CN103649321A - 用于通过添加交替电子受体改善微生物中的产品收率和产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了减少或消除甘油产生并且增加产物形成的新型代谢途径。更具体地，本发明提供了重组微生物，所述微生物包含一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶以及在一个或多个工程化代谢途径中用于将碳水化合物源例如木质纤维素转化成产物例如乙醇的一种或多种天然和/或异源酶，其中所述一种或多种天然和/或异源酶被激活、上调或下调。本发明还提供了重组微生物，所述微生物包含一种或多种用于调节甘油合成的异源酶和/或用于在一个或多个工程化代谢途径中用于将碳水化合物源转化成乙醇的一种或多种天然和/或异源酶，其中所述一种或多种天然和/或异源酶被激活、上调或下调。

Description

用于通过添加交替电子受体改善微生物中的产品收率和产量的方法
发明背景
生物质例如玉米、甘蔗或其它能源作物以及单糖至乙醇的转化是通过使用酵母发酵常规完成的。然而，在酵母代谢过程中，发酵的主要副产品是甘油。甘油在厌氧生长过程中形成，作为酵母平衡其氧化还原状态和再生在糖酵解过程中用作辅因子的NAD+的方式。已显示甘油的功能不可能作为代谢物本身而是作为电子冷阱(electron sink)，捕获电子，从而允许进一步的生长关联代谢继续进行。由于甘油是低价值副产品，因此其可以是不期望的发酵副产品。减少或消除该副产品和进一步将更多的碳导向期望的终产物例如乙醇将是有益的。
在本领域有几个策略，通过生物化学或其它方法将甘油转化成更高价值的产物，但对于除去或减少甘油并且提高至乙醇或其它期望的代谢终产物的总的产糖率而言，实例甚少。通过工程化替代途径，潜在地同时减少或缺失甘油途径，可在酵母代谢过程中使用用于再生NAD+的交替或替代电子受体。这样的交替或替代电子受体可以是分子例如甲酸或氢。
甘油合成基因的消除已被证明，但该途径的去除完全完全阻断了酵母的厌氧生长，在工业过程中阻止了有用的应用。Ansell,R.,等人,EMBO J.16:2179-87(1997)；Pahlman,A-K.,等人,J.Biol.Chem.276:3555-63(2001)；Guo,ZP.,等人,Metab.Eng.13:49-59(2011)。绕过甘油发酵的其它方法需要共利用另外的碳源例如木糖或乙酸来用作电子受体。Lidén,G.,等人,Appl.Env.Microbiol.62:3894-96(1996)；Medina,V.G.,等人,Appl.Env.Microbiol.76:190-195(2010)。通过包含甲酸途径作为交替电子受体，可绕过甘油形成并且可增加乙醇产率。已对来自大肠杆菌(E.coli)的丙酮酸甲酸裂解酶(其能够将丙酮酸转化成甲酸)进行工程化来增加甲酸产量。Waks,Z.和Silver,P.A.,Appl.Env.Microbiol.75:1867-1875(2009)。在Waks和Silver中进行了甲酸工程化，以在酿酒酵母中提供甲酸来源，以通过第二微生物大肠杆菌产生氢。Waks和Silver未将甲酸产生与甘油形成的除去组合，并且甲酸用作用于甘油还原的交替电子受体的用途未被提出或评价。因此，尽管先前做了绕过和/或消除甘油产生的努力，但仍然存在对细胞中交替或替代电子受体的工程化以将更多的碳导向期望的终产物例如乙醇的需要。
工程化交替或或替代电子受体的重要性在玉米糖化醪发酵的过程中得到举例说明。每年产生约160亿加仑的基于玉米的乙醇，因此即使乙醇产率的少量增加例如5-10%，亦可转化成高于当前产量额外10亿左右加仑的乙醇。从玉米糖化醪产生乙醇通常导致范围在10-12g/L内的甘油产率。参见Yang,R.D.,等人,"Pilot plant studies of ethanolproduction from whole ground corn,corn flour,and starch,"FuelAlcohol U.S.A.,February13-16,1982(报导的甘油水平高至7.2%w/w的正常玉米糖化醪发酵中消耗的初始糖，或在使用20%的糖的情况下约1.4g/100mL)。通过在从玉米产生乙醇中减少或消除甘油产率以及再工程化代谢过程，可获得增加的乙醇产率。可在从玉米产生乙醇中获得额外的益处。玉米糖化醪是富含营养物的培养基，在一些情况下，包含可超过3%的总发酵体积的脂质和蛋白质含量。作为这些组分中包含的能量的结果，甚至可获得比使用例如纯糖预期的更高的乙醇产率。额外的增加可来自玉米糖化醪培养基中的脂质或氨基酸的代谢。本发明的重组细胞和方法使得能够通过减少或消除甘油而从生物质发酵增加乙醇产率。
发明概述
本发明总地来说涉及宿主细胞中的甘油产生的减少或去除以及用于再生NAD+的替代电子受体的工程化。
本发明的一个方面涉及重组微生物，所述微生物包含：一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失；和在一个或多个工程化代谢途径中用于将碳水化合物源转化成乙醇的一种或多种天然和/或异源酶，其中所述一种或多种天然和/或异源酶被激活、上调或下调。在一些实施方案中，重组微生物产生比不具有所述一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的对照更少的甘油。在一些实施方案中，糖源是生物质。在一些实施方案中，生物质包括选自如下物质的木质纤维素材料：草、柳枝稷、大米草、黑麦草、草芦、混合草原禾草、芒草、糖加工残渣、甘蔗渣、甘蔗秆、农业废物、稻秆、稻壳、大麦秆、玉米穗轴、谷类秆、小麦秆、芸苔秆、燕麦秆、燕麦壳、玉米纤维、秸杆、大豆秸杆、玉米秸杆、林业废物、再循环木浆纤维、纸污泥、锯屑、硬木、软木、龙舌兰及其组合。在一些实施方案中，生物质是玉米是玉米糖化醪或或玉米淀粉。
