CN109996453A - 用于调节厚味味道的调节钙敏感受体活性的化合物和含有该化合物的宠物食品 - Google Patents

用于调节厚味味道的调节钙敏感受体活性的化合物和含有该化合物的宠物食品 Download PDF

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Abstract

本文描述了一种包含调节、增加和/或增强钙敏感受体活性的至少一种化合物的风味组合物，所述风味组合物可用于增强宠物食品的厚味味道和/或适口性。本文还公开了鉴定所述化合物的方法。

Description

用于调节厚味味道的调节钙敏感受体活性的化合物和含有该 化合物的宠物食品
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年4月14日提交的美国临时申请序列号62/322,641的优先权，该临时申请的全部内容并入本文。
技术领域
本发明公开的主题涉及化合物和风味组合物，其包括至少一种与钙敏感受体(CaSR)相互作用以调节厚味味道的化合物。风味组合物可用于增强或改变宠物食品的适口性、味道和/或风味。风味组合物可包括化合物的组合，并可以各种递送系统形式添加到宠物食品中。
序列表
说明书通过引用进一步引入了2017年4月14日通过EFS随本文提交的序列表。根据37C.F.R.§1.52(e)(5)，标识为CaSRseqlisting.txt的序列表文本文件是13,989字节，并于2017年4月14日创建。以电子方式随本文提交的序列表未超出说明书范围，因此不包含新内容。
背景技术
可食用组合物的味觉谱(taste profile)包括基本味道，如甜味、咸味、苦味、酸味、鲜味和厚味(kokum)。引起这些味道的化合物通常被称为促味剂。在不受理论约束的情况下，假设促味剂由口和咽喉中的味觉受体感知，所述味觉受体将信号传递到脑，在这里记录了促味剂和所产生的味觉谱。味觉受体包括钙敏感受体(CaSR)，其是一种检测细胞外钙水平的变化的G蛋白偶联受体(GPCR)，并与T1R1、T1R2和T1R3受体(即甜味和鲜味受体)密切相关。钙敏感受体已经显示增强甜味、咸味和鲜味，并且作为厚味味道的受体起作用。
宠物食品制造商长期以来希望提供具有高营养价值的宠物食品。此外，特别是对于猫和狗食品，宠物食品制造商希望得到高度适口性，使得宠物可以从它们的食物中获得全营养益处。家养动物，尤其是猫，在其食物偏好方面是众所周知的易变，并且经常随着时间拒绝食用其已经接受的宠物食品，或者拒绝食用任何多于最少量的宠物食品。这种现象可能部分地归因于原料的感官特征的细微差异，由于家养动物的味觉和嗅觉系统，它们可以感知到这些差异。因此，宠物主人经常改变宠物食品的类型和品牌，以使他们的宠物保持健康和满意的状态。
虽然味道和风味技术近来有所进展，但仍需要能够通过增强或改变宠物食品的味觉谱、质地谱(texture profile)和/或风味谱(flavor profile)来增强或改变宠物食品的适口性的化合物。增强或改变可以是增加所需属性的强度，以替换在宠物食品中不存在或以某种方式丢失的所需属性，或者降低不需要的属性的强度。特别地，期望增加宠物食品中所需促味剂的强度。因此，本领域仍需要增强适口性和/或调节宠物食品的厚味味道的组合物。
发明内容
本发明公开的主题涉及风味组合物和制备和改变在各种宠物食品中这种组合物的方法。具体地，本公开涉及包含一种或多种化合物的组合物，其增强、增加、降低和/或调节钙敏感受体(CaSR)的活性，从而调节厚味味道。
在某些实施方案中，风味组合物包含来自周期表的第II族元素的二价或三价盐。在某些实施方案中，第II族元素选自由铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)及它们的组合组成的组。在某些实施方案中，第II族元素是镁(Mg)或锶(Sr)。在某些实施方案中，至少一种钙敏感受体调节化合物是镧系元素的二价或三价盐。在某些实施方案中，镧系元素选自由镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镏(Lu)及它们的组合组成的组。在某些实施方案中，镧系元素是钆(Gd)、镨(Pr)或铽(Tb)。
在某些实施方案中，风味组合物包含具有以下结构之一的式Vft-1a或Vft-1b的化合物
其中n、n6、n7、X1、X2、R1、R2、R3、R4、R5、R6和Y在下文中描述。
在某些实施方案中，风味组合物包含具有以下结构的式Vft-2的化合物：
其中n、X1、X2、W、R1、R2、R3、R4和R5在下文中描述。
在某些实施方案中，风味组合物包含具有以下结构的式Vft-3的化合物：
其中AA1和AA2如下所述，并且任选地由式Vft-3b定义：
其中n、n1、n2、n4、R1、R2、R3、R4和R5如下所述。
在某些实施方案中，风味组合物包含具有以下结构的式Vft-4的化合物：
其中n1、n2和R在下文中描述。
在某些实施方案中，风味组合物包含具有以下结构的式Vft-5的化合物：
R1-AAn-R2，
其中n、AA、R1和R2在下文中描述。
在某些实施方案中，风味组合物包含具有以下结构的式Vft-6的化合物：
其中n1至n6、R1至R12、Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf在下文中描述。
在某些实施方案中，风味组合物包含由式Vft-6.5a、Vft-6.5b和Vft-6.5c之一描述的含磷化合物：
其中n、X1、X2、R1、R2、R3、R4、R5、R6在下文中描述。
在某些实施方案中，风味组合物包含如下文所述的氨基糖苷类(aminoglycoside)。
在某些实施方案中，风味组合物包含氨基糖苷类抗生素。
在某些实施方案中，风味组合物包含与CaSR受体的捕蝇草结构域的活性位点相互作用的化合物，例如在以下氨基酸组中的一种或多种上：Asn64、Phe65、Asn102、Thr145、Ser147、Ala168、Ser169、Ser170、Asp190、Gln193、Asp216、Tyr218、Ser272、Glu297、Ala298、Trp299、Ala300、Ser302、Leu304、Tyr411、Thr412和/或His413。
在某些实施方案中，风味组合物包含拟钙剂(calcimimetic)。在某些实施方案中，风味组合物包含下表1中公开的拟钙剂。例如，拟钙剂可具有下式Tm-1的结构：
其中n1、n2、R1至R9、X1至X11、环A和环B在下文中描述。在本公开的某些实施方案中，风味组合物包含一种或多种如本文所述的拟钙剂式Tm-2至Tm-12。
在某些实施方案中，风味组合物包含与CaSR受体的7跨膜结构域的活性位点相互作用的化合物，例如在以下氨基酸组中的一种或多种上：螺旋3上的Phe684、Gly685和/或Phe688，螺旋4上的Gln735，螺旋5上的Met771、Ala772、Phe775、Leu776和/或Thr780，螺旋6上的Phe814、Val817、Trp818和/或Phe821，和/或螺旋7上的Glu837、Ala840和/或Ile841。
本公开还提供了本文所述化合物的盐和立体异构体。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种如本文所述的氨基酸。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种如本文所述的鲜味受体活化跨膜化合物。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种如本文所述的脂肪酸受体(GPR120)活化化合物。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种如本文所述的核苷酸和/或核苷酸衍生物。
在某些实施方案中，风味组合物包含至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种第一氨基酸，和/或至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种第二氨基酸，和/或至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种第三氨基酸。在某些实施方案中，第一氨基酸是鲜味受体调节氨基酸。在某些实施方案中，第二氨基酸是CaSR受体调节氨基酸。在某些实施方案中，第三氨基酸可以与一种或多种其它味觉受体相互作用，并且不结合与第一氨基酸或第二氨基酸相同的受体，或与第一氨基酸或第二氨基酸竞争用于结合钙敏感受体或鲜味受体。
在某些实施方案中，本公开证明了鉴定钙敏感受体调节化合物的方法，例如，计算机模拟(in silico)和体外(in vitro)方法。
在某些实施方案中，本公开提供了包含含有化合物的风味组合物的宠物食品，其中风味组合物以有效增加食品的厚味味道的量存在，如由一组味道测试员所确定的。风味组合物可以掺入用于宠物食品的递送系统中。
在某些实施方案中，本公开提供了包含含化合物的风味组合物的宠物食品，其中所述风味组合物以宠物食品的约0.0001重量％至约10重量％(w/w％)或约0.001w/w％至约1w/w％的浓度存在。在某些实施方案中，宠物食品是猫宠物食品。
在某些实施方案中，本公开提供了包含含化合物的风味组合物的宠物食品。在某些实施方案中，风味组合物以宠物食品的约0.001ppm至约1000ppm的浓度存在。或者或另外，该化合物可以以约1pM至约1M的浓度存在于宠物食品中。
本公开还提供了用于增加宠物食品的适口性的方法。在某些实施方案中，该方法包括将宠物食品与风味组合物混合。在某些实施方案中，风味组合物以混合物的约0.001重量％至约10重量％或约0.01w/w％至约1w/w％的浓度存在。
在本公开的某些实施方案中，用于增加宠物食品的适口性的方法包括将宠物食品与风味组合物混合。在某些实施方案中，风味组合物以混合物的约0.001ppm至约1000ppm的浓度存在。或者或另外，所述至少一种化合物在混合物中以约1pM至约1M的浓度存在。
在本公开的某些实施方案中，将风味组合物以有效增加宠物食品的适口性的量与宠物食品混合。
本发明公开的主题还提供调节钙敏感受体活性的方法，包括使组合物与钙敏感受体接触，例如，包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的猫钙敏感受体，其中所述组合物与钙敏感受体的相互作用位点中的一个或多个氨基酸相互作用，所述氨基酸选自由VFT结构域中的Asn64、Phe65、Asn102、Ihr145、Ser147、Ala168、Ser169、Ser170、Asp190、Gln193、Asp216、Tyr218、Ser272、Glu297、Ala298、Trp299、Ala300、Ser302、Leu304、Tyr411、Thr412和His413及它们的组合，和/或7TM跨膜结构域中螺旋3上的Phe684、Gly685和/或Phe688，螺旋4上的Gln735，螺旋5上的Met771、Ala772、Phe775、Leu776和/或Thr780，螺旋6上的Phe814、Va1817、Trp818和/或Phe821，和/或螺旋7上的Glu837、Ala840和/或Ile841；及它们的组合组成的组。在本公开中，7TM结构域螺旋按照标准的GPCR用语按顺序编号。
本发明公开的主题还提供了用于鉴定调节钙敏感受体活性的组合物的方法，包括使测试剂与钙敏感受体接触，并检测测试剂与如本文所述的钙敏感受体的相互作用位点中的一种或多种氨基酸之间的相互作用。
前面已经相当广泛地概述了本申请的特征和技术优点，以便可以更好地理解随后的详细描述。在下文中将描述本申请的附加特征和优点，其形成本申请权利要求的主题。本领域技术人员应该理解，所公开的概念和具体实施方案可以容易地用作修改或设计用于实现本申请的相同目的的其他结构的基础。本领域技术人员还应该认识到，这种等效构造不脱离所附权利要求中阐述的本申请的精神和范围。从以下描述中将更好地理解被认为是本申请的特征的关于其组织和操作方法的新颖特征，以及其它目的和优点。
附图说明
图1显示了CaSR二聚体。
图2显示了CaSR二聚体，并描绘了CaSR上的各种结合结构域。
图3A-3C显示化合物L-天冬氨酸与猫CaSR的捕蝇草结构域的结合的计算机模拟建模。(A)显示结合化合物的结构，(B)显示与猫CaSR结合的化合物的模型，以及(C)显示与结合化合物相互作用的推定的CaSR氨基酸残基。
图4A-4C显示化合物L-赖氨酸与猫CaSR的捕蝇草结构域的结合的计算机模拟建模。(A)显示结合化合物的结构，(B)显示与CaSR结合的化合物的模型，以及(C)显示与结合化合物相互作用的推定的CaSR氨基酸残基。
图5A-5C显示化合物L-(+)-2-氨基-3-膦酰基丙酸与猫CaSR的捕蝇草结构域的结合的计算机模拟建模。(A)显示结合化合物的结构，(B)显示与CaSR结合的化合物的模型，以及(C)显示与结合化合物相互作用的推定的CaSR氨基酸残基。
图6A-6C显示化合物谷胱甘肽与猫CaSR的捕蝇草结构域的结合的计算机模拟建模。(A)显示结合化合物的结构，(B)显示与CaSR结合的化合物的模型，以及(C)显示与结合化合物相互作用的推定的CaSR氨基酸残基。
图7A-7C显示化合物H-γ-Glu-Val-Gly-OH与猫CaSR的捕蝇草结构域的结合的计算机模拟建模。(A)显示结合化合物的结构，(B)显示与CaSR结合的化合物的模型，以及(C)显示与结合化合物相互作用的推定的CaSR氨基酸残基。
图8A-8C显示化合物H-γ-Glu-Tyr-OH与猫CaSR的捕蝇草结构域的结合的计算机模拟建模。(A)显示结合化合物的结构，(B)显示与CaSR结合的化合物的模型，以及(C)显示与结合化合物相互作用的推定的CaSR氨基酸残基。
图9A-9C显示化合物H-β-Asp-Leu-OH与猫CaSR的捕蝇草结构域的结合的计算机模拟建模。(A)显示结合化合物的结构，(B)显示与CaSR结合的化合物的模型，以及(C)显示与结合化合物相互作用的推定的CaSR氨基酸残基。
图10A-10C显示化合物N-(1-(4-氯苯基)乙基)-3-(4-异丙氧基苯基)-3-苯基丙-1-胺与猫CaSR的7跨膜结构域的计算机模拟建模。(A)显示结合化合物的结构，(B)显示与CaSR结合的化合物的模型，以及(C)显示与结合化合物相互作用的推定的CaSR氨基酸残基。
图11A-11C显示化合物N-(1-(4-氯苯基)乙基)-3-(4-甲氧基苯基)-4-甲基戊-1-胺与猫CaSR的7跨膜结构域的计算机模拟建模。(A)显示结合化合物的结构，(B)显示与CaSR结合的化合物的模型，以及(C)显示与结合化合物相互作用的推定的CaSR氨基酸残基。
图12A-12C显示化合物3-(呋喃-2-基)-4-苯基-N-(1-苯基乙基)丁-1-胺与猫CaSR的7跨膜结构域的结合的计算机模拟建模。(A)显示结合化合物的结构，(B)显示与CaSR结合的化合物的模型，以及(C)显示与结合化合物相互作用的推定的CaSR氨基酸残基。
图13A-13C显示化合物3-(2，2-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-3-苯基-N-(1-苯基乙基)丙-1-胺与猫CaSR的7跨膜结构域的结合的计算机模拟建模。(A)显示结合化合物的结构，(B)显示与CaSR结合的化合物的模型，以及(C)显示与结合化合物相互作用的推定的CaSR氨基酸残基。
图14A-14C显示化合物N-((2，3-二氢苯并呋喃-2-基)甲基)-1-(喹啉-2-基)乙胺与猫CaSR的7跨膜结构域的结合的计算机模拟建模。(A)显示结合化合物的结构，(B)显示与CaSR结合的化合物的模型，以及(C)显示与结合化合物相互作用的推定的CaSR氨基酸残基。
图15A-15C显示化合物2，6-二氯-4-(1-(((1-甲基-2-(噻吩-2-基)哌啶-3-基)甲基)氨基)乙基)苯胺与猫CaSR的7跨膜结构域的结合的计算机模拟建模。(A)显示结合化合物的结构，(B)显示与CaSR结合的化合物的模型，以及(C)显示与结合化合物相互作用的推定的CaSR氨基酸残基。
图16A-16C显示化合物1-(4-氯苯基)-N-(2-(2，2-二甲基-4-(对甲苯基))四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)乙胺与猫CaSR的7跨膜结构域的结合的计算机模拟建模。(A)显示结合化合物的结构，(B)显示与CaSR结合的化合物的模型，以及(C)显示与结合化合物相互作用的推定的CaSR氨基酸残基。
图17A-17C显示化合物2-(3-氰基苯基)-2-((4-氟-2，3-二氢-1H-茚-1-基)氨基)乙酸甲酯与猫CaSR的7跨膜结构域的结合的计算机模拟建模。(A)显示结合化合物的结构，(B)显示与CaSR结合的化合物的模型，以及(C)显示与结合化合物相互作用的推定的CaSR氨基酸残基。
图18A-18C显示化合物2-(2-乙酰基-1，2-二氢异喹啉-1-基)-N-(1-(3-溴苯基)乙基)乙酰胺与猫CaSR的7跨膜结构域的结合的计算机模拟建模。(A)显示结合化合物的结构，(B)显示与CaSR结合的化合物的模型，以及(C)显示与结合化合物相互作用的推定的CaSR氨基酸残基。
图19A-19C显示化合物1-(苯并[d]噻唑-2-基)-1-(2，4-二甲基苯基)乙醇与猫CaSR的7跨膜结构域的结合的计算机模拟建模。(A)显示结合化合物的结构，(B)显示与CaSR结合的化合物的模型，以及(C)显示与结合化合物相互作用的推定的CaSR氨基酸残基。
图20A-20C显示化合物3-(4-((4-氟-4′-甲基联苯-2-基)甲氧基)苯基)丙酸(也称为TUG891)与猫CaSR的7跨膜结构域的结合的计算机模拟建模。(A)显示结合化合物的结构，(B)显示与CaSR结合的化合物的模型，以及(C)显示与结合化合物相互作用的推定的CaSR氨基酸残基。
图21显示对于如实施例2所述的各种化合物的猫CaSR的体外活化的剂量响应曲线。
图22A-22B显示了对于如表4中所述的四种氨基酸的CaSR的体外活化的剂量响应曲线。
图23显示猫CaSR的氨基酸序列和核苷酸序列，分别标识为SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2。
具体实施方式
迄今为止，仍然需要一种能够增加和/或增强各种猫宠物食品的适口性的风味调节剂。本申请涉及风味组合物，其包含至少一种调节钙敏感受体(CaSR)活性的化合物。风味组合物可用于增加适口性和/或增强或改变各种宠物食品如营养全面的宠物食品的味道，并且可以以各种递送系统形式添加到宠物食品中。风味组合物可进一步包括化合物的组合，所述化合物包括氨基酸、核苷酸和呋喃酮(如2013年10月31日提交的国际申请号PCT/EP2013/072788，2013年10月31日提交的国际申请号PCT/EP2013/072789，2013年10月31日提交的国际申请号PCT/EP2013/072790和2013年10月31日提交的国际申请号PCT/EP2013/072794，其各自的全部内容通过引用并入)和/或鲜味受体活化跨膜化合物(如2015年12月10日提交的国际申请号PCT/US15/65036中所述，其全部内容通过引用并入)和/或核苷酸衍生物(如2015年12月10日提交的国际申请号PCT/US15/65046中所述，其全部内容通过引用并入)和/或脂肪酸受体(GPR120)活性化合物(如2015年12月10日提交的国际申请号PCT/US15/65106中所述，其全部内容通过引用并入)。
1.定义
本说明书中使用的术语在本发明的上下文中和在使用每个术语的特定上下文中通常具有其在本领域中的普通含义。某些术语在下面或说明书中的其他地方讨论，以向从业者提供对描述本发明的组合物和方法以及如何制备和使用它们的额外指导。
如本文所用，当在权利要求和/或说明书中与术语“包括”结合使用时，使用词语“一种”或“一个”可以表示“一个”，但它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。此外，术语“具有”、“包括”、“含有”和“包含”是可互换的，并且本领域技术人员认识到这些术语是开放式术语。
