CN112997800B - 一种牛肝菌科真菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种牛肝菌科真菌及其应用。本发明提供了牛肝菌(Buchwaldoboletus sp.)RGHUNG201903181D85，其保藏号为CCTCC No：M2020221。本发明还提供了一种人工栽培牛肝菌的方法，包括如下步骤：1)将权利要求1所述的牛肝菌在PDA加富固体培养基中进行母种培养，得到母种；2)再将所述母种转接在PDA加富液体培养基中进行原种培养，得到原种；3)将所述原种转接在栽培料中进行栽培种培养，得到栽培种；4)将所述栽培种转接在栽培料中依次进行菌丝培养和出菇，得到人工栽培牛肝菌。本发明发现了一种新的牛肝菌种，子实体一般为中至大型，单生、散生，菇柄粗长，实心，质地脆嫩，柔滑爽口，是一种很有开发前景的食用菌新品种，可用于人工栽培。

Description

一种牛肝菌科真菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及食用菌领域，尤其涉及一种牛肝菌科真菌及其应用。
背景技术
牛肝菌科真菌是大型担子菌的重要类群，在大型真菌中具有很高的地位，是最受人们关注的菌种之一。按照Kir的分类方法，该科菌共包括35个属，超过400个种。
牛肝菌具有重要的经济价值和生态价值。可食用的牛肝菌味道鲜美、营养丰富、含有多种氨基酸、矿物质等活性物质，具有清热解毒、补虚提神等功效，可治疗腰腿疼痛、手足麻木等症状，还有抗流感病毒和防治感冒的作用。
由于牛肝菌大多数为菌根菌，难以离开宿主树进行人工栽培。目前，有一些科研机构在做牛肝菌的人工栽培研究，但均处于实验室阶段。世界范围内已知唯一实现商业化人工栽培的是贵州宏臻菌业生产的黑牛肝菌(Phlebopus portentosus)。该公司的黑牛肝菌采用的是瓶栽工艺，耗资巨大，单产水平也较低。黑牛肝具有较重的土腥味，有些消费者较难接受，并且烹调后会迅速褐变，从而影响菜品卖相，这在很大程度上限制了牛肝菌人工栽培产业的发展。
发明内容
本发明一个目的是提供一种牛肝菌(Buchwaldoboletus sp.)。
本发明提供的牛肝菌(Buchwaldoboletus sp.)RGHUNG201903181D85，其保藏号为CCTCC No：M2020221。
本发明另一个目的是提供一种人工栽培牛肝菌的方法。
本发明提供的方法包括如下步骤：
1)将第一个目的中的牛肝菌在PDA加富固体培养基中进行母种培养，得到母种；
2)将所述母种转接在所述PDA加富液体培养基中进行原种培养，得到原种；
3)将所述原种转接在栽培种培养栽培料中进行栽培种培养，得到栽培种；
4)将所述栽培种转接在菌丝培养栽培料中依次进行菌丝培养和出菇培养，得到牛肝菌，实现人工栽培牛肝菌。
上述方法中，所述PDA加富固体培养基或所述PDA加富液体培养基包括C源、N源和生长因子；
所述C源为葡萄糖、蔗糖或果糖，所述N源为大豆蛋白胨、酵母浸粉或牛肉膏，所述生长因子为维生素B1、维生素B2或肌醇。
上述方法中，所述PDA加富固体培养基或所述PDA加富液体培养基的pH值均为5.5-6.5。
上述方法中，所述PDA加富固体培养基由20g/L葡萄糖、大豆蛋白胨2g/L、200g/L马铃薯、1g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4、10mg/L维生素B1和水组成，并添加凝固剂。
上述方法中，所述PDA加富液体培养基由20g/L葡萄糖、大豆蛋白胨2g/L、200g/L马铃薯、1g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4、10mg/L维生素B1和水组成，不添加凝固剂。
所述栽培种培养栽培料由如下具有质量百分含量的组分组成：杂木屑78％、麦麸20％、玉米粉1％和轻质碳酸钙1％；
所述菌丝培养栽培料由如下具有质量百分含量的组分组成：杂木屑30％、棉子壳35％、麦麸30％、玉米粉4％和轻质碳酸钙1％。
