CN104450959A - 用于检测施马伦贝格病毒的荧光rt-pcr引物、探针及试剂盒 - Google Patents

用于检测施马伦贝格病毒的荧光rt-pcr引物、探针及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN104450959A
CN104450959A CN201410680100.3A CN201410680100A CN104450959A CN 104450959 A CN104450959 A CN 104450959A CN 201410680100 A CN201410680100 A CN 201410680100A CN 104450959 A CN104450959 A CN 104450959A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fluorescence
pcr
executing
detecting
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410680100.3A
Other languages
English (en)
Inventor
杨素
陶旻
陈轩
黄海超
徐海聂
沙才华
廖秀云
罗宝正
薄清如
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ZHUHAI ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC
Original Assignee
ZHUHAI ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ZHUHAI ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC filed Critical ZHUHAI ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC
Priority to CN201410680100.3A priority Critical patent/CN104450959A/zh
Publication of CN104450959A publication Critical patent/CN104450959A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR引物、探针及试剂盒。所述引物与探针的序列如SEQ ID NO.1～6所示。所述试剂盒中含有引物、探针、反转录酶、DNA聚合酶、RNA提取试剂、荧光PCR反应试剂、施马伦贝格病毒阳性对照和阴性对照。本发明建立的施马伦贝格病毒荧光RT-PCR试剂盒及检测方法具有特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉，是施马伦贝格病毒快速检测的良好方法。