术语“约”或“大约”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在3个或多于3个标准偏差内。或者，“约”可表示给定值的至多20％、优选至多10％、更优选至多5％、更优选至多1％的范围。或者，特别是对于生物系统或过程，该术语可以表示数值的数量级，优选地在5倍内，更优选地在2倍内。
如本文所用，“味道”是指由受试者的味蕾中的受体细胞的活化或抑制引起的感觉。在某些实施方案中，味道可选自由甜味、酸味、咸味、苦味、厚味和鲜味组成的组。在某些实施方案中，通过“促味剂”在受试者中引发味道。在某些实施方案中，促味剂是合成的促味剂。在某些实施方案中，促味剂由天然来源制备。
在某些实施方案中，“味道”可包括厚味味道。参见，例如，Ohsu等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，285(2)：1016-1022(2010)，其内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，厚味味道是由受试者的味蕾中的受体细胞例如受体CaSR的活化或抑制引起的感觉，并且与其它味道(例如，甜味、咸味和鲜味)分开，尽管它可以作为这些味道的味道增强剂。
如本文所用，“味觉谱”是指味道的组合，如甜味、酸味、咸味、苦味、鲜味、厚味和游离脂肪酸味中的一种或多种。在某些实施方案中，味觉谱由存在于组合物中的相同或不同浓度的一种或多种促味剂产生。在某些实施方案中，味觉谱是指由受试者或本领域中任何已知的测定法所检测到的味道或味道组合，例如甜味、酸味、咸味、苦味、鲜味、厚味和游离脂肪酸味，的强度。在某些实施方案中，修改、改变或更改味觉谱中的促味剂组合可以改变受试者的感官体验。
如本文所用，“风味”是指一种或多种感官刺激，例如味道(味觉)、气味(嗅觉)、触感(触觉)和温度(热)刺激中的一种或多种。在某些非限制性实施方案中，暴露于风味的受试者的感官体验可以被分类为特定风味的特征体验。例如，风味可以被受试者识别为但不限于花香、柑橘、浆果、坚果、焦糖、巧克力、辛辣(peppery)、烟熏、奶酪、肉味等风味。如本文所用，风味组合物可选自液体、溶液、干粉、喷雾剂、糊剂、悬浮剂及它们的任意组合。风味剂可以是天然组合物、人造组合物、天然等同物或它们的任意组合。
如本文中可互换使用的，“芳香”和“气味”是指对刺激的嗅觉反应。例如但不限于，芳香可以由被嗅觉系统的气味受体感知的芳香物质产生。
如本文所用，“风味谱”是指感官刺激的组合，例如味道，如甜味、酸味、苦味、咸味、鲜味、厚味、游离脂肪酸味道，和/或嗅觉、触觉和/或热刺激。在某些实施方案中，风味谱包含有助于受试者的感官体验的一种或多种风味。在某些实施方案中，修改、改变或更改风味谱中的刺激的组合可以改变受试者的感官体验。
如本文所用，“混合”，例如，“将本申请的风味组合物或其组合与食品混合”，是指在产品形成期间或在这些步骤的某些组合中，风味组合物或风味组合物的各个组分与完整的产品混合或添加到完整的产品中或者与产品的一些或所有组分混合的方法。当在混合的背景下使用时，术语“产品”是指产品或它的任意组分。该混合步骤可包括选自以下步骤的过程：将风味组合物添加到产品中，将风味组合物喷洒在产品上，将风味组合物涂覆在产品上，将产品悬浮在风味组合物中，将风味组合物涂在产品上，将风味组合物粘在产品上，用风味组合物包封产品，将风味组合物与产品混合及它们的任意组合。风味组合物可以是液体、乳液、干粉、喷雾剂、糊剂、悬浮剂及它们的任意组合。
在某些实施方案中，风味组合物的化合物可以在宠物食品的加工例如灭菌、干馏和/或挤出的过程中从宠物食品中存在的前体化合物产生。在某些实施方案中，风味组合物的化合物可以在宠物食品的加工过程中产生，并且可以通过混合将风味组合物的其它组分添加到宠物食品中。
如本文所用，“ppm”表示百万分率并且是重量相对参数。百万分之一是微克每克，使得以10ppm存在的组分是以每1克聚集混合物10微克的特定组分存在。
如本文所用，“适口性”可以指动物食用某种食品的总体意愿。增加宠物食品的“适口性”可以导致伴侣动物享受和接受宠物食品的增加，以确保动物食用“健康量”的宠物食品。如本文所用的术语宠物食品的“健康量”是指使伴侣动物能够维持或实现有助于其在微量营养素、大量营养素和热量方面的总体健康的摄入，如在“玛氏宠物护理必需营养标准(Mars Petcare Essential Nutrient Standards)”中列出的。在某些实施方案中，“适口性”可以指动物对一种食品相对于另一种食品的相对偏好。例如，当动物对两种或更多种食品中的一种显示偏好时，优选的食品更“可口”，并且具有“增强的适口性”。在某些实施方案中，一种食品相对于一种或多种其它食品的相对适口性，可以例如通过并排的自由选择比较来确定，例如通过食品的相对消耗或指示适口性的其它适当的偏好测定。适口性可以通过标准测试方案来确定，其中动物可以同等地获得两种食品，如称为“双碗测试(two-bowltest)”或“对比测试(versus test)”的测试。这种偏好可以来自任何的动物感觉，但是尤其可以与味道、余味、气味、口感和/或质地有关。
术语“宠物食物”或“宠物食品”是指供伴侣动物(如猫、狗、豚鼠、小鼠、兔、鸟和马)食用的产品或组合物。例如，但不作为限制，伴侣动物可以是“家养”猫，如家猫(Felisdomesticus)。在某些实施方案中，伴侣动物可以是“家养”狗，如家犬(Canis lupusfamiliaris)。“宠物食物”或“宠物食品”可包括任何食物、饲料、小吃、食品补充剂、液体、饮料、零食、玩具(可咀嚼和/或可食用的玩具)、膳食替代品或膳食替代物。
如本文所用，“营养全面”是指基于例如伴侣动物营养领域中的公认或主管当局的建议以适当的量和比例包含宠物食品的预期接受者的所有已知所需营养物的宠物食品。因此，这样的食物能够用作膳食摄入的唯一来源以维持生命，而无需添加补充营养来源。
如本文所用，“风味组合物”是指在动物或人类中调节(包括增强、增加、加强、减少、抑制或诱导)天然或合成的促味剂、风味剂、味觉谱、风味谱和/或质地谱的味道、气味、风味和/或质地的至少一种化合物或其生物学上可接受的盐。在某些实施方案中，风味组合物包含化合物或其生物学上可接受的盐的组合。在某些实施方案中，风味组合物包含一种或多种赋形剂。
如本文所用，术语“调节”或“修改”是指受体的量、质量或特定活性的效应的增加或减少，和/或受体的表达、活性或功能的增加或减少。如本文所用，“调节剂”是指使用例如激动剂、拮抗剂及它们的同源物包括片段、变体和模拟物的计算机模拟(in silico)、体外和/或体内测定鉴定的任何抑制性或活化性化合物。
如本文所用，“抑制剂”或“拮抗剂”是指降低、减少、阻断、阻止、延迟激活、失活、脱敏或下调目标受体的生物活性和/或表达或目标途径的调节化合物。
如本文所用，“诱导剂”、“活化剂”或“激动剂”是指增加、诱导、刺激、打开、激活、促进、增强激活、敏化或上调目标受体或途径的调节化合物。
在某些实施方案中，“活性化合物”是调节钙敏感受体，即对钙敏感受体具有活性的化合物。例如，活性化合物可以作为激动剂、拮抗剂、正变构调节剂(positiveallosteric modular，PAM)、负变构调节剂或通过显示活性的混合(例如，作为激动剂活性以及正变构调节活性或激动剂活性以及负变构调节活性)来对钙敏感受体具有活性。
如本文所用，术语“载体”和“表达载体”是指线性或环状的DNA分子，其中可以并入适当大小的另一DNA序列片段。这样的一个或多个DNA片段可以包括提供由DNA序列片段编码的基因的转录的额外区段。额外区段可以包括但不限于：启动子、转录终止子、增强子、内部核糖体进入位点、非翻译区、多聚腺苷酸化信号、选择标记物、复制起点等。表达载体通常衍生自质粒、粘粒、病毒载体和酵母人工染色体。载体通常是含有来自几种来源的DNA序列的重组分子。
术语“可操作地连接”当应用于例如表达载体中的DNA序列时，指示序列被排列为使得它们协同作用以实现它们的预期目的，即启动子序列允许启动转录，转录通过连接的编码序列继续直到终止信号。
本文所用的术语“核酸分子”和“核苷酸序列”是指单链或双链共价连接的核苷酸序列，其中每个核苷酸上的3′和5′末端通过磷酸二酯键连接。核酸分子可以包括脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基，并且可以在体外合成制备或从天然来源分离。
本文可互换使用的术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”是指由至少两个氨基酸的连接形成的分子。一个氨基酸残基与下一个氨基酸残基之间的键是酰胺键，并且有时被称为肽键。多肽可以通过本领域已知的合适方法获得，包括从天然来源分离，在重组表达系统中表达，化学合成或酶促合成。该术语可适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
本文所用的术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及随后被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物和衍生物可以指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团键合的碳，所述R基团例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸甲基锍。此类类似物可具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构，但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的结构的化合物。
本文可互换使用的术语“分离的”或“纯化的”是指从与其天然相关的组分中除去的核酸、多肽或其它生物部分。术语“分离的”可以指与整个生物体分离和分开的多肽，该分子天然存在或在基本上不存在相同类型的其它生物大分子的情况下存在。关于多核苷酸的术语“分离的”可以指完全或部分缺乏通常天然与其相关的序列的核酸分子；或天然存在的但具有与其相关的异源序列的序列；或从染色体分离的分子。
如本文所用，术语“重组”可用于描述核酸分子，并且是指基因组、RNA、DNA、eDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸，其由于其来源或操作与其天然相关的全部或部分多核苷酸不相关。
本文所用的术语“融合”是指通过遗传或化学方法连接不同的肽或蛋白质区段，其中肽或蛋白质区段的连接端可以彼此直接相邻，或者可以通过接头或间隔区部分诸如氨基酸残基或其它连接基团分离。
术语“烷基”是指直链或支链的C1-C20烃基，其仅由碳和氢原子组成，不含不饱和，并且通过单键，例如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1，1-二甲基乙基(叔丁基)，与分子的其余部分连接。
术语“环烷基”表示不饱和的非芳族单或多环烃环系(含有，例如C3-C6)，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基。多环环烷基(含有例如C6-C15)的实例包括全氢萘基(perhydronapththyl)、金刚烷基和降莰基，桥连环状基团，或螺环双环基团，例如螺(4，4)壬-2-基。
2.钙敏感受体(CaSR)
本发明公开的主题提供用于所公开方法中的钙敏感受体。本公开的钙敏感受体可包括用于鉴定厚味味道活性化合物的哺乳动物钙敏感受体，例如但不限于猫、犬和人钙敏感受体。
在某些非限制性实施方案中，本公开的钙敏感受体由2015年10月12日提交的国际申请号PCT/US15/55149描述的核酸编码，其全部内容通过引用并入本文。在某些非限制性实施方案中，本公开的钙敏感受体包含2015年10月12日提交的国际申请号PCT/US15/55149所述的氨基酸序列。
在某些非限制性实施方案中，钙敏感受体包括2015年10月12日提交的国际申请号PCT/US15/55149所述的猫、犬或人钙敏感受体核苷酸序列。
在某些非限制性实施方案中，钙敏感受体包括2015年10月12日提交的国际申请号PCT/US15/55149所述的猫、犬或人钙敏感受体氨基酸序列。
在某些实施方案中，用于本发明公开主题的钙敏感受体可包括受体，所述受体包含与猫、犬或人钙敏感受体核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的核苷酸序列。
在某些实施方案中，用于本发明公开主题的钙敏感受体可包括受体，所述受体包含与猫、犬或人钙敏感受体核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所公开的主题提供分离的或纯化的钙敏感受体和/或其变体和片段的用途。所公开的主题还包括序列变体的用途。在某些实施方案中，变异可以发生在钙敏感受体的核苷酸序列的编码区和非编码区中的任一个或两个中。变体可包括由生物体中相同遗传基因座编码的基本上同源的蛋白质，即等位基因变体。变体还包括衍生自生物体例如猫中其它遗传基因座的蛋白质，但与钙敏感受体具有基本同源性，即同源物。变体还可以包括与钙敏感受体基本上同源但是衍生自另一种生物体的蛋白质，即直向同源物。变体还包括与通过化学合成产生的钙敏感受体基本同源的蛋白质。变体还包括通过重组方法产生的与钙敏感受体基本同源的蛋白质。
所公开的主题还提供了包含钙敏感受体或其片段的融合蛋白。在某些实施方案中，本公开的融合蛋白可包括可检测标记、功能基团如载体、标记、稳定序列或可通过其检测钙敏感受体激动剂结合的机制。标记的非限制性实施方案包括FLAG标签、His标签、MYC标签、麦芽糖结合蛋白和本领域已知的其它标签。本发明公开的主题还提供了编码这种融合蛋白的核酸、含有编码融合蛋白的核酸的载体和包含这种核酸或载体的宿主细胞。在某些实施方案中，可以在钙敏感受体的氨基末端(N-末端)或钙敏感受体的羧基末端(C-末端)进行融合。
在某些实施方案中，本文公开的钙敏感受体可以在序列的N-末端和/或C-末端含有额外的氨基酸，例如当用于所公开的主题的方法时。在某些实施方案中，额外的氨基酸可以帮助固定用于筛选目的的多肽，或者允许多肽是如上所述的融合蛋白的一部分，以便于检测生物活性。
3.钙敏感受体调节化合物
本公开涉及包含至少一种可以调节钙敏感受体(CaSR)活性的化合物的风味组合物。本文公开的化合物通过体外测定法鉴定，其中测定化合物激活培养物中由细胞表达的猫CaSR的能力，和/或通过计算机模拟鉴定，其中通过计算机模拟测定化合物结合CaSR的能力。风味组合物可用于增强或改变宠物食品的适口性、味道或风味。在某些实施方案中，本文所述的风味组合物可以以各种递送系统形式添加到宠物食品组合物中。风味组合物可包括化合物的组合，例如，一种或多种化合物和/或一种或多种氨基酸和/或一种或多种核苷酸和/或一种或多种呋喃酮的组合，如本文和2013年10月31日提交的国际申请号PCT/EP2013/072788、2013年10月31日提交的国际申请号PCT/EP2013/072789、2013年10月31日提交的国际申请号PCT/EP2013/072790、2013年10月31日提交的国际申请号PCT/EP2013/072794中所述；和/或一种或多种鲜味受体活化跨膜化合物，如本文和2015年12月10日提交的国际申请号PCT/US15/65036中所述；和/或一种或多种核苷酸衍生物，如本文和2015年12月10日提交的国际申请号PCT/US15/65046中所述；和/或一种或多种脂肪酸受体(GPR120)活性化合物，如本文和2015年12月10日提交的国际申请PCT/US15/65106中所述；其全部内容通过引用并入本文。
在某些实施方案中，本申请的钙敏感受体调节化合物(可称为钙敏感受体调节剂)通过钙敏感受体例如猫钙敏感受体的计算机模拟建模来鉴定，其中本申请的钙敏感受体调节剂包含适合钙敏感受体结合位点的结构。在某些实施方案中，计算机模拟方法包括本文和本申请的实施例部分中描述的计算机模拟方法。
在某些实施方案中，本申请的钙敏感受体调节剂通过体外方法鉴定，例如，其中钙敏感受体激动剂化合物激活和/或调节在体外由细胞表达的本文公开的钙敏感受体。在某些实施方案中，体外方法包括本文和本申请的实施例部分所描述的体外方法。
在某些实施方案中，化合物包含在风味组合物中而没有其它适口性增强剂。在某些实施方案中，所述化合物与一种或多种另外的适口性增强剂包含在一种或多种风味组合物中，所述另外的适口性增强剂例如本文所述的核苷酸、核苷酸衍生物、氨基酸、呋喃酮、脂肪酸受体活化化合物和鲜味受体活化跨膜化合物，其活化不同受体(例如，鲜味受体)上的不同活性位点。
图1提供了钙敏感受体二聚体的图示。图2提供了钙敏感受体单体的图示，并突出显示了两个结合结构域：捕蝇草(VFT)结构域和7跨膜(7TM)结构域。图2进一步示出每个结构域中的活性位点。钙敏感受体调节化合物，可以称为钙敏感受体调节剂，将参考它们相互作用的结构域进行描述。
3.1 CaSR捕蝇草结构域结合化合物
本公开涉及风味组合物，其包含至少一种钙敏感受体调节化合物，其可以与受体的捕蝇草(VFT)结构域相互作用(例如，结合)。在某些实施方案中，这种与钙敏感受体的VFT结构域的相互作用激动钙敏感受体。在其它实施方案中，化合物与其它钙敏感受体激动剂或调节剂协同作用以调节钙敏感受体的活性。在其它实施方案中，与钙敏感受体的VFT结构域的相互作用拮抗钙敏感受体。在某些实施方案中，该化合物增强钙敏感受体激动剂激活受体的能力(即该化合物起正变构调节剂的作用)。
在某些实施方案中，化合物与VFT结构域中的一个或多个氨基酸相互作用，例如Asn64、Phe65、Asn102、Thr145、Ser147、Ala168、Ser169、Ser170、Asp190、Gln193、Asp216、Tyr218、Ser272、Glu297、Ala298、Trp299、Ala300、Ser302、Leu304、Tyr411、Thr412和His413中的一种或多种。因此，在某些实施方案中，钙敏感受体调节化合物可基于其与这些残基中的一种或多种的相互作用来鉴定和/或定义。
3.1.1二价和三价金属盐
在某些实施方案中，风味组合物包含第II族元素的二价或三价盐。例如，第II族元素可以是铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)或钡(Ba)。在某些实施方案中，第II族元素是镁(Mg)。在某些实施方案中，第II族元素是锶(Sr)。在其它某些实施方案中，第II族元素不是Mg或Sr。在某些实施方案中，第II族元素不是钙(Ca)。
在某些实施方案中，至少一种钙敏感受体调节化合物是镧系元素的二价或三价盐。例如，镧系元素可以是镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)或镏(Lu)。在某些实施方案中，镧系元素是钆(Gd)。在某些实施方案中，镧系元素是镨(Pr)。在某些实施方案中，镧系元素是铽(Tb)。在某些实施方案中，镧系元素不是钆(Gd)、镨(Pr)或铽(Tb)。
3.1.2含磷化合物
在某些实施方案中，风味组合物包含式Vft-6.5a、Vft-6.5b或Vft-6.5c的含磷化合物：
其中Vft-6.5a具有以下结构：
Vft-6.5b具有以下结构：
Vft-6.5c具有以下结构：
其中在Vft-6.5a、Vft-6.5b和Vft-6.5c中：
n为1、2或3，
n1为0、1、2、3或4，
R3、R4、R5、R6各自独立地为H、低级烷基(C1-C6支链或非支链)、芳烷基(即CH2Ph)、芳基、苯基(Ph)、杂芳基或P(＝X3)OR7R8；
R7和R8各自独立地为H、低级烷基(C1-C6支链或非支链)、芳烷基(即CH2Ph)、芳基、Ph或杂芳基；
R1和R2各自独立地为H、CH3、低级烷基C1-C6、杂芳基、(CH2)n1芳基或(CH2)n1杂芳基；
R独立地为H、OH、CH3、低级烷基C1-C6、杂芳基、(CH2)n1芳基、(CH2)n1杂芳基、CH2CH＝CH、低级烯烃或低级炔烃；并且
X1、X2、X3各自独立地为O或S。
3.1.3 α-氨基酸I