上述方法中，所述各步骤中的培养温度均为25℃。
上述方法中，所述母种培养的条件为25℃培养12-14天；
或，所述原种培养的条件依次为如下：
1)25℃避光静置培养48-72小时；
2)25℃避光震荡培养72-96小时，在本发明的实施例中采用160-200r/min震荡；
或，所述栽培种培养的条件为25℃避光培养至菌丝长满栽培种培养栽培料所在的栽培袋；
或，所述菌丝培养的条件为依次为如下：
1)25℃、空气相对湿度60-65％，培养至菌丝长满菌丝培养栽培料所在的栽培袋；
2)25℃、继续后熟培养30-35天。
由上述方法制备的牛肝菌也是本发明保护的范围。
上述第一个目的的牛肝菌或上述方法制备的牛肝菌在作为食用菌中的应用也是本发明保护的范围。
上述第一个目的的牛肝菌或上述方法制备的牛肝菌在制备食用菌产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述方法中的PDA加富固体培养基或所述PDA加富液体培养基也是本发明保护的范围；
或，上述方法中的PDA加富固体培养基和/或所述PDA加富液体培养基在人工栽培上述牛肝菌中的应用也是本发明保护的范围。
上述方法在人工栽培上述第一个目的的牛肝菌中的应用也是本发明保护的范围。
上述方法在扩繁上述牛肝菌中的应用也是本发明保护的范围。
本发明发现了一种新的牛肝菌种，该品种是为数不多的腐生型牛肝菌，通常于冬春季节生长在以蔷薇目豆科植物为主的热带、亚热带的灌木、草丛中的砂质土层中，子实体一般为中至大型，单生、散生，菇柄粗长，实心，质地脆嫩，柔滑爽口，是一种很有开发前景的食用菌新品种，可用于人工栽培。
保藏说明
菌种名称：牛肝菌
拉丁名：Buchwaldoboletus sp.
菌株编号：RGHUNG201903181D85
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏机构简称：CCTCC
地址：中国武汉市武昌区八一路武汉大学
保藏日期：2020年07月03日
保藏中心登记入册编号：CCTCC No：M2020221
附图说明
图1为野生牛肝菌采收图。
图2为组织分离母种图。
图3为分离纯化母种图。
图4为分离纯化原种图。
图5为分离后进行人工栽培的出菇图。
图6为分离后进行人工栽培的出菇图。
图7为子实体切片(切开后菌肉由白色转蓝紫色)。
图8为牛肝菌子实体与菌丝体测序比对。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、牛肝菌的分离鉴定
一、分离
1、采集
2019年12月30日至2020年4月6日，中国海南省东方市大田镇月大村，在海拔高度30-63米，北纬19°12′33″，东经108°53′58″附近栖息地，先后采集到了十一朵野生子实体样本。栖息地为以蔷薇目豆科植物为主的热带、亚热带的草丛中的砂质土层。
2、分离获得母种
PDA培养基：马铃薯200g(煮出液)、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL、pH值自然。
仪器：主要有样品袋、天平、鼓风干燥箱、超净工作台。
1)样品处理
从野外采集新鲜、幼嫩、无虫害的子实体(称为野生牛肝菌，如图1所示)连同基座土装入样品袋带回实验室。采集与到达实验室约间隔不超过4h。
选取保存完好，且生长较为优势的一株野生牛肝菌RGHUNG201903181D85用无菌水冲洗表面泥土，再用刀片将菌柄尾部凹陷处泥土削掉，最后用无菌滤纸吸残留水滴阴凉处放置10min,拿进超净工作台放置到无菌培养皿。
2)组织分离
在超净工作台下，将子实体用75％乙醇表面消毒约45s,再用无菌水冲洗，无菌滤纸吸干，置于新的无菌培养皿中；再用酒精棉擦拭双手,然后从菌柄处将子实体掰开两半，再用无菌解剖刀在掰开的子实体断面上，将菌盖、菌柄交接处的部位分割成8×8mm大小的组织块(余下的子实体烘干留样备用)，用解剖针迅速将组织块放在斜面培养基(PDA培养基)上，置于25℃下恒温箱内进行培养。待菌种萌发后挑取目的菌丝进行转接培养(PDA培养基)，经2-3次纯化后即可获得纯菌种，即为分离菌株(如图2-图3所示)，作为母种。