Description

用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，特别涉及一种用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR引物、探针及试剂盒。
背景技术
施马伦贝格病(Schmallenberg，SB)是2011年11月在德国北莱茵-威斯特法伦州施马伦贝格镇牛羊中发现的一种新的病毒性动物传染病，该病的主要临床特征是：受感染母羊流产、死胎，新生羔羊畸形、成活率下降，感染牛表现为腹泻、发热、产奶量下降等，对畜牧业造成了较大危害。
目前SB的实验室诊断方法主要包括细胞培养分离病毒等病原检测方法，以及酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光试验（IFA）和中和试验（NT）等血清学方法。病毒分离通常是确诊疫病的金标准，但由于成年患病动物常不表现临床症状，难以掌握病毒血症的具体时期，且费时费力，因此病毒分离的实施受到一定的限制，不适应快速检测的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR引物组及试剂盒。
本发明的另一个目的在于提供上述荧光RT-PCR引物组及试剂盒在检测施马伦贝格病毒上的应用。
本发明所采取的技术方案是：
用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR引物和探针，所述引物是根据施马伦贝格病毒核衣壳蛋白基因序列的高度保守区域设计的。其核苷酸序列如下所示：
60F：5’- GCTTGCCTGGGCCAAAT -3’ （SEQ ID NO.1），
60R：5’- CGAATTGCTGCAAGAAGGTTCT -3’ （SEQ ID NO.2），
60P：Fam-5’- TGGATTCTCTCCTGCTGC -3’-Eclipse（SEQ ID NO.3）；
一种用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR试剂盒，其含有以上所述的引物和探针，还含有反转录酶、DNA聚合酶、RNA提取试剂、荧光PCR反应试剂、施马伦贝格病毒阳性对照和阴性对照。
所述施马伦贝格病毒阳性对照为施马伦贝格病毒cDNA的质粒，所述阴性对照为无菌采取澳洲进口牛血清，经检测BSV、BTV、EHDV、AKV、BVDV、IBRV为阴性。
以上所述的试剂盒在施马伦贝格病毒检测中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明建立的施马伦贝格病毒荧光RT-PCR试剂盒及检测方法具有特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉，是施马伦贝格病毒快速检测的良好方法。
附图说明
图1为RT-PCR电泳结果图（M：DNA Marker DL-2000；P：阳性对照；1：引物60扩增pMD-SBV ；N：阴性对照）；
图2为SBV荧光RT-P CR检测结果；
图3为SBV荧光RT-PCR特异性试验；
图4为阳性质粒稀释敏感性试验；
图5为SBV荧光RT-PCR标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1 引物设计
从Genebank下载多个施马伦贝格病毒（SBV）的核衣壳蛋白基因序列，用DNASTAR 5.07软件进行比对，寻找高度保守的区域，然后选取适当的核衣壳蛋白基因序列分别设计2套特异性检测SBV 核衣壳蛋白基因的引物、Taqman探针，送大连宝生物技术有限公司合成，用DEPC处理水溶解，-80℃避光保存。引物、探针见表1：
表1  SBV荧光RT-PCR引物、探针
实施例2 试剂盒组成
1、引物：如表1所示。
2、酶：反转录酶Reverse Transcriptase XL（以下简称AMV）、TaKaRa Ex TaqTM DNA聚合酶（以下简称Ex TaqTM）、PrimeScript 1step Enzyme Mix、2×1Step Buffer为宝生物工程（大连）有限公司产品。
3、荧光PCR试剂
QuantiFast? RT-PCR为德国QIAGEN?公司产品。
4、RNA提取试剂
总RNA纯化试剂（Trizol）为美国Invitrogen公司产品。
5、施马伦贝格病毒阳性对照和阴性对照
阳性对照：将需扩增的SBV核衣壳蛋白基因的目的序列送宝生物工程（大连）有限公司，进行全基因合成，制备目的片段重组质粒pMD-SBV，在含Amp的LB细菌培养液中进行培养，收获菌液作为阳性对照。
阴性对照：无菌采取澳洲进口牛血清，经检测BSV、BTV、EHDV、AKV、BVDV、IBRV为阴性，作为阴性对照。
实施例3荧光RT-PCR反应体系与反应程序的建立
1、病毒RNA提取
（1） 取n个灭菌的1.5 mL Eppendorf 管，其中n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和（阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出），编号。
（2）每管加入600 μL 裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200 μL，再加入200 μL 氯仿，混匀器上振荡混匀5 s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀）。于4 ℃、12 000 r/min 离心15 min。
（3）取与（1）相同数量灭菌的1.5 mL Eppendorf 管，加入400 μL 异丙醇（-20 ℃ 预冷），做标记。吸取本标准（2）各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500μL，不能吸出中间层，颠倒混匀。
（4）于4 ℃、12 000 r/min 离心15 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入600 μL 75％乙醇，颠倒洗涤。
（5） 于4℃、12 000 r/min 离心10 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。
（6） 4 000 r/min 离心10 s（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥5～10 min。
（7） 加入11 μL DEPC 水，溶解管壁上的RNA，2 000 r/min 离心5 s，冰上保存备用。若需长期保存须放置-70 ℃冰箱。
2、SBV RT-PCR扩增产物序列测定
以SBV质粒DNA为模板，按表2、表3的反应组份和参数，进行一步法RT-PCR（反应组份中不加入探针），电泳后将阳性扩增产物送宝生物工程（大连）有限公司测序。
试验结果表明：编号为60的引物、探针可以很好的检测SBV的S基因，其敏感性、特异性、荧光强度、CT值最佳。该引物扩增出约为60 bp的目的条带，与预期大小相符（见图1）。回收纯化RT-PCR产物进行测序，用DNASTAR（5.07）基因分析软件对测序结果进行分析后表明，扩增目的片段的长度分别为60bp，与引物设计时的预计扩增长度相符，测序结果如SEQ ID NO.7所示。
GCTTGCCTGGGCCAAATCTGGATTCTCTCCTGCTGCTAGAACCTTCTTGCAGCAATTCGG（SEQ ID NO.7）
3、荧光RT-PCR反应
将检测SBV的引物、探针及各反应组份按表2 的浓度加入Eppendoff管中充分混匀后加入ABI荧光PCR仪专用反应管中，然后放入ABI荧光PCR仪，记录样本摆放顺序，在96孔板内设置被检样品，分别设立以重组质粒pMD-SBV为模板的阳性对照和阴性对照进行反转录和扩增（反应参数见表3）。检测结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和CT值判定结果。本试验的所有反应试剂加于同一个反应管中，反转录和扩增在ABI荧光PCR仪内一次完成。
当阴性对照的检测结果无数值或Ct值>30，阳性对照的Ct值≤28.0时，Ct值≤30.0的样本判为阳性，Ct值无数值或Ct值>30的样品判为阴性。用analysis功能框观察结果，本发明设计的探针具有较强的荧光信号，探针60检测SBV 荧光值≥2,500,000（图2）。
表2荧光 RT-PCR 反应液组份及浓度
表3 实时荧光RT-PCR反应参数
荧光素设定： Report Dye设定为 FAM；Quench Dye均设定为Eclipse。
实施例4 特异性实验
分别提取SBV、BTV、EHDV、AKV、BVDV、IBRV等病毒核酸，按实施例3的方法进行特异性试验，同时设阳性对照（重组质粒pMD-SBV）和阴性对照。
编号为60的引物、探针检测SBV质粒和阳性对照（重组质粒pMD-SBV）均有荧光增加信号曲线，而BTV、EHDV、AKV、BVDV、IBRV和阴性对照均未观察到荧光信号增加曲线，试验结果见图3。
实施例5 灵敏度实验
提取阳性质粒，经测定浓度为44.70 ng/μL。10倍梯度稀释至10-10，对梯度稀释的样本进行荧光RT-PCR检测。试验结果表明，本方法可以检测到阳性质粒的10-10稀释倍数，经换算为6.67 copies/μL，结果见图4。
实施例6 重复性试验
按表2配制反应体系，置-20℃保存。用107拷贝的阳性定量模板分三次实验进行稳定性和重复性检测，实验时取出-20℃保存的检测反应体系，加入反转录酶和模板。稳定性检测每次间隔1周，每次进行10个重复试验。结束后观察标准模板的Ct值，并将三次结果进行比较。
根据表4结果可见SBV荧光RT-PCR检测方法对三份样本的重复性检测，三次检测结果之间的变异系数（CV）值都小于5%，该方法具有很好的重复性。
表4  SBV荧光RT-PCR重复性实验
实施例7标准曲线的制作
在制作标准曲线时使用DEPC处理水对含有目的扩增片段的质粒标准品作系列稀释，使拷贝数分别为106copies/μL，105copies/μL，104copies/μL，103copies/μL，102copies/μL，进行荧光定量PCR扩增，分别加入不同的反应管在ABI ViiA 7扩增仪上同时进行荧光RT-PCR，反应结束后在计算机上得到标准曲线。检测临界点为扩增信号进入相对稳定对数增长的下限(阈值T)的PCR循环数，在这一区间内CT与起始模板量的对数呈反比关系，根据系列模板的浓度对数与CT值做直线回归得到标准曲线。
将检测定在产物大量生成初期，即刚进入指数增长期的起始点位置--循环阈值（CT），经对数拟合做图，得到定量标准曲线(见图 5)，显示不同浓度标准品的Ct值与该标准品浓度的对数存在线性关系（X轴为模板量的对数值，CT值为Y轴作回归曲线，从标准曲线图中可得：标准曲线的统计学分析相关系数R2为0.999，线性关系较好，斜率为-3.446，符合实时定量PCR的要求，根据未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的DNA拷贝数。
以上实施例表明：本发明建立的施马伦贝格病毒荧光RT-PCR试剂盒及检测方法具有特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉，是施马伦贝格病毒快速检测的良好方法。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
<110>  中华人民共和国珠海出入境检验检疫局
 
