CN110218739B - 一种监测pre-mRNA剪接过程报告基因影像探针及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种监测pre‑mRNA剪接过程报告基因影像探针及其构建方法。所述的探针包括载体pCDNA3.1(+)、基因片段BD、Rluc intron、AD，载体pG5 luc，所述的基因片段BD、Rluc intron、AD按照BD‑Rluc intron‑AD顺序与线性化的pcDNA3.1(+)载体重组。本发明的报告基因分子影像探针可以模拟活体pre‑mRNA加工为成熟mRNA的过程，为模拟活体pre‑mRNA加工过程的动态变化提供了一种实时、无创的监测工具，同时为作用于剪接体的药物研究提供了有效的筛选工具。

Description

一种监测pre-mRNA剪接过程报告基因影像探针及其构建方法

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，涉及一种监测pre-mRNA剪接过程的基因影像探针及其构建方法，具体为一种BD-Rluc intron-AD/pG5 luc报告基因影像探针。

背景技术

真核生物中，DNA携带的遗传信息从转录到翻译成蛋白质的过程中，前体信使RNA(pre-mRNA)的剪接起着非常关键的作用，pre-mRNA的剪接失调是产生许多疾病的根本原因。pre-mRNA的剪接遵循GU-AG规则，通过生物体内的顺式作用元件和反式作用因子调节进行调控,剪接的发生取决于对内含子-外显子边界连接的短共有序列的识别，并由一系列的剪接体核小核糖核蛋白颗粒(snRNPs，由U1，U2，U4，U5，U6，U11，U12，U4atac和U6atac组成)和多种蛋白质形成的RNA-蛋白质复合物参与完成。剪接体装配严格依赖内含子的保守序列元件5'剪接位点、分支点序列(branch point sequence，BPS)和3'剪接位点的存在进行。

内含子保留(intron retention,IR)是内含子被转录成pre-mRNA并且保留在成熟mRNA中，此过程被认为是错误剪接的结果，导致内含子序列不能从前体信使RNA中移除。IR能够加速生物体生理生化进程的快速反应，参与许多疾病发病机理的调控，并且也可以在mRNA内引入能够产生蛋白的功能元件。研究表明，IR存在于大多数哺乳动物的生命进程中，至少有30％人类的基因受到IR的调控作用。为了研究pre-mRNA剪接的生物学功能，开发用于治疗与剪接相关的疾病的治疗药物，有必要研究这些剪接或未剪接的前mRNA在哺乳动物基因表达中的表达变化。

传统检测mRNA水平的基因表达是通过生物化学的方法在体外进行分析，包括RNA印迹，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)，微阵列和放射自显影。随着人类基因组序列和许多其他基因组计划的完成，RNASeq被用于RNA的分析。然而，由于mRNA快速降解，传统的实验方法检测内含子保留的转录物的水平极低或根本不能检测。此外，这些方法需要细胞破坏，并且不能重复提供mRNA表达的动态变化，反映细胞生物进程中mRNA的特征。而动态监测mRNA的变化对于评估体内mRNA加工模式是至关重要的。

目前，尽管已经使用了多种放射性标记的反义寡核苷酸进行mRNA成像，但放射性标记的反义寡核苷酸受限于它与血清蛋白非特异性结合，难以穿过细胞膜，还有一些对核酸酶敏感等，很难特异性准确检测mRNA的含量。分子成像提供了一种强有力的工具，通过引入各种成像技术，可以非侵入性地研究pre-mRNA剪接和在完整细胞或器官中的功能。申请人开发了一种分子成像系统，将具有68bp核苷酸的嵌合内含子插入到萤火虫荧光素酶基因5’端核苷酸第的834位，以监测pre-mRNA体外和体内的剪接过程。尽管剪接成像系统成功地监测了生物体中的前pre-mRNA的剪接，但这种报告基因在剪接抑制剂存在是信号关闭的系统，无法区分减少的信号是否来自实质性的前mRNA剪接还是仅由体内剪接调节剂引起的细胞死亡引起的信号丢失。

