CN103305632A

CN103305632A - 用于检测施马伦贝格病毒的荧光定量rt-pcr引物和探针

Info

Publication number: CN103305632A
Application number: CN201310221441XA
Authority: CN
Inventors: 张永宁; 吴绍强; 林祥梅; 吕继洲; 王彩霞; 邓俊花; 袁向芬
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2013-06-05
Filing date: 2013-06-05
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2033-06-05
Also published as: CN103305632B

Abstract

本发明提供了一种用于检测施马伦贝格病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1-3所示。本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达10^-7SBV RNA标准品，且对于不含有施马伦贝格病毒的检测样本均无扩增信号，表明其具有良好的特异性。

Description

用于检测施马伦贝格病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针

技术领域

本发明涉及荧光定量RT-PCR检测技术，具体地说，涉及一种用于检测施马伦贝格病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针。

背景技术

2011年夏秋季节，德国和荷兰的某些牛场开始出现一种未知疾病，病牛出现发热（>40℃）、体质下降、食欲不振、厌食、腹泻和产奶量下降等临床症状，有时出现流产症状。2011年11月18日，德国弗里德里希洛弗勒研究所（Friedrich Loeffler Institute，FLI）利用宏基因组学技术（Metagenomic technique）和病毒分离技术最终确证导致此次疫情的病原体为一种新型的布尼亚病毒。因该病毒首先从德国西部城镇—施马伦贝格的一头患病奶牛血液中被分离与鉴定成功，因此根据分离地点将其暂时命名为“施马伦贝格病毒（Schmallenbergvirus，SBV）”，并将其引发的疫病称为“施马伦贝格病（Schmallenbergdisease，SBD）”。

SBV的易感动物包括绵羊、牛（奶牛和野牛）、山羊以及马鹿（Reddeer）、獐鹿（Roe deer）、羊驼（Alpaca）和欧洲盘羊（Mouflon）等反刍动物。患病牛主要出现发热（>40℃）、精神不振、体质下降、厌食、产奶量下降（最高达50%）和腹泻等临床症状，部分病牛会出现流产症状。通常情况下，成年羊不出现异常症状，但怀孕羊易出现流产、死胎或产出畸形羔羊，畸形羔羊即使分娩时尚未死亡也往往难以存活，部分发病养殖场新生羔羊畸形率高达25-50%。截至2013年4月底，正式确认存在施马伦贝格病的国家有德国、荷兰、比利时、英国、法国、意大利、卢森堡、西班牙、丹麦、爱沙尼亚、瑞士、爱尔兰、挪威、瑞典、芬兰、波兰、奥地利、斯洛文尼亚、捷克、匈牙利和土耳其，引起了欧盟（EU）、世界动物卫生组织（OIE）以及国际社会的高度重视。俄罗斯、乌克兰、白俄罗斯、哈萨克斯坦、阿根廷、阿尔及利亚、摩洛哥、埃及、约旦、黎巴嫩、美国、日本和中国等众多国家已经对欧盟相关疫情国家的牛、绵羊和山羊活动物（包括胚胎）及其相关制品（包括肉类、精液和卵细胞等遗传物质）采取了不同的贸易限制措施；而智利、加拿大、塞尔维亚和瑞士等国则要求受感染国家提供更多的疫情信息和该病的有关资料，并考虑采取相关的贸易限制措施。毫无疑问，施马伦贝格病的暴发与流行已经给有关国家造成了巨大经济损失。幸运的是，截至目前尚未发现施马伦贝格病疫区内与患病动物或动物生产环境有过密切接触的人员（主要为畜主和兽医）发病的情况。尽管如此，鉴于布尼亚病毒科的多种病毒具有人畜共患的特性，因此，目前尚不能完全排除施马伦贝格病毒感染人类的可能。

现有研究结果表明，施马伦贝格病毒在分类学上属于布尼亚病毒科（Bunyaviride）正布尼亚病毒属（Orthobunyavirus）辛波血清群（Simbu serogroup），其遗传特性与辛波血清群的沙门达病毒（Shamonda virus）、艾罗病毒（Aino virus）和赤羽病毒（Akabane virus）密切相关。基于正布尼亚病毒属病毒的N基因编码区的序列分析结果表明，SBV与沙门达病毒的同源性最高。SBV是一种有囊膜的单股负链RNA病毒，病毒粒子表面有糖蛋白纤突，其基因组可分为3个节段，依次为L、M和S基因节段。其中，L基因编码RNA依赖性RNA聚合酶；M基因编码2种表面糖蛋白Gn和Gc以及1个非结构蛋白（NSm）；S基因编码核衣壳蛋白N和另一个非结构蛋白NSs。FLI研究所已经将其测得的SBV全基因序列提交到GenBank中（登录号为：L基因HE649912；M基因HE649913；S基因HE649914）。