3、原种制备
在无菌条件下，选取长势良好的斜面试管(20mm×200mm)母种(斜面长约120mm)，用接种刀分割成5mm见方的母种块，挑取4-6个母种块分别接种于装有250mL PDA加富液体培养基的1000mL三角瓶，每支管接5-6瓶，然后将接好种的三角瓶放在22-24℃恒温箱中避光静置培养48-72小时，每天注意检测是否感染杂菌，如果发现感染即可淘汰不用。再将经静置培养无污染的三角瓶放置于摇床上进行22-24℃，160-200r/min震荡培养避光培养72-96小时后，菌球大小均匀、密度80％以上，菌液清亮，气味清香、无污染的菌液即为得到的原种(图4)。
上述PDA加富液体培养基，每1L的配方如下：葡萄糖20g、大豆蛋白胨2g、马铃薯200g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g、维生素B1 10mg、水1000mL、pH值自然。
4、栽培种制备
在无菌条件下，取上述3培养得到的原种约15mL，接种于装有750g栽培料的聚丙烯塑料袋(17cm×35cm×0.005cm)，25℃下培养至菌丝满袋，得到栽培种。
栽培料配方，各组分其质量百分含量如下：杂木屑78％、麦麸20％、玉米粉1％和轻质碳酸钙1％。
栽培料制袋：将杂木屑、麦麸、玉米粉和轻质碳酸钙按照上述质量比混合拌匀，补充培养料的含水量，并将含水量控制在65％，pH值调至7.5-8，采用规格为15cm×33cm×0.005cm的聚丙烯栽培袋，每袋装料l000克左右。将装料后的塑料袋套上套环，用透气棉塞塞紧，在126℃温度下维持2小时，待压力自然下降为“零”后，移到冷却净化室进行冷却，得到装有750g栽培料的聚丙烯塑料袋。
5、栽培包生产
1)配料与制袋
栽培料配料：各组分其质量百分含量如下：杂木屑30％、棉子壳35％、麦麸30％、玉米粉4％、轻质碳酸钙1％。
栽培料制袋：先用清水将棉子壳调湿，然后将杂木屑、麦麸、玉米粉、轻质碳酸钙与预湿的棉子壳混合拌匀，补充培养料的含水量，并将含水量控制在65％，pH值调至7.5-8，采用规格为17cm×35cm×0.005cm的聚丙烯栽培袋，每袋装料l000克左右。将装料后的塑料袋套上套环，用透气棉塞塞紧，在126℃温度下维持2小时，待压力自然下降为“零”后，移到冷却净化室进行冷却。
2)接种与菌丝培养
待栽培包温度冷却至25℃以下，按照无菌室操作规程，在百级层流罩下用不锈钢长柄接种铲将上述4培养获得的栽培种表面老菌块及老化菌丝去除，并将菌种挖松，搅碎至黄豆粒大小；用接种铲取栽培种约25g移接到栽培包内，每袋栽培种可接30-40袋栽培包。接种后的菌袋直立于培养室架上避光培养。培养温度24-26℃，培养室空气相对湿度60-65％。菌丝培养阶段，前期关闭门窗，避免室内温度波动幅度过大。后期应加强通风透气，保持室内空气清新，35-40天菌丝可长满菌袋。菌丝长满袋后应将温度下调至22-24℃，继续后熟培养30-35天，待菌袋变软，颜色转暗后开袋，转入出菇房进行出菇管理。
3)出菇期间的管理
当菌袋完成后熟后，去除棉塞、套环，解开袋口并下折，然后在料面上覆土。覆土应先置于太阳下晒至发白，然后用水调节土粒湿度，以土粒能捏扁而不散为度，覆土的厚度为3-4厘米。折袋后，袋口边缘应高出土表面3-5厘米，并将覆土后的菌袋均匀地竖直排列在室外畦面或室内出菇床架上。
覆土后，注意保持覆土湿润，并多关门或多盖膜，刺激原基早日分化。一般覆土后7-10天，原基顶部可露出土面。原基出土后，应注意将场地内空气相对湿度控制在80-95％。同时加强通风，保持场地内宅气清新，并注意使场地内有一定的散射光。
整个出菇阶段场地温度应控制在24-26℃之间。喷水量根菇大小、覆土的湿度和气候情况具体掌握，菇多多喷水，菇少少喷水；晴天多喷，阴天少喷。根据菇体生长不同阶段灵活控制通风量，菌柄出土、菌盖形成和生长各阶段依次加大通风量，菇房空气相对湿度保持在90％左右即可。当菇体成熟时及时采收，每茬菇采完后应及时补上覆土，停水养菌5天后进行下茬出菇管理。
