CN103881928A - 一种被孢霉属菌根真菌在铁皮石斛组培苗培养中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种被孢霉属菌根真菌在铁皮石斛组培苗培养中的应用，属于微生物及组织培养技术，具体涉菌根真菌的分离鉴定、铁皮石斛的组织培养、菌根真菌对铁皮石斛生物量及矿质元素增长的作用。将被孢霉属菌根真菌应用于铁皮石斛组培苗生根壮苗培养，包括菌根真菌分离培养，铁皮石斛组培苗生根壮苗培养和铁皮石斛菌根化三个步骤。采用本发明，铁皮石斛组培苗在鲜重增长率、干重、株高增长率、分蘖、生根等方面都有显著增加，对矿质元素尤其是大量元素的吸收也有明显提高，真菌MortierellaFL9与铁皮石斛形成了良好的共生关系。

Description

一种被孢霉属菌根真菌在铁皮石斛组培苗培养中的应用

技术领域

本发明涉及一种被孢霉属菌根真菌在铁皮石斛组培苗培养中的应用，属于微生物及组织培养技术领域。

背景技术

自然界中绝大多数的兰科植物不同生长状态都有与之共生的菌根真菌。兰科植物种子萌发困难，自然状态下，兰科植物生长状态良好是由于兰科植物与真菌形成良好的共生关系，才能促进兰科植物的生长。

铁皮石斛属兰科石斛兰属多年生草本，为我国传统的名贵中药材，位居中华九大仙草之首。近年来，随着人们保健意识的增强，铁皮石斛市场需求量增大，野生石斛资源采伐严重。人们开始寻求人工栽培的方法来培养铁皮石斛，组培技术的发展实现了其大量繁殖，然而组培苗生长缓慢，移栽驯化成活率低。本发明从菌根保育的角度来研究促进铁皮石斛组培苗生长的方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种使得铁皮石斛菌根化的方法，此方法可以促进铁皮石斛的生长，提高栽培成活率，促进铁皮石斛对矿质营养元素的吸收尤其是大量元素的吸收。

本发明采用的方法是分别先对菌根真菌进行分离鉴定及纯化培养，铁皮石斛组培苗进行生根壮苗培养，再将菌根真菌与铁皮石斛组培苗共培养使得铁皮石斛菌根化。

本发明中菌根真菌MortierellaFL9的分离鉴定。采用根组织分离法，选取浙江大明山野生状态下春兰新鲜营养根的根段，流水洗净，表面消毒后，接种到PDA培养基上，多次纯化得到被孢霉属菌根真菌菌株FL9。乳酚棉兰染色及DNA序列测定得出，真菌为被孢霉属菌根真菌，命名为MortierellaFL9。

上述被孢霉属菌根真菌MortierellaFL9生物学特征表述为：在PDA培养基上生长，早期菌丝贴培养基生长，菌落正反面均为白色，菌丝呈蓬松状，边缘整齐，培养8d后，菌落直径5.2cm，菌落约厚0.4cm，孢子圆形，大小为：6.05～6.14μm，菌丝分支，有隔。

前述被孢霉属菌根真菌MortierellaFL9菌株，其核氨酸序列如SEQ ID NO.1。

本发明中，铁皮石斛的生根壮苗采用的最适培养配方为基本培养基采用1/2MS，附加0.7mg·L^-1IBA+1.0mg·L^-1NAA蔗糖30mg·L^-1，琼脂6.8mg·L^-1，活性炭1mg·L^-1，其中添加有机添加物椰乳有利于石斛苗的生根壮苗。

前述被孢霉属菌根真菌MortierellaFL9菌株在促进铁皮石斛生长中的应用。

本发明提供了一种菌苗共生最适培养基的筛选的方法：在查阅相关文献的基础上，设计5种不同的培养基配方，菌苗共培养过程中，分别观察菌苗的共生培养状况，最终筛选出菌苗均适应的培养基。

本发明中被孢霉属菌根真菌MortierellaFL9与铁皮石斛组培苗共生培养采用的培养基配方为：CaCl₂ 1.0mmol·L^–1，MgSO₄0.5mmol·L^–1，K₂SO₄ 1.0mmol·L^–1，KH₂ PO₄0.4mmol·L^–1，FeSO₄100μ mol·L^–1，H₃ BO₄25μmol·L^–1，MnCl₂33μmol·L^–1，ZnSO₄ 2.8μmol·L^–1，NaMoO₄1.0μ mol·L^–1，Na₂ EDTA140μmol·L^–1，酵母汁1.0g·L^–1，琼脂6.8g·L^–1。