<120>  用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR引物、探针及试剂盒
 
<130> 
 
<160>  7    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
gcttgcctgg gccaaat                                                      17
 
 
<210>  2
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
cgaattgctg caagaaggtt ct                                                22
 
 
<210>  3
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
tggattctct cctgctgc                                                     18
 
 
<210>  4
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
gtaccacaac ggaatgcagc ta                                                22
 
 
<210>  5
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
agttgttgcc catacttacc aataaa                                            26
 
 
<210>  6
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
tttaacccgg aggtcgggta tgtgg                                             25
 
 
<210>  7
<211>  60
<212>  DNA
<213>  施马伦贝格病毒
 
<400>  7
gcttgcctgg gccaaatctg gattctctcc tgctgctaga accttcttgc agcaattcgg       60

Claims (6)

1.用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR引物和探针，其特征在于，所述引物是根据施马伦贝格病毒核衣壳蛋白基因序列的高度保守区域设计的。
2.根据权利要求1所述的用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR引物和探针，其特征在于，其核苷酸序列如下所示：
60F：5’- GCTTGCCTGGGCCAAAT -3’ （SEQ ID NO.1），
60R：5’- CGAATTGCTGCAAGAAGGTTCT -3’ （SEQ ID NO.2），
60P：Fam-5’- TGGATTCTCTCCTGCTGC -3’-Eclipse（SEQ ID NO.3）。
3.一种用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR试剂盒，其含有权利要求1或2所述的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有反转录酶、DNA聚合酶、RNA提取试剂、荧光PCR反应试剂、施马伦贝格病毒阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述施马伦贝格病毒阳性对照为施马伦贝格病毒cDNA的质粒，所述阴性对照为无菌采取澳洲进口牛血清，经检测BSV、BTV、EHDV、AKV、BVDV、IBRV为阴性。
6.权利要求3～5任一项所述的试剂盒在施马伦贝格病毒检测中的应用。
CN201410680100.3A 2014-11-20 2014-11-20 用于检测施马伦贝格病毒的荧光rt-pcr引物、探针及试剂盒 Pending CN104450959A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410680100.3A CN104450959A (zh) 2014-11-20 2014-11-20 用于检测施马伦贝格病毒的荧光rt-pcr引物、探针及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410680100.3A CN104450959A (zh) 2014-11-20 2014-11-20 用于检测施马伦贝格病毒的荧光rt-pcr引物、探针及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104450959A true CN104450959A (zh) 2015-03-25

