WO2014133153A1 - 病原性真菌の一括検出方法 - Google Patents

病原性真菌の一括検出方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2014133153A1
WO2014133153A1 PCT/JP2014/055132 JP2014055132W WO2014133153A1 WO 2014133153 A1 WO2014133153 A1 WO 2014133153A1 JP 2014055132 W JP2014055132 W JP 2014055132W WO 2014133153 A1 WO2014133153 A1 WO 2014133153A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
primer set
nos
set forth
lamp
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/055132
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
紘司 石川
浩平 笠原
澄江 佐藤
藤本　淳治
渡辺　幸一
島川　康久
Original Assignee
株式会社ヤクルト本社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社ヤクルト本社 filed Critical 株式会社ヤクルト本社
Priority to JP2015503057A priority Critical patent/JP6298040B2/ja
Publication of WO2014133153A1 publication Critical patent/WO2014133153A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Definitions

  • the present invention relates to a rapid and simple batch detection method for pathogenic fungi using the LAMP method.
  • Fungus is a general term for filamentous fungi, yeast and mushrooms, and is a widespread fungus in the living environment. Normally, this fungus has no effect on the human body, but depending on the type of fungus, it can cause disease if it infects organs such as the lungs and liver, and body surfaces such as the hands and soles. In particular, it is known that when an immunodeficiency state such as neutropenia occurs, a so-called opportunistic infection is likely to occur.
  • fungi that cause deep mycosis include Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, and other Candida parapsilosis.
  • the state where infection occurs on the surface of the fungus body is called superficial mycosis.
  • superficial mycosis for example, trichophyton mentrums such as Trichophyton rubrum and Trichophyton mentagrophytes are known.
  • Patent Document 1 a method of separating and culturing
  • Non-Patent Document 1 a direct microscopic method
  • Non-Patent Document 1 a serological test method
  • PCR (Polymerase Chain Reaction) a method of separating and culturing
  • the isolation culture method can detect even if the amount of bacteria is very small, but there is a time problem that it takes several days to several weeks for colony formation on the plate medium.
  • the direct microscopic method is to observe the specimen as it is, or if it is liquid, the sediment after centrifugation is observed directly with an optical microscope or with Gram staining or Giemsa staining, but only by microscopic images. For this reason, there is a problem that judgment may be lost depending on the sample, and skilled techniques are required.
  • Serological tests such as ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) method and Latex Agglutination method detect antigens such as glycoproteins and components of cell walls, or metabolites of pathogenic fungi. Although this method is excellent in rapidity and convenience, there are problems such as low sensitivity and multiple factors that cause false positives due to antigen matching with other fungi.
  • the PCR method uses fungal nucleic acid as a template, the specificity is greatly improved compared to the above method, but PCR reactions and electrophoresis of PCR products that require periodic temperature change settings for nucleic acid amplification are performed. There is a problem that it takes a long time for inspection. In addition, in this method, only one type of fungus can be detected in one reaction, and when a plurality of types of fungi are to be examined, the PCR method must be performed for each type of fungus.
  • an object of the present invention is to provide a method that can rapidly and easily detect pathogenic fungi at once.
  • the present inventors have used a LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method, and as a LAMP primer set used for this, a specific region of a pathogenic fungus of one species is used.
  • LAMP primer set capable of amplifying the bacterium was used, it was found that pathogenic fungi of two or more bacterial species could be collectively detected even when two or more bacterial species were mixed, and the present invention was completed.
  • the present invention provides the following steps (1) to (3).
  • (1) A step of extracting DNA from a sample.
  • (2) The LAMP primer set for amplifying at least part of the region containing the ITS region or IGS region of a pathogenic fungus of one species and two or more species, and the LAMP reaction using the DNA extracted in (1)
  • (3) A method for collectively detecting pathogenic fungi, comprising a step of confirming the presence or absence of amplification.
  • the present invention also includes a LAMP primer set for amplifying at least a part of a region containing an ITS region or an IGS region of a pathogenic fungus of one bacterial species, for batch detection of pathogenic fungi, characterized by comprising two or more bacterial species. It is a LAMP primer set.
  • the present invention is a collective detection kit for pathogenic fungi comprising the LAMP primer set for collective detection of pathogenic fungi.
  • the collective detection method for pathogenic fungi of the present invention can detect a plurality of pathogenic fungi at a time with high sensitivity.
  • the collective detection method for pathogenic fungi of the present invention has a constant temperature condition, and the result can be confirmed visually, so that it is not only faster than the conventional PCR method but also a test instrument. Pathogenic fungi can be easily detected in a lump even in an environment where they are not aligned. Moreover, according to the present invention, a detection kit capable of batch detection of pathogenic fungi can be provided.
  • the collective detection method for pathogenic fungi of the present invention includes the following steps (1) to (3).
  • the sample used in the step (1) of the detection method of the present invention is not particularly limited.
  • clinical specimens such as blood and biopsy (biopsy), environmental samples such as soil, or food and drink such as dairy products
  • food and drink such as dairy products
  • dairy products include raw materials for foods and drinks.
  • food and drink are preferable, and dairy products are particularly preferable.
  • the dairy product is not particularly limited as long as it contains milk-derived components.
  • These dairy products include not only final products but also milk-derived raw materials such as casein, whey protein, milk peptides, lactoferrin, and intermediate processed products such as cultures by lactic acid bacteria.
  • the method for extracting DNA from the sample is not particularly limited.
  • a method for extracting using an organic solvent such as phenol, chloroform, benzyl chloride, a method for physically crushing bacterial cells by shaking glass beads, an alkali A method such as a method of directly adding, a method by heat treatment, a protease treatment method and the like can be mentioned.
  • a commercially available DNA extraction kit may be used for extracting DNA from a sample. Among these methods, a method including protease treatment is preferable from the viewpoint that the time required for DNA extraction is short and the extraction efficiency is high.
  • a method for extracting DNA by a protease treatment method is as follows. After the dairy product is treated with protease, the protein or polypeptide digested with protease is removed by centrifugation or the like. Thereafter, an alkaline solution, a buffer buffer or the like is added, and the DNA is exposed from the cells by heat treatment or the like. A solution after the heat treatment or a solution from which impurities are further removed by centrifugation or the like is used as a DNA solution.
  • the concentration of the protease used is not particularly limited, but is, for example, 0.1 to 500 mg / ml.
  • the LAMP primer set used in step (2) of the detection method of the present invention amplifies at least a part of a region containing an ITS region or an IGS region of one pathogenic fungus. By using these regions, even when primer sets of two or more bacterial species are combined, at least a part of the region including the ITS region or the IGS region for each bacterial species can be specifically amplified.
  • pathogenic fungi cause deep mycosis, for example, Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis ) And other fungi of the genus Candida, Trichosporon asahii, Trichosporon mucoides and other fungi of the genus Trichosporon, Filobasidiella neoformans and the like Fungi, superficial mycosis causing Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes and other fungi of the genus Trichophyton, Malassezia globosa, Malassez ⁇ Pachi Zehnder Mathis (Malassezia pachydermatis) fungus Malassezia genus, and the like.
  • At least two genera selected from the group consisting of fungi of the genus Candida, fungi of the genus Trichosporon and fungus of the genus Philobasidiella are preferred, and in particular, Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis 2 or more selected from the group consisting of Candida parapsilosis, Trichosporon Asahi, Trichosporon mucoides and Philobasidiera neoformans are preferred, and all of these are more preferred.
  • primers F3, B3, FIP, and BIP are essential for a LAMP primer set that amplifies at least a part of the ITS region or IGS region of these pathogenic fungi. Moreover, it is preferable to add loop primers such as LF and LB to this LAMP primer set in order to shorten the detection time.
  • loop primers such as LF and LB
  • a base sequence region from the 5 ′ side of a target region selected from a base sequence containing at least a part of an ITS region or IGS region of a pathogenic fungus F3, F2 and F1 are selected as B3c, B2c and B1c as base sequence regions from the 3 ′ side of the target region.
  • A a base sequence (BIP) having the B2 region on the 3 ′ side and the B1c region on the 5 ′ side
  • B Base sequence having the B3 region
  • C a base sequence having the F2 region on the 3 ′ side and the F1c region on the 5 ′ side
  • F3 region Base sequence having the F3 region (F3)
  • E Base sequence having the F3 region (LB) having a sequence complementary to a portion between the B1 region and the B2 region
  • F a base sequence (LF) having a sequence complementary to a portion between the F1 region and the F2 region
  • primers used in the LAMP method including long primers of 35 bases or more. Therefore, when the LAMP method is performed by mixing primer sets of two or more bacterial species in the same reaction solution (multiplex LAMP), primers of other bacterial species form double strands to form primer dimers, and LAMP It is easily expected that the reaction will not proceed normally.
  • the inventors of the present invention designed a primer targeting at least a part of the ITS region or IGS region of a pathogenic fungus, and used the primer to combine two or more species of primer sets in the same reaction solution. It was found that even when mixed in, the LAMP reaction proceeds normally and the target bacterial species can be specifically detected.
  • the ITS region includes both the ITS1 region (existing between 18S rDNA and 5.8S rDNA) and the ITS2 region (existing between 5.8S rDNA and 26S rDNA).
  • the IGS region includes both the IGS1 region (existing between 26S rDNA and 5S rDNA) and the IGS2 region (existing between 5S rDNA and 18S rDNA).
  • Primers constituting the LAMP primer set for detecting pathogenic fungi of the present invention are obtained by analyzing the homology of base sequence information including at least a part of the ITS region and IGS region of pathogenic fungi and closely related fungi.
  • a base sequence including at least a part of a base sequence that holds only fungi is preferable.
  • the LAMP primer set can be designed using software, for example, except for selecting the region described in paragraph 0022.
  • the base sequence information of the fungus is obtained from the international base sequence database (DDBJ / EMBL-Bank / GenBank), MAFT Version 6 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/software), ClustalW, etc.
  • the base sequence information held only by the pathogenic fungus can be obtained by performing an analysis using the above homology analysis software and finding the base sequence held only by the pathogenic fungus.
  • LAMP primer design software (Primer Explorer Ver. 4.0 (https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/)) provided on the website can be used.
  • the software can also design loop primers.
  • the region containing the ITS1 and ITS2 regions of Candida albicans is the base sequence described in SEQ ID NO: 1 (accession number: EF567995).
  • SEQ ID NO: 1 accession number: EF567995.
  • a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 8 to 11 or oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 8, 9, 11, 13 1 type or more chosen from the primer set which consists of.
  • a primer set consisting of an oligonucleotide represented by a nucleotide sequence described in SEQ ID NOs: 8 to 12 with a loop primer added thereto, or a nucleotide sequence described in SEQ ID NOs: 8, 9, 11 to 13 is used. It is preferred to use a primer set consisting of the indicated oligonucleotides.
  • the region containing the ITS1 and ITS2 regions of Candida glabrata is the base sequence described in SEQ ID NO: 2 (accession number: AB032177).
  • SEQ ID NO: 2 accession number: AB032177.
  • the region containing the ITS1 and ITS2 regions of Candida tropicalis is the base sequence described in SEQ ID NO: 3 (accession number: AY939810).
  • a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 19 to 22 can be mentioned. Further, as the primer set, it is preferable to use a primer set consisting of an oligonucleotide represented by the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 19 to 23, to which a loop primer is added.
  • the region containing the ITS1 and ITS2 regions of Candida parapsilosis is the base sequence described in SEQ ID NO: 4 (accession number: AY391843).
  • the LAMP primer set capable of amplifying this sequence includes a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 24-27 and oligonucleotides represented by the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 24-26, 30 Primer set, primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 31 to 34, primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 32 and 37 to 39, and SEQ ID NOs: 41 to 44 Or a primer set consisting of an oligonucleotide represented by the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 46 to 49.
