CN111808993A - 用于新型冠状病毒的基因检测的特异性引物、探针及试剂盒 - Google Patents

用于新型冠状病毒的基因检测的特异性引物、探针及试剂盒 Download PDF

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杜富宽
赵曰水
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Abstract

本发明公开了一种用于新型冠状病毒的基因检测的特异性引物、探针及试剂盒，所述试剂盒包括新型冠状病毒特异性核酸定量标准品、病毒RNA提取试剂以及荧光扩增检测试剂，检测中直接用待测对象的血浆、全血、咽拭子、漱口液或呼吸道分泌物为分析样本，提取出样本中的RNA作为核酸模板，再对核酸模板链进行荧光聚合酶链反应扩增。这种检测方法快捷，方便，能够尽快检测出待测对象的分泌物或血液中是否存在新型冠状病毒，有效减少新型冠状病毒在人群中的传播。

Description

用于新型冠状病毒的基因检测的特异性引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明属于基因检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种用于新型冠状病毒的基因检测的特 异性引物、探针及试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性， 直径60-140nm。其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别。目前所见传染源主要是新型冠状病毒感染的患者。无症状感染者也可能成为传染源。经呼吸道飞沫和接触传播是主要的传播途径。基于目前的流行病学调查，潜伏期1-14天，多为3-7天，以发热、 乏力、干咳为主要表现。由于其潜伏期长，潜伏期内患者仍然具有传播能力，因此导致疾 病难以控制，感染人数众多。目前还没有特效疫苗及特效药物，多数人对新型冠状病毒没 有免疫力，因此，快速、准确检测出感染病人，切断传播源成为了阻断新型冠状病毒传播 的重要方法。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术中无法快速、准确检测待测对象的无细胞体液样本中 是否存在新型冠状病毒的问题，提供一种用于新型冠状病毒的基因检测的特异性引物、探 针及试剂盒，能够快速、准确地检测待测对象是否存在新型冠状病毒。
本发明采用的技术方案如下：
一种用于新型冠状病毒基因检测的试剂，包括用于检测新型冠状病毒基因的特异性引 物、探针及阳性参照；
用于检测新型冠状病毒基因的特异性引物和探针包括以下两组中的至少一组：
组1、特异性引物：
引物S1:5’-ACGCGTTCCATGTGGTCAT-3’，
引物R1:5’-CATGGAGTGGCACGTTGAGA-3’；
特异性探针核苷酸序列1：5’-CAATCCAGAAACTAACATTC-3’；
组2、特异性引物：
引物S2:5’-GGACGCTGTGACATCAAGGA-3’，
引物R2:5’-AGCGTTCGTGATGTAGCAAC-3’；
特异性探针核苷酸序列2：5’-CTGCCTAAAGAAATC-3’。
进一步地，阳性参照包括：
引物S3:5’-GTGAAATGGTCATGTGTGGCGG-3’，
引物R3:5’-CAAATGTTAAAAACACTATTAGCATA-3’；
特异性探针核苷酸序列3：5’-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-3’。
一种用于新型冠状病毒的基因检测的试剂盒，包括：
上述的用于新型冠状病毒基因检测的试剂；
一步法RT-PCR混合试剂；
病毒RNA提取试剂，包括病毒裂解系统和Carrier RNA；
新型冠状病毒特异性核酸定量标准品，所述标准品为新型冠状病毒的部分序列：
5’-TTGAGTGAAATGGTCATGTGTGGCGGTTCACTATATGTTAAACCAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGCCA CAACTGCTTATGCTAATAGTGTTTTTAACATTTGTCAA-3’。
进一步地，病毒裂解系统包括3-5mol/L异硫氰酸胍、0.3-0.6wt％十二烷基肌氨酸钠、 0.05-0.15mmol/Lβ巯基乙醇，20-30mmol/L柠檬酸钠和15-25μg糖原；所述Carrier RNA为200-300nt的RNA混合物。
进一步地，病毒裂解系统包括4mol/L异硫氰酸胍、0.5wt％十二烷基肌氨酸钠、0.1mmol/Lβ巯基乙醇，25mmol/L柠檬酸钠和20μg糖原。
进一步地，一步法RT-PCR混合试剂由以下组分混合而成：
2×Buffer10ul
Enzyme Mix
10uM正向引物 0.2-1.0uM
10uM反向引物 0.2-1.0uM
探针 0.3-1.0uM
RNA 10-100ng
RNase free dH2O 补足至20ul。
进一步地，采用病毒RNA提取试剂从待测对象的无细胞体液中提取病毒RNA，具体为：
在200ul RNase free H2O中加入600ul异硫氰酸胍，然后分别加入对照和样品，再加 200ul氯仿，颠倒混匀，在13000rpm下离心15min取上清；然后加入400ul预冷异丙醇， 颠倒混匀，在13000rpm下离心15min，再加600ul75％乙醇，颠倒混匀，在13000rpm下离 心15min，弃上清；再在4000rpm离心10sec，室温干燥2－3min；最后加入20ulDEPE水， 轻轻混匀溶解RNA；最后在2000rpm离心5sec后，于冰上保存。