目前，为了控制施马伦贝格病疫情在欧盟各成员国之间进一步传播与蔓延，德国FLI研究所已经建立了检测SBV血清抗体的间接免疫荧光、中和试验等血清学检测方法，利用KC细胞（杂斑库蠓幼虫细胞）和BHK-21、Vero细胞已经从患病牛血液中成功分离到了施马伦贝格病毒，为施马伦贝格病血清学检测方法的建立提供了物质保障。

由于施马伦贝格病是一种新发的外来动物疫病，目前仅流行于欧洲，我国尚未出现相关疫情，因此国内针对该疫病尚无任何检测技术储备。鉴于布尼亚病毒科多数病毒具有人畜共患和相同传播媒介（主要为库蠓、蚊子和白蛉）的特点，目前尚不能完全排除施马伦贝格病毒能够引起人类发病的可能性。综上所述，从维持我国畜牧业持续健康发展、保障国民身体健康以及维护国家利益的角度出发，预先开展该病的检测技术储备研究已经势在必行。

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。它是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术。除了具有普通PCR的优点外，它还具有以下优点：（1）特异性更强，灵敏度更高。由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了人工判断的主观性，又可进一步提高灵敏度；（2）全封闭反应，在线式实时监测荧光，无须PCR其PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，实现了扩增产物的实时动态检测和结果自动分析，避免了对扩增产物的后处理，有效地避免了实验室交叉污染，同时可在较短的时间内得到结果；（3）数据分析选在核酸扩增的对数期，摈弃普通PCR方法的受多因素干扰的终点分析法，使得定量更准确可靠；（4）可实现单管双检或多检，还可设计针对性内标，监控抽提效率及排除抑制剂干扰；（5）不接触有毒试剂，操作安全；（6）有利于规模化、自动化及联网管理。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测施马伦贝格病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针。

为了实现本发明目的，本发明首先提供用于检测施马伦贝格病毒的荧光定量RT-PCR引物对，其包括：

上游引物SBV-S-130F：5’-GAAGCTAGTGCTCAGATTGTCATGC-3’，

下游引物SBV-S-130R：5’-GTGGATAGAAGTCAAAAGCATCAAGG-3’。

本发明还提供用于施马伦贝格病毒荧光定量RT-PCR检测的探针，所述探针的核苷酸序列为：

5’-R-AAGGGATGCACCTGGGCCGATGGTTA-Q-3’

其中，R为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。

优选地，其为TaqMan探针：

SBV-S-130FAM：FAM-AAGGGATGCACCTGGGCCGATGGTTA-BHQ1。

所述引物对是通过对GenBank中公布的布尼亚病毒科的相关病毒以及施马伦贝格病毒基因组序列进行比较与分析，选择无二级结构且高度保守的区段，设计多对引物和探针，引物长度一般为25个碱基左右，引物间和引物内无互补序列，最终设计得到最优的引物、探针序列组合。

本发明还提供含有所述引物对和所述探针的用于施马伦贝格病毒的荧光定量RT-PCR检测的试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括反转录酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物和一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种核苷酸单体（dNTP）等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团（R）和荧光淬灭基团（Q）的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在PCR扩增过程中，Taq酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，荧光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测到，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。

本发明的优点在于：

（一）本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达10^-7SBV RNA标准品（RNA标准品提取于10⁶TCID₅₀SBV），表明其具有良好的灵敏度。

（二）本发明提供的引物和探针对于不含有施马伦贝格病毒的检测样本均无扩增信号，表明其具有良好的特异性。

（三）本发明分别对所有已知的施马伦贝格病毒基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段进行引物和探针的设计，避免了假阴性结果的产生。

（四）本发明采用荧光RT-qPCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法如PCR-电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果；由于对PCR产物进行实时监测，大大节省了监测时间，节约了人力物力。

附图说明

图1为本发明实施例1中利用引物对SBV-S-130F/R和TaqMan探针SBV-S-130FAM检测施马伦贝格病毒RNA标准品的荧光定量RT-qPCR扩增曲线图。

图2为本发明实施例1中利用引物对SBV-S-130F/R和TaqMan探针SBV-S-130FAM检测施马伦贝格病毒RNA标准品的荧光定量RT-qPCR标准曲线图。