  • a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 24-29, with the addition of a loop primer, the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 24-26, 28-30
  • a primer set consisting of the oligonucleotides shown a primer set consisting of the oligonucleotides shown in the base sequences of SEQ ID NOs: 31 to 36, and a primer set consisting of the oligonucleotides shown in the base sequences of SEQ ID NOs: 32 and 37-40
  • One or more selected from a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 41 to 45 or a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 46 to 50 may be used. preferable.
  • the region containing the IGS1 region of Trichosporon Asahi is the base sequence described in SEQ ID NO: 5 (accession number: FJ754250).
  • a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 51 to 54 can be mentioned. Further, as the primer set, it is preferable to use a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 51 to 55, to which a loop primer is added.
  • the region including the IGS1 region of Trichosporon mucoides is the base sequence described in SEQ ID NO: 6 (accession number: EU934806).
  • SEQ ID NO: 6 accession number: EU934806
  • a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 56 to 59 can be mentioned. Further, as a primer set, it is preferable to use a primer set consisting of an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 56 to 60, to which a loop primer is added.
  • the region containing the ITS1 and ITS2 regions of Philobasidiella neoformans is the base sequence described in SEQ ID NO: 7 (accession number: EU240005).
  • SEQ ID NO: 7 accession number: EU240005
  • each primer which comprises the LAMP primer set designed as mentioned above can be obtained using a normal DNA synthesis method well known to those skilled in the art, for example, a DNA synthesizer, or Sigma-Aldrich. It can be obtained by requesting synthesis from a DNA synthesizer such as Japan or Life Technologies Japan.
  • the LAMP primer set for amplifying at least a part of the region containing the ITS region or IGS region of one pathogenic fungus as described above is more than 2 species, preferably more than 4 species, particularly preferably 7 species Using this for more than minutes, this is reacted with the DNA extracted in step (1).
  • the conditions for the LAMP reaction are not particularly limited, and known conditions can be used.
  • the LAMP reaction includes the LAMP primer set, the DNA extracted in step (1), the nucleic acid synthesizing enzyme, the nucleic acid synthesizing substrate, other buffers that give conditions suitable for the enzymatic reaction as necessary, and salts as cofactors. (Magnesium salt, manganese salt, etc.), a protective solution that contributes to the stabilization of the enzyme and template DNA, and a reagent that is necessary for the detection of the reaction product, if necessary. It is preferably carried out by maintaining at 60 to 65 ° C. for 1 to 180 minutes, preferably 10 to 120 minutes.
  • the DNA nucleic acid synthase used in the LAMP reaction is preferably a template-dependent nucleic acid synthase having strand displacement activity.
  • examples of such enzymes include Bst DNA polymerase (large fragment), Csa DNA polymerase, 96-7 DNA polymerase, and the like.
  • examples of the nucleic acid synthesis substrate include dNTP (including dATP, dCTP, dGTP, and dTTP).
  • the presence or absence of amplification can be confirmed by a known method.
  • magnesium pyrophosphate is generated as a by-product of the amplification reaction, and the reaction solution becomes cloudy. Therefore, it can be confirmed that amplification has occurred by visual observation or measurement with a turbidimeter. Can be confirmed by the presence or absence of the ladder pattern.
  • the fluorescence intensity is enhanced by irradiating UV to the reaction solution amplified by adding ethidium bromide to the reaction solution, it can be confirmed that there was amplification depending on the presence or absence of fluorescence.
  • the detection method of the present invention described above can quickly and easily detect pathogenic fungi at once.
  • kits containing the LAMP primer set for batch detection of pathogenic fungi as described above can also be used.
  • kits described above include the LAMP primer set for collective detection of pathogenic fungi described above, a template-dependent nucleic acid synthetase having strand displacement activity, a substrate for nucleic acid synthesis, and a buffer solution that provides conditions suitable for the enzyme reaction. , Salts containing cofactors (magnesium salts, manganese salts, etc.), protecting agents that contribute to the stabilization of enzymes and template DNA, and reagents and instruments necessary for detecting reaction products as necessary Can be mentioned.
  • the kit of the present invention may include a positive control for confirming that the LAMP reaction proceeds normally with the primer set of the present invention. Examples of the positive control include DNA containing a region amplified by the primer set of the present invention.
  • Example 1 Specific detection of pathogenic fungi: (1) Design and synthesis of LAMP primer First, Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, Candida parapsilosis (C parapsilosis), Trichosporon Asahi, T. mucoides, F. neoformans, and closely related 18S-26S rDNA ITS The base sequence information of the region or 26S-5S rDNA IGS region was obtained from the international base sequence database (DDBJ / EMBL-Bank / GenBank).
  • a LAMP primer capable of amplifying at least a part of the region including the ITS region or the IGS region is positioned at positions 260 to 490 of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and from 570 to 570 of the base sequence described in SEQ ID NO: 2.
  • Calb-a is SEQ ID NO: 8-12
  • Cgla is SEQ ID NO: 14-18
  • Ctro is SEQ ID NO: 19-23
  • Cpar-b is SEQ ID NO: 24-26, 28-30
  • Tasa is SEQ ID NO: 51-55
  • Tmuc is a set of primers consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 56-60
  • Fneo is set forth in SEQ ID NOs: 61-65, respectively.
  • the DNA extracted in (2) above was prepared at a concentration of 10 ⁇ g / mL and used as a template DNA solution.
  • the LAMP reaction was performed using a Loopamp DNA amplification reagent kit (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) and each primer set described in Table 1 alone, and according to the protocol attached to the kit, using the reaction solution described in Table 2, The reaction was performed at 62 ° C. for 90 minutes.
  • Amplification of DNA of pathogenic fungi was evaluated by the presence or absence of increase in turbidity of the reaction solution during the reaction using a Loopamp real-time turbidity measuring device (LA-200: manufactured by Telamex) (+: turbidity increased within 60 minutes) Yes (with amplification),-: No increase in turbidity after 90 minutes (no amplification)).
  • LA-200 manufactured by Telamex
  • Tt time
  • each primer set was able to amplify only the DNA sequence of the target pathogenic fungus and specifically detect it.
  • Example 2 Examination of LAMP primers Primer sets specific to C. albicans and candidate primer sets specific to C. parapsilosis group are designed on 5.8S-26S rDNA ITS2 of each target strain did.
  • the designed primers are shown in Table 4.
  • Calb-a is SEQ ID NO: 8-12
  • Calb-b is SEQ ID NO: 8, 9, 11-13
  • Cpar-a is SEQ ID NO: 24-29
  • Cpar-b is SEQ ID NO: 24-26, 28-30
  • Cpar-60 has the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 31 to 36
  • Cpar-63 has the sequence numbers 32 and 37 to 40
  • Cpar-65 has the sequence numbers 41 to 45
  • Cpar-68 has the sequence numbers 46 to 50.
  • a set of primers was carried out at 62 ° C. for 90 minutes using 10 ng of DNA extracted from Candida albicans (YIT 8272 T ) or Candida parapsilosis (YIT 10333 T ) in the same manner as in Example 1. Then, the time (Tt) when the turbidity of the reaction solution exceeded the threshold value (0.1) was measured with a Loopamp real-time turbidity measuring device (LA-200: manufactured by Teramex). The results are shown in Table 5.
  • the primer set specific to Candida albicans has a faster Tt for Calb-a than Calb-b, and the primer set specific to the Candida parapsilosis group has the fastest Tt for Cpar-b It was confirmed.
  • Loopamp DNA amplification reagent kit (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) includes 4 types of primer sets (Calb-a, Cgla, Cpar-b, and Ctro primers total 21 (mCan)) for detecting deep candidiasis-causing bacteria.
  • MLAMP reaction solution mixed with 5 ⁇ L (50 ng) of template DNA solution for bacterial species, or mLAMP reaction solution mixed with 2 types of primer set for detecting deep trichorsporonosis-causing bacteria (10 total primers (mTri) from Tasa and Tmuc)
  • mTri total primers
  • the turbidity of the reaction solution is set to the threshold (0.1).
  • the time exceeded (Tt) was measured. The results are shown in Table 6.
  • the experiment was performed in triplicate, and only when the increase in turbidity was observed in all reactions, the detection was positive.
  • Loopamp DNA amplification reagent kit (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) includes seven primer sets listed in Table 1 (Fneo, Calb-a, Cgla, Cpar-b, Ctro, Tasa and Tmuc primer total 36 (7plex))
  • Table 1 a mLAMP reaction solution in which 5 ⁇ L (50 ng) of a template DNA solution for one bacterial species was mixed
  • the mixture was turbid for 90 minutes while reacting at 62 ° C. with a Loopamp real-time turbidity measurement apparatus (LA-200: manufactured by Telamex). The change in degree was measured, and the time (Tt) when the turbidity of the reaction solution exceeded the threshold (0.1) was measured.
  • the results are shown in Table 7.
  • the reaction was performed in triplicate for the same DNA solution.
  • Example 5 Examination of detection limit of LAMP method: A DNA solution extracted by a benzyl chloride method from a suspension containing 1.0 ⁇ 10 7 cells / ml of the target bacterial species was serially diluted 5 to 10 times with TE buffer (pH 8.0). For the LAMP reaction, the seven primer sets (Fneo, Calb-a, Cgla, Cpar-b, Ctro, Tasa, Tmuc) described in Table 1 were added to the Loopamp DNA amplification reagent kit (manufactured by Eiken Chemical), respectively. Furthermore, using a LAMP reaction solution mixed with 5 ⁇ L of the template DNA solution for each bacterial species, the turbidity changes for 90 minutes while reacting at 62 ° C.
  • TE buffer pH 8.0
  • detection limit in qPCR is, 10 1 cell / ml corresponding DNA in Candida albicans and Candida glabrata, since it has been reported that 10 2 cell / ml corresponding DNA in Trichosporon Asahi, LAMP method using the primer set was found to have better detection sensitivity than the qPCR method.
  • Example 6 Examination of detection limit of multiplex LAMP (mLAMP) method: A DNA solution extracted by a benzyl chloride method from a suspension containing 1.0 ⁇ 10 7 cells / ml of the target bacterial species was serially diluted 5 to 10 times with TE buffer (pH 8.0).
  • the mLAMP reaction was carried out using a Loopamp DNA amplification reagent kit (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), 4 types of primer sets for detecting candidiasis caused by deep candidiasis (Calb-a, Cgla, Cpar-b and Ctro primer total 21 (mCan) ) And 5 ⁇ L of the template DNA solution, or a LAMPamp solution containing a mixture of two primer sets for detecting deep trichorsporonosis-causing bacteria (total 10 Tasa and Tmuc primers (mTri)).
  • the change in turbidity was measured for 90 minutes while reacting at 62 ° C. using a real-time turbidity measuring device (LA-200: manufactured by Terramex).
  • the reaction was carried out in triplicate for the same DNA dilution, and only when the increase in turbidity was observed in all reactions was detected positive, and the detection positive value with the smallest number of bacteria was taken as the detection limit.
  • detection limit in qPCR is, 10 1 cells / ml corresponding DNA in Candida albicans and Candida glabrata, since it has been reported that 10 2 cells / ml corresponding DNA in Trichosporon Asahi, MLAMP method using the primer set was found to have almost the same detection sensitivity as the qPCR method.
  • Example 7 Examination of DNA extraction method: Filobasidiella neoformans was appropriately suspended in physiological saline, and a suspension was prepared so that the cell concentration was 1.0 ⁇ 10 7 cells / ml by cell counting using a hemocytometer. This suspension was centrifuged at 15,000 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was removed from the cell pellet. Yakult (non-fat milk solid content 3.1%, milk fat 0) 1% of Yakult HQ) was added.
  • Benzyl chloride method 1 ml of the pseudo-contaminated dairy product was centrifuged at 15,000 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was removed. To the obtained pellet, 250 ⁇ L Extraction buffer (100 mM Tris-HCl, 40 mM EDTA [pH 9.0]), 0.7 g glass beads ( ⁇ 0.1-0.2 mm), 500 ⁇ L benzyl chloride were added, and Fastprep FP120 ( Bio101) was vigorously shaken for 30 seconds at a strength of 6.5, then 50 ⁇ L of 10% sodium dodecyl sulfate solution was added, and the cells were crushed by vigorous shaking at 50 ° C. for 20 minutes in a Microincubator (made by Taitec). did.
  • Extraction buffer 100 mM Tris-HCl, 40 mM EDTA [pH 9.0]
  • 0.7 g glass beads ⁇ 0.1-0.2 mm
  • 500 ⁇ L benzyl chloride were added, and Fastprep FP120
  • Example 8 Examination of shortening of detection time by loop primer Using 10 ng of P. cerevisiae Neoformans DNA extracted by the same method as in Example 1 and using Fneo primer set specific for P. foliosidei neoformans A LAMP reaction was performed in the same manner as in Example 1. In addition, among 5 types of primers contained in the Fneo primer set, a primer set excluding only Fneo-LB (loop primer) was used, and a LAMP reaction was similarly carried out using 10 ng of Filobasidia neoformans DNA as a template. went.
  • pathogenic fungi since pathogenic fungi can be detected quickly and easily at a time, diagnosis and prevention of diseases caused by pathogenic fungi and the delay in shipment due to food and drink contaminated with pathogenic fungi It can be used for suppression.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　迅速、簡便に病原性真菌を一括で検出できる方法を提供することを目的とし、以下の工程（１）～（３） （１）試料からＤＮＡを抽出する工程。 （２）１菌種の病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットを２菌種分以上と、（１）で抽出したＤＮＡを用いてＬＡＭＰ反応を行う工程 （３）増幅の有無を確認する工程 を含むことを特徴とする病原性真菌の一括検出方法を提供する。