酵母表达质粒转录激活因子的DNA结合结构域(binding domain,BD)和转录激活结构域(activation domain，AD)形成的杂合蛋白可激活pG5 luc载体(该载体含有Fluc基因，购自Promega公司)上游激活序列(UAS)3`端的启动子，启动下游基因表达。本发明通过BD、AD序列中间连接一段含有Rluc开放阅读框的内含子序列，当发生剪接时，BD/AD会形成杂合蛋白，启动pG5 luc载体上的Fluc表达。然而随着间接抑制进程的进行，Rluc随着内含子得以保留，含有Rluc的内含子序列由于存在于开放阅读框中得以表达，并且随着抑制程度的加深其荧光强度增大，存在于内含子下游的终止密码使得转录终止于内含子序列而不能转录AD序列，并且随着剪接抑制的进程加深，由于缺少AD的转录而形成的BD/AD杂合蛋白的含量变少，启动pG5 luc载体上的Fluc表达含量随之降低。本申请利用pre-mRNA的剪接结合酵母双杂交系统的检测灵敏度和精确度构建了用于实时监测pre-mRNA间接进程的报告基因系统BD-Rluc intron-AD/pG5 luc。当剪接正常进行时，Rlu含量降低，产生的海肾荧光素酶信号强度减少，而BD/AD融合蛋白含量增加，启动pG5 luc载体上的Fluc表达含量随之增高。而当剪接发生抑制时，产生的效果则相反。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种BD-Rluc intron-AD/pG5luc报告基因影像探针系统及其构建方法，并用于在体监测pre-mRNA剪接过程的发生发展。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种监测pre-mRNA剪接过程的报告基因影像探针，所述的探针包括载体pcDNA3.1(+)、基因片段BD、Rluc intron和AD以及载体pG5 luc，所述的基因片段BD、Rluc intron和AD按照BD-Rluc intron-AD顺序与线性化的pcDNA3.1(+)载体重组。

所述的片段BD-Rluc intron-AD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的另一方面，提供了上述剪接报告基因影像探针的制备方法，包括以下步骤：

1)用NheI和PstI酶切载体pcDNA3.1(+)，使其线性化；

2)PCR扩增BD、Rluc intron、AD片段；

3)通过基因重组技术将各个片段按BD-Rluc intron-AD顺序与线性化的pcDNA3.1(+)载体重组；

4)重组载体经转化、提取、酶切鉴定，获得BD-Rluc intron-AD载体。

5)BD-Rluc intron-AD载体的BD/AD杂合蛋白激活pG5 luc载体，，获得BD-Rlucintron-AD/pG5 luc报告基因探针系统。

本发明的有益效果为：

本发明构建了一种BD-Rluc intron-AD/pG5 luc报告基因探针系统，由于其能够很好地在生物体内表达，具有以下优点：

(1)为模拟活体pre-mRNA加工过程的动态变化提供了一种实时、无创的监测工具。

(2)克服了传统方法体外含量分析可能与体内实际作用出现偏差的不足。

(3)由于报告基因系统靶向性强、安全性好、高通量、价格相对低廉、操作方便等优点，为作用于剪接体的药物研究提供了有效的筛选工具，在新药研制、观测生物体内生理病理过程、活体条件下精确区分pre-mRNA的加工过程等方面有着非常重要的价值。

(4)构建基于报告基因的显像系统用于pre-mRNA加工过程的定量研究，对于体内pre-mRNA的加工机制研究有着重要的意义，为pre-mRNA的加工过程提供了有效的监测工具。

(5)pre-mRNA的剪接结合酵母双杂交系统的检测灵敏度和精确度构建了用于实时监测pre-mRNA剪接进程的报告基因系统，检测结果更加精确、有效。

附图说明

图1是本发明BD-Rluc intron-AD全基因电泳图；

图2是本发明载体BD-Rluc intron-AD结构；

图3是本发明分子探针构建示意图；

图4是本发明不同浓度报告基因活性检测结果；

图5是本发明不同时间点报告基因活性检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1BD-Rluc intron-AD/pG5 luc报告基因探针的构建

一实验材料

1.主要仪器

实验材料

1.1.1主要仪器

PCR扩增仪：北京东胜创新生物科技有限公司；电泳仪：北京君意东方电泳设备公司；Genosens 800凝胶成像系统。

2.酶和试剂

Pfu-MasterMix：上海捷瑞生物工程有限公司自配；NheI/PstI酶：Fermentas；同源重组酶：上海捷瑞生物工程有限公司；DNA mark：上海捷瑞生物工程有限公司。

3.实验所用溶液

1)LB培养基

10g Nacl，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物溶于1L双蒸水，高压灭菌；

2)琼脂糖凝胶电泳所需溶液

琼脂糖凝胶制备：

5.6g琼脂糖，置于500ml锥形瓶，加入1×TAE480ml,加热完全溶解后再冷却50-60摄氏度，倒入事先准备好的制胶板中；

TAE琼脂糖凝胶电泳液：

50×TAE贮存液配置：242g Tris，57.1ml乙酸，37.2g Na₂EDTA.2H₂O溶于1L水并调PH至8.0；

1×TAE:电泳时将50×TAE配置成1×工作液使用；

2×上样缓冲液：

0.5mol/L(PH6.8)Tris-Hcl 2ml,甘油2ml，20％SDS(W/V)2ml,0.1％溴酚蓝0.5ml，β-巯基乙醇1.0ml，双蒸水2.5ml,室温存放备用；