图3为本发明实施例2中利用引物对SBV-S-130F/R和TaqMan探针SBV-S-130FAM检测施马伦贝格病毒阴性牛羊RNA样品的荧光定量RT-qPCR扩增曲线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989），或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1施马伦贝格病毒的荧光定量RT-PCR检测

1引物和探针设计：通过对GenBank中公布的布尼亚病毒科的相关病毒以及施马伦贝格病毒基因组序列进行比较与分析，选择无二级结构且高度保守的区段，设计多对引物和探针，引物长度一般为25个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。最优引物、探针（根据S基因设计）序列组合如下（SEQ ID No.1-3）：

上游引物SBV-S-130F：5’-GAAGCTAGTGCTCAGATTGTCATGC-3’

下游引物SBV-S-130R：5’-GTGGATAGAAGTCAAAAGCATCAAGG-3’

TaqMan探针SBV-S-130FAM：

5’-FAM-AAGGGATGCACCTGGGCCGATGGTTA-BHQ1-3’

2施马伦贝格病毒RNA的制备：选取引物对SBV-S-130F/R和探针SBV-S-130FAM，将待检的样品组织用TRIzol法抽提施马伦贝格病毒RNA。具体步骤如下：

2.1样品的采集

按照GB/T18088的有关规定进行采样。疑似感染活动物可无菌采集EDTA抗凝血或不加抗凝剂的血液（分离血清用）；对于产死胎或畸形胎儿的母牛和母羊可无菌采集羊水和胎盘；对于死胎或畸形的犊牛和羔羊胎儿可无菌采集脑组织（主要为大脑和脑干）、心包液、羊水、吮吸初乳前的胎儿血液和胎粪。采样完毕后，应按规定填写《送样单》并低温运送至具有相应资质的生物安全实验室进行检测。

2.2样品的处理

血液：用2%DMEM培养基将EDTA血液作5倍稀释后，在无菌条件下将其进行超声破碎（工作循环20%，超声1s，间歇9s，共10次）。

血清：将采集的不加抗凝剂的血液于室温静置4h，将其转移至4℃冰箱内放置1h，然后将析出的透明血清转移至离心管内，3000rpm离心10min，将上清液分装、保存备用。

脑组织、胎粪：无菌处理样品并称量，置于无菌研钵内，加入少量含双抗（青霉素2000IU/mL、链霉素2000μg/mL）的2%DMEM培养液后进行研磨，再加适量组织培养液使样品变为10%组织悬液，然后反复冻融2次，3000rpm离心10min，将上清液用0.22μm滤器过滤除菌，分装，置-20℃保存备用。

羊水、心包液：向无菌采集的新鲜羊水和心包液中加入双抗（终浓度为青霉素2000IU/mL、链霉素2000μg/mL），3000rpm离心10min，将上清液用0.22μm滤器过滤除菌，分装，置-20℃保存备用。

2.3SBV RNA提取

本发明采用TRIzol法提取RNA。

A、取250μL处理后的样品置1.5mL Eppendorf管中，作好标记，同时设立阳性样品、阴性样品对照，加入750μL TRIzol剧烈振荡，室温静置5min。

B、加入250μL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5min；4℃12000rpm离心15min，将上层水相转入另一新标记的无RNase的1.5mLEppendorf管中，加入等体积异丙醇，充分混匀，-20℃沉淀15min。

C、4℃12000rpm离心15min，轻轻弃掉上清液，加1mL DEPC处理水配制的75%乙醇洗涤沉淀。

D、4℃7500rpm离心5min，小心弃去上清，常温瞬离，待沉淀自然风干后，用20μL DEPC处理水溶解RNA沉淀，立即进行cDNA的合成或-80℃保存备用。

除TRIzol提取法外，SBV RNA的提取也可选用其他等效的商品化RNA提取试剂盒。

3RT-qPCR操作步骤

3.1荧光定量RT-qPCR反应液的配制

在反应混合物配制区进行。设所需荧光RT-qPCR检测总数为N（N=U+2+2+2），其中，N为PCR管数，U为被检样品数、2为阳性对照数、2为阴性对照数，通常情况下需要多配2个样品的使用量。按照表1配制反应体系的混合液，配制和分装反应液时应在冰盒上进行。本研究采用市售的商品化一步法荧光RT-qPCR试剂盒（AgPath-ID^TMOne-Step RT-PCR Kit；货号：4387391）。

表1荧光定量RT-qPCR反应液的配制

*：使用的是

III反转录酶

3.2荧光RT-qPCR反应液分装

将(1)中配制的荧光RT-qPCR反应液充分混匀，按每管20μL分装于200μL荧光PCR管内，一定要按顺序记录好被检样品管、阳性对照管、阴性对照管。将加完反应液的PCR管转移至样本处理区。