在某些实施方案中，风味组合物包含式Vft-1a或Vft-1b的化合物：
其中n的范围为1至6；
其中n6和n7各自独立地为1或2；
其中X1和X2独立地为氧或硫；
其中R1和R2独立地选自由H、CH3、支链或非支链低级烷基(C1-C8)、(CH2)n2芳基、(CH2)n2杂芳基、芳基、杂芳基、c-C3H5、c-C4H7、c-C5H9、c-C6H11和(CH2)n3环烷基(C3-C6)组成的组；
其中Y、R3和R4、R7和R8独立地选自由H、CH3和支链或非支链低级烷基(C1-C10)组成的组；
其中R5和R6独立地选自由H、OH、支链或非支链低级烷基(C1-C6)、O(CH2)n4芳基、O(CH2)n4杂芳基、NR7R8、N(R9)OH、芳基和杂芳基组成的组；
其中R9、R11、R12和R13独立地等于H、CH3、支链或非支链的低级烷基(C1-C10)；
其中n2、n3和n4独立地在0至4的范围内；
其中n5是0、1或2；
在式Vft-1a和Vft-1b中，支链和非支链芳基和烷基可任选地被CH3、OH、SH、OCH3、SCH3、COOH、COOR13、S(O)n4R1、C(O)R11、C(O)NR11R12、CN、NR11R12、NR11C(O)R12、芳基、亚甲二氧基、烷基(C1-C5)、CH2SSCH2CH(COOH)(NH2)、卤素(包括F、C1、Br或I)、NO2、NHC(＝NH)NH2、CHO、CF3、P(＝X1)(OR1)2和OP(＝X1)(OR1)2中的一种或多种取代。
式Vft-1a和Vft-1b包括(R)和(S)立体异构体。在某些实施方案中，该化合物是(R)立体异构体。在某些实施方案中，化合物是(S)立体异构体。
在某些实施方案中，风味组合物包含L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸和L-赖氨酸中的至少一种。
在某些实施方案中，风味组合物不包含L-天冬氨酸，L-谷氨酸，L-精氨酸和L-赖氨酸中的至少一种。
3.1.4 α-氨基酸II
在某些实施方案中，风味组合物包含具有以下结构的式Vft-2的化合物：
其中n的范围为0至6；
其中W选自由CR6R7、O、S、S(O)n2、Se、Se(O)n2、P(X2)(OR1)2、OP(X2)(OR1)2、NH2、NHC(＝NH)NH2、苯基(Ph)、吲哚和杂芳基组成的组；
其中X1选自由H、CH3、低级烷基(C1-C6)、(CH2)n3芳基、(CH2)n3杂芳基、芳基、杂芳基、OH、NR1R2、NH(＝C)NR1R2、苯基、对羟基苯基、吲哚、SR1、OR1、COOR1、S(O)n2、四唑、咪唑、P(＝X2)(OR1)2和OP(＝X2)(OR1)2组成的组；
其中X2是氧或硫；
其中R1和R2独立地选自由H、支链或非支链低级烷基(C1-C8)、(CH2)n2芳基、(CH2)n2杂芳基、芳基、杂芳基、c-C3H5、c-C4H7、c-C5H9、c-C6H11和(CH2)n3环烷基(C3-C6)组成的组；
其中R3、R4、R6、R7、R11、R12和R13独立地选自由H、CH3、支链和非支链低级烷基(C1-C10)组成的组；
其中R5选自由H、OH、支链或非支链低级醇盐(C1-C6)、OCH3、OEt、OCH2Ph、O烷基(C1-C6)、O(CH2)n4芳基、O(CH2)n4杂芳基、NR6R7、N(R8)OH、O-芳基和O-杂芳基组成的组；
其中R8是H或CH3；其中n2的范围为0至2；和
其中n3和n4独立地范围为0至4。
芳基和烷基(支链和非支链两者)基团可任选被CH3、OH、SH、OCH3、SCH3、COOH、COOR13、S(O)n2R1、C(O)R11、C(O)NR11R12、CN、NR11R12、NR11C(O)R12、芳基、亚甲二氧基、烷基(C1-C5)、CH2SSCH2CH(COOH)(NH2)、卤素(F、C1、Br、I)、NO2、NHC(＝NH)NH2、CHO、CF3、P(＝X2)(OR1)2、或OP(＝X2)(OR1)2；R11、R12和R13独立地为H、CH3、支链或非支链的低级烷基(C1-C10)取代；
式Vft-2包括(R)和(S)立体异构体。在某些实施方案中，化合物是(R)立体异构体。在某些实施方案中，化合物是(S)立体异构体。
在某些实施方案中，风味组合物包含L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸和Se-(甲基)硒代半胱氨酸中的至少一种。
在某些实施方案中，风味组合物不包含L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸和Se-(甲基)硒代半胱氨酸中的至少一种。
3.1.5γ-谷氨酰基和β-天冬氨酰二肽和三肽
在某些实施方案中，风味组合物包含具有以下结构的式Vft-3的化合物：
其中n为0或1，使得当n1为0时，不存在AA2；
其中AA1-(AA2)n1独立地是下面3.1.6部分中列出的任意氨基酸；
其中n的范围为0至6；
其中n1和n2独立地范围为0至3；
其中n3的范围为0至2；
其中n4的范围为1至6；
其中n5的范围为0至3。
另外，AA1至(AA2)n是具有以下结构的式Vft-3b的氨基酸：
其中W选自由O、S、S(O)n3、Se、Se(O)n3、OP(O)(OH)2、NR1R2、CR1R2、CH2组成的组；
其中R1、R2、R3、R4选自由H、CH3、低级烷基(C1-C6)、(CH2)n2吲哚、(CH2)n2芳基、(CH2)n2杂芳基和OH、COOH组成的组；
其中R5选自由H、CH3、低级烷基(C1-C6)、C(O)C1-C6、C(O)芳基、C(O)杂芳基、C(O)OC1-C6、C(O)CH(OH)CH3、C(O)OCH2芳基、(CH2)n2吲哚、(CH2)n2芳基、(CH2)n2杂芳基、亚硝基和OH、芳基、吲哚组成的组，
其中n2的范围为0至2；
其中如果AA1或AA2含有硫或硒，则可以氧化氨基酸以提供S(O)n2或Se(O)n2，以及亚硝基类物质，如S(N＝O)或Se(N＝O)；和
其中如果AA1或AA2含有硫或硒，则可在硫或硒上烷基化氨基酸。
在式Vft-3中，支链和非支链芳基和烷基可任选地被甲基、OH、SH、OCH3、SCH3、COOH、COOR13、S(O)n3R1、C(O)R11、C(O)NR11R12、CN、NR11R12、NR11C(O)R12、芳基、亚甲二氧基、烷基(C1-C5)、CH2SSCH2CH(COOH)(NH2)、卤素(包括F、Cl、Br或I)、NO2、NHC(＝NH)NH2、CHO、CF3、P(＝X1)(OR1)2和OP(＝X1)(OR1)2中的一种或多种取代；
其中R11、R12和R13独立地等于H、CH3、支链或非支链的低级烷基(C1-C10)。式Vft-3包括(R)和(S)立体异构体。在某些实施方案中，化合物是(R)立体异构体。在某些实施方案中，化合物是(S)立体异构体。
在双官能团氨基酸(bifunctional amino acids)例如天冬氨酸和谷氨酸的情况下，酰胺键形成在α羧酸基团(alpha carboxylate)或侧链羧酸基团(side-chaincarboxylate)属于本发明的范围内。
在某些实施方案中，风味组合物包含选自由γ-Glu-Val、γ-Glu-Tyr、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Phe和γ-D-Glu-Trp组成的组的γ-谷氨酰二肽。在某些实施方案中，风味组合物包含选自由以下组成的组的γ-谷氨酰三肽：视晶酸(γ-Glu-Abu-Gly)、γ-Glu-Val-Gly、S-甲基谷胱甘肽、S-(2-羟乙基)谷胱甘肽、3-谷胱甘肽-S-甲基吲哚、谷胱甘肽(γ-Glu-Cys-Gly)和S-乳酰基谷胱甘肽。在某些实施方案中，风味组合物包含选自由γ-Glu-Met、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Trp、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Abu、γ-Glu-γ-Glu-Glu、γ-Glu-γ-Glu-Gln组成的组的γ-谷氨酰肽。在某些实施方案中，风味组合物包含选自由β-Asp-Ala、β-Asp-Gly、β-Asp-Leu和β-Asp-Phe组成的组的β-天冬氨酰肽。
在某些实施方案中，风味组合物不包含一种或多种前述γ-谷氨酰肽。在某些实施方案中，风味组合物不包含一种或多种前述γ-谷氨酰三肽。
在某些实施方案中，式Vft-3如上定义，除了其不包括谷胱甘肽(γ-Glu-Cys-Gly)(例如，L-谷胱甘肽)、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Met、γ-Glu-Val、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Val-Gly、γ-Glu-Cys-Gly、γ-Glu-Val-Cys、γ-Glu-Val-Pro、γ-Glu-Val-Ser、γ-Glu-Val-Phe、γ-Glu-Val-Asn、γ-Glu-Ser-Gly、γ-Glu-Abu-Gly、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH2、γ-Glu-Val-醇、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys(S-Me)(O)、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leu和/或γ-Glu-Cys(S-Me)。
3.1.6其它氨基酸
在某些实施方案中，风味组合物包含下列氨基酸的一种或多种：甘氨酸、肌氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸(Pheylalanine)、高苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基丁酸(ABU)、硒代半胱氨酸、Se-(甲基)硒代半胱氨酸、鸟氨酸、硫代脯氨酸、青霉胺、5，5-二甲基噻唑烷-4-羧酸、二氨基丙酸和β-丙氨酸。在某些实施方案中，谷氨酸和天冬氨酸的酰胺键可以通过α-羧酸基团(alpha-carboxlate)或侧链羧酸基团(side-chain caboxylate)和/或两者形成。在某些实施方案中，可以将谷氨酸和天冬氨酸的游离羧酸基团(free caboxlate)酯化以提供低级烷基酯(甲基或乙基)。在某些实施方案中，可以将含有硫或硒的氨基酸氧化以提供S(O)n3和Se(O)n3，以及亚硝基类物质如S(N＝O)、Se(N＝O)。在某些实施方案中，还可以氧化含有硫或硒的氨基酸，以提供相应的同型二聚体和异二聚体二硫化物和二硒化物(diselenofide)。在某些实施方案中，那些含有硫或硒的氨基酸也可以在硫或硒上烷基化。
3.1.7多元肽
在某些实施方案中，风味组合物包含具有以下结构的式Vft-4的化合物：
其中n1的范围为1至550；
其中n2的范围为0至5；
其中R是NR1R2、C(＝N)NH2、NR1C(＝NR2)NR3R4或咪唑；
其中R1、R2、R3、R4独立地是H、CH3或低级烷基(C1-C6)。
由式Vft-4规定的本发明的多元肽可包含一种或多种单独的化合物(例如，在混合物中)，其中每种单独的化合物由式Vft-4规定。
在某些实施方案中，化合物包含聚精氨酸、聚赖氨酸和聚鸟氨酸中的至少一种。
在某些实施方案中，化合物不包含聚精氨酸、聚赖氨酸和聚鸟氨酸中的至少一种。
在某些实施方案中，风味组合物包含具有以下结构的式Vft-5的化合物：
R1-AAn-R2，
其中n为1-550；
其中每个AA独立地选自3.1.6部分中规定的氨基酸；
其中R1选自由H、C(＝O)低级烷基(C1-C6)、苄氧羰基(Cbz)、C(＝O)O低级烷基(C1-C6)、C(O)芳基和本领域普通技术人员已知用于氮的其它保护基团组成的组；和
其中R2选自OH、NR2aR3a、OCH3、O(C1-C6)、OCH2芳基和C(CH3)3；
其中R2a和R3a独立地选自H、支链或非支链低级烷基(C1-C8)和CH2苯基。
在某些实施方案中，化合物包含聚精氨酸(例如聚-L-精氨酸)、聚赖氨酸(例如聚-L-赖氨酸)或聚鸟氨酸(例如聚-L-鸟氨酸)。
在某些实施方案中，式Vft-4如上定义，不同之处在于其不包括聚精氨酸(例如聚-L-精氨酸)、聚赖氨酸(例如聚-L-赖氨酸)和聚鸟氨酸(例如聚-L-鸟氨酸)。
3.1.8多胺
在某些实施方案中，风味组合物包含具有以下结构的式Vft-6的化合物：
其中n1至n6独立地在0至6的范围内，使得当n1至n6中的一个或多个等于0时，其表示链终止；
其中R1至R12独立地选自由H、CH3、支链或非支链低级烷基(C1-C6)、CH2CH＝CH2、芳基、苯基、CH2芳基和CH2Ph组成的组；
其中Ra至Rf独立地选自H、CH3、支链或非支链的低级烷基(C1-C6)、CH2CH＝CH2、芳基、苯基、CH2芳基、CH2Ph和(CR13R14)n7NR15R16；
其中n7的范围为2至6；
其中R13和R14独立地选自由H、CH3、支链或非支链低级烷基(C1-C6)、CH2CH＝CH2、芳基、苯基、CH2芳基和CH2Ph组成的组；
其中R15和R16独立地选自由H、CH3、支链或非支链低级烷基(C1-C6)、CH2CH＝CH2、芳基、苯基、CH2芳基和CH2Ph组成的组；和
其中，任选地，式Vft-6的化合物包含环状结构，其中虚线表示两个末端原子之间的共价键。
在某些实施方案中，风味组合物包含式Vft-6化合物的直链形式。在某些实施方案中，风味组合物包含式Vft-6的化合物的环状形式。
在某些实施方案中，式Vft-5如上定义，不同之处在于其不包括亚精胺、精胺和腐胺中的一种或多种。
3.1.9氨基糖苷类抗生素
在某些实施方案中，风味组合物包含氨基糖苷类抗生素。例如，氨基糖苷类抗生素可选自由新霉素、妥布霉素、庆大霉素、核糖霉素(ribosamycin)、巴龙霉素和抗生素遗传霉素(Antibiotic GENETICIN)组成的组。对于进一步的实例，氨基糖苷类抗生素可以选自由阿米卡星、链霉素、新霉胺(Neamine)、巴龙霉胺(Paromamine)、安普霉素、丁苷菌素B、利维霉素A、卡那霉素A、卡那霉素B、卡那霉素C、妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素C1、庆大霉素C2、遗传霉素、西索米星、阿贝卡星、阿司米星、卡那霉素B、地贝卡星、二双氢链霉素、爱萨霉素(Elsamitruein)、潮霉素B、异帕米星、春日霉素、莱高霉素(Legomycin)、利维霉素(Lividomycin)、小诺米星、新霉胺、新霉素、奈替米星、诺尔丝菌素、普拉佐米星(Plazomicin)、妥布霉素、妥妥霉素(Totomycin)和威达米星(Verdamicin)，
在某些实施方案中，氨基糖苷类抗生素是庆大霉素、妥布霉素、核糖霉素、巴龙霉素或抗生素遗传霉素。在某些实施方案中，氨基糖苷类抗生素不是新霉素。
3.1.10与CaSR VFT结构域的相互作用
在某些实施方案中，风味组合物包含与CaSR的VFT结构域的活性位点相互作用的化合物。例如，VFT结构域的铰链区处的配体配位(参见图2)可以引起在下组氨基酸中的一个或多个位置的相互作用：Tyr218、Thr145、Ser147、Ala168、Ser170、Asp190、Glu297、Ala298和Ser272。例如，Asp190和Glu297可以在配体上两性离子和其它氮的结合中起作用；例如，活性氨基酸、γ-谷氨酰二肽和三肽以及含有碱性氮的其它化合物中的氮。
另外，较长的配体可以进一步远离铰链区延伸，引起其它特异性相互作用，例如，直到His413、Thr412和Trp299。这也可以产生与Asn64、Phe65、Asn102、Ser169、Gln193、Asp216、Ala300、Ser302、Leu304和/或Tyr411的接触。
在某些实施方案中，结合VFT结构域的铰链区的活性化合物，例如激动剂或正变构调节剂，可以帮助协调Ca2+与Ca+2的主要结合位点处的铰链区的结合。在某些实施方案中，此类主要结合位点不是VFT结构域的铰链区处Ca+2的唯一结合位点。
因此，在某些实施方案中，风味组合物包含含有两性离子或碱性氮的化合物。这种化合物可与Asp190和/或Glu297形成相互作用。
在某些实施方案中，风味组合物包含在VFT结构域的铰链区形成两种以上相互作用的化合物。至少一种相互作用可以是Tyr218、Thr145、Ser147、Ala168、Ser170、Asp190、Glu297、Ala298和/或Ser272。在某些实施方案中，两种或更多种相互作用是针对Tyr218、Thr145、Ser147、Ala168、Ser170、Asp190、Glu297、Ala298和/或Ser272。在某些实施方案中，所有相互作用是针对Tyr218、Thr145、Ser147、Ala168、Ser170、Asp190、Glu297、Ala298和/或Ser272。
在某些实施方案中，风味组合物包含含有两性离子或碱性氮的化合物，所述两性离子或碱性氮与Asp190和/或Glu297形成一种或多种相互作用，并进一步与Tyr218、Thr145、Ser147、Ala168、Ser170、Asp190、Glu297、Ala298和/或Ser272形成两种以上的相互作用。
在某些实施方案中，风味组合物包含在VFT结构域的铰链区处形成相互作用的化合物，其中两种或更多种相互作用是Asp190、Glu297、Tyr218、Thr145、Ser147、Ala168、Ser170、Asp190、Glu297、Ala298和/或Ser272，并且另外两种或更多种相互作用是针对Tyr218、Thr145、Ser147、Ala168、Ser170、Asp190、Glu297、Ala298和/或Ser272。
在某些实施方案中，风味组合物包含与VFT结构域的铰链区形成两种或更多种相互作用的化合物，其中两种或更多种相互作用是针对Asp190、Glu297、Tyr218、Thr145、Ser147、Ala168、Ser170、Asp190、Glu297、Ala298和Ser272，并且该化合物还有助于协调与VFT结构域的铰链区结合的Ca+2离子。
3.2 CaSR 7跨膜结构域结合化合物
本公开进一步涉及风味组合物，其包含至少一种钙敏感受体调节化合物，其可以与受体的7跨膜(7TM)结构域相互作用(例如，结合)。在某些实施方案中，与钙敏感受体的7TM结构域的这种相互作用激动钙敏感受体。在其它实施方案中，化合物与其它钙敏感受体激动剂或调节剂协同作用以调节钙敏感受体的活性。在其它实施方案中，与钙敏感受体的7TM结构域的相互作用拮抗钙敏感受体。在某些实施方案中，该化合物增强钙敏感受体激动剂激活受体的能力(即该化合物起正变构调节剂的作用)。
在某些实施方案中，化合物与7TM结构域中的一个或多个氨基酸相互作用，例如，受体的螺旋3、4、5、6和/或7中的一个或多个氨基酸。在螺旋3上，活性位点的残基包括Phe684、Gly685和Phe688。在螺旋4上，活性位点的残基包括Gln735。在螺旋5上，活性位点的残基包括Met771、Ala772、Phe775、Leu776和Thr780。在螺旋6上，活性位点的残基包括Phe814、Va1817、Trp818和Phe821。在螺旋7上，活性位点的残基包括Glu837、Ala840和Ile841。因此，在某些实施方案中，钙敏感受体调节化合物可基于其与一种或多种这些残基的相互作用来鉴定和/或定义。
3.2.1拟钙剂
在某些实施方案中，风味组合物包含一种或多种拟钙剂。在某些实施方案中，拟钙剂包含4-氯-N-[(1S，2S)-2-[[(1R)-1-(1-萘基)乙基]氨基]环己基]-苯甲酰胺盐酸盐(4-Chloro-N-[(1S，2S)-2-[[(1R)-1-(1-naphthalenyl)ethyl]amino]cyclohexyl]-benzamide hydrochloride)。在某些实施方案中，拟钙剂包含2-氯-6-[(2R)-3-([1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基]氨基)-2-羟基丙氧基]苄腈(2-chloro-6-[(2R)-3-([1，1-dimethyl-2-(2-naphthaleny)ethyl]amino)-2-hydroxypropxy]benzonitrile)。