Description

病原性真菌の一括検出方法
　本発明は、ＬＡＭＰ法を利用した迅速、簡便な病原性真菌の一括検出方法に関する。
　真菌は糸状菌、酵母、キノコの総称であり、生活環境において幅広く存在している菌である。通常この真菌は人体に影響はないが、真菌の種類によっては、肺や肝臓等の臓器や手、足裏等の体表面に感染した場合、疾患を引き起こすことがある。特に、好中球減少症をはじめとした免疫不全の状態になると、いわゆる日和見感染を起こしやすい状態になることが知られている。
　これらの疾患のうち、真菌が肺や肝臓など、体の深部に入り込んで感染が起こっている状態を深在性真菌症という。深在性真菌症を引き起こす真菌としては、例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida　albicans）、カンジダ・グラブラータ（Candida　glabrata）、カンジダ・トロピカリス（Candida　tropicalis）、カンジダ・パラプシローシス（Candida　parapsilosis）等のカンジダ属の真菌、トリコスポロン・アサヒ（Trichosporon　asahii）、トリコスポロン・ムコイデス（Trichosporon　mucoides）等のトリコスポロン属の真菌、フィロバシディエラ・ネオフォルマンス（Filobasidiella　neoformans）等のフィロバシディエラ属の真菌等が知られている。
　また、真菌の体表面で感染が起こっている状態を表在性真菌症という。表在性真菌症を引き起こす真菌としては、例えば、トリコフィトン・ルブラム（Trichophyton　rubrum）、トリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton　mentagrophytes）等のトリコフィトン属の真菌が知られている。
　これら人体に疾患を引き起こす病原性の真菌を早期に検出することは非常に重要である。特に、食品分野において、製品出荷前に製品中に混入した病原性の真菌を迅速に検出することは、製品出荷停滞の縮減および生産効率の向上をはかる上で非常に重要である。
　これまで病原性の真菌の検出法として、分離培養する方法（特許文献１）や直接鏡検法（非特許文献１）、血清学的検査法（非特許文献１）、あるいはＰＣＲ（Polymerase　Chain　Reaction）法（特許文献２、３）が従来から用いられている。分離培養法は、菌がごく少量であったとしても検出可能であるが、平板培地への集落形成には数日から場合によっては数週間を要するという時間的な問題があった。直接検鏡法は検体をそのまま、あるいは液体であれば遠心分離後の沈殿物を光学顕微鏡で直接、あるいはグラム染色やギムザ染色等を施して観察するものであるが、鏡検像のみで判断するため、検体によっては判断に迷うことがあり、熟練した技術が必要といった問題があった。ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked　ImmmunoSorbent　Assay）法やラテックス凝集（Latex　Agglutination）法などの血清学的検査は、病原性真菌が保持する糖タンパク質や細胞壁の構成成分等の抗原あるいは病原性真菌の代謝産物を検出する方法であり、迅速性や簡便性に優れた方法であるが、感度が低いことや、他の真菌との抗原一致によって偽陽性となる要因が複数存在するといった問題があった。ＰＣＲ法は真菌の核酸を鋳型とすることから、前記方法と比較して特異性が大幅に向上したが、核酸増幅に周期的な温度変化設定が必要なＰＣＲ反応、ＰＣＲ産物の電気泳動を実施する必要があり、検査に長時間を要するといった問題があった。また、この方法では１回の反応で１種類しか真菌が検出できず、複数種の真菌が検査対象の場合には、それぞれの菌種についてＰＣＲ法を実施しなければならなかった。さらに、複数の病原性真菌を一括で検出する手法として、複数のプライマーを反応液に混合してＰＣＲ反応を行うマルチプレックスＰＣＲ法と、マイクロプレートハイブリダイゼーションを組み合わせて用いる手法についても報告がされている（特許文献３）。しかしながら、この方法もＰＣＲ産物を用いた検出工程を実施する必要があり、検査に長時間を要するといった問題があった。
特開平６－２３９９８２号公報 特開平８－８９２５４号公報 特開２００８－５４５６３号公報
深在性真菌症のガイドライン作成委員会編、「深在性真菌症の診断・治療ガイドライン２００７」、協和企画、２００７年２月、ｐ．４３
　従って、本発明の課題は、迅速、簡便に病原性真菌を一括で検出できる方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated　Isothermal　Amplification）法を利用し、これに用いるＬＡＭＰプライマーセットとして、１菌種の病原性真菌の特定の領域を増幅しうるＬＡＭＰプライマーセットを用いれば、これを２菌種分以上混合しても２菌種以上の病原性真菌を一括で検出できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の工程（１）～（３）
（１）試料からＤＮＡを抽出する工程。
（２）１菌種の病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットを２菌種分以上と、（１）で抽出したＤＮＡを用いてＬＡＭＰ反応を行う工程
（３）増幅の有無を確認する工程
を含むことを特徴とする病原性真菌の一括検出方法である。
　また、本発明は１菌種の病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットを２菌種分以上含むことを特徴とする病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセットである。
　更に、本発明は上記病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセットを含むことを特徴とする病原性真菌の一括検出キットである。
　本発明の病原性真菌の一括検出方法は、感度よく、複数の病原性真菌を一括で検出することができる。
　また、本発明の病原性真菌の一括検出方法は、温度条件も一定であり、結果を目視でも確認できるため、従来行われていたＰＣＲ法等と比べて迅速であるのみならず、試験器具が揃わないような環境下でも簡便に病原性真菌を一括で検出することができる。また、本発明により、病原性真菌の一括検出が可能な検出キットを提供することができる。
　本発明の病原性真菌の一括検出方法（以下、「本発明検出方法」という）は、以下の工程（１）～（３）を含む。
（１）試料からＤＮＡを抽出する工程。
（２）１菌種の病原性真菌の１８Ｓ－２６Ｓ　ｒＤＮＡ　ＩＴＳ（内部転写スペーサー、Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　Ｓｐａｃｅｒ）領域またはＩＧＳ（遺伝子間スペーサー、Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ　Ｓｐａｃｅｒ）領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットを２菌種分以上と、（１）で抽出したＤＮＡを用いてＬＡＭＰ反応を行う工程
（３）増幅の有無を確認する工程
　本発明検出方法の工程（１）において用いられる試料としては、特に限定されないが、例えば、血液やバイオプシー（生検）などの臨床検体や、土壌などの環境試料、あるいは乳製品等の飲食品、飲食品の原材料等が挙げられる。これらの中でも、飲食品が好ましく、特に乳製品が好ましい。ここで、乳製品としては、乳由来成分を含むものであれば特に限定されず、例えば、牛乳、加工乳、乳飲料、クリーム、発酵乳、乳酸菌飲料、練乳、濃縮乳、粉乳、バター、チーズ、アイスクリーム、バターミルク等が挙げられる。これら乳製品には、最終製品のみならず、カゼイン、ホエー蛋白質、乳ペプチド、ラクトフェリン等の乳由来原料、乳酸菌による培養物等の中間加工処理物等も含まれる。
　上記試料からＤＮＡを抽出する方法は、特に限定されないが、例えば、フェノールやクロロホルム、ベンジルクロライドなどの有機溶剤を用いて抽出する方法や、ガラスビーズ振盪により物理的に菌体を破砕する方法、アルカリを直接添加する方法、加熱処理による方法、あるいはプロテアーゼ処理法等の方法が挙げられる。また、試料からＤＮＡを抽出するにあたり、市販のＤＮＡ抽出キットを用いてもよい。これらの方法の中でもプロテアーゼ処理を含む方法がＤＮＡの抽出の所要時間が短く、かつ抽出効率が高い点から好ましい。
　具体的に、試料として乳製品を用いた場合に、プロテアーゼ処理法でＤＮＡを抽出する方法は次の通りである。乳製品をプロテアーゼで処理した後、遠心分離等により、プロテアーゼで消化されたタンパク質あるいはポリペプチドを除去する。その後、アルカリ溶液や緩衝バッファー等を添加し、加熱処理等によって菌体からＤＮＡを露出させる。加熱処理後の溶液、あるいはこれから更に遠心分離等によって不純物を除去した後の溶液をＤＮＡ溶液とする。使用するプロテアーゼの濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１～５００ｍｇ／ｍｌである。
　本発明検出方法の工程（２）において用いられるＬＡＭＰプライマーセットは、１菌種の病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するものである。これらの領域を用いることにより、２菌種以上のプライマーセットを組み合わせたとしても、菌種ごとのＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を特異的に増幅できる。
　具体的に病原性真菌としては、深在性真菌症を引き起こす、例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida　albicans）、カンジダ・グラブラータ（Candida　glabrata）、カンジダ・トロピカリス（Candida　tropicalis）、カンジダ・パラプシローシス（Candida　parapsilosis）等のカンジダ属の真菌、トリコスポロン・アサヒ（Trichosporon　asahii）、トリコスポロン・ムコイデス（Trichosporon　mucoides）等のトリコスポロン属の真菌、フィロバシディエラ・ネオフォルマンス（Filobasidiella　neoformans）等のフィロバシディエラ属の真菌、表在性真菌症を引き起こす、トリコフィトン・ルブラム（Trichophyton　rubrum）、トリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton　mentagrophytes）等のトリコフィトン属の真菌や、マラセチア・グロボーサ（Malassezia　globosa）、マラセチア・パチダーマティス（Malassezia　pachydermatis）等のマラセチア属の真菌が挙げられる。これらの病原性真菌の中でも、カンジダ属の真菌、トリコスポロン属の真菌およびフィロバシディエラ属の真菌からなる群から選ばれる２属以上が好ましく、特にカンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシローシス、トリコスポロン・アサヒ、トリコスポロン・ムコイデスおよびフィロバシディエラ・ネオフォルマンスからなる群から選ばれる２種以上が好ましく、これらの全種がより好ましい。