4)病虫害防治
在菌丝生长阶段，重点防止各种霉菌侵入培养基造成污染。注意生产环境、原辅材料、生产过程要符合要求，同时注意搞好环境卫生，日常查菌不可过于频繁。在子实体生长阶段，重点防止各种虫害，如各类菇蝇、菇蚊等，菇房通风口应加装防虫网，菇房内可视情况悬挂杀虫灯，周边环境应保持整洁卫生，发现病虫危害的菌袋及时拣出妥善处理。
5)采收与包装
当子实体长大成型、菌柄长度5-7㎝，菌盖直径4-9㎝时，用手捏在子实体根部附近，左右轻轻晃动，将菇体连根拔起，竖直放在篮子里，得到分离培养后牛肝菌。
为防止在采收时受到损伤的小菇在土中腐烂招致病虫害发生，应在采收时顺带取出残留在土中的菇脚(图5)。
上市销售的牛肝菌，采收后先将子实体多余的菌柄剪去，按子实体菌盖大小和菇柄长度分级包装。未及时上市销售的产品，应及时置于0-3℃的冷库中贮藏，可保鲜10天。
二、鉴定
1、形态学鉴定
观察上述分离培养后牛肝菌，该种牛肝菌子实体的菌盖直径3-13㎝，凸面至扁平；上表面土黄色，至黄褐色，触碰后呈深蓝色，无明显绒毛，干燥略微呈粉状。菌肉白色，可达2.5㎝厚，切开后会局部呈现浅蓝色条纹。
菌孔浅黄色至金黄色，色泽比菌盖上表面更加鲜艳，切开或触碰后呈深蓝色，并伴有水渍状。菌孔近放射状排列，近圆形，直径约1mm。
菌管与菌孔同色，竖直，排列紧密，可以分离出单根，长至12mm，在成熟的子实体上，菌管易于从菌盖上剥离，切开或触碰后逐渐变深蓝色。
菌柄实心，质地紧密，中生，近圆柱状，无菌托和菌环，长4-9㎝，直径1.5-6㎝；其不同部位的颜色有所差异，靠近基部的部位与菌盖上表面颜色接近，呈土黄色至黄褐色；靠近菌盖的部位与菌孔颜色接近；表面光滑无绒毛；菌肉与菌盖不同色，略带棕黄色，切开后呈浅蓝色。基部菌丝索状，呈金黄色。
该种牛肝菌与现有的木生小腐生牛肝菌(Buchwaldoboletus lignicola)相比，具有明显不同的特征：本发明分离菌的菌盖和菌肉颜色不同，菌盖的菌肉呈白色，菌柄的菌肉呈浅黄色；而Buchwaldoboletus lignicola菌盖的菌肉和菌柄的菌肉颜色均为浅黄色。Buchwaldoboletus lignicola出于腐烂的木头上，而本发明分离菌品种出现在砂质土层的地面上，着生位置没有可见的草木植株或腐木残留。
本发明分离菌株RGHUNG201903181D85人工栽培后获得的牛肝菌子实体与野生牛肝菌子实体相比，主要形态特征一致。
2、分子鉴定
将上述一的2组织分离剩余所留存的野生牛肝菌子实体干品，与其分离得到的菌丝体一起送往华大基因、生工生物进行测序。
利用rDNA上的ITS区段对野生牛肝菌及其分离菌株进行分子鉴定便可确定分离菌株是否为其纯培养菌种。
利用ITS 1和ITS 4通用引物对野生牛肝菌子实体及其组织分离的菌株菌丝体进行扩增、测序。结果如下：
野生牛肝菌子实体ITS序列为序列1；组织分离菌株菌丝体ITS序列为序列2。
将测序结果进行BLAST比对，发现二者的序列均与登录号为MH234512.1的Buchwaldoboletus lignicola(木生小腐生牛肝菌)菌株同源性程度最高，分别达到91.14％、91.17％。结合形态学分析比对，可以确定所分离的菌株与木生小腐生牛肝菌(Buchwaldoboletus lignicola)为同属不同种,属于Buchwaldoboletus sp.。
同时，通过序列的比对分析，野生牛肝菌子实体与组织分离菌株菌丝体序列具有高度的同源性,达到99.85％(图8)，因此，可以确定分离的菌株和野生型子实体样本是同一种。
结合子实体形态可判断分离的菌株应为牛肝菌(Buchwaldoboletus sp.)RGHUNG201903181D85，已于2020年07月03日将该分离菌株的菌丝体备份保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉市武昌区八一路武汉大学)，保藏编号为CCTCCNo：M2020221。