在某些实施方案中，拟钙剂可具有表1中的式Tm-1至Tm-12中任一种的结构。
表1.拟钙化合物的结构
在Tm-1至Tm-12中，G1至G4独立地为C(R4aR4b)、N(R4)、S或O；
W是OR4或SR4；
X是NR1R2、CR1R2、O或S；
X1至X10独立地为C或N；
X11是C、O、N或S；
X12是O、NH或S；
X13是CR4aR4b、O、N(R12)或S；
Z是H、O、N、S或C；
n1、n2和n3独立地在0至4的范围内，使得当n1或n2为0时，它表示化学键；
n4的范围为0至2；
n5的范围为1至3；
R1、R1a、R1b和R1c独立地选自由H、CH3、CF3、CBr3、支链或非支链低级烷基(C1-C6)、环烷基(C3-C6)、COOR13、C(O)NR16R17和SO2NR4aR4b组成的组；且
R2选自由CH3、CF3、CBR3、NO2、低级烷基(C1-C6)、环烷基(C3-C6)、芳基和杂芳基组成的组。
在Tm-1至Tm-12中，环A和B是任何芳基或杂芳基环，其可以独立地被官能团R3和/或R7取代。R3和R7可以独立地选自由H、OH、支链或非支链低级烷基(C1-C6)、O(CH2)n3芳基、O(CH2)n3杂芳基、NR10R11、N(R12)OH、芳基、杂芳基、甲基、OH、SH、OCH3、SCH3、COOH、COOR13、S(O)n4R14、C(O)R15、C(O)NR16R17、CN、NR18R19、NR20C(O)R21、芳基、亚甲二氧基、烷基(C1-C5)、CH2SSCH2CH(COOH)(NH2)、卤素(包括F、Cl、Br或I)、NO2、NHC(＝NH)NH2、CHO、CF3、P(＝X1)(OR1)2、OP(＝X1)(OR1)2、四唑、C(O)N(R12)OH、CF3、OR4、SR4、N＝C＝S、N＝C＝O、C(R4)＝C(R4a)R4b、(CH2)n1CH＝CH2、NHC(＝X12)NH2、NHC(＝X12)NHR4、SO2NR4aR4b和C CR4组成的组。
R4、R4a和R4b独立地选自由H、CH3、低级烷基(C1-C6)、环烷基(C3-C6)、苯基、芳基和杂芳基组成的组。
R5、R6、R8和R9独立地选自由H、CH3、支链或非支链低级烷基(C1-C10)、芳基、杂芳基、苯基、吡啶基、呋喃、吡喃、噻吩、(CH2)n芳基、(CH2)n杂芳基、四氢吡喃组成的组，其中n为0-4。当n为0时，这意味着化学键。
R10和R11独立地选自由H、CH3、低级烷基(C1-C6)、苯基组成的组。
R12是H或CH3。
R13选自由H、CH3、低级烷基(C1-C6)和CH2芳基组成的组。
R14选自由H、CH3、低级烷基(C1-C6)和OH组成的组。
R15选自由H、CH3、CF3、低级烷基(C1-C6)和苯基组成的组。
R16、R17、R18、R19、R20和R21各自独立地选自由H、CH3、低级烷基、苯基、CH2苯基和环烷基(C1-C6)组成的组。
R22选自由H、C(X)R4组成的组。当R22不存在时，环A为芳香族。
环A和环B独立地可以是饱和的或不饱和的。此外，环A和环B可独立地含有稠合的五元或六元饱和或不饱和环。例如，环B可以在X1和X2之间、X2和X3之间、X3和X4之间或X4和X5之间含有不饱和的六元环，产生例如萘环体系或其它稠环体系如苯并噻吩、苯并呋喃、2，3-二氢苯并呋喃、吲哚、环己基、喹啉、异喹啉、喹唑啉、喹喔啉和噌啉。同样地，环A可以在X6和X7之间、X7和X8之间、X8和X9之间或X9和X10之间含有饱和或不饱和的六元环，以提供一个或多个稠环系统。
J可选自由芳基、苯基、吡啶基、呋喃、噻吩、吡咯、苯并噻吩、苯并噻唑、苯并咪唑、苯并[d]唑、苯并呋喃、吲哚、喹啉、异喹啉、喹唑啉、喹喔啉、噌啉、噻唑并[4，5-c]吡啶、噻唑并[5，4-d]嘧啶、唑并[5，4-d]嘧啶和唑并[5，4-b]吡啶组成的组。
芳基1可选自由苯基、呋喃、噻吩、吡咯、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、吲哚、喹啉、异喹啉、杂芳基和芳基组成的组。
Q可选自由芳基、杂芳基、环烷基(C1-C7)和茚满基组成的组。
烷基和环烷基可任选地具有以下连接的官能团：H、OH、NR10R11、N(R12)OH、芳基(aryl)、杂芳基、甲基、OH、SH、OCH3、SCH3、COOH、COOR13、S(O)n4R14、C(O)R15、C(O)NR16R17、CN、NR18R19、NR20C(O)R21、芳基(aryl)、卤素(包括F、Cl、Br、I)、NO2、NHC(＝NH)NH2、CHO、CF3、P(＝X1)(OR1)2、OP(＝X1)(OR1)2、CF3、OR4、SR4、C(R4)＝C(R4a)R4b、(CH2)n1CH＝CH2、NHC(＝X12)NH2、NHC(＝X12)NHR4和SO2NR4aR4b。
在某些实施方案中，具有式Tm-1或式Tm-2结构的拟钙剂选自N-(1-(4-氯苯基)乙基)-3-(4-甲氧基苯基)-6-甲基庚-1-胺、N-(1-(4-氯苯基)乙基)-3-(呋喃-2-基)-3-(对甲苯基)丙-1-胺、N-(1-(4-氯苯基)乙基)-3-(4-异丙氧基苯基)-3-苯基丙-1-胺、N-(1-(4-氯苯基)乙基)-3-(4-甲氧基苯基)-4-甲基戊-1-胺、N-(1-(4-氯苯基)乙基)-3-(4-异丙氧基苯基)-3-(2-甲氧基苯基)丙-1-胺、3-(呋喃-2-基)-3-苯基-N-(1-苯基乙基)丙-1-胺、N-(1-(4-氯苯基)乙基)-3-(呋喃-2-基)-3-(2-甲氧基苯基)丙-1-胺、N-(1-(4-氯苯基)乙基)-3-(4-异丙氧基苯基)-6-甲基庚-1-胺、N-(1-(4-氯苯基)乙基)-3-(4-异丙氧基苯基)-4-甲基戊-1-胺、3-(呋喃-2-基)-N-(1-苯基乙基)-3-(对甲苯基)丙-1-胺、3-(2，2-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-3-苯基-N-(1-苯基乙基)丙-1-胺(3-(2，2-dimethyltetrahydro-2H-pyran-4-y1)-3-phenyl-N-(1-phenylethyl)propan-1-amine)、3-(呋喃-2-基)-N-(1-(噻吩-2-基)乙基)-3-(对甲苯基)丙-1-胺和N-(1-(4-氯苯基)乙基)-3-(呋喃-2-基)-4-苯基丁-1-胺。
在某些实施方案中，具有式Tm-2结构的拟钙剂是3-(呋喃-2-基)-4-苯基-N-(1-苯基乙基)丁-1-胺或N-(1-(1H-吲哚-2-基)乙基)-1-(3，4-二甲基苯基)乙胺。
在某些实施方案中，具有式Tm-1、Tm-2、Tm-3或Tm-4结构的拟钙剂是西那卡塞。
在某些实施方案中，具有式Tm-1、Tm-2、Tm-3或Tm-4结构的拟钙剂不是西那卡塞。
在某些实施方案中，具有式Tm-2或Tm-5结构的拟钙剂是卡林多(Calindol)。
在某些实施方案中，具有式Tm-2或Tm-5结构的拟钙剂不是卡林多。
在某些实施方案中，具有式Tm-3结构的拟钙剂是6-溴-4-氟-N-(1-(吡啶-4-基)乙基)-2，3-二氢-1H-茚-1-胺或2-(3-氰基苯基)-2-((4-氟-2，3-二氢-1H-茚-1-基)氨基)乙酸甲酯。
在某些实施方案中，具有式Tm-4结构的拟钙剂是3-((8-氯-2，3，4，5-四氢苯并[b]氧杂-5-基)氨基)-2-(吡啶-2-基甲基)丙-1-醇(3-((8-chloro-2，3，4，5-tetrahydrobenzo[b]oxepin-5-y1)amino)-2-(pyridin-2-ylmethyl)propan-1-ol)。
在某些实施方案中，具有式Tm-5结构的拟钙剂是N-((2，3-二氢苯并呋喃-2-基)甲基)-1-(喹啉-2-基)乙胺。
在某些实施方案中，具有式Tm-6结构的拟钙剂是6-溴-4-氟-N-(1-(吡啶-4-基)乙基)-2，3-二氢-1H-茚-1-胺或2-(3-氰基苯基)-2-((4-氟-2，3-二氢-1H-茚-1-基)氨基)乙酸甲酯。
在某些实施方案中，具有式Tm-8结构的拟钙剂是3-苯基-1-(1，2，3，4-四氢萘-1-基)吡咯烷。
在某些实施方案中，具有式Tm-9结构的拟钙剂是2-(2-乙酰基-1，2-二氢异喹啉-1-基)-N-(1-(3-溴苯基)乙基)乙酰胺。
在某些实施方案中，具有式Tm-10结构的拟钙剂是1-(苯并[d]噻唑-2-基)-1-(2，4-二甲基苯基)乙醇或1-(4-氨基-2，5)-二甲氧基苯基)-1-(苯并[d]噻唑-2-基)-2，2，2-三氟乙醇。
在某些实施方案中，具有式Tm-11结构的拟钙剂是2，6-二氯-4-(1-(((1-甲基-2-(噻吩-2-基)哌啶-3-基)甲基)氨基)乙基)苯胺。
在某些实施方案中，具有式Tm-12结构的拟钙剂是1-(4-氯苯基)-N-(2-(2，2-二甲基-4-(对甲苯基)四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)乙胺。
在某些实施方案中，具有式Tm-1至Tm-12中任一个的结构的拟钙剂不包括一种或多种前述种类的拟钙化合物。
3.2.2与CaSR 7TM结构域的相互作用
在某些实施方案中，风味组合物包含与CaSR的7TM结构域的活性位点相互作用的化合物。例如，活性化合物例如结合7TM结构域的激动剂或正变构调节剂，可以形成从化合物到Glu837的盐桥或氢键。
可选地或另外地，活性化合物可经历环堆积相互作用。例如但不限于，环堆积相互作用可以是对于Phe821、Phe775、Trp818、Phe684和Phe688中的一种或多种。
在某些实施方案中，一种或多种活性化合物可以相互作用以填充活性位点，例如，通过与活性位点中的一个或多个残基形成疏水相互作用。例如，活性化合物可通过与上述螺旋3、4、5、6和/或7上的残基相互作用而填充活性位点。在某些实施方案中，所述一个或多个残基包括螺旋3上的Phe684、Gly685和/或Phe688，螺旋4上的Gln735，螺旋5上的Met771、Ala772、Phe775、Leu776和/或Thr780，螺旋6上的Phe814、Va1817、Trp818，和/或Phe821，和/或螺旋7上的Glu837、Ala840和/或Ile841。化合物可与任意螺旋组合上的任意数目的残基形成相互作用。例如，在某些实施方案中，化合物与螺旋3、4、5、6或7上的一个、两个、三个、四个、五个或更多个残基形成疏水相互作用。在某些实施方案中，化合物与螺旋5、6和7上的一个、两个、三个、四个、五个或更多个残基形成疏水相互作用，并与螺旋3、4和5上的一个、两个、三个、四个、五个或更多个残基形成疏水相互作用。
4.鉴定钙敏感受体调节化合物的方法
本公开还提供了鉴定调节钙敏感受体活性和/或表达的化合物的方法。例如但不作为限制，调节剂可以是激动剂或拮抗剂。本发明公开的主题提供了用于鉴定调节上文公开的钙敏感受体活性和/或表达的那些化合物的计算机模拟和体外方法。
4.1计算机模拟方法
本发明公开的主题还提供了用于鉴定可能与钙敏感受体相互作用和/或调节钙敏感受体(例如猫、犬或人的钙敏感受体)的活性和/或表达的化合物的计算机模拟方法。
在某些实施方案中，该方法可以包括预测钙敏感受体的三维结构(3D)并用推定的钙敏感受体调节化合物(即测试化合物)筛选预测的3D结构。该方法可以进一步包括通过分析与推定的化合物和受体的氨基酸的潜在相互作用来预测推定的化合物是否会与受体的结合位点相互作用。该方法可以进一步包括通过确定化合物的3D结构在受体的3D结构的结合位点内是否适合来鉴定可以结合和/或调节钙敏感受体的生物活性的测试化合物。
在某些实施方案中，用于所公开方法的钙敏感受体可具有如2015年10月12日提交的国际申请号PCT/US15/55149所述的氨基酸或核苷酸序列或其片段或变体。
可以使用所公开的方法测试的化合物(例如可能的钙敏感受体调节剂)的非限制性实例包括任何小化学化合物或任何生物实体，例如本领域已知的肽、盐和氨基酸。在某些实施方案中，测试化合物可以是小化学分子。
在某些实施方案中，可以使用密切相关的GPCR的晶体结构作为用于同源性建模的模板来构建钙敏感受体的结构模型。对于CaSR的捕蝇草结构域，最近已经解决了人钙受体捕蝇草结构域(VFT)的X射线晶体学结构。蛋白质数据库(PDB，www.rcsb.org)中存在的结构包括：
PDB ID：5FBH-结合Gd+3的人钙敏感受体细胞外结构域的晶体结构；
PDB ID：5FBK-人钙敏感受体细胞外结构域的晶体结构；
PDB ID：5K5T-无活性形式的人钙敏感受体细胞外结构域的晶体结构；
PDB ID：5K5S-活性形式的人钙敏感受体细胞外结构域的晶体结构(参见Geng等人，人类钙敏感受体的配体激活的结构机制(Structural mechanism of ligandactivation in human calcium-sensing receptor)，Elife.2016年7月19日；5.pii：e13662；Zhang等人，用于通过镁离子调节人钙敏感受体的结构基础和意想不到的色氨酸衍生物共激动剂(Structural basis for regulation of human calcium-sensingreceptor by magnesium ions and an unexpected tryptophan derivative co-agonist)，科学进展(Sci Adv.)2016年5月；2(5)：e1600241其全部内容通过引用并入本文)。
在某些实施方案中，可以基于与人VFT的序列同源性，为其它目标物种(例如猫和狗)生成模型VFT结构。在某些实施方案中，跨膜结构域模型结构可以基于与结构已经在结晶学上确定的GPCR的七跨膜结构域(7TM)的序列同源性来产生。
例如但不作为限制，可以使用C组GPCR的晶体结构产生跨膜结构域的结构模型。在某些实施方案中，钙敏感受体的捕蝇草结构域或跨膜结构域的结构模型可以基于GPCR的已知晶体结构的组合。(参见Binet等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem)，282(16)：12154-63(2007)；Wu等人，科学(Science)，344(6179)：58-64(2014)；和Dore，自然(Nature)511：557-562(2014)；其全部内容通过引用并入本文。例如但不作为限制，可以基于具有蛋白质数据库(PDB)ID号为4OR2和/或4OO9的晶体结构产生用于猫或狗的7跨膜结构域的结构模型。图3-20描绘了可用于所公开的计算机模拟方法的钙敏感受体的结构模型。可以使用本领域已知的任何合适的建模软件。在某些实施方案中，Modeller软件包(Accelrys，BIOVIA，达索系统(Dassault Systèmes))可用于产生三维蛋白质结构。
在某些实施方案中，鉴定结合钙敏感受体的化合物的计算机模拟方法包括确定测试化合物是否与如本文所述的钙敏感受体相互作用结构域的一个或多个氨基酸相互作用。
可以使用本文公开的体外方法进一步测试通过所公开的计算机模拟方法鉴定的化合物。
4.2钙敏感受体结合位点
本申请提供筛选调节钙敏感受体例如猫、犬或人钙敏感受体的活性的化合物的方法，其中所述化合物与钙敏感受体的一种或多种氨基酸相互作用。在某些实施方案中，钙敏感受体的结合位点包含跨膜结构域内的氨基酸，例如，受体的7跨膜(7TM)结构域或捕蝇草(VFT)结构域，并且可以通过产生如本文所述的使用计算机模拟建模的受体的相互作用图来鉴定。在一个非限制性实例中，相互作用图中氨基酸的存在意味着残基位于配体结合环境附近，并与配体相互作用。
在某些实施方案中，化合物与本文所述的钙敏感受体的一个或多个氨基酸之间的相互作用可包含一个或多个氢键、共价键、非共价键、盐桥、物理相互作用及它们的组合。相互作用还可以是本领域已知的配体受体相互作用的任何相互作用特征。这种相互作用可以基于已知的激动剂、结构测定及它们的组合通过例如定点诱变、X射线晶体学、X射线或其它光谱方法、核磁共振(NMR)、交联评估、质谱或电泳、低温显微镜法(cryo-microscopy)、置换分析(displacement assay)来确定。在某些实施方案中，例如通过理论手段，例如使用分子对接、分子建模、分子模拟或本领域普通技术人员已知的其它手段将化合物对接到猫或犬钙敏感受体结合袋中，通过计算机模拟测定相互作用。
在某些实施方案中，相互作用是盐桥相互作用。
在某些实施方案中，相互作用是氢键相互作用。
在某些实施方案中，相互作用是疏水相互作用。
在某些实施方案中，相互作用是环堆积相互作用。
在某些实施方案中，根据本文所述的调节钙敏感受体活性的方法鉴定的化合物与钙敏感受体的捕蝇草(VFT)结构域中的一个或多个氨基酸相互作用。在某些实施方案中，化合物与之相互作用的氨基酸包括钙敏感受体例如包括猫钙敏感受体的钙敏感受体中的Asn64、Phe65、Asn102、Thr145、Ser147、Ala168、Ser169、Ser170、Asp190、Gln193、Asp216、Tyr218、Ser272、Glu297、Ala298、Trp299、Ala300、Ser302、Leu304、Tyr411、Thr412和His413的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或更多个，或犬钙敏感受体或人钙敏感受体的功能等同氨基酸。
在某些实施方案中，根据本文所述的调节钙敏感受体活性的方法鉴定的化合物与钙敏感受体的跨膜结构域例如7跨膜(7TM)结构域中的一个或多个氨基酸相互作用。在某些实施方案中，化合物与之相互作用的氨基酸包含钙敏感受体例如包括猫钙敏感受体的钙敏感受体中的螺旋3上的Phe684、Gly685和/或Phe688，螺旋4上的Gln735，螺旋5上的Met771、Ala772、Phe775、Leu776和/或Thr780，螺旋6上的Phe814、Val817、Trp818和/或Phe821，和/或螺旋7上的Glu837、Ala840和/或Ile841的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多个，或犬钙敏感受体或人钙敏感受体的功能等同氨基酸。
在某些实施方案中，鉴定调节猫钙敏感受体活性的组合物的方法包括(a)使测试剂与钙敏感受体例如包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的猫钙敏感受体接触，(b)检测测试剂与选自由以下组成的组的钙敏感受体的相互作用位点中的一个或多个氨基酸之间的相互作用：VFT结构域中的Asn64、Phe65、Asn102、Thr145、Ser147、Ala168、Ser169、Ser170、Asp190、Gln193、Asp216、Tyr218、Ser272、Glu297、Ala298、Trp299、Ala300、Ser302、Leu304、Tyr411、Thr412和His413及它们的组合，和/或螺旋3上的Phe684、Gly685和/或Phe688，螺旋4上的Gln735，螺旋5上的Met771、Ala772、Phe775、Leu776和/或Thr780，螺旋6上的Phe814、Val817、Trp818和/或Phe821，和/或螺旋7上的Glu837、Ala840和/或Ile841，和(c)选择与一种或多种氨基酸相互作用的测试剂作为组合物。
在某些实施方案中，该方法还包括在步骤(a)后测定钙敏感受体的活性，并选择增加钙敏感受体活性的测试剂作为组合物。
在某些实施方案中，该方法还包括使钙敏感受体与配体例如激动剂接触，并选择增加或增强激动剂激活钙敏感受体的能力的测试剂作为组合物。
4.3体外方法
本发明公开的主题还提供了用于鉴定可调节钙敏感受体活性和/或表达的化合物的体外方法。