　これら病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットには、Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰ、ＢＩＰの４種類のプライマーが必須である。また、このＬＡＭＰプライマーセットには、検出時間を短縮するために、ＬＦ、ＬＢといったループプライマーを追加することが好ましい。プライマー設計のためには、まず、これらのプライマーが標的とする領域として、病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域の少なくとも一部を含む塩基配列から選択される標的領域の５’側から塩基配列領域としてＦ３、Ｆ２およびＦ１を選択し、前記標的領域の３’側から、塩基配列領域としてＢ３ｃ、Ｂ２ｃおよびＢ１ｃを選択する。そして、前記Ｂ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃの相補的塩基配列を、それぞれＢ３、Ｂ２、Ｂ１とし、前記Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１の相補的塩基配列を、それぞれＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃとしたとき、それぞれのプライマーは以下の（Ａ）～（Ｆ）のいずれかに該当する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
（Ａ）前記Ｂ２領域を３’側に有し、前記Ｂ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列（ＢＩＰ）
（Ｂ）前記Ｂ３領域を有する塩基配列（Ｂ３）
（Ｃ）前記Ｆ２領域を３’側に有し、前記Ｆ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列（ＦＩＰ）
（Ｄ）前記Ｆ３領域を有する塩基配列（Ｆ３）
（Ｅ）前記Ｂ１領域と前記Ｂ２領域の間の部分と相補的な配列を有する塩基配列（ＬＢ）
（Ｆ）前記Ｆ１領域と前記Ｆ２領域の間の部分と相補的な配列を有する塩基配列（ＬＦ）
　前記のとおりＬＡＭＰ法で用いるプライマーは少なくとも４種類であり、その中には３５塩基以上の長いプライマーも含まれている。したがって、２菌種以上のプライマーセットを同一反応液中に混合してＬＡＭＰ法を行う（マルチプレックスＬＡＭＰ）場合、他菌種のプライマー同士が二本鎖を形成してプライマーダイマーを形成し、ＬＡＭＰ反応が正常に進まないことが容易に予想される。しかしながら、本願発明の発明者らは、病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域の少なくとも一部を標的として、プライマーを設計し、当該プライマーを用いることにより、２菌種以上のプライマーセットを同一反応液中に混合した場合でも、ＬＡＭＰ反応が正常に進み、標的菌種を特異的に検出することが可能であることを見出した。
　なお、本願発明において、ＩＴＳ領域とはＩＴＳ１領域（１８Ｓ　ｒＤＮＡと５．８Ｓ　ｒＤＮＡの間に存在する）と、ＩＴＳ２領域（５．８Ｓ　ｒＤＮＡと２６Ｓ　ｒＤＮＡの間に存在する）の両方を含むものである。また、ＩＧＳ領域とはＩＧＳ１領域（２６Ｓ　ｒＤＮＡと５Ｓ　ｒＤＮＡの間に存在する）と、ＩＧＳ２領域（５Ｓ　ｒＤＮＡと１８Ｓ　ｒＤＮＡの間に存在する）の両方を含むものである。
　本発明の病原性真菌検出用ＬＡＭＰプライマーセットを構成するプライマーは、病原性真菌およびこれに近縁な菌のＩＴＳ領域およびＩＧＳ領域の少なくとも一部を含む塩基配列情報を相同性解析し、病原性真菌のみ保持する塩基配列の少なくとも一部を含む塩基配列であることが好ましい。また、ＬＡＭＰプライマーセットの設計は、段落００２２に記載の領域を選択する以外は、例えば、ソフトウェアを用いて設計することができる。
　具体的には、前記真菌の塩基配列情報を国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ－Ｂａｎｋ／ＧｅｎＢａｎｋ）より入手し、ＭＡＦＦＴ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　６（http://mafft.cbrc.jp/alignment/software）やＣｌｕｓｔａｌＷなどの相同性解析ソフトウェアを用いて解析を行い、病原性真菌のみが保持する塩基配列を見出すことにより、病原性真菌のみ保持する塩基配列情報を得ることができる。さらに、Ｗｅｂサイト上で提供されているＬＡＭＰプライマー設計ソフトウェア（Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｌｏｒｅｒ　Ｖｅｒ．４．０（https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/））を用いて設計することができる。前記ソフトウェアにより、ループプライマーも設計することができる。
　以下に具体的な病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域やＬＡＭＰプライマーセットについて説明する。
　カンジダ・アルビカンスのＩＴＳ１およびＩＴＳ２領域を含む領域は、配列番号１に記載の塩基配列（アクセッションナンバー：EF567995）である。本発明検出方法においては、配列番号１に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号１に記載の塩基配列の２６０～４９０位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。
　この配列を増幅できるＬＡＭＰプライマーセットとしては、配列番号８～１１に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットまたは配列番号８、９、１１、１３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットから選ばれる１種以上が挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号８～１２に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットまたは配列番号８、９、１１～１３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることが好ましい。
　カンジダ・グラブラータのＩＴＳ１およびＩＴＳ２領域を含む領域は、配列番号２に記載の塩基配列（アクセッションナンバー：AB032177）である。本発明検出方法においては、配列番号２に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号２に記載の塩基配列の５７０～７９３位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。
　この配列を増幅できるＬＡＭＰプライマーセットとしては、配列番号１４～１７に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号１４～１８に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることが好ましい。
　カンジダ・トロピカリスのＩＴＳ１およびＩＴＳ２領域を含む領域は、配列番号３に記載の塩基配列（アクセッションナンバー：AY939810）である。本発明検出方法においては、配列番号３に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号３に記載の塩基配列の２８０～５００位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。
　この配列を増幅できるＬＡＭＰプライマーセットとしては、配列番号１９～２２に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号１９～２３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることが好ましい。
　カンジダ・パラプシローシスのＩＴＳ１およびＩＴＳ２領域を含む領域は、配列番号４に記載の塩基配列（アクセッションナンバー：AY391843）である。本発明検出方法においては、配列番号４に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号４に記載の塩基配列の２６０～５７０位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。
　この配列を増幅できるＬＡＭＰプライマーセットとしては、配列番号２４～２７に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号２４～２６、３０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３１～３４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３２、３７～３９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号４１～４４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットまたは配列番号４６～４９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットから選ばれる１種以上が挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号２４～２９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号２４～２６、２８～３０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３１～３６に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３２、３７～４０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号４１～４５に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットまたは配列番号４６～５０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットから選ばれる１種以上を用いることが好ましい。
　トリコスポロン・アサヒのＩＧＳ１領域を含む領域は、配列番号５記載の塩基配列（アクセッションナンバー：FJ754250）である。本発明検出方法においては、配列番号５に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号５記載の塩基配列の１３０～３４０位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。
　この配列を増幅できるＬＡＭＰプライマーセットとしては、配列番号５１～５４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号５１～５５に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることが好ましい。
　トリコスポロン・ムコイデスのＩＧＳ１領域を含む領域は、配列番号６記載の塩基配列（アクセッションナンバー：EU934806）である。本発明検出方法においては、配列番号６に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号６記載の塩基配列の２２０～４６０位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。
　この配列を増幅できるＬＡＭＰプライマーセットとしては、配列番号５６～５９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号５６～６０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることが好ましい。