实施例2、人工栽培牛肝菌CCTCC No：M2020221
一、人工栽培条件摸索
(一)供试原料与培养基
栽培料中的木屑、棉籽壳、杂木屑、麦麸、玉米粉、轻质碳酸钙均由当地市面上常规商业途径采购获得。
供试菌株：已进行保藏的CCTCC No：M2020221，如无特别说明，本实施例所使用的母种均从获得已进行专利保藏的CCTCC No：M2020221扩繁获得。
马铃薯琼脂培养基(PDA培养基)：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂18-22g，加水1000mL，pH自然；配制方法常规方法。
碳源试验基础培养基：蛋白胨3g，KH2PO4 1.5g，MgSO4 0.5g，琼脂20g，加水1000mL，pH自然。
氮源试验基础培养基：葡萄糖20g，KH2PO4 1.5g，MgSO4 0.5g，琼脂20g，加水1000mL，pH自然。
(二)试验方法
1、温度对牛肝菌菌丝生长的影响
用打孔器取直径5mm的母种菌块(5×5mm)接种至装有25mLPDA培养基的培养皿后分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃恒温培养箱培养。采用十字交叉法测定菌丝生长速度(菌丝生长速度＝菌落半径/培养天数)，定期观察并记录菌丝长势。每个处理设5个重复。
试验表明，不同温度处理对牛肝菌菌株生长速度具有显著的影响。在16-32℃之间菌丝均能正常生长，但24-26℃最适宜，其中在25℃时菌丝生长速度、生长势均较优；当温度低于16℃时，虽然菌丝仍然洁白稠密，但生长速度减慢；当温度达到35℃时，菌丝完全停止生长。因此，该菌株的最适培养温度为25℃。
2、不同碳源对牛肝菌菌丝生长的影响
以碳源试验基础培养基为对照，在碳源试验基础培养基中分别加20g/L葡萄糖、20g/L可溶性淀粉、20g/L蔗糖或20g/L果糖，制成平板，作为不同碳源培养基。每个处理5个重复。
用打孔器取直径5mm的CCTCC No：M2020221的母种菌块(5×5mm)分别接种至装有25mL不同碳源培养基的培养皿和装有25mL碳源试验基础培养基的培养皿中；接种后25℃恒温培养，采用十字交叉法测定菌丝生长速度(菌丝生长速度＝菌落半径/培养天数)，定期观察并记录菌丝长势，筛选最适碳源。
试验表明，该牛肝菌菌株对各种碳源都能利用，但不同碳源间牛肝菌菌丝生长速度和长势差异显著。其中，该菌株在以葡萄糖为碳源的培养基上日生长速度较快，其次为蔗糖、果糖，在淀粉和对照培养基上长势差，菌丝生长速度最慢。
3、不同氮源对牛肝菌菌丝生长的影响
以氮源试验基础培养基为对照，在氮源试验基础培养基中分别加3g/L的硫酸铵、3g/L大豆蛋白胨、3g/L牛肉膏和3g/L酵母浸粉。制成平板，作为不同氮源培养基。每个处理5个重复。
用打孔器取直径5mm的CCTCC No：M2020221的母种菌块(5×5mm)分别接种至装有25mL不同氮源培养基的培养皿和装有25mL氮源试验基础培养基的培养皿中；接种后于25℃恒温培养，采用十字交叉法测定菌丝生长速度(菌丝生长速度＝菌落半径/培养天数)，定期观察并记录菌丝长势，筛选出最适氮源。
试验表明，牛肝菌菌株在不同氮源培养基上的生长速度差异显著。菌丝生长速度以大豆蛋白胨最快；其次是酵母浸粉、牛肉膏；最慢的是硫酸铵和对照。从菌丝生长势来看，以大豆蛋白胨为氮源的菌丝浓密，长势最佳；其次为酵母浸粉；大豆粉和对照最差。因此，该菌株的最佳氮源为大豆蛋白胨。
4、初始pH值对牛肝菌菌丝生长的影响
配制PDA培养基，分别调整pH至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，灭菌后再分别倒平板，作为不同pH值的平板。每个处理设5个重复。
用打孔器取直径5mm的CCTCC No：M2020221的母种菌块(5×5mm)分别接种于不同pH值的平板，25℃恒温培养，采用十字交叉法测定菌丝生长速度(菌丝生长速度＝菌落半径/培养天数)，定期观察并记录菌丝长势。