用于本发明公开的方法的钙敏感受体可包括本文公开的分离的或重组的钙敏感受体或表达钙敏感受体的细胞。在某些实施方案中，用于所公开方法的钙敏感受体可具有如2015年10月12日提交的国际申请号PCT/US15/55149所述的氨基酸或核苷酸序列或其片段或变体。
在某些实施方案中，鉴定调节钙敏感受体活性和/或表达的化合物的方法包括在不存在和/或存在测试化合物的情况下测量钙敏感受体的生物活性。在某些实施方案中，该方法可包括在不同浓度的测试化合物的存在下测量钙敏感受体的生物活性。该方法可以进一步包括鉴定在不存在测试化合物的情况下与钙敏感受体的活性和/或表达相比导致钙敏感受体的活性和/或表达的调节的测试化合物。
在某些实施方案中，与当化合物不存在时钙敏感受体的生物活性相比，根据本文所述方法鉴定的化合物将钙敏感受体的生物活性提高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。在某些实施方案中，与当化合物不存在时钙敏感受体的生物活性相比，根据本文所述方法鉴定的化合物将钙敏感受体的生物活性提高至少约30％。
在某些实施方案中，该方法可以进一步包括组合分析两种或更多种、三种或更多种或者四种或更多种测试化合物。在某些实施方案中，两种或更多种、三种或更多种或者四种或更多种测试化合物可以来自不同类别的化合物，例如氨基酸和小化学化合物。例如但不作为限制，该方法可包括在一种或多种氨基酸测试化合物存在下分析一种或多种小化学测试化合物对钙敏感受体的生物活性和/或表达的影响。在某些实施方案中，鉴定化合物对钙敏感受体的活性和/或表达的影响的方法包括分析测试在一种或多种核苷酸或核苷酸衍生物测试化合物的存在下化合物对钙敏感受体的生物活性和/或表达的影响。
在某些实施方案中，鉴定调节钙敏感受体活性和/或表达的化合物的方法包括确定化合物是否例如作为激动剂或拮抗剂直接调节受体。在某些实施方案中，该方法包括确定化合物是否间接调节受体的活性(例如，作为变构调节剂)，例如，通过增强或降低其它化合物对激活或抑制受体活性的作用。
在某些实施方案中，鉴定调节钙敏感受体的活性和/或表达的化合物的方法包括在细胞系中表达钙敏感受体，并在存在和/或不存在测试化合物的情况下测量受体的生物活性。该方法可以进一步包括通过确定在测试化合物存在下的受体活化相比不存在测试化合物时受体活性是否存在不同来鉴定调节受体活性的测试化合物。在某些实施方案中，推定的钙敏感受体调节剂的选择性可以通过比较其对其它GPCR(G蛋白偶联受体)或味觉受体(例如鲜味、GPR120、T1R等受体)的作用来评估。
可以通过使用标记化合物和/或试剂来检测所公开方法中受体的活化。在某些实施方案中，钙敏感受体的活性可通过检测第二信使来确定，所述第二信使例如但不限于cAMP、cGMP、IP3、DAG或钙。在某些实施方案中，钙敏感受体的活性可通过检测细胞内钙水平来确定。监测可以通过发光或荧光检测的方式，如通过钙敏感荧光染料。在某些实施方案中，细胞内钙水平可以使用细胞染料例如荧光钙指示剂如钙4(Calcium 4)测定。在某些实施方案中，细胞内钙水平可以通过测量钙结合到钙结合蛋白例如钙调蛋白的水平来确定。或者和/或另外，钙敏感受体的活性可通过检测钙敏感受体的一个或多个下游蛋白质靶标的磷酸化、转录物水平和/或蛋白质水平来确定。
在所公开的方法中使用的细胞系可包括能够表达钙敏感受体的任何细胞类型。可用于所公开方法的细胞的非限制性实例包括HeLa细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(COS细胞)、非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocyte)、HEK-293细胞和鼠3T3成纤维细胞。在某些实施方案中，该方法可包括在CHO-K1细胞中表达钙敏感受体。在某些实施方案中，该方法可包括在HEK-293细胞中表达钙敏感受体。在某些实施方案中，该方法可包括在COS细胞中表达钙敏感受体。在某些实施方案中，细胞组成型表达钙敏感受体。在另一个实施方案中，细胞对钙敏感受体的表达是诱导型的。
在某些实施方案中，细胞表达钙结合发光蛋白，其中发光蛋白在结合钙时发光。在某些实施方案中，钙结合发光蛋白包含蛋白质clytin。在某些实施方案中，clytin是重组clytin。在某些实施方案中，clytin包含分离的clytin，例如，从Clytia gregarium分离的clytin。在某些实施方案中，钙结合发光蛋白包含蛋白质水母发光蛋白(aequorin)，例如重组水母发光蛋白或分离的水母发光蛋白，如从维多利亚多管发光水母(Aequoreavictoria)分离的水母发光蛋白。在某些实施方案中，钙结合发光蛋白包含蛋白质奥贝林(obelin)，例如重组奥贝林或分离的奥贝林，如从薮枝螅(Obelia longissima)分离的奥贝林。
在某些实施方案中，细胞中钙敏感受体的表达可以通过将编码钙敏感受体的核酸引入细胞中来进行。例如但不作为限制，可以将具有2015年10月12日提交的国际申请号PCT/US15/55149中所列出的核苷酸序列的核酸或其片段引入细胞中。在某些实施方案中，核酸向细胞中的引入可以通过本领域已知的任何方法进行，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。本领域已知用于将外源基因导入细胞的多种技术(参见，例如Loeffler和Behr，酶学方法(Meth.Enzymol)，217：599-618(1993)；Cohen等人，酶学方法，217：618-644(1993)；Cline，药物治疗(Pharmac.Ther.)29：69-92(1985)，其全部内容通过引用并入本文)，并且可以根据所公开的主题使用。在某些实施方案中，该技术可以提供核酸向细胞的稳定转移，使得核酸可被细胞表达，并且是可遗传的且被其后代表达。在某些实施方案中，该技术可以提供核酸向细胞的瞬时转移，使得核酸可被细胞表达，其中遗传力和表达力在细胞后代的后续世代中降低。
在某些实施方案中，该方法可包括鉴定结合钙敏感受体的化合物。该方法可包括使钙敏感受体与测试化合物接触，并测量化合物与钙敏感受体之间的结合。例如，但不作为限制，该方法可以包括在无细胞系统中提供分离的或纯化的钙敏感受体，并使受体与无细胞系统中的测试化合物接触，以确定测试化合物是否结合钙敏感受体。在某些实施方案中，该方法可包括使细胞表面上表达的钙敏感受体与测试化合物接触，并检测测试化合物与钙敏感受体的结合。结合可以直接测量，例如，通过使用标记的测试化合物，或可以间接测量。在某些实施方案中，检测包括检测由化合物与钙敏感受体结合引起的细胞中的生理事件，例如细胞内钙水平的增加。例如但不作为限制，可以通过荧光检测如钙敏感荧光染料，通过发光检测或本领域已知的任何其它检测方法进行检测。
在某些非限制性实施方案中，体外测定包括表达对细胞天然的钙敏感受体的细胞。这种表达天然的钙敏感受体的细胞的实例包括例如但不限于，狗(犬科动物)和/或猫(猫科动物)味觉细胞(例如，初级味觉受体细胞)。在某些实施方案中，从狗和/或猫中分离表达钙敏感受体的狗和/或猫味觉细胞，并在体外培养。在某些实施方案中，味觉受体细胞可以是永生化的，例如，使得从狗和/或猫分离的细胞可以在培养物中繁殖。
在某些实施方案中，可以通过基因编辑诱导细胞中钙敏感受体的表达，例如，通过使用CRISPR基因编辑系统将钙敏感受体基因并入到细胞的基因组中，或编辑或修饰对细胞天然的钙敏感受体基因。
在某些实施方案中，鉴定结合钙敏感受体的化合物的体外方法包括确定测试化合物是否如本文所述与钙敏感受体相互作用结构域的一个或多个氨基酸相互作用。
在某些实施方案中，鉴定为钙敏感受体的调节剂的化合物可以在其它分析方法中进一步测试，包括但不限于体内测定，以确认或定量它们的调节活性。
在某些实施方案中，本文所述的方法可包括确定钙敏感受体调节剂是否是钙敏感味道增强化合物，例如钙敏感受体激动剂。
在某些实施方案中，鉴定钙敏感受体调节剂的方法可包括比较测试化合物对钙敏感受体激动剂的作用。例如，当与钙敏感受体激动剂接触时，与受体活性相比，增加受体活性的测试化合物可以被选为钙敏感受体调节化合物(例如，作为激动剂)。
在某些实施方案中，鉴定钙敏感受体调节剂的方法可包括确定当受体与激动剂接触时测试化合物是否调节受体活性，或测试化合物是否可调节正变构调节剂(PAM)的活性。增加或降低所述激动剂或PAM对受体的作用的测试化合物可以被选为钙敏感受体调节化合物(例如，作为变构调节剂)。
5.风味组合物
在某些实施方案中，本公开的风味组合物可用于增加宠物食品如猫食品的适口性。风味组合物可包括化合物的组合，并可以各种递送系统添加到宠物食品中。
在某些实施方案中，本公开涉及调节厚味味道(例如，钙敏感受体的活性)和/或宠物食品的适口性的方法，包括：a)提供至少一种宠物食品或其前体，以及b)将宠物食品或其前体与至少厚味味道调节量的至少一种风味组合物组合，所述风味组合物例如包含一种或多种化合物或其食用上可接受的盐，以形成增强的宠物食品。
在某些实施方案中，本公开的风味组合物可以增强钙敏感受体的活性和/或宠物食品的适口性，所述宠物食品是例如包括湿宠物食品、干宠物食品、潮湿宠物食品、宠物饮料产品和/或小吃宠物食品的宠物食品。
在某些实施方案中，本公开的一种或多种风味组合物可以以有效修改、增强或改变宠物食品的味道或味觉谱的量添加到宠物食品中。该改变可以包括，例如，宠物食品的适口性的增加或增强，如由动物例如猫和/或狗确定的，或者在配方测试的情况下，由一组动物味道测试员例如猫和/或狗通过本领域已知的程序所确定。
在本公开的某些实施方案中，可以生产含有足量的本文所述的例如包含化合物的至少一种风味组合物的宠物食品，以生产具有所需味道例如厚味味道的宠物食品。
在本公开的某些实施方案中，可以生产含有足量的风味组合物的宠物食品，所述风味组合物包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种化合物。
在某些实施方案中，可以将钙敏感受体调节量的一种或多种本公开的风味组合物添加到宠物食品中，使得与没有风味组合物时制备的宠物食品相比，宠物食品具有增加的适口性，如由动物例如猫和/或狗确定的，或者在配方测试的情况下，由一组动物味道测试员通过本领域已知的程序所确定。
在本公开的某些实施方案中，将风味组合物以有效增加、增强和/或改变宠物食品的适口性的量添加到宠物食品中。
与宠物食品混合以调节和/或改善宠物食品的适口性的风味组合物的浓度可以根据变量而变化，所述变量例如宠物食品的特定类型、何种味道调节化合物已经存在于宠物食品中及其浓度、以及特定风味组合物对这些味道调节化合物的增强剂作用。
可以使用宽范围浓度的风味组合物来提供这种适口性改变。在本申请的某些实施方案中，将风味组合物与宠物食品混合，其中风味组合物的存在量为约0.001ppm至约1000ppm。例如但不作为限制，风味组合物的存在量可以为约0.001ppm至约750ppm、约0.001ppm至约500ppm、约0.001ppm至约250ppm、约0.001ppm至约150ppm、约0.001ppm至约100ppm、约0.001ppm至约75ppm、约0.001ppm至约50ppm、约0.001ppm至约25ppm、约0.001ppm至约15ppm、约0.001ppm至约10ppm、约0.001ppm至约5ppm、约0.001ppm至约4ppm、约0.001ppm至约3ppm、约0.001ppm至约2ppm、约0.001ppm至约1ppm、约0.01ppm至约1000ppm、约0.1ppm至1000ppm、约1ppm至1000ppm、约2ppm至约1000ppm、约3ppm至约1000ppm、约4ppm至约1000ppm、约5ppm至约1000ppm、约10ppm至约1000ppm、约15ppm至约1000ppm、约25ppm至约1000ppm、约50ppm至约1000ppm、约75ppm至约1000ppm、约100ppm至约1000ppm、约150ppm至约1000ppm、约250ppm至约1000ppm、约250ppm至约1000ppm、约500ppm至约1000ppm或约750ppm至约1000ppm，以及介于两者之间的值。
在本申请的某些实施方案中，将风味组合物与宠物食品混合，其中风味组合物的存在量为约0.001ppm至约500ppm、或约0.01ppm至约500ppm、约0.1ppm至约500ppm、或约1ppm至约500ppm，以及介于两者之间的值。
在本申请的某些实施方案中，将风味组合物与宠物食品混合，其中风味组合物的存在量为约0.01ppm至约100ppm、或约0.1ppm至约100ppm、或约1ppm至约100ppm，以及介于两者之间的值。
在某些实施方案中，风味组合物在宠物食品中的存在量大于约0.001ppm、大于约0.01ppm、大于约0.1ppm、大于约1ppm、大于约2ppm、大于约3ppm、大于约4ppm、大于约5ppm、大于约10ppm、大于约25ppm、大于约50ppm、大于约75ppm、大于约100ppm、大于约250ppm、大于约500ppm、大于约750ppm或大于约1000ppm，以及介于两者之间的值。
在某些实施方案中，本公开的化合物以足以调节、活化和/或增强钙敏感受体的量存在于食品中。例如但不作为限制，化合物在食品中的存在量可以为约1pM至约1M、约1nM至约1M、约1μM至约1M、约1mM至约1M、约10mM至约1M、约100mM至约1M、约250mM至约1M、约500mM至约1M、约750mM至约1M、约0.001μM至约1M、约0.001μM至约750mM、约0.001μM至约500mM、约0.001μM至约250mM、约0.001μM至约100mM、0.001μM至约50mM、约0.001μM至约25mM、约0.001μM至约10mM、约0.001μM至约1mM、约0.001μM至约100μM或约0.001μM至约10μM，以及介于两者之间的值。
在某些实施方案中，本公开的化合物以足以调节、活化和/或增强钙敏感受体的量存在于食品中。例如但不作为限制，化合物在食品中的存在量可以为约1pM至约I0M、约1pM至约1M、约1nM至约1M、约1μM至约1M、约1mM至约1M、约10mM至约1M、约100mM至约1M、约250mM至约1M、约500mM至约1M、约750mM至约1M、约1μM至约1M、约1μM至约750mM、约1μM至约500mM、约1μM至约250mM、约1μM至约100mM、约1μM至约50mM、约1μM至约25mM、约1μM至约10mM、约1μM至约1mM、约1μM至约100μM、或约1μM至约10μM，以及介于两者之间的值。
在本申请的某些实施方案中，将风味组合物与宠物食品混合，其中风味组合物的存在量为约10pM至约0.5M、或约1pM至约0.5M、或约0.1pM至约0.5M，以及介于两者之间的值。
在本申请的某些实施方案中，将风味组合物与宠物食品混合，其中风味组合物的存在量为约10pM至约0.1M、或约1pM至约0.1M、或约0.1pM至约0.1M，以及介于两者之间的值。
在本申请的某些实施方案中，将风味组合物与食品混合，其中风味组合物的存在量为食品的约0.0001重量/重量％至约10重量/重量(w/w)％。例如，但不作为限制，风味组合物的存在量可以为约0.0001w/w％至约10w/w％、约0.0001w/w％至约1w/w％、约0.0001w/w％至约0.1w/w％、约0.0001w/w％至约0.01w/w％、约0.0001w/w％至约0.001w/w％、约0.001w/w％至约10w/w％、约0.001w/w％至约1w/w％、约0.01w/w％至约1w/w％或约0.1w/w％至约1w/w％，以及介于两者之间的值。
在本申请的某些实施方案中，将风味组合物与食品混合，其中风味组合物的存在量为约0.0001w/w％至约5w/w％、或约0.001w/w％至约5w/w％、约0.01w/w％至约5w/w％、或约0.1w/w％至约5w/w％，以及两者之间的值。
在本申请的某些实施方案中，将风味组合物与食品混合，其中风味组合物的存在量为约0.0001w/w％至约1w/w％、或约0.001w/w％至约1w/w％、约0.01w/w％至约1w/w％、或约0.1w/w％至约1w/w％，以及两者之间的值。
在本申请的某些实施方案中，将风味组合物与食品混合，其中风味组合物的存在量为约0.001w/w％至约10w/w％。
在某些实施方案中，本申请的化合物以各种比例共混在一起或与其它化合物共混在一起，所述其它化合物例如核苷酸和/或呋喃酮和/或氨基酸和/或鲜味受体活化跨膜化合物和/或核苷酸衍生物和/或脂肪酸受体(GPR120)活化化合物，以形成各种风味组合物。核苷酸、核苷酸衍生物、呋喃酮、氨基酸、脂肪酸受体(GPR120)活化化合物和鲜味受体活化跨膜化合物的非限制性实例公开于以下国际申请中：2013年10月31日提交的提交的PCT/EP2013/072788，2013年10月31日提交的PCT/EP2013/072789，2013年10月31日提交的PCT/EP2013/072790，2013年10月31日提交的PCT/EP2013/072794，2015年12月10日提交的PCT/US15/65046，2015年12月10日提交的PCT/US15/65036，以及2015年12月10日提交的PCT/US15/65106，其全部内容通过引用并入本文。
5.1氨基酸
在本公开的某些实施方案中，风味组合物包含至少一种化合物和至少一种氨基酸，其如本文以及下列国际申请中所述：2013年10月31日提交的PCT/EP2013/072788，2013年10月31日提交的PCT/EP2013/072789，2013年10月31日提交的PCT/EP2013/072790和2013年10月31日提交的PCT/EP2013/072794，其全部内容通过引用并入本文。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物包含至少一种氨基酸，其选自由L-谷氨酸(或谷氨酸一钠(MSG))、L-天冬氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸和Se-(甲基)硒代半胱氨酸组成的组。在某些实施方案中，至少一种氨基酸活化CaSR作为PAM。在某些实施方案中，至少一种氨基酸活化CaSR作为激动剂。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物至少包含第一氨基酸、第二氨基酸和第三氨基酸。在某些实施方案中，第一氨基酸可以提高T1R1/T1R3受体(即鲜味受体)的活性，并且可以是选自表2中描述的第一组氨基酸的氨基酸。在某些实施方案中，第二氨基酸可以调节如本文所述的钙敏感受体的活性，并且可以是选自表2中描述的第二组氨基酸的氨基酸。在某些实施方案中，第三氨基酸可以与一种或多种其它味觉受体相互作用，并且不与第一氨基酸或第二氨基酸结合相同的受体，或与第一氨基酸或第二氨基酸竞争受体结合。在某些实施方案中，第三氨基酸可以是选自表2中描述的第三组氨基酸的氨基酸。在某些实施方案中，风味组合物包含至少一种第一组氨基酸、至少一种第二组氨基酸和至少一种第三组氨基酸。
表2味觉受体活性氨基酸
在某些实施方案中，所述至少一种第一氨基酸、第二氨基酸和/或第三氨基酸的存在量可以为宠物食品的约1mM至约1M、或约250mM至约1M、或约5mM至约500mM、或约10mM至约100mM、或约15mM至约50mM或约20mM至约40mM。在某些实施方案中，一种或多种氨基酸的存在量可以为宠物食品的小于约1M、小于约200mM、小于约100mM、小于约50mM、小于约20mM或小于约10mM。在某些实施方案中，单独或组合的第一氨基酸和/或第二氨基酸和/或第三氨基酸的存在量可以为宠物食品的约25mM。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种如本文所述的核苷酸和/或核苷酸衍生物。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种如本文所述的脂肪酸受体(GPR120)活化化合物。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种如本文所述的鲜味受体活化跨膜化合物。
5.2鲜味受体活化跨膜化合物