4.实验所用菌株和载体

菌株:XL10-gold

载体:pPEX

二实验过程

1.实验方案设计及引物合成

根据BD-Rluc intron-AD全基因序列，合成引物进行PCR扩增；共设计了3条引物进行扩增；

本实验中所使用的所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司引物合成部合成。

2.PCR扩增反应体系

引物：

反应条件：

其中2-4进行20个循环，反应结束后，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并回收，并进行下一步反应，直至做出全长基因，结果如图1所示，PCR扩增出全长的目的片段，大小为2057bp。

3.克隆

1)将载体线性化

30ul,150ng/ul待切的载体，NheI/PstI各1ul酶，5ul Buffer，加水补齐至50ul体系，放入恒温培养培养箱2-3h后，回收所需的载体骨架备用；

将上述PCR扩增得到的基因全长序列和载体各4ul，加同源重组酶重组1.4ul，同源重组酶Buffer 1.2ul，混匀，室温放置45min，立即转化挑取单克隆进行鉴定测序，测序结果如SEQ ID NO.5所示。

获得BD-Rluc intron-AD/pG5 luc探针系统，载体BD-Rluc intron-AD结构如图2，其包含BD、Rluc intron和AD。该分子探针的构建示意图如图3所示，DNA首先在体内转录生成pre-mRNA，然后在剪接体及多种蛋白的参与下移除内含子，形成成熟的mRNA，但是在由剪接酶抑制剂的存在下，pre-mRNA剪切受到抑制，随着内含子得以保留，含有Rluc的内含子序列由于存在于开放阅读框中得以表达，并且随着抑制程度的加深其荧光强度增大，存在于内含子下游的终止密码使得转录终止于内含子序列而不能转录AD序列，并且随着间接抑制的进程加深，由于缺少AD的转录而形成的BD/AD杂合蛋白的含量变少，启动pG5 luc载体上的Fluc表达含量随之降低。Rluc荧光素酶催化底物形成荧光的强度及BD/AD产生融合蛋白启动pG5 luc载体上的Fluc表达催化相应底物产生的荧光信号变化能够反映剪接的发生发展进程。本发明的分子影像探针可以活体模拟pre-mRNA剪接过程，实时反映剪接进程中pre-mRNA的剪接变化,克服了目前常用的检测手段的有创、操作繁琐、不能提供pre-mRNA剪接完整动态变化的缺陷,为在体pre-mRNA剪接过程的发生发展提供了有效的监测工具。

实施例2剪接BD-Rluc intron-AD/pG5 luc影像探针在体分子显像监测

Pladienolide B作用下BD-Rluc intron-AD/pG5 luc荧光活性检测，24孔板培养HEK293细胞，待细胞汇集到80％时，使用Lipofectamine 2000，将1μg的BD-Rluc intron-AD和pG5 luc质粒共转染HEK293细胞。12h后分别加入DMSO、10nM、100nM、1000nMPladienolide B，4h后收集细胞，用100μl/孔细胞裂解液裂解细胞。取10μl裂解后的液体，加入10ul的底物使用Glomax-20/20Luminometer进行荧光强度测定。

结果如图4所示，当加入剪接抑制剂时，Rlu活性增强，AD表达降低，BD-AD结合激活下游Fluc活性减弱，使其荧光素酶产生的信号降低。

不同时间点报告基因活性检测如图5所示，1000nM的Pladienolide B作用于RLuc-intron探针，不同时间点探针产生的荧光强度发生变化，并随着药物作用时间的延长，Fluc活性降低，Rluc活性增强。即本发明构建的RLuc-intron报告基因系统能够动态的进行剪接发生发展进程的监测，提供实时动态的监测结果。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 西安电子科技大学

<120> 一种监测pre-mRNA剪接过程报告基因影像探针及其构建方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1862

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaagctac tgtcttctat cgaacaagca tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag 60

tgctccaaag aaaaaccgaa gtgcgccaag tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac 120