本发明提供了一种被孢霉属菌根真菌MortierellaFL9与铁皮石斛共生培养的方法：将铁皮石斛组培苗植入共生培养基中，培养一周后选取生长状态良好无污染的瓶苗，采用直径0.5cm的打孔器打取PDA培养基上活化的菌片，接种到铁皮石斛瓶苗内，进行共生培养。

本发明提供了一种霉属菌根真菌MortierellaFL9菌株对铁皮石斛生长的效应研究的方法。通过对共生植株生物量测定，矿质营养元素含量的测定分析菌株的铁皮石斛组培苗生长的作用。

附图说明

图1为被孢霉属菌根真菌MortierellaFL9平板图；

图2为被孢霉属菌根真菌MortierellaFL9菌株的菌丝图片（400倍）；

图3为被孢霉属菌根真菌MortierellaFL9菌株的孢子图片（1000倍）；

图4为被孢霉属菌根真菌MortierellaFL9对铁皮石斛促生作用图（左侧为CK，右侧为接菌苗）。

具体实施方式

实施例1：本发明中被孢霉属菌根真菌MortierellaFL9菌株的分离鉴定

采自浙江大明山野生状态下春兰新鲜营养根，水冲洗根上的泥沙，对材料表面进行灭菌，无菌水冲洗干净，无菌条件下横切成长约为5mm的块状，置于PDA培养基中，切面朝向培养基，25℃恒温避光培养。经过7d的培养菌丝从组织块上长出形成一定大小菌落，从边缘挑取菌丝移到另一PDA平板重复至纯化得到菌株FL9。

菌株FL9形态观察及乳酚棉兰染色，结合图1-3，生物学特征表述为：在PDA培养基上生长，早期菌丝贴培养基生长，菌落正反面均为白色，菌丝呈蓬松状，边缘整齐，培养8d后，菌落直径5.2cm，菌落约厚0.4cm，孢子圆形，大小为：6.05～6.14μm，菌丝分支，有隔。

ITS基因的PCR扩增和序列测定，菌株DNA提取后进行PCR扩增DNA，选用DNA多聚酶链式反应（PCR）试剂盒，设计使用的引物为ITS1（5’TCCGTAGGTGAACCTGC 3’）和ITS2（5’AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG3’）。建立50mL体系进行反应；对DNA模板的PCR产物进行检测。

根据菌落形态观察和提取的14种DNA序列与网上基因库（http:// www. ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）查询对比，以基因序列相似度为标准，参照《中国真菌志》来测定这菌株FL9的科属，菌株FL9为被孢霉属菌根真菌MortierellaFL9。

实施例2：铁皮石斛组培苗的生根壮苗

选取生长状态基本一致的小苗，重量约为0.28±0.4g，株高2.5±0.5cm，接种到生根壮苗培养基中，基本培养基采用1/2MS，附加0.7mg·L^-1IBA+1.0mg·L^-1NAA蔗糖30mg·L^-1，琼脂6.8mg·L^-1，活性炭1mg·L^-1，pH为5.8，不同有机添加物椰乳、香蕉泥、马铃薯对铁皮石斛组培苗生根壮苗的影响，每瓶接种5株，重复三次。培养两个月后调查苗的株高、鲜重、发根数。结果表明，添加椰乳有利于铁皮石斛幼苗的分化、新根的生成。

实施例3：菌苗共生培养基的筛选

 A：DE1培养基，配方为：CaCl₂ 1.0mmol·L^–1，MgSO₄0.5mmol·L^–1，K₂SO₄ 1.0mmol·L^–1，KH₂ PO₄0.4mmol·L^–1，FeSO₄100μ mol·L^–1，H₃ BO₄25μmol·L^–1，MnCl₂33μmol·L^–1，ZnSO₄ 2.8μmol·L^–1，NaMoO₄1.0μ mol·L^–1，Na₂ EDTA140μmol·L^–1，酵母汁1.0g·L^–1，琼脂8.0g·L^–1。