在本公开的某些实施方案中，风味组合物包含如本申请所述的至少一种化合物和如2015年12月10日提交的国际申请号PCT/US15/65036所述的至少一种鲜味受体活化跨膜化合物，PCT/US15/65036的全部内容通过引用并入本文。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物包含至少一种化合物和至少两种、三种、四种、五种或更多种鲜味受体活化跨膜化合物。
在某些实施方案中，本公开的鲜味受体活化跨膜化合物在食品中的存在量可以为约1pM至约1M、约1nM至约1M、约1μM至约1M、约1 mM至约1M、约10mM至约1M、约100mM至约1M、约250mM至约1M、约500mM至约1M、约750mM至约1M、约1μM至约1M、约1μM至约750mM、约1μM至约500mM、约1μM至约250mM、约1 μM至约100mM、约1μM至约50mM、约1μM至约25mM、约1μM至约10mM、约1μM至约1mM、约1μM至约100μM或约1μM至约10μM，以及介于两者之间的值。
在某些实施方案中，鲜味受体活化跨膜化合物可以是本文所述的跨膜化合物的盐、立体异构体或可食用形式。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种如本文所述的氨基酸。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种如本文所述的核苷酸和/或核苷酸衍生物。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种如本文所述的脂肪酸受体(GPR120)活化化合物。
5.3核苷酸和核苷酸衍生物
在本公开的某些实施方案中，风味组合物包含至少一种化合物和至少一种核苷酸和/或核苷酸衍生物，其如本文以及下列国际申请中所述：2015年12月10日提交的PCT/US15/65046，2013年10月31日提交的PCT/EP2013/072788、2013年10月31日提交的PCT/EP2013/072789、2013年10月31日提交的PCT/EP2013/072790和2013年10月31日提交的PCT/EP2013/072794，其全部内容通过引用并入本文。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物包含如本文所述的至少一种化合物和至少两种、三种、四种、五种或更多种核苷酸和/或核苷酸衍生物。核苷酸的非限制性实例包括鸟苷一磷酸(GMP)、肌苷一磷酸(IMP)、腺苷一磷酸(AMP)、胞苷一磷酸(CMP)、胸腺嘧啶一磷酸(TMP)、黄嘌呤一磷酸(XMP)、尿苷一磷酸(UMP)和它们的组合。
在某些实施方案中，风味组合物可包括存在于食品中的核苷酸和/或核苷酸衍生物，其存在量可以为约1pM至约1M、约1nM至约1M、约1μM至约1M、约1mM至约1M、约10mM至约1M、约100mM至约1M、约250mM至约1M、约500mM至约1M、约750mM至约1M、约1μM至约1M、约1μM至约750mM、约1μM至约500mM、约1μM至约250mM、约1μM至约100mM、约1μM至约50mM、约1μM至约25mM、约1μM至约10mM、约1μM至约1mM、约1μM至约100μM或约1μM到约10μM，以及介于两者之间的值。
在某些实施方案中，核苷酸和/或核苷酸衍生物的存在量可以为宠物食品的大于约1mM或大于约2.5mM。在某些非限制性实施方案中，核苷酸和/或核苷酸衍生物的存在量可以为宠物食品的小于约100mM、小于约50mM、小于约20mM或小于约10mM。在某些非限制性实施方案中，核苷酸和/或核苷酸衍生物以宠物食品的约5mM的量存在。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种如本文所述的氨基酸。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种如本文所述的鲜味受体活化跨膜化合物。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种如本文所述的脂肪酸受体(GPR120)活化化合物。
5.4脂肪酸受体(GPR120)活化化合物
在本公开的某些实施方案中，风味组合物包含至少一种如本申请所述的化合物，和如2015年12月10日提交的国际申请号PCT/US15/65106所述的至少一种脂肪酸受体(GPR120)活化化合物，PCT/US15/65106的全部内容通过引用并入本文。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物包含至少一种化合物和至少两种、三种、四种、五种或更多种脂肪酸受体(GPR120)活化化合物。
在某些实施方案中，本发明的脂肪酸受体(GPR120)活化化合物在食品中的存在量可以为约1pM至约1M、约1nM至约1M、约1μM至约1M、约1mM至约1M、约10mM至约1M、约100mM至约1M、约250mM至约1M、约500mM至约1M、约750mM至约1M、约1μM至约1M、约1μM至约750mM、约1μM至约500mM、约1μM至约250mM、约1μM至约100mM、约1μM至约50mM、约1μM至约25mM、约1μM至约10mM、约1μM至约1mM、约1μM至约100μM或约1μM至约10μM，以及介于两者之间的值。
在某些实施方案中，脂肪酸受体(GPR120)活化化合物可以是本文所述的脂肪酸受体(GPR120)活化化合物的盐、立体异构体或可食用形式。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种如本文所述的氨基酸。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种如本文所述的核苷酸和/或核苷酸衍生物。
在本公开的某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种如本文所述的鲜味受体活化化合物。
6.递送系统
在某些实施方案中，本申请的风味组合物可以掺入用于宠物食品的递送系统中。递送系统可以是非水性液体、固体或乳液。递送系统通常适应于适合风味组合物和/或风味组合物将掺入其中的宠物食品的需要。
调味组合物可以非水性液体形式、干燥形式、固体形式和/或乳液使用。当以干燥形式使用时，可以使用合适的干燥方法如喷雾干燥。或者，可以将调味组合物包封或吸收到水不溶性材料上。制备这种干燥形式的实际技术在本领域中是公知的，并且可以应用于本发明公开的主题。
本发明公开的主题的风味组合物可以以本领域公知的许多不同的物理形式使用，以提供味道、风味和/或质地的初始爆释(initial burst)；和/或味道、风味和/或质地的持续很久的感觉。不限于此，这些物理形式包括游离形式，如喷雾干燥、粉末和珠状形式和包封形式以及它们的混合物。
在某些实施方案中，风味组合物的化合物可以在宠物食品的加工过程例如灭菌、干馏和/或挤出中从宠物食品中存在的前体化合物产生。
在某些实施方案中，如上所述，包封技术可用于对风味系统进行改变。在某些实施方案中，风味化合物、风味组分或整个风味组合物可以完全或部分被包封。可以选择包封材料和/或技术以确定风味系统的改变类型。
在某些实施方案中，选择包封材料和/或技术以改善风味化合物、风味组分或风味组合物的稳定性；而在其它实施方案中，选择包封材料和/或技术以改变风味组合物的释放曲线。
合适的包封材料可包括但不限于水胶体，如藻酸盐、果胶、琼脂、瓜尔胶、纤维素等，蛋白质，聚乙酸乙烯酯，聚乙烯，交联聚乙烯吡咯烷酮，聚甲基丙烯酸甲酯，聚丙交酯(polylactidacid)，聚羟基链烷酸酯，乙基纤维素，聚乙烯基乙酸邻苯二甲酸酯，聚乙二醇酯，甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯，乙烯-乙酸乙烯酯(EVA)共聚物等，以及它们的组合。合适的包封技术可包括但不限于喷雾涂覆、喷雾干燥、喷雾冷却、吸收、吸附、包合络合(例如、产生调味剂/环糊精复合物)、凝聚、流化床包衣，或者其它方法可用于用包封材料包封成分。
用于风味剂或甜味剂的包封递送系统可包含围绕甜味剂或风味剂芯的疏水性脂肪或蜡基质。脂肪可选自任何数量的常规材料，如脂肪酸、甘油酯或聚甘油酯、山梨糖醇酯及它们的混合物。脂肪酸的实例包括但不限于氢化和部分氢化的植物油，如棕榈油、棕榈仁油、花生油、菜籽油、米糠油、大豆油、棉籽油、向日葵油、红花油及它们的组合。甘油酯的实例包括但不限于甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。
蜡可选自由天然蜡和合成蜡及它们的混合物组成的组。非限制性实例包括石蜡、矿脂、碳蜡、微晶蜡、蜂蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、羊毛脂、杨梅蜡、甘蔗蜡、鲸蜡、米糠蜡及它们的混合物。
脂肪和蜡可以单独使用或组合使用，其量为包封系统重量的约10％至约70％或者约30％至约60％。当组合使用时，脂肪和蜡可以分别以约70∶10至85∶15的比例存在。
典型的包封风味组合物、风味剂或甜味剂递送系统公开在美国专利号4,597,970和4,722,845中，其公开内容通过引用并入本文。
液体递送系统可包括但不限于具有本申请的风味组合物的分散体的系统，如在碳水化合物糖浆和/或乳液中。液体递送系统还可包括提取物，其中化合物和/或风味组合物溶解在溶剂中。固体递送系统可通过喷雾干燥、喷雾涂覆、喷雾冷却、流化床干燥、吸收、吸附、凝聚、络合或任何其它标准技术产生。在一些实施方案中，可以选择递送系统以与可食用组合物相容或在其中起作用。在某些实施方案中，递送系统将包括含油物质，如脂肪或油。在某些实施方案中，递送系统将包括糖食脂肪，如可可脂、可可脂替代物、可可脂替代品或可可脂等同物。
当以干燥形式使用时，可以使用合适的干燥方法如喷雾干燥。或者，调味组合物可以吸附或吸收到基质如水不溶性物质上，并且可以被包封。制备这种干燥形式的实际技术是本领域熟知的。
7.宠物食品
本公开主题的风味组合物可用于多种宠物食品中。合适的宠物食品的非限制性实例包括如本文所述的湿食品、干食品、潮湿食品、宠物食品补充剂(例如维生素)、宠物饮料产品、小吃和零食。
当需要时，本发明公开主题的一种或多种调味组合物与宠物食品和任选成分的组合，例如通过增加钙敏感受体的活性，提供具有意想不到的味道并赋予例如厚味感官体验的调味剂。本文公开的风味组合物可以在宠物食品的配制加工或包装之前、期间或之后加入，并且风味组合物的组分可以依次或同时加入。在某些实施方案中，风味组合物的化合物可以例如从宠物食品中存在的前体化合物在宠物食品的加工过程例如灭菌、干馏和/或挤出中产生。
在某些实施方案中，宠物食品是营养全面的干食品。干的或含低水分的营养全面的宠物食品可包含少于约15％的水分，并包括约10％至约60％的脂肪、约10％至约70％的蛋白质和约30％至约80％的碳水化合物，例如膳食纤维和灰分。
在某些实施方案中，宠物食品是营养全面的湿食品。湿的或含高水分的营养全面宠物食品可包含大于约50％的水分。在某些实施方案中，湿宠物食品包含约40％脂肪、约50％蛋白质和约10％碳水化合物，例如膳食纤维和灰分。
在某些实施方案中，宠物食品是营养全面的潮湿食品。潮湿例如半湿或半干或软干或软潮湿或中等或含中等水分的营养全面的宠物食品含有约15％至约50％的水分。
在某些实施方案中，宠物食品是宠物食物小吃产品。宠物食物小吃产品的非限制性实例包括小吃棒、宠物咀嚼物、松脆零食、谷物棒、小吃、饼干和甜食。
在某些实施方案中，蛋白质来源可以源自植物来源，如羽扇豆蛋白、小麦蛋白、大豆蛋白及它们的组合。或者或另外，蛋白质来源可以源自多种动物来源。动物蛋白的非限制性实例包括牛肉、猪肉、家禽、羊肉或鱼，包括例如肌肉、肉类副产品、肉粉或鱼粉。
8.测量味道属性的方法
在本公开的某些实施方案中，宠物食品的味道、风味和/或适口性属性可以通过将风味组合物与食品混合来改变或在食品制备条件下产生，如本文所述。在某些实施方案中，可以通过增加或降低与食品混合或产生的风味组合物的浓度来增强或降低一种或多种属性。在某些实施方案中，可以如本文所述评价改变食品的味道属性，并且可以基于评价结果增加或减少与食品混合或产生的风味组合物的浓度。
在本公开的某些实施方案中，可以使用体外测定法测量味道和/或适口性属性，其中测量化合物活化体外细胞在不同浓度下表达的猫钙敏感受体的能力。在某些实施方案中，受体活化的提高与化合物的味道和/或适口性属性的增加相关。在某些实施方案中，组合物单独测量或与其它化合物组合测量。在某些实施方案中，体外测定包括本申请的实施例部分中描述的体外测定。
在本公开的某些实施方案中，可以使用计算机模拟模型测量味道和/或适口性属性，其中由计算机模拟确定化合物与钙敏感受体的结合位点中的氨基酸残基相互作用的能力。在某些实施方案中，化合物调节猫钙敏感受体的能力与在计算机模拟中化合物与受体模型的结合程度相关。在某些实施方案中，组合物单独测量或与其它化合物组合测量。在某些实施方案中，计算机模拟模型包括本申请的实施例部分中描述的计算机模拟模型。
在本公开的某些实施方案中，味道和/或适口性属性可以使用一组味道测试员来测量。例如，但不作为限制，该组可以包含猫组员。在某些实施方案中，该组可包括犬组员。在某些实施方案中，宠物食品的适口性可以通过仅含有风味组合物的宠物食品的消耗来确定(例如，单碗测试(one bowl test)，一元排名(monadic ranking))。在某些实施方案中，宠物食品的适口性可通过含有本文公开的风味组合物的宠物食品对不含风味组合物或其它风味组合物的宠物食品的优先消耗来确定(例如，测试偏好、差异和/或选择的双碗测试)。
在某些实施方案中，风味组合物的适口性和/或厚味味道可以通过含有本文公开的风味组合物的水溶液对不含风味组合物或含有不同风味组合物的水溶液的优先消耗来确定(例如，双瓶测试)。例如，可以使用溶液组来比较一元暴露中一系列浓度的化合物的适口性。在某些实施方案中，溶液可含有适口性增强剂，例如L-组氨酸，作为摄入/正向促味剂，以增加基线溶液摄入，因此能够鉴定测试化合物的潜在负面影响。
每种宠物食品或乳液的摄入比率可以通过测量一种日粮(ration)消耗量除以总消耗量来确定。然后可以计算消耗比(CR)以比较一种口粮相对另一种口粮的消耗，以确定一种食品或乳液相对于另一种的优先消耗。或者或另外，摄入(g)差异可用于评估双瓶测试中两种乳液之间或两种宠物食品之间在双碗试验中在选定显著性水平下(例如在5％显著性水平下)的平均摄入差异，以确定平均摄入差异，95％置信区间。然而，可以使用任何显著性水平，例如，1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％或50％显著性水平。在某些实施方案中，百分比偏好分数，例如动物对一种乳液或食品的偏好百分比是所述乳液或食品占在该测试期间所摄入的总乳液或食品的百分比，其也可以经计算得出。
9.生成方法
在某些实施方案中，可以使用标准化学合成方法生成本公开的化合物。在某些实施方案中，化学合成方法提供纯度为至少99.999％、或至少99％、或至少95％、或至少90％、或至少85％或至少80％的化合物。在某些实施方案中，化合物可以使用标准水解方法制备，如使用酸、酶或酸和酶的组合的标准水解方法。
在某些实施方案中，本公开的化合物可以在食品制备条件下生成，例如在宠物食品的生产过程中。例如但不作为限制，本发明的化合物可以从宠物食品中存在的前体化合物在热食品过程例如灭菌、干馏和/或挤出中生成。在某些实施方案中，还可以向例如干宠物食品中加入液体和/或粉末适口剂以增强宠物食品的味道，并增加宠物食品的适口性。适口剂可以是肉(例如肝脏)的消化物(digest)和/或蔬菜的消化物，并且可以任选地包括本领域已知的其它适口剂。在某些实施方案中，化合物可以在其添加到宠物食品之前与液体和/或粉末适口剂混合或在其中产生。或者或另外，化合物可在其添加到宠物食品中之后与液体和/或粉末适口剂混合或在其中产生。
10.本公开方法的非限制性实例
在某些非限制性实施方案中，本公开提供了增加宠物食品的适口性的方法，包括将宠物食品与包含本文所述化合物的风味组合物混合，其中所述化合物以在混合物中约1pM至约10M或约1pM至约1M的浓度存在。
在某些非限制性实施方案中，本公开提供了增加宠物食品的适口性的方法，包括用包含本文所述化合物的风味组合物生产宠物食品，其中所述化合物以在产品中约1pM至约10M或约1pM至约1M的浓度存在。
在某些非限制性实施方案中，本公开提供了例如通过增加钙敏感受体的活性增加宠物食品的厚味味道的方法，包括将宠物食品与包含本文所述化合物的风味组合物混合，其中所述化合物以在混合物中0.001ppm至1000ppm的浓度存在。
在某些非限制性实施方案中，本公开提供了增加宠物食品的适口性的方法，包括将宠物食品与包含本文所述化合物的风味组合物混合，其中所述风味组合物在混合物中以约0.001ppm至1000ppm的浓度存在。
在某些非限制性实施方案中，本公开提供了例如通过增加钙敏感受体的活性增加宠物食品的厚味味道的方法，包括将宠物食品与包含本文所述化合物的风味组合物混合，其中所述风味组合物在混合物中以约0.0001w/w％至约10w/w％、或约0.001w/w％至约5w/w％或约0.01w/w％至约1w/w％的浓度存在。
在某些非限制性实施方案中，本公开提供了增加宠物食品的适口性的方法，包括将宠物食品与包含本文所述化合物的风味组合物混合，其中所述风味组合物在混合物中以约0.0001w/w％至约10w/w％、或约0.001w/w％至约5w/w％、或约0.01w/w％至约1w/w％的浓度存在。
实施例
通过参考以下实施例将更好地理解本发明公开的主题，这些实施例作为本发明的示例提供，而不作为限制。
实施例1-使用计算机模拟筛选鉴定CaSR调节剂。
本实施例描述了猫和犬钙敏感受体(CaSR)的计算机建模以鉴定推定的化合物调节剂。
计算机方法用于分析CaSR的三维结构以鉴定可用于选择性调节受体的多肽区域。基于人CaSR的晶体结构产生CaSR的捕蝇草结构域和富含半胱氨酸的结构域的结构同源模型(Geng等人2016；Zhang等人2016)。基于C类GPCR的结构产生CaSR的跨膜结构域的模型(参见Binet等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem)，282(16)：12154-63(2007)；Wu等人，科学(Science)，344(6179)：58-64(2014)；和Dore等人，自然(Nature)511：557-562(2014)；其全部内容通过引用并入本文)。同源模型使用Accelrys的Discovery Studio(DS)程序套件构建。具体地，使用来自DS的Modeller程序(参见Eswar等人，现有生物信息学方法(CurrentProtocols in Bioinformatics)，增刊15：5.6.1-5.6.30(2006)，其全部内容通过引用并入本文)。“计算机模拟”筛选(“in silico”screening)用于鉴定与CaSR结构域相互作用的化合物。
GPCR蛋白家族C组包括T1R1、T1R2、T1R3、CaSR、GabaB和mGlu蛋白。C组蛋白具有(1)大的外部结构域，称为捕蝇草(Venus Flytrap，VFT)结构域，(2)7跨膜(7TM)结构域和(3)连接VFT和7TM结构域的富含半胱氨酸的结构域。基于现在可以从蛋白质数据库(PDB，www.rcsb.org)获得的最近的hCaSR的晶体结构(Geng等人2016；Zhang等人2016)，产生猫CaSR受体的VFT和富含半胱氨酸结构域的同源模型。来自BioPredict的对接程序BioDock用于将化合物L-天冬氨酸(图3)、L-赖氨酸(图4)和谷胱甘肽(图5)由计算机模拟对接到CaSR的VFT结构域的活性位点。
图3显示当L-天冬氨酸充当激动剂时L-天冬氨酸与猫CaSR的VTF结构域的铰链区的结合。L-天冬氨酸的两性离子氮可形成Glu297的盐桥，以及连接Ala168的可能的氢键。L-天冬氨酸的两性离子羧酸根与Ser 170、Ser147和Ala168的主链羰基形成氢键。L-天冬氨酸的侧链羧酸根可以与Arg66形成盐桥相互作用。图3C中还显示了用于Sr+2和PO-3的结合位点，其在本文引用的hCSAR的晶体结构中观察到的结合离子之后被建模。