Family

ID=52897704

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410680100.3A Pending CN104450959A (zh) 2014-11-20 2014-11-20 用于检测施马伦贝格病毒的荧光rt-pcr引物、探针及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104450959A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110157836A (zh) * 2018-04-04 2019-08-23 广西壮族自治区兽医研究所 一种检测ibrv和bvdv的引物、探针及方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103305632A (zh) * 2013-06-05 2013-09-18 中国检验检疫科学研究院 用于检测施马伦贝格病毒的荧光定量rt-pcr引物和探针
CN103397110A (zh) * 2013-08-21 2013-11-20 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 施马伦贝格病毒等温扩增快速检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103305632A (zh) * 2013-06-05 2013-09-18 中国检验检疫科学研究院 用于检测施马伦贝格病毒的荧光定量rt-pcr引物和探针
CN103397110A (zh) * 2013-08-21 2013-11-20 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 施马伦贝格病毒等温扩增快速检测方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110157836A (zh) * 2018-04-04 2019-08-23 广西壮族自治区兽医研究所 一种检测ibrv和bvdv的引物、探针及方法
CN110157836B (zh) * 2018-04-04 2023-11-28 广西壮族自治区兽医研究所 一种检测ibrv和bvdv的引物、探针及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106947838B (zh) 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
Hoffmann et al. A universal heterologous internal control system for duplex real-time RT-PCR assays used in a detection system for pestiviruses
CN101818207B (zh) 甲型流感病毒、h1n1及h3n2亚型流感病毒检测方法及检测试剂盒
CN103757139B (zh) 犬瘟热、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂及其检测方法
CN103397105B (zh) 一种检测gii型诺如病毒的试剂盒及其用途
CN107488749A (zh) 一种检测猪圆环病毒3型的lamp引物及检测方法
CN106435039A (zh) 一种检测猪繁殖与呼吸综合征类nadc‑30毒株的引物、探针、试剂盒及方法
CN105624329A (zh) 单纯疱疹病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
CN112739833A (zh) 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用
CN104498623B (zh) 猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株鉴别诊断用引物及其检测试剂盒
CN105603127A (zh) 一种鉴别NADC30-like PRRSV的PCR检测试剂盒
CN105463132A (zh) 犬细小病毒的遗传标记物及其特异性引物和探针
CN107513583A (zh) 检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量pcr引物及试剂盒
CN104774953A (zh) 非洲猪瘟病毒cp530r基因的荧光pcr检测试剂及其制备方法与用途
CN102071263B (zh) 禽流感病毒h5亚型套式荧光rt-pcr检测试剂及检测试剂盒
CN101724712B (zh) 动物虫媒病多重rt-pcr鉴别检测试剂及制备方法和应用
CN108531647A (zh) 一种寨卡病毒一步法荧光rt-PCR检测方法及试剂盒
Wei et al. Rapid and visual detection of porcine parvovirus using an ERA-CRISPR/Cas12a system combined with lateral flow dipstick assay
CN108130385A (zh) 一种人巨细胞病毒核酸检测试剂盒
CN112553372A (zh) 一种猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒3型双重荧光定量pcr检测引物和探针、试剂盒及方法
CN105925729A (zh) 一种荧光定量PCR检测猪delta冠状病毒的引物、探针、试剂盒及方法
CN103215389B (zh) 猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法rt-pcr诊断试剂盒
CN104450959A (zh) 用于检测施马伦贝格病毒的荧光rt-pcr引物、探针及试剂盒
CN104073571B (zh) H7n9亚型禽流感病毒双重荧光rt-pcr引物、探针及其检测试剂盒和检测方法
CN108411042A (zh) 一种检测乙型脑炎病毒的荧光定量pcr引物及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150325