B：选用Dijk和Eck对兰花与真菌共生培养的改良培养基，简称DE2培养基，其配方为：CaCl₂1.0μmol·L^–1，MgSO₄0.5μmol·L^–1，K₂SO₄1.0μmol·L^–1，KH₂PO₄0.4μmol·L^–1，FeSO₄100μmol·L^–1，H₃BO₄25μmol·L^–1，MnCl₂33μmol·L^–1，ZnSO₄2.8μmol·L^–1，NaMoO₄ 1.0μmol·L^–1，Na₂ EDTA140μmol·L^–1，酵母汁1.0g·L^–1，琼脂8.0g·L^–1，可溶性淀粉9.0g/L。

C：MS培养基，蔗糖10g·L^-1。

D：MS培养基，蔗糖15g·L^-1。

E：MS培养基，蔗糖20g·L^-1。

将生长状态良好，根长约1.5~2cm的，株高约2.5~3.0cm的铁皮石斛组培苗植入菌苗共生培养基中，每瓶三株，成正三角形栽植，培养10~15 d后，将经PDA培养基活化的8种真菌分别用直径为0.5cm的打孔器在菌落表面打取平板菌块，然后用接种针将平板菌块接种于三株苗的中间培养基上，每一处理重复3瓶。培养50d后对菌苗的生长状况进行调查，结果表明培养基A也就是DE1培养基为菌苗共生的最适培养基。

实施例4：铁皮石斛与被孢霉属菌根真菌MortierellaFL9共生培养

将生长状态良好的铁皮石斛组培苗植入菌苗共生培养基中，每瓶三株，成正三角形栽植，培养10~15 d后，将经PDA培养基活化的8种真菌分别用直径为0.5cm的打孔器在菌落表面打取平板菌块，然后用接种针将平板菌块接种于三株苗的中间培养基上，每一处理10瓶，重复3次。

菌苗共培养60d后，分别取出对照苗和接菌苗，洗净根部残留琼脂，用滤纸吸干表面水分待用。调查统计接菌苗与对照苗的重量、株高、叶片数、分蘖和末根数，计算平均鲜重增长率、株高增长率、新增分蘖数及新发根均为所有苗数的平均值。

随机抽取铁皮石斛菌根苗和对照苗各30株置于80℃的烘箱中烘干，粉碎后过60目筛。将粉末在105℃下烘至恒重，准确称取0.5g样品于平底消解管中，加入5～15ml 的55～65%（质量分数）硝酸，再加入1.5ml 50～60%（质量分数）HClO₄，在消解炉中140℃下加热至冒白烟为止，冷却后加入5～15ml 的34～37%（质量分数）HCl，转入50ml容量瓶中。采用电感耦合等离子体原子发射光谱仪（ICP-AES）测定组培苗各元素含量，含量计算公式：

P(%)=(C*V*ts*100)/(m*10⁶)             

C—测得显色液中的浓度，V—显色体积，m—烘干样品质量，ts—分取倍数。

表1 菌苗共培养60d后，真菌对铁皮石斛生物量增长的效应

由表1看出，真菌Mortierella FL9共生铁皮石斛组培苗，与对照组（铁皮石斛组培苗上没有处理过FL9真菌，即铁皮石斛组培苗与FL9真菌未经过共生培养，简称为CK组）相比，鲜重增长率、干重、株高增长率、分蘖、生根等都有显著增加。

表2 菌苗共培养60d后，真菌对铁皮石斛矿质元素吸收的影响

表2中，B—Mg（B、Cu、Fe、Mn、Zn、Mo、Na、Ca、Mg）含量单位为mg/kg，K—Si（K、P、S、Si）含量的单位为%。由表2可以看出，真菌MortierellaFL9促进了铁皮石斛对矿质元素的吸收，尤其是大量元素的吸收。结合图4，可认为真菌MortierellaFL9与铁皮石斛形成了良好的共生关系。

以上内容是结合本发明的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于上述这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

                        SEQUENCE LISTING

 

<110>浙江农林大学，浙江省亚热带作物研究所

 

<120>一种被孢霉属菌根真菌在铁皮石斛组培苗培养中的应用

 

<160>1

 

<211>560

<212>DNA

<213>被孢霉属菌根真菌(Mortierella repens)

 

<222>（158）…（248）

 