tctcccaaaa ccaaaaggtc tccgctgact agggcacatc tgacagaagt ggaatcaagg 180

ctagaaagac tggaacagct atttctactg atttttcctc gagaagacct tgacatgatt 240

ttgaaaatgg attctttaca ggatataaaa gcattgttaa caggattatt tgtacaagat 300

aatgtgaata aagatgccgt cacagataga ttggcttcag tggagactga tatgcctcta 360

acattgagac agcatagaat aagtgcgaca tcatcatcgg aagagagtag taacaaaggt 420

caaagacagt tgactgtatc gcaggaagta cacgagaagc tccgaggatg gctgaagtcc 480

aacgtctctg atgcggtggc tcagagcacc cgtatcattt atggaggtga gtggctttgg 540

ttcccggctg aggtggagtg ggctgaggct tccaaggtgt acgaccccga gcaacgcaaa 600

cgcatgatca ctgggcctca gtggtgggct cgctgcaagc aaatgaacgt gctggactcc 660

ttcatcaact actatgattc cgagaagcac gccgagaacg ccgtgatttt tctgcatggt 720

aacgctgcct ccagctacct gtggaggcac gtcgtgcctc acatcgagcc cgtggctaga 780

tgcatcatcc ctgatctgat cggaatgggt aagtccggca agagcgggaa tggctcatat 840

cgcctcctgg atcactacaa gtacctcacc gcttggttcg agctgctgaa ccttccaaag 900

aaaatcatct ttgtgggcca cgactggggg gcttgtctgg cctttcacta ctcctacgag 960

caccaagaca agatcaaggc catcgtccat gctgagagtg tcgtggacgt gatcgagtcc 1020

tgggacgagt ggcctgacat cgaggaggat atcgccctga tcaagagcga agagggcgag 1080

aaaatggtgc ttgagaataa cttcttcgtc gagaccatgc tcccaagcaa gatcatgcgg 1140

aaactggagc ctgaggagtt cgctgcctac ctggagccat tcaaggagaa gggcgaggtt 1200

agacggccta ccctctcctg gcctcgcgag atccctctcg ttaagggagg caagcccgac 1260

gtcgtccaga ttgtccgcaa ctacaacgcc taccttcggg ccagcgacga tctgcctaag 1320

atgttcatcg agtccgaccc tgggttcttt tccaacgcta ttgtcgaggg agctaagaag 1380

ttccctaaca ccgagttcgt gaaggtgaag ggcctccact tcagccagga ggacgctcca 1440

gatgaaatgg gtaagtacat caagagcttc gtggagcgcg tgctgaagaa cgagcagtaa 1500

gactagactg agccctcgga catggaggtg gggatggggc agactcatcc cattcttgac 1560

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ccagcccaaa aaagaagaga aaggtagatg aattcccggg gatctcgacg gcccccccga 1680

ccgatgtcag cctgggggac gagctccact tagacggcga ggacgtggcg atggcgcatg 1740

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gatcgccagg gatccgtcga cttgacgcgt tgatatcatc tagagcggcc gcaggtacct 1860

ga 1862

<210> 2

<211> 7280

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

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cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

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aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

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tgcatcatcc ctgatctgat cggaatgggt aagtccggca agagcgggaa tggctcatat 1740

cgcctcctgg atcactacaa gtacctcacc gcttggttcg agctgctgaa ccttccaaag 1800

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tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt 3420

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aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaattaa ttctgtggaa tgtgtgtcag 3600

ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc 3660

aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa 3720

agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc 3780

ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat 3840

gcagaggccg aggccgcctc tgcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt 3900

ggaggcctag gcttttgcaa aaagctcccg ggagcttgta tatccatttt cggatctgat 3960

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ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc 4080

tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc 4140

gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc 4200

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ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag 4320

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tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg 4620

ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag 4680

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tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc 4920

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gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt 5040

ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctgtata ccgtcgacct 5100

ctagctagag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc 5160

tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat 5220

gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 5280

tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 5340

ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 5400

cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 5460

gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 5520

tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 5580

agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 5640

tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 5700

cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 5760

ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 5820

ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 5880

ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 5940

ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 6000

cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 6060

gcggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 6120

ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 6180

tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 6240

ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 6300

gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 6360

tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 6420

cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 6480

ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 6540

gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 6600

caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 6660

gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 6720

ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 6780

tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 6840

caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 6900

tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 6960

cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 7020

ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 7080

aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 7140

tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 7200

gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 7260

gaaaagtgcc acctgacgtc 7280

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cactataggg agacccaagc tggctagcat gaagctactg tcttctatcg 50

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtggatccg agctcggtac caagctttca ggtacctgcg gc 42

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcaaatggg cggtaggcgt g 21

Claims (2)

1.一种监测pre-mRNA剪接过程的报告基因影像探针，其特征在于，所述的探针包括载体pcDNA3.1(+)、基因片段BD、Rlucintron和AD以及载体pG5 luc，所述的基因片段BD、Rlucintron和AD按照BD-Rlucintron-AD顺序与线性化的pcDNA3.1(+)载体重组；

所述的片段BD-Rlucintron-AD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的监测pre-mRNA剪接过程的报告基因影像探针的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用NheI和PstI酶切载体pcDNA3.1(+)，使其线性化；

2)PCR扩增BD、Rlucintron、AD片段；

3)通过基因重组技术将各个片段按BD-Rlucintron-AD顺序与线性化的pcDNA3.1(+)载体重组；

4)重组载体经转化、提取、酶切鉴定，获得BD-Rlucintron-AD载体；

5)BD-Rlucintron-AD载体的BD/AD杂合蛋白激活pG5 luc载体，，获得BD-Rlucintron-AD/pG5 luc报告基因探针系统。

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