　フィロバシディエラ・ネオフォルマンスのＩＴＳ１およびＩＴＳ２領域を含む領域は、配列番号７記載の塩基配列（アクセッションナンバー：EU240005）である。本発明検出方法においては、配列番号７に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号７記載の塩基配列の２５０～５１０位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。
　この配列を増幅できるＬＡＭＰプライマーセットとしては、配列番号６１～６４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号６１～６５に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることが好ましい。
　なお、前記のようにして設計されたＬＡＭＰプライマーセットを構成する各プライマーは、当業者によく知られた通常のＤＮＡの合成法、例えば、ＤＮＡ合成機を用いて得ることもできるし、シグマアルドリッチジャパン社やライフテクノロジーズジャパン社などのＤＮＡ合成業者等に合成を依頼して得ることができる。
　上記した１菌種の病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットを、２菌種分以上、好ましくは４菌種分以上、特に好ましくは７菌種分以上用い、これを工程（１）で抽出したＤＮＡとＬＡＭＰ反応させる。ＬＡＭＰ反応の条件は、特に限定されず、公知の条件を用いることができる。
　具体的に、ＬＡＭＰ反応は、上記ＬＡＭＰプライマーセット、工程（１）で抽出したＤＮＡ、核酸合成酵素、核酸合成の基質、その他必要により酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類（マグネシウム塩やマンガン塩等）、酵素や鋳型ＤＮＡの安定化に寄与する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬等を含む反応液とし、これを５８～６７℃、好ましくは６０～６５℃で１～１８０分間、好ましくは１０～１２０分間維持することにより行われる。
　前記ＬＡＭＰ反応に用いられるＤＮＡの核酸合成酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素が好ましい。このような酵素としては、例えば、Ｂｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｃｓａ　ＤＮＡポリメラーゼ、９６－７　ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。また、核酸合成の基質としては、例えば、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む）等が挙げられる。
　本発明検出方法の工程（３）において増幅の有無の確認は、公知の方法で行うことができる。具体的に、ＬＡＭＰ法は増幅反応の副産物としてピロリン酸マグネシウムが生成し、反応液が白濁するので目視や濁度計による測定で増幅があったことを確認することもできるし、また、反応液を電気泳動させればラダーパターンが存在するかどうかによって増幅があったことを確認することができる。さらに、反応液にエチジウムブロマイドを添加して増幅させた反応液にＵＶを照射することで蛍光強度が増強されるため、蛍光の有無によって増幅があったことを確認することができる。
　以上説明した本発明検出方法は、迅速、簡便に病原性真菌を一括で検出することができる。
　また、本発明検出方法を実施するため、上記した病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセットを含むキットを用いることもできる。
　上記したキットの好ましい態様としては、上記した病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセット、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素、核酸合成の基質と、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類（マグネシウム塩やマンガン塩等）、酵素や鋳型ＤＮＡの安定化に寄与する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬、器具類等を含むものが挙げられる。また、本発明のキットには、本発明のプライマーセットによってＬＡＭＰ反応が正常に進行していることを確認するための陽性対照を含んでいてもよい。陽性対照として、例えば本発明のプライマーセットにより増幅される領域を含むＤＮＡ等が挙げられる。
　以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
実　施　例　１
　　　病原性真菌の特異的検出：
（１）ＬＡＭＰプライマーの設計および合成
　まず、病原性真菌である、カンジダ・アルビカンス（C.　albicans）、カンジダ・グラブラータ（C.　glabrata）、カンジダ・トロピカリス（C.　tropicalis）、カンジダ・パラプシローシス（C.　parapsilosis）、トリコスポロン・アサヒ（T.　asahii）、トリコスポロン・ムコイデス（T.　mucoides）、フィロバシディエラ・ネオフォルマンス（F.　neoformans）、およびこれらに近縁の菌種の１８Ｓ－２６Ｓ　ｒＤＮＡ　ＩＴＳ領域、あるいは２６Ｓ－５Ｓ　ｒＤＮＡ　ＩＧＳ領域の塩基配列情報を、国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ－Ｂａｎｋ／ＧｅｎＢａｎｋ）より入手した。ＭＡＦＦＴ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　６（http://mafft.cbrc.jp/alignment/software）を用いてこれらをアライメント解析し、ＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域上の病原性真菌特異的な配列を抽出した。これらをもとに、ＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅できるＬＡＭＰプライマーを、配列番号１に記載の塩基配列の２６０～４９０位、配列番号２に記載の塩基配列の５７０～７９３位、配列番号３に記載の塩基配列の２８０～５００位、配列番号４に記載の塩基配列の２６０～５７０位、配列番号５に記載の塩基配列の１３０～３４０位、配列番号６に記載の塩基配列の２２０～４６０位、配列番号７に記載の塩基配列の２５０～５１０位を増幅できるよう、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ　Ｖｅｒ．　４．０（https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/）を使用して設計した。設計したＬＡＭＰプライマーを表１に示した。ここでCalb-aは配列番号８～１２、Cglaは配列番号１４～１８、Ctroは配列番号１９～２３、Cpar-bは配列番号２４～２６、２８～３０、Tasaは配列番号５１～５５、Tmucは配列番号５６～６０、Fneoは配列番号６１～６５、にそれぞれ記載の塩基配列からなるプライマーのセットである。なお、これらのプライマーはライフテクノロジーズジャパン社にＤＮＡ合成を依頼して得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）病原性真菌からのＤＮＡ抽出
　後記する表３に示した菌をそれぞれ生理食塩水に適宜懸濁し、血球計算盤を用いたセルカウントにより菌濃度が１.０ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁液を調製した。この懸濁液から、ベンジルクロライド法によりＤＮＡを抽出した。
　具体的には、１ｍＬの菌体懸濁液を１５,０００×ｇで５分間遠心分離を行ない、上清を除去した。得られたペレットに、２５０μＬ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４０ｍＭ　ＥＤＴＡ［ｐＨ　９.０］）、０.７ｇ　ガラスビーズ（φ０．１－０．２ｍｍ)、５００μＬ　ベンジルクロライドを添加し、Ｆａｓｔｐｒｅｐ　ＦＰ１２０（Ｂｉｏ１０１）にて強さ６.５で３０秒間激しく振とうした後、５０μＬ　１０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を加えてＭｉｃｒｏｉｎｃｕｂａｔｏｒ（タイテック製）にて５０℃、２０分間激しく振とうすることにより菌体を破砕した。その後１５０μＬ　３Ｍ酢酸ナトリウムを加えて攪拌し、１５,０００×ｇで８分間遠心分離を行ない、上清４００μＬを回収した。回収した上清に４００μＬ冷イソプロピルアルコールを添加し、転倒混和した後、１５,０００×ｇで８分間遠心分離を行ない、上清を除去した。これに３００μＬ冷７０％エタノールを添加して転倒混和後、１５,０００×ｇで３分間遠心分離を行なった。上清を除去し風乾後、５０μＬ　ＴＥ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ［ｐＨ　８.０］で沈殿物を溶解させたものをＤＮＡ溶液とした。
（３）ＬＡＭＰ法による病原性真菌の検出
　上記（２）で抽出したＤＮＡは、１０μｇ／ｍＬの濃度に調製して鋳型ＤＮＡ溶液とした。ＬＡＭＰ反応は、Ｌｏｏｐａｍｐ　ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学製）および表１に記載の各プライマーセットをそれぞれ単独で用いて、前記キットに添付のプロトコールに従い、表２に記載の反応液を用いて、６２℃で９０分間反応させた。病原性真菌のＤＮＡの増幅評価は、Ｌｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置（ＬＡ－２００：テラメックス製）により、反応中の反応液の濁度上昇の有無で評価した（＋：６０分以内に濁度上昇あり（増幅あり）、－：９０分経過後も濁度上昇なし（増幅なし））。評価においては、濁度０.１を閾値とし、閾値に達した際の時間（Ｔｔ）を比較基準とした。この結果を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記結果より、各プライマーセットは、標的とした病原性真菌のＤＮＡ配列のみを増幅し、特異的に検出することができた。
実　施　例　２
　　　ＬＡＭＰプライマーの検討：
　カンジダ・アルビカンス（C.　albicans）に特異的なプライマーセットと、カンジダ・パラプシローシス（C.　parapsilosis）グループに特異的なプライマーセット候補を、それぞれの標的菌種の５．８Ｓ－２６Ｓ　ｒＤＮＡ　ＩＴＳ２上に設計した。設計したプライマーを表４に示した。ここでCalb-aは配列番号８～１２、Calb-bは配列番号８、９、１１～１３、Cpar-aは配列番号２４～２９、Cpar-bは配列番号２４～２６、２８～３０、Cpar-60は配列番号３１～３６、Cpar-63は配列番号３２、３７～４０、Cpar-65は配列番号４１～４５、Cpar-68は配列番号４６～５０、にそれぞれ記載の塩基配列からなるプライマーのセットである。これらのプライマーセットを用いて、カンジダ・アルビカンス（YIT　8272T）あるいはカンジダ・パラプシローシス（YIT　10333T）より、実施例１と同様にして抽出したＤＮＡ１０ｎｇを鋳型に、６２℃で９０分間ＬＡＭＰ反応を実施して、Ｌｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置（ＬＡ－２００：テラメックス製）により反応液の濁度が閾値（０.１）を越えた時間（Ｔｔ）を測定した。その結果を表５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　上記結果より、カンジダ・アルビカンスに特異的なプライマーセットでは、Calb-bよりCalb-aでＴｔが早く、カンジダ・パラプシローシスグループに特異的なプライマーセットでは、Cpar-bが最もＴｔが早いことが確認された。
