonine derivatives.", TETRAHEDRON ASYM., vol. 8, no. 9, 1997, pages 1453 - 1465, XP008158097 *
KIICHIRO NAKAJIMA ET AL.: "Studies on 2- Aziridinecarboxylic Acid. IX. Convenient Synthesis of Optically Active S-Alkylcysteine, threo-S-Alkyl-beta-methylcysteine, and Lanthionine Derivatives via the Ring-opening Reaction of Aziridine by Several Thiols.", BULL. CHEM. SOC. JPN., vol. 56, 1983, pages 520 - 522, XP008158510 *
MUSTAPA M. FIROUZ ET AL.: "Synthesis of cyclic peptides containing nor-lanthionine bridges via a triply-orthogonal protecting group strategy.", TETRAHEDRON LETT., vol. 43, 2002, pages 8363 - 8366, XP008158101 *
See also references of EP2524925A4
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 285, no. 2, 2010, pages 1016 - 22

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8568814B2 (en) 2009-12-28 2013-10-29 Ajinomoto Co., Inc. Lanthionine derivatives
WO2013002329A1 (ja) * 2011-06-28 2013-01-03 味の素株式会社 ランチオニン誘導体の製造方法

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