图4A-4C显示当L-赖氨酸充当正变构调节剂(PAM)时L-赖氨酸与猫CaSR的VTF结构域的铰链区的结合。两性离子主链可以与铰链上的残基形成延伸的相互作用，特别是Ser147和Glu297，而侧链氮与Glu297形成盐桥相互作用。
图5A-5C显示了L-(+)-2-氨基-3-膦酰基丙酸与猫CaSR的VTF结构域的铰链区的结合。两性离子羧基可以与Ser147形成氢键，而两性离子氮(zwitterionic nitrogen)形成与Glu297连接的盐桥和与Ala168的主链羰基连接的氢键。侧链膦基丙酸基可以与Arg66形成盐桥相互作用并且与Ser272形成另外的氢键。
图6A-6C显示了作为激动剂的谷胱甘肽(γ-Glu-Cys-Gly)与猫CaSR的VTF结构域的铰链区的结合。在铰链区中，谷胱甘肽的γ-谷氨酰残基的两性离子氮形成与Glu297连接的盐桥，而γ-谷氨酰残基的两性离子羧酸根与Ser170形成额外的氢键相互作用。谷胱甘肽的半胱氨酸残基的SH可以与Glu297形成额外的相互作用。甘氨酸残基的NH可以与Glu297或Trp299或两者的主链羰基形成氢键。谷胱甘肽的甘氨酸残基的羧基可以与His413形成盐桥相互作用，以及与Thr412形成额外的氢键相互作用。因为这些相互作用是上叶和下叶两者，所以它们可以稳定VTF结构域的封闭形式。
图7A-7C显示作为激动剂的“厚味肽”(γ-Glu-Val-Gly)与猫CaSR的VTF结构域的结合。在铰链区中，谷氨酸的两性离子羧酸根可与铰链处的残基特别是Ser147、Ser170和Thr145形成氢键。两性离子氮可与Ser170和Ala168的主链羰基形成氢键相互作用，可与Glu197形成盐桥相互作用。肽缬氨酸和甘氨酸的肽氮可各自与Glu297形成相互作用，而肽甘氨酸的两性离子羧基可与Arg66和Ser301形成盐桥相互作用。
图8A-8C显示了作为激动剂的γ-谷氨酰二肽H-γ-Glu-Tyr-OH与猫CaSR的VTF结构域的结合。在铰链区中，肽谷氨酰基(glutamatyl group)的两性离子羧酸基团(carboxylate)可与铰链处的残基特别是Ser147和Ser170形成氢键。肽谷氨酰基的两性离子氮可以与Ser170和Ser169的主链羰基形成氢键以及形成肽内的内部氢键。
肽酪氨酸基团可以通过捕蝇草的其余部分特别是Glu297、Thr145以及Ser301和Phe320的主链形成氢键相互作用。
图9A-9C显示了作为激动剂的β-天冬氨酰二肽H-β-Asp-Leu-OH与猫CaSR的VTF结构域的结合。在铰链区中，肽谷氨酰基的两性离子羧酸根可以与铰链处的残基特别是Ser147和Ser170形成氢键。肽谷氨酰基的两性离子氮可以与Ser170和Ser169的主链羰基形成氢键，以及与Glu297形成盐桥相互作用。肽亮氨酸基团的羧酸根可以与Arg66形成盐桥。
类似地，基于来自PDB的4OR2和4OO9的晶体结构产生猫CaSR 7M结构域的同源模型。4OR2是来自与负变构调节剂(NAM)结合的C组GPCR的mGluR1的跨膜结构域的晶体结构(参见Wu等人，科学(Science)，，344(6179)：58-64(2014)，其全部内容通过引入并入本文)。4OO9是与NAM结合的C组GPCR的mGluR5的跨膜结构域的晶体结构(参见Dore等人，自然(Nature)511：557-562(2014)，其通过引用整体并入本文)。使用来自BioPredict的对接程序BioDock将化合物N-(1-(4-氯苯基)乙基)-3-(4-异丙氧基苯基)-3-苯基丙-1-胺(图10)、N-(1-(4-氯苯基)乙基)-3-(4-甲氧基苯基)-4-甲基戊-1-胺(图11)、3-(呋喃-2-基)-4-苯基-N-(1-苯乙基)丁-1-胺(图12)、3-(2，2-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-3-苯基-N-(1-苯基乙基)丙-1-胺(图13)、N-((2，3-二氢苯并呋喃-2-基)甲基)-1-(喹啉-2-基)乙胺(图14)、2，6-二氯-4-(1-(((1-甲基-2-(噻吩-2-基)哌啶-3-基)甲基)氨基)乙基)苯胺(图15)、1-(4-氯苯基)-N-(2-(2，2-二甲基-4-(对甲苯基)四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)乙胺(图16)、2-(3-氰基苯基)-2-((4-氟-2，3-二氢-1H-茚-1-基)氨基)乙酸甲酯(图17)、2-(2-乙酰基-1，2-二氢异喹啉-1-基)-N-(1-(3-溴苯基)乙基)乙酰胺(图18)、1-(苯并[d]噻唑-2-基)-1-(2，4-二甲基苯基)乙醇(图19)和4-氯-N-[(1S，2S)-2-[[(1R)-1-(1-萘基)乙基]氨基](图20)在计算机模拟中对接入CaSR的7TM结构域的活性位点。
图10显示了N-(1-(4-氯苯基)乙基)-3-(4-异丙氧基苯基)-3-苯基丙-1-胺在猫CaSR的7TM结构域中的结合。图10B显示了在猫CaSR的7TM结构域中的结合位置。图10C提供了配体和7TM结构域之间相互作用的特写图。类似地，图11显示了N-(1-(4-氯苯基)乙基)-3-(4-甲氧基苯基)-4-甲基戊-1-胺在猫CaSR的7TM结构域中的的结合，图12显示了3-(呋喃-2-基)-4-苯基-N-(1-苯基乙基)丁-1-胺在猫CaSR的7TM结构域中的结合。这些化合物和其它γ-支链PAMS很好地适合猫CaSR的7TM结构域，在活性位点中获得广泛的疏水相互作用。对于这些化合物存在与Glu837连接的盐桥，并且对于其它高活性跨膜PAM观察到与Glu837连接的盐桥或氢键。对于Phe821(右)显示了环堆积相互作用，这是与大多数其它活性跨膜PAM共有的相互作用。对于这些化合物Phe775(左)，可能有额外的环堆积。
图13显示3-(2，2-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-3-苯基-N-(1-苯基乙基)丙-1-胺的结合。图13B显示了7TM结构域中结合的位置，图13C提供了配体和7TM结构域之间相互作用的特写图。如图10至图12所示，与Glu837连接的盐桥，被视为与Phe821的关键环堆积相互作用以及与Phe775可能的额外环堆积相互作用。
图14显示N-((2，3-二氢苯并呋喃-2-基)甲基)-1-(喹啉-2-基)乙胺的结合。图14B显示了7TM结构域中结合的位置，图14C提供了配体和7TM结构域之间相互作用的特写图。虽然化合物的类别与图10至图13中突出显示的类别不同，但是对结合模式的类似观察也适用。该化合物很好地填充活性位点，在整个活性位点显示出广泛的疏水相互作用。显示了与Glu837的盐桥相互作用，被视为与Phe821的环堆积相互作用以及与Phe775可能的额外环堆积相互作用。
图15显示2，6-二氯-4-(1-(((1-甲基-2-(噻吩-2-基)哌啶-3-基)甲基)氨基)乙基)苯胺的结合。图15B显示了7TM结构域中结合的位置，图15C提供了配体和7TM结构域之间相互作用的特写图。如图10至图14所示，与Glu837连接的盐桥具有碱性氮。取决于活性位点的轻微移动取代的苯基的环堆积可以在PHE821或Phe688上。
图16显示1-(4-氯苯基)-N-(2-(2，2-二甲基-4-(对甲苯基)四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)乙胺的结合。图16B显示了7TM结构域中结合的位置，图16C提供了配体和7TM结构域之间相互作用的特写图。如图10至图15所示，与Glu837连接的盐桥具有碱性氮。取代的苯基在Phe688和/或Phe821上的环堆积是可能的。随着活性位点的轻微移动，在Phe775上的环堆积是可能的。四氢吡喃增加了额外的疏水接触。
图17显示2-(3-氰基苯基)-2-((4-氟-2，3-二氢-1H-茚-1-基)氨基)乙酸甲酯的结合。图17B显示了7TM结构域中结合的位置，图17C提供了配体和7TM结构域之间相互作用的特写图。如图10至图16所示，与Glu837连接的盐桥具有碱性氮。存在取代的苯基在Phe821上的环堆积。随着活性位点的轻微移动，在Phe775上的环堆积是可能的。酯指向Phe688上方的疏水袋。
图18显示2-(2-乙酰基-1，2-二氢异喹啉-1-基)-N-(1-(3-溴苯基)乙基)乙酰胺的结合。图18B显示了7TM结构域中结合的位置，图18C提供了配体和7TM结构域之间相互作用的特写图(close-up view)。与Glu837的氢键在图17中显示为配体酰胺氮。存在取代的苯基在Phe821上的环堆积。
图19显示1-(苯并[d]噻唑-2-基)-1-(2，4-二甲基苯基)乙醇的结合。图19B显示了7TM结构域中结合的位置，图15C提供了配体和7TM结构域之间相互作用的特写图。与Glu837的氢键在图19C中显示为配体羟基。取代的苯基在Phe821和/或Phe688上的环堆积是可能的。苯并[d]噻唑在Phe688上的额外环堆积是可能的。
图20显示了作为拮抗剂的4-氯-N-[(1S，2S)-2-[[(1R)-1-(1-萘基)乙基]氨基](Calhex 231)的结合。图20B显示了7TM结构域中结合的位置，图20C提供了配体和7TM结构域之间相互作用的特写图。如图10至图19所示，与Glu837连接的盐桥具有碱性氮。定位萘以提供与芳族残基的可能的环堆积相互作用，如图20C所示。该化合物的其余部分在整个活性位点产生广泛的疏水相互作用，可能与Phe775形成环堆积相互作用。
参考文献：
1.Binet等人，“A类和C类G蛋白偶联受体中的跨膜螺旋结构域功能的共同结构要求(Common Structural Requirements for Heptahelical Domain Function in Class Aand Class CG Protein-coupled Receptors.)”(2007)化学生物杂志(J.Biol.Chem)，282(16)：12154-63。
2.Wu等人，“与变构调节剂结合的C类GPCR代谢型谷氨酸受体1的结构(Structureof a Class C GPCR Metabotropic Glutamate Receptor 1Bound to an AllostericModulator.)”(2014)科学(Science)，344(6179)：58-64。
3.Dore等人，“C类GPCR代谢型谷氨酸受体5跨膜结构域的结构(Structure ofclass C GPCR metabotropic glutamate receptor 5transmembrane domain.)”(2014)自然(Nature)511：557-562。
4.Eswar等人，现有生物信息学方法(Current Protocols in Bioinformatics)，增刊15：5.6.1-5.6.30(2006)。
实施例2-在体外活化钙敏感受体的化合物。
本实施例描述了在体外通过化合物活化猫CaSR。
使用双注射方案通过体外功能表征鉴定可以作为CaSR激动剂(AGO)、正变构调节剂(PAM)和/或拮抗剂起作用的化合物。
方法：使用可诱导表达猫CaSR(f：CaSR)转基因构建体的HEK293TRex/nat-Clytin细胞筛选119种测试化合物，以鉴定调节f：CaSR活性的化合物。将不表达CaSR的细胞(即，未诱导的转基因细胞或用空质粒载体转染的模拟对照细胞(mock control cell))用作对照。将HEK293细胞以10000个细胞/孔接种于384MTP中。细胞接种后24小时，在室温下将细胞加入到具有10μm腔肠素(coelenterazine)的测定缓冲液(20μL/孔)中4h。在初级分析中测试每种化合物在100mM(1M×10-1)至0.01μM(1M×10-8)浓度范围内活化CaSR的能力。每种化合物活化由HEK293细胞表达的f：CaSR的能力通过在根据以下方案以激动剂模式和PAM模式使细胞与化合物接触后使用Tetra筛选系统测量发光来确定：
AGO/PAM模式(双注射)：注射10μl/孔的测试化合物(3倍浓度)和对照并测量发光(即，AGO活性)。5分钟后，以对应于激动剂EC20(3倍浓缩)(15μl/孔)的浓度注射CaCl2，其中测量发光(即PAM活性)。
激动剂测试的对照是15mM CaCl2(EC100，阳性对照)和0mM CaCl2(阴性对照)。
PAM测试的对照是0.9mM CaCl2(EC20)+Calindol增强剂(阳性对照)、0.9mM CaCl2(EC20，阴性对照)和卡林多(Calindol)增强剂(阴性对照)。
用于初级分析的对照细胞系是未诱导的转基因HEK细胞。
进一步测试在初级分析测试中作为激动剂、拮抗剂或PAM调节CaSR活性的化合物以确定EC 50或IC 50。在这些研究中，使用的对照细胞系是未用CaSR转基因转染的模拟HEK细胞系。卡巴胆碱(内源性表达的毒蕈碱受体的激动剂)用于确定HEK细胞的参考活性水平。
使用Genedata Screener软件的分析器模块进行数据分析。
·动力学响应值(KRV)∶[最大值(2s∶90s)]-[基线]]。注射后动力学轨迹的最大RLU减去注射前的点的中值。
·通过刺激物对照标准化的KRV(即阳性对照)减去中性对照(即未诱导或模拟参照细胞的活性)，应用下式，表示测试化合物的活性[％]：
其中：
x是孔的计算信号值(KRV)。
<>表示通过平板测定参考孔的计算信号值(KRV)的中值。
标准化将化合物活性值置于等效标度上，并使它们在平板上可比较。因此，化合物活性值被缩放(基于两个参照)到共同范围(两点标准化)。
结果：在激动剂和PAM模式下获得初步分析结果(数据未显示)。基于初步分析，选择54种化合物用于进一步研究以确定EC 50或IC 50。在激动剂模式下配体活化/抑制CaSR的剂量响应曲线和用于EC50/IC50分析的PAM模式的剂量响应曲线显示在图21中。
如图21所述，测试的配体中的23个作为激动剂活化CaSR，27个作为PAM活化CaSR，并且2个作为拮抗剂活化CaSR。对于每种配体，测定EC 50或IC 50值。术语半数最大有效浓度(EC 50)(或半数最大抑制浓度，IC 50)是指在指定的暴露时间后在基线和最大值之间诱导响应的一半的化合物浓度。表3提供了选择用于进一步研究的52种化合物中的每一种的化学结构和结果(来自初级分析的54种活性化合物的剩余2种化合物L-精氨酸和L-赖氨酸的PAM分析，示于实施例3中)。
表3.CaSR活性化合物
实施例3-在体外活化钙敏感受体的氨基酸。
本实施例描述了在体外通过氨基酸活化猫CaSR。
通过使用单注射方案的体外功能表征鉴定可以作为CaSR PAM起作用的氨基酸。评估了化合物在活化CaSR中的有效性。
方法：使用可诱导表达猫CaSR(f∶CaSR)转基因构建体的HEK293TRex/nat-Clytin细胞筛选30个氨基酸，以鉴定调节f∶CaSR活性的化合物。将不表达CaSR的细胞(即，用空质粒载体转染的模拟对照细胞)用作对照。将HEK293细胞以10000个细胞/孔接种于384MTP中。细胞接种后24小时，在室温下将细胞加入到具有10μm腔肠素的测定缓冲液(20μL/孔)中4h。在PAM模式中在5mM或10mM浓度的30种氨基酸中的每一种存在下测定钙的剂量响应曲线，以确定钙的EC50的变化。单独使用CaCl2作为对照。
PAM模式(单次注射)：将测试化合物(6倍浓缩)和CaCl2(6倍浓缩)在化合物板上以1∶1直接混合，得到每种测试化合物和对照的3倍浓缩工作溶液。注入10μl/孔的测试化合物或对照工作混合物，并测量发光(即PAM活性)。
结果：获得了30种氨基酸的PAM测试结果(数据未显示)。鉴定出4种氨基酸为PAM：L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-赖氨酸，这是由于所获得的钙的EC50值显著降低。图19A-19B显示了四种氨基酸的CaSR的体外活化的剂量响应曲线。表4提供了使用单次注射方案的具有PAM活性的4种氨基酸的化学结构和结果。
表4.CaSR PAM活性氨基酸
实施例4-具有至少三种氨基酸的示例性风味组合物。
本实施例描述了风味组合物，其包含活化猫鲜味(T1R1/T1R3)受体的第一氨基酸、活化猫钙敏感受体的第二氨基酸、以及活化除鲜味和钙敏感受体之外的猫味觉受体的第三氨基酸。
风味组合物含有活化猫鲜味受体的第一氨基酸，其选自表4中的第一组氨基酸。风味组合物还含有活化猫钙敏感受体的第二氨基酸，其选自表4中的第二组氨基酸。风味组合物还含有第三种氨基酸，其选自表5中的第三组氨基酸。第三组氨基酸对猫具有味道活性，但不活化猫鲜味受体或钙敏感受体。
表5.氨基酸
据认为组合来自这些组中的每一组的氨基酸可具有加成或协同关系。这种组合可用于开发用于猫的味觉谱。
此外，可以应用类似的技术来开发用于犬和/或人类的味觉谱。发现活化人钙敏感受体的化合物不一定能激活猫钙敏感受体。表6列出了这些化合物。
表6.猫和人中味觉受体活性化合物的差异的实例。
如表6所示，某些对猫钙敏感受体无活性的化合物对另一种味觉受体具有活性。例如，L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸和L-丙氨酸不会活化猫钙敏感受体，但对猫来说具有鲜味活性。使用这些信息，可以根据待活化的味觉受体例如与猫钙敏感受体相比的人钙敏感受体，开发不同的味觉谱。
值得注意的是，比较人CaSR和猫CaSR的晶体结构在活性位点上显示出非常小的差异(在我们已经建模的氨基酸的4A中，没有一个残基在人和猫之间的同一性上不同)。因此值得注意的是，猫CaSR在其对氨基酸作为激动剂和/或PAMS的偏好方面具有一定的差异，这强调的事实是本文提供的结果是关于人CaSR的现有技术重要的扩展。
***
尽管已经详细描述了本发明公开的主题及其优点，但应该理解，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种改变、替换和变更。此外，本申请的范围不旨在限于说明书中描述的过程、机器、制造和物质组合物、装置、方法和步骤的特定实施例。本领域普通技术人员将从本发明公开的主题、过程、机器、制造、物质组合物、装置、方法或步骤的公开内容容易地理解，可以根据本发明公开的主题利用与本发明描述的相应实施方案执行基本相同的功能或实现基本相同的结果的目前存在或稍后开发的内容。因此，所附权利要求旨在在其范围内包括这样的过程、机器、制造、物质组合物、装置、方法或步骤。
在本申请全文中引用了专利、专利申请、出版物、产品描述和方案，其公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。

Claims (50)

1.一种风味组合物，所述风味组合物包含第II族元素的二价或三价盐。
2.如权利要求1所述的风味组合物，其中第II族元素选自由铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)及它们的组合组成的组。
3.如权利要求2所述的风味组合物，其中所述第II族元素是镁(Mg)或锶(Sr)。
4.一种风味组合物，所述风味组合物包含镧系元素的二价或三价盐。
5.如权利要求4所述的风味组合物，其中所述镧系元素选自由镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镏(Lu)及它们的组合组成的组。
6.如权利要求5所述的风味组合物，其中所述镧系元素是钆(Gd)、镨(Pr)或铽(Tb)。
7.一种风味组合物，所述风味组合物包含式Vft-1a或Vft-1b的化合物：
其中
n的范围为1至6；
n6和n7各自独立地为1或2；
X1和X2独立地为氧或硫；
R1和R2独立地选自由H、CH3、支链或非支链低级烷基(C1-C8)、(CH2)n2芳基、(CH2)n2杂芳基、芳基、杂芳基、c-C3H5、c-C4H7、c-C5H9、c-C6H11和(CH2)n3环烷基(C3-C6)组成的组；
Y、R3和R4独立地选自由H、OH、CH3和支链或非支链低级烷基(C1-C10)组成的组；