実　施　例　３
　　　マルチプレックスＬＡＭＰ（ｍＬＡＭＰ）法の検討（１）：
　深在性カンジダ症起因菌および深在性トリコスポロン症起因菌による汚染をそれぞれ一回の反応で判定可能とするため、複数のプライマーセットを同一反応液に混合したｍＬＡＭＰ法を検討した。
　Ｌｏｏｐａｍｐ　ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学製）に、深在性カンジダ症起因菌検出用プライマーセット４種（Calb-a、Cgla、Cpar-bおよびCtroのプライマー計２１本（mCan）)とそれぞれ１菌種分の鋳型ＤＮＡ溶液５μＬ(５０ｎｇ)を混合したｍＬＡＭＰ反応液あるいは深在性トリコスポロン症起因菌検出用プライマーセット２種（TasaおよびTmucのプライマー計１０本（mTri））を混合したｍＬＡＭＰ反応液を用いて、Ｌｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置（ＬＡ－２００：テラメックス製）により、６２℃で反応しながら、９０分間濁度の変化を測定し、反応液の濁度が閾値（０.１）を越えた時間（Ｔｔ）を測定した。その結果を表６に示した。
　実験は３連で実施し、全ての反応で濁度上昇が観察された場合のみを検出陽性とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　上記の結果より、標的菌種に近縁な４７菌種について交叉性を調べた結果、通常のＬＡＭＰ法と同様に、プライマーセットを複数組み合わせたｍＬＡＭＰにおいても検出対象菌種のみを特異的に検出可能であることが確認された。
実　施　例　４
　　　マルチプレックスＬＡＭＰ（ｍＬＡＭＰ）法の検討（２）：
　深在性真菌症起因菌の検出を迅速にするために、７つのプライマーセットを同時に反応させ、ｍＬＡＭＰ法を行った。
　Ｌｏｏｐａｍｐ　ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学製）に、表１に記載の７つのプライマーセット（Fneo、Calb-a、Cgla、Cpar-b、Ctro、TasaおよびTmucのプライマー計３６本（7plex））と、それぞれ１菌種分の鋳型ＤＮＡ溶液５μＬ（５０ｎｇ）を混合したｍＬＡＭＰ反応液を用いて、Ｌｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置（ＬＡ－２００：テラメックス製）により、６２℃で反応しながら、９０分間濁度の変化を測定し、反応液の濁度が閾値（０.１）を越えた時間（Ｔｔ）を測定した。その結果を表７に示した。なお、反応は同一ＤＮＡ溶液について３連で実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　上記の結果より、プライマーセットは７種組み合わせても検出対象菌種のみを特異的に検出可能であることが確認された。
実　施　例　５
　　　ＬＡＭＰ法の検出限界の検討：
　標的菌種を１.０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ含む懸濁液よりベンジルクロライド法にて抽出したＤＮＡ溶液をＴＥ緩衝液（ｐＨ８.０）にて５倍ないし１０倍で段階希釈した。ＬＡＭＰ反応は、Ｌｏｏｐａｍｐ　ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学製）に、表１に記載の７つのプライマーセット（Fneo、Calb-a、Cgla、Cpar-b、Ctro、Tasa、Tmuc）をそれぞれ添加し、更にそれぞれ１菌種分の鋳型ＤＮＡ溶液５μＬを混合したＬＡＭＰ反応液を用いて、Ｌｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置（ＬＡ－２００：テラメックス製）により、６２℃で反応しながら、９０分間濁度の変化を測定した。なお、反応は同一ＤＮＡ希釈液について３連で実施し、全ての反応で濁度上昇が観察された場合のみを検出陽性として、最も菌数が少ない検出陽性の値を検出限界とした。これらの結果を表８に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　ｑＰＣＲでの検出限界は、カンジダ・アルビカンスおよびカンジダ・グラブラータでは１０１ｃｅｌｌ／ｍｌ相当ＤＮＡ、トリコスポロン・アサヒでは１０２ｃｅｌｌ／ｍｌ相当ＤＮＡと報告されていることから、上記プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法はｑＰＣＲ法より優れた検出感度をもつことがわかった。
実　施　例　６
　　　マルチプレックスＬＡＭＰ（ｍＬＡＭＰ）法の検出限界の検討：
　標的菌種を１.０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ含む懸濁液よりベンジルクロライド法にて抽出したＤＮＡ溶液をＴＥ緩衝液（ｐＨ８.０）にて５倍ないし１０倍で段階希釈した。ｍＬＡＭＰ反応は、Ｌｏｏｐａｍｐ　ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学製）に、深在性カンジダ症起因菌検出用プライマーセット４種（Calb-a、Cgla、Cpar-bおよびCtroのプライマー計２１本（mCan）)と鋳型ＤＮＡ溶液５μＬを混合したｍＬＡＭＰ反応液あるいは深在性トリコスポロン症起因菌検出用プライマーセット２種（TasaおよびTmucのプライマー計１０本（mTri））を混合したｍＬＡＭＰ反応液を用いて、Ｌｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置（ＬＡ－２００：テラメックス製）により、６２℃で反応しながら、９０分間濁度の変化を測定した。なお、反応は同一ＤＮＡ希釈液について３連で実施し、全ての反応で濁度上昇が観察された場合のみを検出陽性として、最も菌数が少ない検出陽性の値を検出限界とした。これらの結果を表９に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　ｑＰＣＲでの検出限界は、カンジダ・アルビカンスおよびカンジダ・グラブラータでは１０１ｃｅｌｌｓ／ｍｌ相当ＤＮＡ、トリコスポロン・アサヒでは１０２ｃｅｌｌｓ／ｍｌ相当ＤＮＡと報告されていることから、上記プライマーセットを用いたｍＬＡＭＰ法はｑＰＣＲ法とほぼ同等の検出感度をもつことがわかった。
実　施　例　７
　　　ＤＮＡ抽出方法の検討：
　フィロバシディエラ・ネオフォルマンスを生理食塩水に適宜懸濁し、血球計算盤を用いたセルカウントにより菌濃度が１.０ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁液を調製した。この懸濁液を１５,０００×ｇで５分間遠心分離を行ない、上清を除去した菌体ペレットに市販の乳製品乳酸菌飲料であるヤクルト（無脂乳固形分３．１％、乳脂肪０．１％、ヤクルト本社製）を１ｍｌ添加した。これを前記乳製品乳酸菌飲料で段階希釈して調製した、種々の濃度（１．０ｘ１０７～１．０ｘ１００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）のフィロバシディエラ・ネオフォルマンスを含む擬似汚染乳製品について以下の（１）～（３）のＤＮＡの抽出方法について所要時間を検討した。またこれらの方法で擬似汚染乳製品から抽出したＤＮＡと、フィロバシディエラ・ネオフォルマンスに特異的なFneoプライマーセットを用い、実施例６と同様にして検出感度を測定した。
（１）ベンジルクロライド法
　擬似汚染乳製品１ｍｌを１５,０００×ｇで５分間遠心分離を行ない、上清を除去した。得られたペレットに、２５０μＬ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４０ｍＭ　ＥＤＴＡ［ｐＨ　９.０］）、０.７ｇ　ガラスビーズ（φ０．１－０．２ｍｍ)、５００μＬ　ベンジルクロライドを添加し、Ｆａｓｔｐｒｅｐ　ＦＰ１２０（Ｂｉｏ１０１）にて強さ６.５で３０秒間激しく振とうした後、５０μＬ　１０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を加えてＭｉｃｒｏｉｎｃｕｂａｔｏｒ（タイテック製）にて５０℃、２０分間激しく振とうすることにより菌体を破砕した。その後１５０μＬ　３Ｍ酢酸ナトリウムを加えて攪拌し、１５,０００×ｇで８分間遠心分離を行ない、上清４００μＬを回収した。回収した上清に４００μＬ冷イソプロピルアルコールを添加し、転倒混和した後、１５,０００×ｇで８分間遠心分離を行ない、上清を除去した。これに３００μＬ冷７０％エタノールを添加して転倒混和後、１５,０００×ｇで３分間遠心分離を行なった。上清を除去し風乾後、５０μＬ　ＴＥ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ［ｐＨ　８.０］で沈殿物を溶解させたものをＤＮＡ溶液とした。
（２）アルカリ直接添加法
　擬似汚染乳製品１ｍｌに、アルカリ溶液（２５μｌ　５Ｍ　ＮａＯＨ）を添加し、５分間、３７℃で反応したものを粗ＤＮＡ抽出液とした。
（３）プロテアーゼ処理法
　擬似汚染乳製品１ｍｌに、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ　８．０］に溶解したプロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ（天野エンザイム製）を３８．３ｍｇ／ｍｌの濃度で１５０μｌ添加し、３分間、４５℃で反応後、２分間、１０，０００×ｇで遠心し、上清を除去した。これにアルカリ溶液（１０％　Ｃｈｅｌｅｘ－１００　ｒｅｓｉｎ　ｉｎ　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ　１１］）を添加し、５分間、１００℃で反応後、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で中和した。これを１分間、２０，０００×ｇで遠心し、上清をＤＮＡ抽出液とした。
　ベンジルクロライド法でＤＮＡを抽出したところ抽出に９０分かかり、検出感度は１.９×１０２ｃｅｌｌ／ｍｌであった。また、アルカリ直接添加法でＤＮＡを抽出したところ抽出は１５分であったものの、検出感度は５.３×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌであった。一方、プロテアーゼ処理法でＤＮＡを抽出したところ抽出は１５分であり、検出感度は１.０×１０３ｃｅｌｌ／ｍｌであった。この結果より、抽出時間と検出感度から総合的に判定するとＤＮＡの抽出法としてはプロテアーゼ処理法が優れていることが分かった。
実　施　例　８
　　　ループプライマーによる検出時間短縮の検討
　実施例１と同様の方法で抽出したフィロバシディエラ・ネオフォルマンスのＤＮＡ１０ｎｇを鋳型とし、フィロバシディエラ・ネオフォルマンスに特異的なFneoプライマーセットを用いて実施例１と同様の方法でＬＡＭＰ反応を行った。
　また、Fneoプライマーセットに含まれる５種のプライマーのうち、Fneo-LB（ループプライマー）のみを除いたプライマーセットを用いて、フィロバシディエラ・ネオフォルマンスのＤＮＡ１０ｎｇを鋳型とし同様にＬＡＭＰ反応を行った。
　Ｌｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置（ＲＴ－１６０Ｃ：栄研化学製）により反応液の吸光度の微分値が閾値（０．００８）を越えた時間（Ｔｔ）を測定した。なお反応は同一ＤＮＡ希釈液について３連で実施した。
　これらの結果を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
ループプライマーを用いた方が検出時間が短縮されることが分かった。
　本発明によれば、迅速、簡便に病原性真菌を一括で検出することができるので、病原性真菌を原因とする疾患の診断、予防や、病原性真菌に汚染された飲食品による出荷停滞の抑制等に利用することができる。