采用上述的试剂盒进行检测的方法，以新型冠状病毒特异性核酸定量标准品为对照， 即新型冠状病毒的部分序列：
5’-TTGAGTGAAATGGTCATGTGTGGCGGTTCACTATATGTTAAACCAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGCCA CAACTGCTTATGCTAATAGTGTTTTTAACATTTGTCAA-3’；
直接用待测病人的血浆、全血、咽拭子、漱口液或呼吸道分泌物为分析样本；
(1)提取RNA
在200ul RNase free H2O中加入600ul异硫氰酸胍，然后分别加入对照和样品，再加 200ul氯仿，颠倒混匀，在13000rpm下离心15min取上清；然后加入400ul预冷异丙醇， 颠倒混匀，在13000rpm下离心15min，再加600ul75％乙醇，颠倒混匀，在13000rpm下离 心15min，弃上清；再在4000rpm离心10sec，室温干燥2－3min；最后加入20ulDEPE水， 轻轻混匀溶解RNA；最后在2000rpm离心5sec后，于冰上保存备用；
(2)荧光PCR扩增
反应体系如下：
2×Buffer10ul
Enzyme Mix
10uM正向引物 0.2-1.0uM
10uM反向引物 0.2-1.0uM
探针 0.3-1.0uM
RNA 10-100ng
RNase free dH2O 补足至20ul；
PCR程序如下：
42℃ 5min 20℃/sec
95℃ 10sec 20℃/sec
1cycle
95℃ 5sec 20℃/sec
60℃ 20sec 20℃/sec
40cycles
95℃ 0sec 20℃/sec
65℃ 15sec 20℃/sec
95℃ 0sec；
(3)结果分析
通过扩增曲线和溶解曲线判断扩增质量，基于标准品的浓度和Ct值绘制标准曲线，依 据标准曲线计算检测样本的浓度。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
采用荧光PCR技术可以从核酸水平上检测病毒，荧光PCR技术对PCR产物的检测原理 做了很大的改进，可动态实时检测核酸产物的形成，无须后处理过程，这样在一定程度上 避免了扩增产物的污染，既缩短了检测时间，又节省了特殊仪器及专业人员的配备。
荧光定量PCR技术通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检 测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板 进行定量分析。
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。荧光探针法通过 探针可以增加反应收集信号的特异性，该探针的5’端与3’端分别标记上不同的荧光基团， 探针5’端标记以报告荧光基团(reporter，R)，3’端标记一淬灭荧光基团(quencher，Q)，当探针保持完整时，5’端的荧光基团R吸收光能后会将能量转移给临近3’端荧光淬 灭基团Q，所以检测系统检测不能检测该探针5’端荧光基团所发出的荧光信号。PCR扩增 时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光和淬灭荧光基团分离，从 而荧光检测系统可以接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实 现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。荧光信号的强弱与PCR的产物数量成正比， 根据测量到的荧光信号强弱，通过分析软件得到样本的原始拷贝量。
基于上述原理，本发明设计适合新冠病毒的特异性引物和特异性探针，提供一种能快速、 准确检测新型冠状病毒的基因检测试剂盒及基因检测方法，检测下限4.02×102IU/mL，整 个流程3小时以内，从而实现快速诊断待测对象是否携带新型冠状病毒，并可检测出病毒 数量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简 单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围 的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些 附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例6的荧光检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本 发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。 通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设 计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本 发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员 在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操 作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这 种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除 在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明较佳的实施例提供一种新型冠状病毒的基因检测试剂盒，包括：