R5和R6独立地选自由H、OH、支链或非支链低级烷基(C1-C6)、O(CH2)n4芳基、O(CH2)n4杂芳基、NR7R8、N(R9)OH、芳基和杂芳基组成的组；
R7和R8独立地选自由H、OH、CH3和支链或非支链低级烷基(C1-C10)组成的组；
R9、R11、R12和R13独立地选自由H、CH3、支链和非支链的低级烷基(C1-C10)组成的组；
n2、n3和n4独立地在0至4的范围内；
n5是0、1或2；并且
芳基和烷基(支链和非支链两者)基团任选地被CH3、OH、SH、OCH3、SCH3、COOH、COOR13、S(O)n5R1、C(O)R11、C(O)NR11R12、CN、NR11R12、NR11C(O)R12、芳基、亚甲二氧基、烷基(C1-C5)、CH2SSCH2CH(COOH)(NH2)、卤素(F、Cl、Br、I)、NO2、NHC(＝NH)NH2、CHO、CF3、P(＝X1)(OR1)2或OP(＝X1)(OR1)2取代。
8.一种风味组合物，所述风味组合物包含具有以下结构的式Vft-2的化合物：
其中
n的范围为0至6；
W选自由CR6R7、O、S、S(O)n2、Se、Se(O)n2、P(X2)(OR1)2、OP(X2)(OR1)2、NH2、NHC(＝NH)NH2、Ph、吲哚和杂芳基组成的组；
X1选自由H、CH3、低级烷基(C1-C6)、(CH2)n3芳基、(CH2)n3杂芳基、芳基、杂芳基、OH、NR1R2、NH(＝C)NR1R2、苯基、对羟基苯基、吲哚、SR1、OR1、COOR1、S(O)n2、四唑、咪唑、P(＝X2)(OR1)2和OP(＝X2)(OR1)2组成的组；
X2是氧或硫；
R1和R2独立地选自由H、支链或非支链低级烷基(C1-C8)、(CH2)n2芳基、(CH2)n2杂芳基、芳基、杂芳基、c-C3H5、c-C4H7、c-C5H9、c-C6H11和(CH2)n3环烷基(C3-C6)组成的组；
R3、R4、R6、R7、R11、R12和R13独立地选自由H、CH3、支链和非支链的低级烷基(C1-C10)组成的组；
R5选自由H、OH、支链或非支链低级醇盐(C1-C6)、OCH3、OEt、OCH2Ph、O(CH2)n4芳基、O(CH2)n4杂芳基、NR6R7、N(R8)OH、O-芳基和O-杂芳基组成的组；
芳基和烷基(支链和非支链两者)基团任选被CH3、OH、SH、OCH3、SCH3、COOH、COOR13、S(O)n2R1、C(O)R11、C(O)NR11R12、CN、NR11R12、NR11C(O)R12、芳基、亚甲二氧基、烷基(C1-C5)、CH2SSCH2CH(COOH)(NH2)、卤素(F、Cl、Br、I)、NO2、NHC(＝NH)NH2、CHO、CF3、P(＝X2)(OR1)2、或OP(＝X2)(OR1)2取代；
R8是H或CH3；
n2的范围为0至2；并且
n3和n4独立地范围为0至4。
9.如权利要求8所述的风味组合物，其中式Vft-2的化合物为(R)立体异构体。
10.如权利要求8所述的风味组合物，其中式Vft-2的化合物为(S)立体异构体。
11.一种风味组合物，所述风味组合物包含选自由以下氨基酸中的一种或多种组成的组：甘氨酸、肌氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、高苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、ABU、硒代半胱氨酸、Se-(甲基)硒代半胱氨酸、鸟氨酸、硫代脯氨酸、青霉胺、及5，5-二甲基噻唑烷-4-羧酸、二氨基丙酸和β-丙氨酸。
12.如权利要求11所述的风味组合物，其中谷氨酸和天冬氨酸的酰胺键通过α-羧酸基团或侧链羧酸基团形成。
13.如权利要求11所述的风味组合物，其中谷氨酸和天冬氨酸的游离羧酸基团被酯化以提供低级烷基酯。
14.如权利要求11所述的风味组合物，其中含有硫或硒的氨基酸被氧化以提供S(O)n3、Se(O)n3，以及选自由S(N＝O)和Se(N＝O)组成的组的亚硝基类物质。
15.如权利要求11所述的风味组合物，其中含有硫或硒的氨基酸被氧化，以提供相应的同型二聚体和异二聚体二硫化物和二硒化物。
16.如权利要求11所述的风味组合物，其中含有硫或硒的氨基酸在硫或硒上烷基化。
17.一种风味组合物，所述风味组合物包含具有以下结构的式Vft-3的化合物：
其中AA1和AA2独立地是权利要求3中列出的任意氨基酸，或者具有以下结构的式Vft-3b的氨基酸：
其中
n的范围为0至6；
n1和n2独立地为0、1、2或3；
n3为0、1或2；
n4的范围为1至6；
n5为0、1、2或3；
W选自由O、S、S(O)n3、Se、Se(O)n3、OP(O)(OH)2、NR1R2、CR1R2和CH2组成的组；
R1、R2、R3、R4选自由H、CH3、低级烷基(C1-C6)、(CH2)n2吲哚、(CH2)n2芳基、(CH2)n2杂芳基和OH、COOH组成的组；
R5选自由H、CH3、低级烷基(C1-C6)、C(O)C1-C6、C(O)芳基、C(O)杂芳基、C(O)OC1-C6、C(O)CH(OH)CH3、C(O)OCH2芳基、(CH2)n2吲哚、(CH2)n2芳基、(CH2)n2杂芳基、亚硝基、OH、芳基和吲哚组成的组；
其中如果AA1或AA2含有硫或硒，则所述氨基酸任选地被氧化以提供S(O)n2、Se(O)n2、S(N＝O)或Se(N＝O)；
其中如果AA1或AA2含有硫或硒，则所述氨基酸任选地在硫或硒上烷基化。
其中芳基和烷基(支链和非支链两者)基团任选地被甲基、OH、SH、OCH3、SCH3、COOH、COOR13、S(O)n3R1、C(O)R11、C(O)NR11R12、CN、NR11R12、NR11C(O)R12、芳基、亚甲二氧基、烷基(C1-C5)、CH2SSCH2CH(COOH)(NH2)、卤素(F、Cl、Br、I)、NO2、NHC(＝NH)NH2、CHO、CF3、P(＝X1)(OR1)2、OP(＝X1)(OR1)2取代；并且
其中R11、R12和R13独立地等于H、CH3、支链或非支链的低级烷基(C1-C10)。
18.如权利要求17所述的风味组合物，其中式Vft-3的化合物是(R)立体异构体。
19.如权利要求17所述的风味组合物，其中式Vft-3的化合物是(S)立体异构体。
20.如权利要求17所述的风味组合物，其中式Vft-3的化合物是双官能团氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)，其中酰胺键形成在α羧酸基团或侧链羧酸基团处。
21.一种风味组合物，所述风味组合物包含具有以下结构的式Vft-4的化合物：
其中
n1的范围为1至550；
n2的范围为0至5；
R选自由NR1R2、C(＝N)NH2、NR1C(＝NR2)NR3R4和咪唑组成的组；
R1、R2、R3、R4独立地选自由H、CH3和低级烷基(C1-C6)组成的组。
22.如权利要求17所述的风味组合物，其中式Vft-4的化合物包含一种或多种单独的化合物(例如，在混合物中)，其中每种单独的化合物由式Vft-4定义。
23.一种风味组合物，所述风味组合物包含具有以下结构的式Vft-5的化合物：
R1-AAn-R2，
其中n为1-550；
其中每个AA独立地选自由权利要求3中列出的氨基酸组成的组；
其中R1选自由H、C(＝O)低级烷基(C1-C6)、苄氧羰基(Cbz)、C(＝O)O低级烷基(C1-C6)、C(＝O)芳基、C(＝O)OEt、C(＝O)OCH3、C(＝O)OC(CH3)3、芴甲氧羰基(Fmoc)、C(CH3)3、CH2Ph、C(＝O)OCH＝CH2、对甲氧基苯基、对硝基苯基、C(Ph)3、C(＝O)OCH2CCl3和C(＝O)CH3组成的组；
其中R2选自由OH、NR2aR3a、OCH3、O(C1-C6)、OCH2芳基和C(CH3)3组成的组；并且
其中R2a和R3a独立地选自由H、支链或非支链低级烷基(C1-C8)和CH2苯基组成的组。
24.一种风味组合物，所述风味组合物包含具有以下结构的式Vft-6的化合物：
其中
n1至n6独立地在0至6的范围内，使得当n1至n6中的一个或多个等于0时，其表示链终止；
R1至R12独立地选自由H、CH3、支链或非支链低级烷基(C1-C6)、CH2CH＝CH2、芳基、苯基、CH2芳基和CH2Ph组成的组；
Ra至Rf独立地选自由H、CH3、支链或非支链的低级烷基(C1-C6)、CH2CH＝CH2、芳基、苯基、CH2芳基、CH2Ph和(CR13R14)n7NR15R16组成的组；并且
n7的范围为2至6；
R13和R14独立地选自由H、CH3、支链或非支链低级烷基(C1-C6)、CH2CH＝CH2、芳基、苯基、CH2芳基和CH2Ph组成的组；并且
R15和R16独立地选自由H、CH3、支链或非支链低级烷基(C1-C6)、CH2CH＝CH2、芳基、苯基、CH2芳基和CH2Ph组成的组；并且
其中，任选地，式Vft-6的化合物包含环状结构，其中虚线表示两个末端原子之间的共价键。
25.一种风味组合物，所述风味组合物包含式Vft-6.5a、Vft-6.5b或Vft-6.5c的化合物：
其中
n的范围为1至3；
n1的范围为0至4；
R3、R4、R5和R6各自独立地选自由H、低级烷基(C1-C6支链或非支链)、芳烷基(即CH2Ph)、芳基、Ph、杂芳基和P(＝X3)OR7R8组成的组；
R7和R8各自独立地选自由H、低级烷基(C1-C6支链或非支链)、芳烷基(即CH2Ph)、芳基、Ph和杂芳基组成的组；
R1和R2各自独立地选自由H、CH3、低级烷基C1-C6、杂芳基、(CH2)n1芳基和(CH2)n1杂芳基组成的组；
R独立地选自由H、OH、CH3、低级烷基C1-C6、杂芳基、(CH2)n1芳基、(CH2)n1杂芳基、CH2CH＝CH、低级烯烃和低级炔烃组成的组；并且
X1、X2、X3各自独立地选自由O和S组成的组。
26.一种风味组合物，所述风味组合物包含一种或多种氨基糖苷类抗生素，所述氨基糖苷类抗生素选自由以下组成的组：新霉素、妥布霉素、庆大霉素、核糖霉素、巴龙霉素、抗生素遗传霉素、阿米卡星、链霉素、新霉胺、巴龙霉胺、安普霉素、丁苷菌素B、利维霉素A、卡那霉素A、卡那霉素B、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素C1、庆大霉素C2、遗传霉素、西索米星、阿贝卡星、阿司米星、卡那霉素B、地贝卡星、二双氢链霉素、爱萨霉素、潮霉素B、异帕米星、春日霉素、莱高霉素、利维霉素、小诺米星、新霉胺、新霉素、奈替米星、诺尔丝菌素、普拉佐米星、妥布霉素、妥妥霉素和威达米星。
27.一种风味组合物，所述风味组合物包含与CaSR的捕蝇草(VFT)结构域相互作用位点中一个或多个氨基酸相互作用的化合物，所述氨基酸选自由以下组成的组：Tyr218、Thr145、Ser147、Ala168、Ser170、Asp190、Glu297、Ala298、Ser272、His413、Thr412、Trp299、Asn64、Phe65、Asn102、Ser169、Gln193、Asp216、Ala300、Ser302、Leu304、Tyr411及它们的组合。
28.一种风味组合物，所述风味组合物包含与CaSR的7跨膜(7TM)结构域相互作用位点中一个或多个氨基酸相互作用的化合物，所述氨基酸选自由以下组成的组：Phe684、Gly685、Phe688、Gln735、Met771、Ala772、Phe775、Leu776、Thr780、Phe814、Val817、Trp818、Phe821、Glu837、Ala840、Ile841及它们的组合。
29.一种风味组合物，所述风味组合物包含选自由下式组成的组的化合物：
其中
G1至G4独立地为C(R4aR4b)或N(R4)；
W是OR4或SR4；
X是O或S；
X1至X10独立地为C或N；
X11是C、O、N或S；
X12是O、NH或S；
X13是CR4aR4b、O、N(R12)或S；
Z是H、O、N、S或C；
n1、n2和n3独立地在0至4的范围内，使得当n1或n2为0时，它表示化学键；
n4的范围为0至2；
n5的范围为1至3；
R1、R1a、R1b和R1c独立地选自由H、CH3、CF3、CBr3、支链或非支链低级烷基(C1-C6)、环烷基(C3-C6)、COOR13、C(O)NR16R17和SO2NR4aR4b组成的组；并且
R2选自由CH3、CF3、CBR3、NO2、低级烷基(C1-C6)、环烷基(C3-C6)、芳基和杂芳基组成的组；
其中环A和B，以及任何芳环，能够任选独立地被官能团R3和/或R7取代，其中R3和R7独立地选自由以下组成的组：H、OH、支链或非支链低级烷基(C1-C6)、O(CH2)n3芳基、O(CH2)n3杂芳基、NR10R11、N(R12)OH、芳基、杂芳基、甲基、OH、SH、OCH3、SCH3、COOH、COOR13、S(O)n4R14、C(O)R15、C(O)NR16R17、CN、NR18R19、NR20C(O)R21、芳基、亚甲二氧基、烷基(C1-C5)、CH2SSCH2CH(COOH)(NH2)、卤素(包括F、Cl、Br或I)、NO2、NHC(＝NH)NH2、CHO、CF3、P(＝X1)(OR1)2、OP(＝X1)(OR1)2、四唑、C(O)N(R12)OH、CF3、OR4、SR4、N＝C＝S、N＝C＝O、C(R4)＝C(R4a)R4b、(CH2)n1CH＝CH2、NHC(＝X12)NH2、NHC(＝X12)NHR4、SO2NR4aR4b和C CR4；
R4、R4a和R4b独立地选自由H、CH3、低级烷基(C1-C6)、环烷基(C3-C6)、苯基、芳基和杂芳基组成的组；
R5、R6、R8和R9独立地选自由H、CH3、支链或非支链低级烷基(C1-C10)、芳基、杂芳基、苯基、吡啶基、呋喃、吡喃、噻吩、(CH2)n芳基、(CH2)n杂芳基、四氢吡喃组成的组，其中n为0-4，并且当n为0时，这意味着化学键；
R10和R11独立地选自由H、CH3、低级烷基(C1-C6)、苯基组成的组；
R12是H或CH3；
R13选自由H、CH3、低级烷基(C1-C6)和CH2芳基组成的组；
R14选自由H、CH3、低级烷基(C1-C6)和OH组成的组；
R15选自由H、CH3、CF3、低级烷基(C1-C6)和苯基组成的组；
R16、R17、R18、R19、R20和R21各自独立地选自由H、CH3、低级烷基、苯基、CH2苯基和环烷基(C1-C6)组成的组；
R22选自由H、C(X)R4组成的组，并且当R22不存在时，环A为芳香族；
J选自由以下组成的组：芳基、苯基、吡啶基、呋喃、噻吩、吡咯、苯并噻吩、苯并噻唑、苯并咪唑、苯并[d]唑、苯并呋喃、吲哚、喹啉、异喹啉、喹唑啉、喹喔啉、噌啉、噻唑并[4，5-c]吡啶、噻唑并[5，4-d]嘧啶、唑并[5，4-d]嘧啶和唑并[5，4-b]吡啶；
芳基1选自由苯基、呋喃、噻吩、吡咯、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、吲哚、喹啉、异喹啉、杂芳基和芳基组成的组；并且
Q选自由芳基、杂芳基、环烷基(C1-C7)和茚满基组成的组。
30.一种风味组合物，所述风味组合物包含
(a)第一氨基酸，选自由色氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、天冬酰胺及它们的组合组成的组；
(b)第二氨基酸，选自由谷氨酸、谷氨酸单钠、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸及它们的组合组成的组；以及
(c)第三氨基酸，选自由苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、羟基-L-脯氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、鸟氨酸、牛磺酸及它们的组合组成的组。
31.一种食品，所述食品包含权利要求1-29中任一项所述的风味组合物，其中所述风味组合物以如由一组味道测试员所确定的有效增加所述食品的厚味味道的量存在。
32.一种食品，所述食品包含权利要求1-29中任一项所述的风味组合物，其中所述风味组合物以如由一组味道测试员所确定的有效增加所述食品的适口性的量存在。
33.如权利要求30或31所述的食品，其中所述风味组合物在所述食品中以约1pM至约10M、约1pM至约1M、约0.0001w/w％至约10w/w％、约0.001w/w％至约5w/w％、或约0.01w/w％至约1w/w％的浓度存在。
34.如权利要求30-32中任一项所述的食品，其中所述食品包括宠物食品。
35.如权利要求33所述的食品，其中所述宠物食品是猫宠物食品或犬宠物食品。
36.如权利要求33所述的食品，其中所述宠物食品是湿宠物食品。
37.如权利要求33所述的食品，其中所述宠物食品是干宠物食品。
38.一种增加食品中厚味味道强度的方法，所述方法包括将食品与权利要求1-29中任一项所述的风味组合物混合，其中所述风味组合物以如由一组味道测试员确定的有效增加食品厚味味道的量存在。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述风味组合物在混合物中以约1pM至约10M、约1pM至约1M、约0.0001w/w％至约10w/w％、约0.001w/w％至约5w/w％、或约0.01w/w％至约1w/w％的浓度存在。
40.一种调节钙敏感受体(CaSR)活性的方法，所述方法包括使CaSR与权利要求1-29中任一项所述的风味组合物接触。
41.一种鉴定调节CaSR活性的组合物的方法，所述方法包括：
(a)使测试剂与CaSR接触，
(b)检测所述测试剂与所述CaSR的捕蝇草(VFT)结构域相互作用位点、所述CaSR的7跨膜(7TM)结构域相互作用位点或它们的组合中的一个或多个氨基酸之间的相互作用，以及
(c)选择与一个或多个氨基酸相互作用的测试剂作为组合物。
42.如权利要求40所述的方法，其中(b)包括检测所述测试剂与所述CaSR的捕蝇草(VFT)结构域相互作用位点中的一个或多个氨基酸之间的相互作用，所述氨基酸选自由以下组成的组：Asn64、Phe65、Asn102、Thr145、Ser147、Ala168、Ser169、Ser170、Asp190、Gln193、Asp216、Tyr218、Ser272、Glu297、Ala298、Trp299、Ala300、Ser302、Leu304、Tyr411、Thr412、His413及它们的组合。
43.如权利要求40所述的方法，其中(b)包括检测所述测试剂与所述CaSR的7跨膜(7TM)结构域相互作用位点中的一个或多个氨基酸之间的相互作用，所述氨基酸选自由以下组成的组：螺旋3上的Phe684、Gly685和/或Phe688，螺旋4上的Gln735，螺旋5上的Met771、Ala772、Phe775、Leu776和/或Thr780，螺旋6上的Phe814、Va1817、Trp818和/或Phe821，和/或螺旋7上的Glu837、Ala840和/或Ile841，及它们的组合。
44.如权利要求40所述的方法，所述方法还包括在步骤(a)之后确定所述CaSR的活性。
45.如权利要求40-43中任一项所述的方法，所述方法还包括使CaSR配体与所述CaSR接触。
46.如权利要求40-44中任一项所述的方法，其中步骤(c)还包括选择增加所述CaSR活性的测试剂作为组合物。
47.如权利要求40所述的方法，其中所述相互作用通过定点诱变、x射线结晶学、x射线光谱学、核磁共振(NMR)、交联评估、质谱、电泳、置换分析及它们的组合来确定。
48.一种鉴定调节CaSR活性的组合物的方法，所述方法包括：
(a)使CaSR激动剂与CaSR接触，并测定所述CaSR的活性，
(b)使测试剂与所述CaSR接触，并测定所述CaSR的活性，以及
(c)当(b)的活性大于(a)的活性时，选择所述测试剂作为组合物。
49.如权利要求40-47中任一项所述的方法，其中CaSR由细胞表达，并且其中所述测试剂与所述细胞接触。
50.如权利要求48所述的方法，其中所述细胞表达钙结合发光蛋白。
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