<400>1

ATTTCACACT GTCAGATCTT TTCCTTTGAG CTGGCTGTGA CCGTATGTTG

TTCCGGACTT TAATGTGGTT CGCAAGGTTC GGTCCCAATG CCAAAACTTT

ATCCTTAAAC TGTTGTTTCT GATGACTTCC ACGAACGACT TTTAAAAACG

GTCAACCATG ACTTTCAGCG CATTATCTTT CGGTTCCATA AACCCAAAGG

TTAGGTGTGA GAGTGCTCAT GATACTGAAA CATGCATACT CCTCGGAATC

CCCAAGACTG TAATGTGCCT TTGAACACCC TGTGATTCCC TGAATTCTGC

AATTCACATT ACGTATCGCA TTTCGCTGCC TTCTTCATTG GGTTTATGAA

CCAAGAATTC CAATGTTGAA ACTTGTTTTA AACACATTTC TAAAATCATT

TGTTTGATTG TTCCCAAAAA ATTTCATAAG GATGATATAT TGTTTTTGGG

ACCGGCCCTT GCTAACCATT TTATAGTCCC AAAATTACAT ACGGTCAATA

CCAGCACAAA GGAAAAAATC TTTCCTTGTT GAAAGATTTC TCTTGCGCTG

ATCCTTCCCA

Claims (8)

1.被孢霉属菌根真菌的分离培养方法，其特征在于：选取野生状态下春兰新鲜营养根的根段，流水洗净，表面消毒后接种到PDA培养基上，多次纯化得到被孢霉属菌根真菌菌株。

2.如权利要求1所述培养方法获得的被孢霉属菌根真菌，其特征在于，其生物学特征为：在PDA培养基上生长，早期菌丝贴培养基生长，菌落正反面均为白色，菌丝呈蓬松状，边缘整齐，培养8d后，菌落直径5.2cm，菌落约厚0.4cm，孢子圆形，大小为：6.05～6.14μm，菌丝分支，有隔。

3.如权利要求1所述培养方法获得的被孢霉属菌根真菌，其特征在于，所述的被孢霉属菌根真菌的核氨酸序列为：SEQ ID NO.1。

4.一种被孢霉属菌根真菌在铁皮石斛组培苗培养中的应用，其特征在于包括如下步骤：

（1）菌根真菌分离培养：选取春兰新鲜营养根根段，流水洗净，表面消毒后，接种到PDA培养基上，恒温避光培养，重复纯化得到菌株FL9；

（2）铁皮石斛组培苗生根壮苗培养：选取生长状态一致的株苗，重量为0.28±0.4g，株高2.5±0.5cm，接种到生根壮苗培养基中，获得壮苗；

（3）铁皮石斛菌根化：将步骤（2）所得壮苗植入共生培养基中，培养一周后选取生长状态良好无污染的瓶苗，采用直径0.5cm的打孔器打取步骤（1）中PDA培养基上活化的菌片，接种到铁皮石斛瓶苗内，进行共生培养。

5.如权利要求4一种被孢霉属菌根真菌在铁皮石斛组培苗培养中的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述的生根壮苗培养基为：基本培养基采用1/2MS，附加0.7mg·L^-1IBA+1.0mg·L^-1NAA蔗糖30mg·L^-1，琼脂6.8mg·L^-1，活性炭1mg·L^-1。

6.如权利要求5所述的一种被孢霉属菌根真菌在铁皮石斛组培苗培养中的应用，其特征在于：所述的生根壮苗培养基中添加椰乳、香蕉泥或马铃薯。

7.如权利要求5或6所述的一种被孢霉属菌根真菌在铁皮石斛组培苗培养中的应用，其特征在于：所述的生根壮苗培养基中添加椰乳。

8.如权利要求4所述的一种被孢霉属菌根真菌在铁皮石斛组培苗培养中的应用，其特征在于，步骤（3）中，所述的共生培养采用的培养基配方为：CaCl₂ 1.0mmol·L^–1，MgSO₄0.5mmol·L^–1，K₂SO₄ 1.0mmol·L^–1，KH₂ PO₄0.4mmol·L^–1，FeSO₄100μ mol·L^–1，H₃ BO₄25μmol·L^–1，MnCl₂33μmol·L^–1，ZnSO₄ 2.8μmol·L^–1，NaMoO₄1.0μ mol·L^–1，Na₂ EDTA140μmol·L^–1，酵母汁1.0g·L^–1，琼脂6.8g·L^–1。

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