新型冠状病毒特异性核酸定量标准品，即新型冠状病毒的部分序列：
5’-TTGAGTGAAATGGTCATGTGTGGCGGTTCACTATATGTTAAACCAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGCCA CAACTGCTTATGCTAATAGTGTTTTTAACATTTGTCAA-3’；
病毒RNA提取试剂：包括病毒裂解系统和Carrier RNA，所述病毒裂解系统包括4mol/L 异硫氰酸胍、0.5wt％十二烷基肌氨酸钠、0.1mmol/Lβ巯基乙醇，25mmol/L柠檬酸钠和20μg 糖原，所述Carrier RNA为200-300nt的RNA混合物；
荧光扩增检测试剂：由一步法RT-PCR混合液、特异性扩增引物及特异性探针混合物混 合而成；其中，
待测样本的特异性扩增引物：
引物S1:5’-ACGCGTTCCATGTGGTCAT-3’，
引物R1:5’-CATGGAGTGGCACGTTGAGA-3’；
特异性探针核苷酸序列1：5’-CAATCCAGAAACTAACATTC-3’；
阳性参照(定量标准品)的特异性扩增引物：
引物S3:5’-GTGAAATGGTCATGTGTGGCGG-3’，
引物R3:5’-CAAATGTTAAAAACACTATTAGCATA-3’；
特异性探针核苷酸序列3：5’-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-3’；
一步法RT-PCR混合液由以下组分混合而成：
2×Buffer10ul
Enzyme Mix
正向引物(10uM) 0.2-1.0uM
反向引物(10uM) 0.2-1.0uM
探针 0.3-1.0uM
RNA 10-100ng
RNase free dH2O 补足至20ul。
实施例2
本发明较佳的实施例提供一种新型冠状病毒的基因检测试剂盒，包括：
新型冠状病毒特异性核酸定量标准品，即新型冠状病毒的部分序列：
5’-TTGAGTGAAATGGTCATGTGTGGCGGTTCACTATATGTTAAACCAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGCCA CAACTGCTTATGCTAATAGTGTTTTTAACATTTGTCAA-3’；
病毒RNA提取试剂：包括病毒裂解系统和Carrier RNA，所述病毒裂解系统包括5mol/L 异硫氰酸胍、0.4wt％十二烷基肌氨酸钠、0.08mmol/Lβ巯基乙醇，23mmol/L柠檬酸钠和19μg 糖原，所述Carrier RNA为200-300nt的RNA混合物；
荧光扩增检测试剂：由一步法RT-PCR混合液、特异性扩增引物及特异性探针混合物混 合而成；其中，
特异性扩增引物：
引物S2:5’-GGACGCTGTGACATCAAGGA-3’，
引物R2:5’-AGCGTTCGTGATGTAGCAAC-3’；
特异性探针核苷酸序列2：5’-CTGCCTAAAGAAATC-3’；
阳性参照(定量标准品)的特异性扩增引物：
引物S3:5’-GTGAAATGGTCATGTGTGGCGG-3’，
引物R3:5’-CAAATGTTAAAAACACTATTAGCATA-3’；
特异性探针核苷酸序列3：5’-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-3’；
一步法RT-PCR混合液由以下组分混合而成：
2×Buffer10ul
Enzyme Mix
正向引物(10uM) 0.2-1.0uM
反向引物(10uM) 0.2-1.0uM
探针 0.3-1.0uM
RNA 10-100ng
RNase free dH2O 补足至20ul。
实施例3
利用实施例1的试剂盒进行检测的方法，具体如下：
采用病毒RNA提取试剂从20个待测对象的无细胞体液中提取病毒RNA：
在200ul RNase free H2O中加入600ul异硫氰酸胍，然后分别加入对照和样品，再加 200ul氯仿，颠倒混匀，在13000rpm下离心15min取上清；然后加入400ul预冷异丙醇， 颠倒混匀，在13000rpm下离心15min，再加600ul75％乙醇，颠倒混匀，在13000rpm下离 心15min，弃上清；再在4000rpm离心10sec，室温干燥2－3min；最后加入20ulDEPE水， 轻轻混匀溶解RNA；最后在2000rpm离心5sec后，于冰上保存。
以新型冠状病毒特异性核酸定量标准品为阳性对照，即新型冠状病毒的部分序列：
5’-TTGAGTGAAATGGTCATGTGTGGCGGTTCACTATATGTTAAACCAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGCCA CAACTGCTTATGCTAATAGTGTTTTTAACATTTGTCAA-3’；
以不添加模板(待测样本的核酸或者是新型冠状病毒特异性核酸定量标准品)的样本 为阴性对照；
直接用待测病人的血浆、全血、咽拭子、漱口液或呼吸道分泌物为分析样本；
(1)提取RNA
在200ul RNase free H2O中加入600ul异硫氰酸胍，然后分别加入对照和样品，再加 200ul氯仿，颠倒混匀，在13000rpm下离心15min取上清；然后加入400ul预冷异丙醇， 颠倒混匀，在13000rpm下离心15min，再加600ul75％乙醇，颠倒混匀，在13000rpm下离 心15min，弃上清；再在4000rpm离心10sec，室温干燥2－3min；最后加入20ulDEPE水， 轻轻混匀溶解RNA；最后在2000rpm离心5sec后，于冰上保存备用；