试验表明，牛肝菌菌丝在pH值为4.0-9.0之间均能生长；当pH值小于4.0或大于9.0时，牛肝菌菌丝不能生长。在pH值为5.0-7.0时，菌丝生长较快，且差异不显著。从菌丝生长势来看，当pH值6.5时，菌丝长势最旺；其次是pH值为5.5、6.0；菌丝在pH值为7.5-9.0、4.0-5.0之间时长势较弱。因此，该菌株的最适pH值为6.5。
5、生长因子对牛肝菌菌丝生长的影响
以在PDA培养基中分别加0.05g/L的维生素B1、0.05g/L维生素B2、0.05g/L维生素C或0.05g/L肌醇，制成平板，作为不同生长因子的平板。每个处理5个重复。
用打孔器取直径5mm的CCTCC No：M2020221的母种菌块(5×5mm)分别接种后于25℃恒温培养，采用十字交叉法测定菌丝生长速度(菌丝生长速度＝菌落半径/培养天数)，观察并记录菌丝生长情况，筛选出最适生长因子。
试验表明，不同生长因子对牛肝菌菌丝生长存在一定的影响，其中维生素B1菌丝生长速度最快，维生素B2和肌醇次之，维生素C最差。因此，该菌株的最佳生长因子为维生素B1。
二、人工栽培技术
1、母种制作
将CCTCC No：M2020221母种菌块(5×5mm)转接到PDA加富斜面培养基(PDA加富固体培养基)试管上，置于25℃温度下进行恒温培养约12天，得到母种。
培养期间注意检查菌丝生长情况，是否有杂菌污染。
上述PDA加富斜面培养基配方：葡萄糖20g、大豆蛋白胨2g、马铃薯200g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g、维生素B1 10mg、琼脂16g、水1000mL、pH值6.5，分装到20×200mm的试管，按照常规方法配置灭菌后摆斜面备用。
2、原种制备
在无菌条件下，选取长势良好的斜面试管(20mm×200mm)母种(斜面长约120mm)，用接种刀分割成5mm见方的母种块，挑取4-6个母种块分别接种于装有250mL PDA加富液体培养基的1000mL三角瓶内，每支试管接5-6瓶，然后将接好种的三角瓶放在25℃恒温箱中避光静置培养48-72小时，每天注意检测是否感染杂菌，如果发现感染即可淘汰不用。再将经静置培养无污染的三角瓶放置于摇床上进行25℃恒温，160-200r/min震荡，避光培养72-96小时后，菌球大小均匀、密度80％以上，菌液清亮，气味清香、无污染的即为条件下，避光培养至菌丝满瓶，得到的菌液即为原种(图4)。
上述PDA加富液体培养基，每1L的配方如下：葡萄糖20g、大豆蛋白胨2g、马铃薯200g、KH2 PO4 1g、MgSO4 0.5g、维生素B1 10mg、水1000mL、pH值6.5。
3、栽培种制作
在无菌条件下，用无菌移液枪取原种25mL，移接到装有750g栽培料的聚丙烯塑料袋(17cm×35cm×0.005cm)，在25℃下恒温、避光培养至菌丝满袋。
栽培料配方，各组分其质量百分含量如下：杂木屑78％、麦麸20％、玉米粉1％和轻质碳酸钙1％。
栽培料制袋：将杂木屑、麦麸、玉米粉和轻质碳酸钙按照上述质量比混合拌匀，补充培养料的含水量，并将含水量控制在65％，pH值调至7.5-8，采用规格为17cm×35cm×0.005cm的聚丙烯栽培袋，每袋装料l000克左右。将装料后的塑料袋套上套环，用透气棉塞塞紧，在126℃温度下维持2小时，待压力自然下降为“零”后，移到冷却净化室进行冷却，得到装有750g栽培料的聚丙烯塑料袋。
4、栽培包生产
1)配料与制袋
栽培料配料：杂木屑30％、棉子壳35％、麦麸30％、玉米粉4％、轻质碳酸钙1％。
栽培料制袋：先用清水将棉子壳调湿，然后将杂木屑、麦麸、玉米粉、轻质碳酸钙与预湿的棉子壳混合拌匀，补充培养料的含水量，并将含水量控制在65％，pH值调至7.5-8，采用规格为17cm×35cm×0.005cm的聚丙烯栽培袋，每袋装料l000克左右。将装料后的塑料袋套上套环，用透气棉塞塞紧，在126℃温度下维持2小时，待压力自然下降为“零”后，移到冷却净化室进行冷却。