Claims (18)

  1. 　以下の工程（１）～（３）
    （１）試料からＤＮＡを抽出する工程。
    （２）１菌種の病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットを２菌種分以上と、（１）で抽出したＤＮＡを用いてＬＡＭＰ反応を行う工程
    （３）増幅の有無を確認する工程
    を含むことを特徴とする病原性真菌の一括検出方法。
  2. 　病原性真菌が、カンジダ属の真菌、トリコスポロン属の真菌およびフィロバシディエラ属の真菌からなる群から選ばれるものである請求項１記載の病原性真菌の一括検出方法。
  3. 　病原性真菌が、カンジダ・アルビカンス（Candida　albicans）、カンジダ・グラブラータ（Candida　glabrata）、カンジダ・トロピカリス（Candida　tropicalis）、カンジダ・パラプシローシス（Candida　parapsilosis）、トリコスポロン・アサヒ（Trichosporon　asahii）、トリコスポロン・ムコイデス（Trichosporon　mucoides）およびフィロバシディエラ・ネオフォルマンス（Filobasidiella　neoformans）からなる群から選ばれるものである請求項１記載の病原性真菌の一括検出方法。
  4. 　病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域が、配列番号１～７に記載の塩基配列からなる群から選ばれるものである請求項１記載の病原性真菌の一括検出方法。
  5. 　病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域が、配列番号１に記載の塩基配列の２６０～４９０位、配列番号２に記載の塩基配列の５７０～７９３位、配列番号３に記載の塩基配列の２８０～５００位、配列番号４に記載の塩基配列の２６０～５７０位、配列番号５に記載の塩基配列の１３０～３４０位、配列番号６に記載の塩基配列の２２０～４６０位および配列番号７に記載の塩基配列の２５０～５１０位からなる群から選ばれるものである請求項１記載の病原性真菌の一括検出方法。
  6. 　病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットが、以下の（ａ）～（ｇ）
    （ａ）カンジダ・アルビカンス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号８～１１に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号８、９、１１、１３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる１種以上
    （ｂ）カンジダ・グラブラータ用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号１４～１７に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    （ｃ）カンジダ・トロピカリス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号１９～２２に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    （ｄ）カンジダ・パラプシローシス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号２４～２７に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号２４～２６、３０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３１～３４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３２、３７～３９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号４１～４４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号４６～４９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる１種以上
    （ｅ）トリコスポロン・アサヒ用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号５１～５４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    （ｆ）トリコスポロン・ムコイデス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号５６～５９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    （ｇ）フィロバシディエラ・ネオフォルマンス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号６１～６４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    からなる群から選ばれるものである請求項１記載の病原性真菌の一括検出方法。
  7. 　病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットが、以下の（ａ）’～（ｇ）’
    （ａ）’カンジダ・アルビカンス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号８～１２に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号８、９、１１～１３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる１種以上
    （ｂ）’カンジダ・グラブラータ用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号１４～１８に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    （ｃ）’カンジダ・トロピカリス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号１９～２３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    （ｄ）’カンジダ・パラプシローシス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号２４～２９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号２４～２６、２８～３０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３１～３６に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３２、３７～４０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号４１～４５に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号４６～５０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる１種以上
    （ｅ）’トリコスポロン・アサヒ用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号５１～５５に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    （ｆ）’トリコスポロン・ムコイデス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号５６～６０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    （ｇ）’フィロバシディエラ・ネオフォルマンス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号６１～６５に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    からなる群から選ばれるものである請求項１記載の病原性真菌の一括検出方法。
  8. 　試料からＤＮＡを抽出する工程にプロテアーゼ処理を含むことを特徴とする請求項１記載の病原性真菌の一括検出方法。
  9. 　１菌種の病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットを２菌種分以上含むことを特徴とする病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
  10. 　病原性真菌が、カンジダ属の真菌、トリコスポロン属の真菌およびフィロバシディエラ属の真菌からなる群から選ばれるものである請求項９記載の病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
  11. 　病原性真菌が、カンジダ・アルビカンス（Candida　albicans）、カンジダ・グラブラータ（Candida　glabrata）、カンジダ・トロピカリス（Candida　tropicalis）、カンジダ・パラプシローシス（Candida　parapsilosis）、トリコスポロン・アサヒ（Trichosporon　asahii）、トリコスポロン・ムコイデス（Trichosporon　mucoides）およびフィロバシディエラ・ネオフォルマンス（Filobasidiella　neoformans）からなる群から選ばれるものである請求項９記載の病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
  12. 　病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域が、配列番号１～７の塩基配列からなる群から選ばれるものである請求項９記載の病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
  13. 　病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域が、配列番号１に記載の塩基配列の２６０～４９０位、配列番号２に記載の塩基配列の５７０～７９３位、配列番号３に記載の塩基配列の２８０～５００位、配列番号４に記載の塩基配列の２６０～５７０位、配列番号５に記載の塩基配列の１３０～３４０位、配列番号６に記載の塩基配列の２２０～４６０位および配列番号７に記載の塩基配列の２５０～５１０位からなる群から選ばれるものである請求項９記載の病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
  14. 　病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットが、以下の（ａ）～（ｇ）
    （ａ）カンジダ・アルビカンス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号８～１１に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号８、９、１１、１３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる１種以上
    （ｂ）カンジダ・グラブラータ用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号１４～１７に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    （ｃ）カンジダ・トロピカリス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号１９～２２に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    （ｄ）カンジダ・パラプシローシス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号２４～２７に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号２４～２６、３０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３１～３４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３２、３７～３９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号４１～４４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号４６～４９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる１種以上
    （ｅ）トリコスポロン・アサヒ用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号５１～５４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    （ｆ）トリコスポロン・ムコイデス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号５６～５９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    （ｇ）フィロバシディエラ・ネオフォルマンス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号６１～６４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    からなる群から選ばれるものである請求項９記載の病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
  15. 　病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットが、以下の（ａ）’～（ｇ）’
    （ａ）’カンジダ・アルビカンス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号８～１２に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号８、９、１１～１３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる１種以上
    （ｂ）’カンジダ・グラブラータ用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号１４～１８に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    （ｃ）’カンジダ・トロピカリス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号１９～２３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    （ｄ）’カンジダ・パラプシローシス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号２４～２９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号２４～２６、２８～３０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３１～３６に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３２、３７～４０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号４１～４５に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号４６～５０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる１種以上
    （ｅ）’トリコスポロン・アサヒ用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号５１～５５に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    （ｆ）’トリコスポロン・ムコイデス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号５６～６０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    （ｇ）’フィロバシディエラ・ネオフォルマンス用ＬＡＭＰプライマーセット
    　　　配列番号６１～６５に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
    からなる群から選ばれるものである請求項９記載の病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
  16. 　請求項９～１５の何れかに記載の病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセットを含むことを特徴とする病原性真菌の一括検出キット。
  17. 　更に、核酸合成酵素と、核酸合成の基質を含む請求項１６に記載の病原性真菌の一括検出キット。
  18. 　核酸合成酵素が鎖置換活性を有する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼであり、核酸合成の基質がｄＮＴＰである請求項１７に記載の病原性真菌の一括検出キット。
PCT/JP2014/055132 2013-03-01 2014-02-28 病原性真菌の一括検出方法 WO2014133153A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015503057A JP6298040B2 (ja) 2013-03-01 2014-02-28 病原性真菌の一括検出方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013041017 2013-03-01
JP2013-041017 2013-03-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014133153A1 true WO2014133153A1 (ja) 2014-09-04