(2)荧光PCR扩增
反应体系如下：
2×Buffer10ul
Enzyme Mix
10uM正向引物 0.2-1.0uM
10uM反向引物 0.2-1.0uM
探针 0.3-1.0uM
RNA 10-100ng
RNase free dH2O 补足至20ul；
PCR程序如下：
42℃ 5min 20℃/sec
95℃ 10sec 20℃/sec
1cycle
95℃ 5sec 20℃/sec
60℃ 20sec 20℃/sec
40cycles
95℃ 0sec 20℃/sec
65℃ 15sec 20℃/sec
95℃ 0sec；
(3)结果分析
通过扩增曲线和溶解曲线判断扩增质量，基于标准品的浓度和Ct值绘制标准曲线，依 据标准曲线计算检测样本的浓度。
分析结果如下表1：
表1样品检测结果
Figure BDA0002595354580000081
Figure BDA0002595354580000091
检测过程整个流程约3h，结果显示，共20份样品，2019-nCoV阳性样品6份，阴性样品14份。与现有技术中其他的检测方法检测得到的结果鉴定一致，准确率达100％。
实施例4
取阳性对照品(含2019-nCoV基因片段)，测定其浓度并计算拷贝数，按照10倍的浓度 梯度稀释，选取病毒浓度50CFU/mL～5×107CFU/mL的浓度作为样品，用本发明的实施例1 的试剂盒和实施例3的检测方法进行检测。
检测结果表明，本发明的试剂盒对2019-nCoV的最低检出限浓度为4.02×102IU/mL， 灵敏度较高。
实施例5
取试剂盒中阳性对照的1000倍稀释品，用本发明实施例1的试剂盒和实施例3的检测 方法，连续重复10次试验，结果阳性对照的100倍稀释品Ct值变异系数均小于5％，表面其重复性良好。
实施例6
利用实施例1中的试剂盒和实施例3的方法分别对HCoV-229E病毒、HCoV-OC43病毒、 HCoV-NL63病毒、HCoV-HKU1病毒、SARS-CoV病毒和MERS-CoV病毒进行PCR检测，结果如图1，各样本均为阴性。结果表明，本发明的检测试剂盒特异性高，与其他冠状病毒均无交叉反应。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原 则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于新型冠状病毒基因检测的试剂，其特征在于，包括用于检测新型冠状病毒基因的特异性引物、探针及阳性参照；
用于检测新型冠状病毒基因的特异性引物和探针包括以下两组中的至少一组：
组1、特异性引物：
引物S1:5’-ACGCGTTCCATGTGGTCAT-3’，
引物R1:5’-CATGGAGTGGCACGTTGAGA-3’；
特异性探针核苷酸序列1：5’-CAATCCAGAAACTAACATTC-3’；
组2、特异性引物：
引物S2:5’-GGACGCTGTGACATCAAGGA-3’，
引物R2:5’-AGCGTTCGTGATGTAGCAAC-3’；
特异性探针核苷酸序列2：5’-CTGCCTAAAGAAATC-3’。
2.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒基因检测的试剂，其特征在于，所述阳性参照包括：
引物S3:5’-GTGAAATGGTCATGTGTGGCGG-3’，
引物R3:5’-CAAATGTTAAAAACACTATTAGCATA-3’；
特异性探针核苷酸序列3：5’-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-3’。
3.一种用于新型冠状病毒的基因检测的试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求1或2所述的用于新型冠状病毒基因检测的试剂；
一步法RT-PCR混合试剂；
病毒RNA提取试剂，包括病毒裂解系统和Carrier RNA；
新型冠状病毒特异性核酸定量标准品，所述标准品为新型冠状病毒的部分序列：
5’-TTGAGTGAAATGGTCATGTGTGGCGGTTCACTATATGTTAAACCAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGCCACAACTGCTTATGCTAATAGTGTTTTTAACATTTGTCAA-3’。
4.根据权利要求3所述的用于新型冠状病毒的基因检测的试剂盒，其特征在于，所述病毒裂解系统包括3-5mol/L异硫氰酸胍、0.3-0.6wt％十二烷基肌氨酸钠、0.05-0.15mmol/Lβ巯基乙醇，20-30mmol/L柠檬酸钠和15-25μg糖原；所述Carrier RNA为200-300nt的RNA混合物。
5.根据权利要求4所述的用于新型冠状病毒的基因检测的试剂盒，其特征在于，所述病毒裂解系统包括4mol/L异硫氰酸胍、0.5wt％十二烷基肌氨酸钠、0.1mmol/Lβ巯基乙醇，25mmol/L柠檬酸钠和20μg糖原。
6.根据权利要求3所述的用于新型冠状病毒的基因检测的试剂盒，其特征在于，所述一步法RT-PCR混合试剂由以下组分混合而成：
2×Buffer10ul
Enzyme Mix
10uM正向引物 0.2-1.0uM
10uM反向引物 0.2-1.0uM
探针 0.3-1.0uM
RNA 10-100ng
RNase free dH2O 补足至20ul。
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