3.2加样

在样本处理区进行。在各设定的荧光RT-qPCR管中分别加入制备好的RNA溶液5.0μL，盖紧管盖，500rpm离心30s。转移至检测区。

3.4荧光RT-qPCR检测

在检测区进行。将（3）中离心后的PCR管放入荧光定量PCR检测仪内，记录好被检样品（Samples）、阳性对照（PC）、阴性对照（NTC）的放置顺序。设置探针：5’端为FAM，3’端为BHQ1。

3.5循环条件设置

第一阶段，反转录（45℃，10min）；第二阶段，反转录酶灭活（95℃，10min）；第三阶段，变性（95℃，15s）、退火（56℃，20s）和延伸（72℃，30s），共42个循环。在第三阶段每次循环的延伸结束时收集荧光信号。待检测结束后，保存结果，根据收集的扩增曲线和Ct值判定检测结果。

4结果判定

4.1结果分析和条件设定

直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。

4.2质控标准

4.2.1阴性对照无Ct值，并且无扩增曲线，一直为水平线。

4.2.2阳性对照的Ct值应小于38，并出现典型的扩增曲线，两个阳性对照扩增曲线基本重合。否则，此次试验视为无效。

4.3结果描述及判定

4.3.1阴性

无Ct值并且无扩增曲线，表示样品中无施马伦贝格病毒。

4.3.2阳性

Ct值小于等于38，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在施马伦贝格病毒。

4.3.3有效原则

Ct值在38-40之间的样品建议重做。重做结果无Ct值或者大于等于40者为阴性，否则为阳性。

4.4结果处理

如样品经荧光RT-qPCR检测方法判定为阳性者，应立即将原样品按生物安全要求包装，送具有相应资质的生物安全实验室进行确认。

图1为利用引物对SBV-S-130F/R和TaqMan探针SBV-S-130FAM检测施马伦贝格病毒RNA标准品的荧光定量RT-qPCR扩增曲线图。其中，SBV RNA标准品（RNA标准品提取于10⁶TCID₅₀SBV）分别进行了10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8倍稀释，所建立的荧光定量RT-qPCR能够检测到10^-7稀释的SBV RNA。

图2为利用引物对SBV-S-130F/R和TaqMan探针SBV-S-130FAM检测施马伦贝格病毒RNA标准品的荧光定量RT-qPCR标准曲线图。其回归方程为：Y=-3.346X+27.179（R²=0.999，扩增效率99.0%）

实施例2施马伦贝格病毒荧光定量RT-PCR检测的特异性分析

采用德国FLI研究所保存的12份与SBV亲缘关系最近的布尼亚病毒科辛波血清（Simbu serogroup）的Sango Texas、Shuni Texas、Aino Texas、Simbu Texas、Peaton Texas、Sathuperi Texas、AkabaneAustralien A347、Akabane Boeringer Vakzine A、Oropouche AustralienO、AINO Z445Australien、Tinaroo A371Australien和Thimiri V981Australien病毒RNA样品和132份SBV阴性牛羊RNA样品，以及从国内采集的46份牛、46份绵羊的阴性血清RNA样品，验证了引物和探针对施马伦贝格病毒检测的特异性。结果表明，上述所有SBV阴性RNA样品经荧光定量RT-PCR扩增，均未出现特异性扩增曲线，只有SBV RNA标准品（10^-3）出现典型扩增，说明所设计的引物和探针对施马伦贝格病毒具有良好的特异性。

图3为利用引物对SBV-S-130F/R和TaqMan探针SBV-S-130FAM检测施马伦贝格病毒阴性牛羊RNA样品的荧光定量RT-qPCR扩增曲线图。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.用于检测施马伦贝格病毒的荧光定量RT-PCR引物对，其特征在于，其包括：

上游引物SBV-S-130F：5’-GAAGCTAGTGCTCAGATTGTCATGC-3’，

下游引物SBV-S-130R：5’-GTGGATAGAAGTCAAAAGCATCAAGG-3’。

2.用于施马伦贝格病毒荧光定量RT-PCR检测的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：

5’-R-AAGGGATGCACCTGGGCCGATGGTTA-Q-3’；

其中，R为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，其为TaqMan探针：SBV-S-130FAM：FAM-AAGGGATGCACCTGGGCCGATGGTTA-BHQ1。

4.含有权利要求1所述引物对和权利要求2所述探针的用于施马伦贝格病毒的荧光定量RT-PCR检测的试剂盒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反转录酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。