2)接种与菌丝培养
待栽培包温度冷却至25℃以下，按照无菌室操作规程，在百级层流罩下将上述4得到的栽培种进行接菌(转接量：25g/袋)，每袋栽培种可接30-40袋栽培包。接种后的菌袋直立于培养室架上避光培养。培养温度25℃，培养室空气相对湿度60-65％。菌丝培养阶段，前期关闭门窗，避免室内温度波动幅度过大。后期应加强通风透气，保持室内空气清新，35-40天菌丝可长满菌袋。菌丝长满袋后，继续在25℃下后熟培养30-35天，待菌袋变软，颜色转暗后开袋，转入出菇房进行出菇管理。
3)出菇期间的管理
当菌袋完成后熟后，去除棉塞、套环，解开袋口并下折，然后在料面上覆土。覆土应先置于太阳下晒至发白，然后用水调节土粒湿度，以土粒能捏扁而不散为度，覆土的厚度为3-4厘米。折袋后，袋口边缘应高出土表面3-5厘米，并将覆土后的菌袋均匀地竖直排列在室外畦面或室内出菇床架上。
覆土后，注意保持覆土湿润，并多关门或多盖膜，刺激原基早日分化。一般覆土后7-10天，原基顶部可露出土面。原基出土后，应注意将场地内空气相对湿度控制在80-95％。同时加强通风，保持场地内宅气清新，并注意使场地内有一定的散射光。
整个出菇阶段场地温度应控制在24-26℃之间。喷水量根菇大小、覆土的湿度和气候情况具体掌握，菇多多喷水，菇少少喷水；晴天多喷，阴天少喷。根据菇体生长不同阶段灵活控制通风量，菌柄出土、菌盖形成和生长各阶段依次加大通风量，菇房空气相对湿度保持在90％左右即可。当菇体成熟时及时采收，每茬菇采完后应及时补上覆土，停水养菌3-5天后进行下茬出菇管理。
4)病虫害防治
在菌丝生长阶段，重点防止各种霉菌侵入培养基造成污染。注意生产环境、原辅材料、生产过程要符合要求，同时注意搞好环境卫生，日常查菌不可过于频繁。在子实体生长阶段，重点防止各种虫害，如各类菇蝇、菇蚊等，菇房通风口应加装防虫网，菇房内可视情况悬挂杀虫灯，周边环境应保持整洁卫生，发现病虫危害的菌袋及时拣出妥善处理。
5)采收与包装
当子实体长大成型、菌柄长度5-7㎝，菌盖直径4-9㎝时，用手捏在子实体根部附近，左右轻轻晃动，将菇体连根拔起，竖直放在篮子里，得到人工栽培后牛肝菌。
为防止在采收时受到损伤的小菇在土中腐烂招致病虫害发生，应在采收时顺带取出残留在土中的菇根(图6)。
上市销售的牛肝菌，采收后先将子实体多余的菌柄剪去，按子实体菌盖大小和菇柄长度分级包装。未及时上市销售的产品，应及时置于0-3℃的冷库中贮藏，可保鲜10-15天。
人工栽培牛肝菌CCTCC No：M2020221出菇成功。
三、毒性检测
将上述二的步骤4获得的人工栽培牛肝菌CCTCC No：M2020221按照GB15193.32014《食品安全国家标准急性经口毒性试验》委托福建省疾病预防控制中心检测。
结果如下：该样品急性经口毒性试验结果LD50>10g/kg体重，根据急性毒性剂量分级属实际无毒。
四、感观检测
将上述三毒性检测结果为实际无毒的人工栽培牛肝菌CCTCC No：M2020221幼菇子实体鲜品和野生牛肝菌RGHUNG201903181D85子实体带到无异味、无空气对流的实验室进行感官检测。
首先，用鼻子闻子实体，可以感到淡淡的香气，人工栽培的子实体较清新怡人，野生的子实体香气更为浓郁一些；
然后，用不锈钢刀具将人工栽培牛肝菌CCTCC No：M2020221幼菇子实体纵向切成约3mm厚的薄片，可以看到子实体表面橘黄色，而菌肉呈白色，数秒钟后逐渐变蓝紫色(图7)；
之后，切一小块人工栽培牛肝菌CCTCC No：M2020221幼菇子实体放入口中含住，口感顺滑冰凉，舌尖感觉清甜，无辛辣苦涩感。
  SEQUENCE LISTING
<110> 郑永彬
<120> 一种牛肝菌科真菌及其应用
<160>  2
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  805
<212>  DNA
<213> Buchwaldoboletus sp.