Family

ID=51428411

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2014/055132 WO2014133153A1 (ja) 2013-03-01 2014-02-28 病原性真菌の一括検出方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP6298040B2 (ja)
WO (1) WO2014133153A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106701944A (zh) * 2016-12-28 2017-05-24 上海市东方医院 一种用于检测光滑假丝酵母菌lamp引物组合物及其lamp检测试剂盒和使用方法
JPWO2017043114A1 (ja) * 2015-09-07 2018-09-27 株式会社ファスマック 等温増幅反応産物の多項目同時検出方法
CN110129466A (zh) * 2018-02-08 2019-08-16 北京智德医学检验所有限公司 用于检测眼内液中白色念珠菌的lamp引物组合及应用
JP2019140997A (ja) * 2018-02-22 2019-08-29 佐藤製薬株式会社 白癬菌の遺伝子をｌａｍｐ法により検出するためのプライマーセット及びそれを含むキット並びにそれらを用いて白癬菌を検出する方法
CN112041441A (zh) * 2018-04-27 2020-12-04 学校法人帝京大学 耳念珠菌检测用引物组、耳念珠菌检测试剂盒和耳念珠菌的检测方法
WO2024043830A1 (en) * 2022-08-26 2024-02-29 Denka Life Innovation Research Pte. Ltd. Methods for the detection and identification of fungal species

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6872523B1 (en) * 2000-05-30 2005-03-29 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Materials and methods for molecular detection of clinically relevant pathogenic fungal species

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6872523B1 (en) * 2000-05-30 2005-03-29 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Materials and methods for molecular detection of clinically relevant pathogenic fungal species

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAGAS-NETO T.C. ET AL.: "Bloodstream infections due to Trichosporon spp.: species distribution, Trichosporon asahii genotypes determined on the basis of ribosomal DNA intergenic spacer 1 sequencing, and antifungal susceptibility testing", J. CLIN. MICROBIOL., vol. 47, no. 4, 2009, pages 1074 - 1081 *
KOHEI KASAHARA ET AL.: "Multiplex LAMP-ho ni yoru Shinzaisei Candida-sho Kiinkin Oyobi Shinzaisei Trichosporon-sho Kiinkin no Jinsoku Kanben na Kenshutuho", BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY TAIKAI KOEN YOSHISHU, 5 March 2013 (2013-03-05) *
KOJI ISHIKAWA ET AL.: "Nyuseihin-chu Filobasidiella neoformans no Jinsoku Kanben na Kenshutsuho", BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY TAIKAI KOEN YOSHISHU, 5 March 2013 (2013-03-05) *
SHAO Y. ET AL.: "Development of multiplex loop- mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP- RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk", INT. J. FOOD MICROBIOL., vol. 148, no. 2, 2011, pages 75 - 79 *
SHIN'YA FUKUMOTO: "Keiko Multiplex Toon Idenshi Zofukuho no Kaihatsu", IDENSHI ZOFUKU RPA-HO NI MOTOZUITA BAIKAI KA NI OKERU JINSOKU KANBEN BYOGENTAI KENSHUTSUHO NO KAIHATSU HEISEI 21 NENDO SOKATSU BUNTAN KENKYU HOKOKUSHO, 2010, pages 19 - 26 *
SUN J. ET AL.: "Development and evaluation of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for the rapid diagnosis of Penicillium marneffei in archived tissue samples", FEMS IMMUNOL. MED. MICROBIOL., vol. 58, no. 3, 2010, pages 381 - 388 *
SUN J. ET AL.: "Rapid detection of pathogenic fungi using loop-mediated isothermal amplification, exemplified by Fonsecaea agents of chromoblastomycosis", J. MICROBIOL. METHODS, vol. 80, no. 1, 2010, pages 19 - 24 *
TAKASHI SUGITA ET AL.: "Molecular Taxonomy and Identification of Pathogenic Fungi Based on DNA Sequence Analysis", JPN. J. MED. MYCOL., vol. 45, no. 2, 2004, pages 55 - 58 *
TOMLINSON J.A. ET AL.: "Detection of Botrytis cinerea by loop-mediated isothermal amplification", LETT. APPL. MICROBIOL., vol. 51, no. 6, 2010, pages 650 - 657 *
YOKO KUZUHARA ET AL.: "LAMP-ho no Multiplex-ka -Rinsho Kensa eno Jitsuyoka ni Mukete", DAI 25 KAI ANNUAL MEETING OF THE MOLECULAR BIOLOGY SOCIETY OF JAPAN PROGRAM KOEN YOSHISHU, 2002, pages 954 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2017043114A1 (ja) * 2015-09-07 2018-09-27 株式会社ファスマック 等温増幅反応産物の多項目同時検出方法
CN106701944A (zh) * 2016-12-28 2017-05-24 上海市东方医院 一种用于检测光滑假丝酵母菌lamp引物组合物及其lamp检测试剂盒和使用方法
CN110129466A (zh) * 2018-02-08 2019-08-16 北京智德医学检验所有限公司 用于检测眼内液中白色念珠菌的lamp引物组合及应用
JP2019140997A (ja) * 2018-02-22 2019-08-29 佐藤製薬株式会社 白癬菌の遺伝子をｌａｍｐ法により検出するためのプライマーセット及びそれを含むキット並びにそれらを用いて白癬菌を検出する方法
EP3757231A4 (en) * 2018-02-22 2021-11-17 Sato Pharmaceutical Co., Ltd. PRIMARY SUBSTITUTE FOR DETECTION OF TRICHOPHYTON GENE BY THE LAMP METHOD, KIT WITH IT, AND METHOD FOR DETECTION OF TRICHOPHYTONE USING THEREOF
JP7176682B2 (ja) 2018-02-22 2022-11-22 佐藤製薬株式会社 白癬菌の遺伝子をｌａｍｐ法により検出するためのプライマーセット及びそれを含むキット並びにそれらを用いて白癬菌を検出する方法
US11560602B2 (en) 2018-02-22 2023-01-24 Sato Pharmaceutical Co., Ltd. Primer set for detecting trichophyton gene by lamp method, kit including same, and method for detecting trichophyton using same
CN112041441A (zh) * 2018-04-27 2020-12-04 学校法人帝京大学 耳念珠菌检测用引物组、耳念珠菌检测试剂盒和耳念珠菌的检测方法
EP3786295A4 (en) * 2018-04-27 2022-01-19 Teikyo University CANDIDA AURIS DETECTION PRIMERS SET, CANDIDA AURIS DETECTION KIT, AND CANDIDA AURIS DETECTION METHOD
CN112041441B (zh) * 2018-04-27 2023-11-28 学校法人帝京大学 耳念珠菌检测用引物组、耳念珠菌检测试剂盒和耳念珠菌的检测方法
WO2024043830A1 (en) * 2022-08-26 2024-02-29 Denka Life Innovation Research Pte. Ltd. Methods for the detection and identification of fungal species

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2014133153A1 (ja) 2017-02-09
JP6298040B2 (ja) 2018-03-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6298040B2 (ja) 病原性真菌の一括検出方法
Chen et al. A review of nucleic acid-based diagnostic tests for systemic mycoses with an emphasis on polymerase chain reaction-based assays
Vrålstad et al. A quantitative TaqMan® MGB real-time polymerase chain reaction based assay for detection of the causative agent of crayfish plague Aphanomyces astaci
US20180265933A1 (en) Method of Detecting Heat-Resistant Fungus
Shipitsyna et al. Evaluation of polymerase chain reaction assays for the diagnosis of Trichomonas vaginalis infection in Russia
Thomas et al. Molecular identification of Fusarium species complexes: which gene and which database to choose in clinical practice?
Dhib et al. Evaluation of Chitine synthase (CHS1) polymerase chain reaction assay in diagnosis of dermatophyte onychomycosis
Abastabar et al. Hyphal wall protein 1 gene: A potential marker for the identification of different Candida species and phylogenetic analysis
Hossein et al. Comparison of enzymatic method rapid yeast plus system with RFLP-PCR for identification of isolated yeast from vulvovaginal candidiasis
Ahmed et al. A set of conventional and multiplex real-time PCR assays for direct detection of Elsinoe fawcettii, E. australis, and Pseudocercospora angolensis in citrus fruits
Makkonen et al. Genetic variation in the ribosomal internal transcribed spacers of Aphanomyces astaci Schikora from Finland
Lakner et al. Evaluation of fluorescence in situ hybridisation (FISH) for the identification of Candida albicans in comparison with three phenotypic methods
US6599701B1 (en) Identifying organisms by detecting intronic nucleic acids
JP5654265B2 (ja) ビソクラミス属に属する菌類の検出方法
de Sousa et al. PCR-RFLP as a useful tool for diagnosis of invasive mycoses in a healthcare facility in the North of Brazil
CN101636507A (zh) 用于检测酵母和真菌物种的核酸探针
JP2014003946A (ja) サーモアスカス属真菌の検出方法
WO2006123423A1 (ja) フザリウム属菌検出用プライマー
CN114574609B (zh) 检测毛霉菌病病原体的试剂盒及方法
US11560602B2 (en) Primer set for detecting trichophyton gene by lamp method, kit including same, and method for detecting trichophyton using same
Monstein et al. Comparison of a capillary gel electrophoresis-based multiplex PCR assay and ribosomal intergenic transcribed spacer-2 amplicon sequencing for identification of clinically important Candida species
US20150292039A1 (en) Method to amplify nucleic acids of fungi to generate fluorescence labeled fragments of conserved and arbitrary products
JP5956389B2 (ja) 耐熱性ペニシリウム属真菌の検出方法
JP5548385B2 (ja) 耐熱性菌類の検出方法
JP2010004879A (ja) ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルスフミガタスの検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14757646

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015503057

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14757646

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1