<400>  1
gattacgaat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag atttccgtag gtgaacctgc  60
gggaagggat cattatcgaa atctctagga gaaacgtgaa gggggggaag tcgagcgggc 120
gaagtttggt cgaggttgtc gctggccctt cggggcatgt tgcacgcctt tgccttagtc 180
ctcgttctct tttctctttt gcgtcgatcc gttctctcac acacctgtgc acctgttgta 240
ggttttctcg agagaggaaa cctatgtttt tcataaacac ctttgtatgt ctatagaatg 300
tctatgttga cgtcgaccac tgggcgacgt taaacaaaac tatgaacaac tttcagcaac 360
ggatctcttg gctctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaat tgcgataagt aatgtgaatt 420
gcagattttc agtgaatcat cgaatctttg aacgcacctt gcgctccttg gtattctgag 480
gagcatgcct gtttgagtgt cattgaattc tcaaccatgt cttgatgtcg tcgagcgcat 540
ggcttggatg tgggggttgc tggcggcgcg agctgtcggc tctccttaaa tgcattagca 600
aagggcgagc ctttcgtgca cggccttcga cgtgataatg atcgtcgtgg ctggagcgga 660
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acctcaaatc aggtaggact acccgctgaa cttaagcata tcaataagcg gaggaatcgt 780
cgacctgcag catgcaagct tggca                                       805
<210>  2
<211>  684
<212>  DNA
<213>  Buchwaldoboletus sp.
<400>  2
tcattatcga aatctctagg agaaacgtga aggggggaag tcgagcgggc gaagtttggt  60
cgaggttgtc gctggccctt cggggcatgt tgcacgcctt tgccttagtc ctcgttctct 120
tttctctttt gcgtcgatcc gttctctcac acacctgtgc acctgttgta ggttttctcg 180
agagaggaaa cctatgtttt tcataaacac ctttgtatgt ctatagaatg tctatgttga 240
cgtcgaccac tgggcgacgt taaacaaaac tatgaacaac tttcagcaac ggatctcttg 300
gctctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaat tgcgataagt aatgtgaatt gcagattttc 360
agtgaatcat cgaatctttg aacgcacctt gcgctccttg gtattccgag gagcatgcct 420
gtttgagtgt cattgaattc tcaaccatgt cttgatgtcg tcgagcgcat ggcttggatg 480
tgggggttgc tggcggcgcg agctgtcggc tctccttaaa tgcattagca aagggcgagc 540
ctttcgtgca cggccttcga cgtgataatg atcgtcgtgg ctggagcgga aggcatgaat 600
cgtcgttgct tctaatctct gatccttttg ggatcgcttt cgaaacttga cctcaaatca 660
ggtaggacta cccgctgaac ttaa                                        684

Claims (10)

1.牛肝菌(Buchwaldoboletus sp.)RGHUNG201903181D85，其保藏号为CCTCC No：M2020221。
2.一种人工栽培牛肝菌的方法，包括如下步骤：
1)将权利要求1所述的牛肝菌在PDA加富固体培养基中进行母种培养，得到母种；
2)再将所述母种转接在PDA加富液体培养基中进行原种培养，得到原种；
3)将所述原种转接在栽培种培养栽培料中进行栽培种培养，得到栽培种；
4)将所述栽培种转接在菌丝培养栽培料中依次进行菌丝培养和出菇培养，得到牛肝菌，实现人工栽培牛肝菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述PDA加富固体培养基或所述PDA加富液体培养基均包括C源、N源和生长因子；
所述C源为葡萄糖、蔗糖或果糖，所述N源为大豆蛋白胨、酵母浸粉或牛肉膏，所述生长因子为维生素B1、维生素B2或肌醇。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：
所述PDA加富固体培养基或所述PDA加富液体培养基的pH值均为5.5-6.5。
5.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于：
各步骤中的培养温度均为24-26℃。
6.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于：
所述母种培养的条件为25℃培养12-14天；
或，所述原种培养的条件依次为如下：
1)25℃避光静置培养48-72小时；
2)25℃避光震荡培养72-96小时；
或，所述栽培种培养的条件为25℃避光培养至菌丝长满栽培种培养栽培料所在的栽培袋；
或，所述菌丝培养的条件为依次为如下：
1)25℃、空气相对湿度60-65％，培养至菌丝长满菌丝培养栽培料所在的栽培袋；
2)25℃、继续后熟培养30-35天。
7.由权利要求2-6任一所述方法制备的牛肝菌。
8.权利要求1所述的牛肝菌或权利要求7所述的牛肝菌在作为食用菌中的应用；
或，权利要求1所述的牛肝菌或权利要求7所述的牛肝菌在制备食用菌产品中的应用。
9.权利要求2-6中任一所述方法中的所述PDA加富固体培养基和/或所述PDA加富液体培养基在人工栽培权利要求1所述的牛肝菌中的应用。
10.权利要求2-6中任一所述方法在人工栽培权利要求1所述的牛肝菌中的应用；
或，权利要求2-6中任一所述方法在扩繁权利要求1所述的牛肝菌中的应用。
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