在具体方面，一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpd1多核苷酸、gpd2多核苷酸或gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码。在某些实施方案中，重组微生物还包含有效地连接于天然gpd2启动子多核苷酸的天然和/或异源gpd1多核苷酸。在其它方面，一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpp1多核苷酸、gpp2多核苷酸或gpp1多核苷酸和gpp2多核苷酸编码。
在具体的方面，一种或多种用于调节甘油合成的天然酶由fps1多核苷酸编码。
在其它方面，工程化代谢途径包含丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化。在某些实施方案中，丙酮酸通过丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)转化成乙酰-CoA和甲酸。在一些实施方案中，PFL具有原核生物或真核生物来源。在一些实施方案中，PFL是双歧杆菌属,埃希氏菌属、好热厌氧杆菌属、梭菌属、链球菌属、乳杆菌属、衣藻属、单鞭毛菌属、新丽鞭毛菌属或芽孢杆菌属的一种或多种。在一些实施方案中，PFL来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、解纤维素梭菌(Clostridium cellulolyticum)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)PflA、单鞭毛菌属E2或新丽鞭毛菌(Neocallimastix frontalis)的一种或多种。在一个实施方案中，PFL来自青春双岐杆菌。
在另外的方面，工程化代谢途径包括乙酰-CoA至乙醇的转化。在某些实施方案中，乙酰-CoA通过乙醛脱氢酶转化成乙醛，乙醛通过醇脱氢酶转化成乙醇。在某些实施方案中，乙酰-CoA通过双功能乙醛/醇脱氢酶转化成乙醇。在一些实施方案中，乙醛脱氢酶、醇脱氢酶或双功能乙醛/醇脱氢酶具有原核或真核生物来源。在一些实施方案中，乙醛脱氢酶来自C.phytofermentans。在一些实施方案中，双功能乙醛/醇脱氢酶来自埃希氏菌属、梭菌属、衣藻属、单鞭毛菌属或双歧杆菌属。在一些实施方案中，双功能乙醛/醇脱氢酶来自大肠杆菌、Clostridium phytofermentans、莱茵衣藻、单鞭毛菌属E2或青春双岐杆菌。在一个实施方案中，双功能乙醛/醇脱氢酶来自青春双岐杆菌或单鞭毛菌属E2。
在其它方面，重组微生物包含一种或多种由fdh1多核苷酸、fdh2多核苷酸或fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的天然酶的缺失。
在某些实施方案中，重组微生物的碳水化合物源是木质纤维素。在某些实施方案中，重组微生物产生乙醇。在某些实施方案中，重组微生物产生甲酸。
在某些实施方案中，重组微生物选自酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、解脂耶罗维亚酵母、多形汉森酵母、红发夫酵母、实用假丝酵母、Arxula adeninivorans、树干毕赤酵母、汉逊德巴利酵母、多型德巴利酵母、粟酒裂殖酵母、白色念珠菌和西方许旺酵母。在一个实施方案中，重组微生物是酿酒酵母。
在某些实施方案中，重组微生物包含一种或多种由gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码的用于产生甘油的天然酶，包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化的工程化代谢途径和包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化的工程化代谢途径，并且重组微生物还包含一种或多种由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的天然酶的缺失。
在某些实施方案中，重组微生物包含一种或多种由gpp1多核苷酸和gpp2多核苷酸编码的用于产生甘油的天然酶，包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化的工程化代谢途径。在其它实施方案中，重组微生物的一个工程化代谢途径通过双功能乙醛/醇脱氢酶将乙酰-CoA转化成乙醇，并且重组微生物还包括一种或多种由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的天然酶的缺失。
在某些实施方案中，重组微生物包含一种或多种由fps1多核苷酸编码的用于调节甘油合成的天然酶，包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化的工程化代谢途径。在其它实施方案中，重组微生物的一个工程化代谢途径通过双功能乙醛/醇脱氢酶将乙酰-CoA转化成乙醇，并且重组微生物还包括一种或多种由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的天然酶的缺失。
在某些实施方案中，重组微生物包含由一种或多种由fps1多核苷酸编码的用于调节甘油合成的天然酶以及一种或多种由gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码的用于产生甘油的天然酶，和包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化的工程化代谢途径以及包含通双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化的工程化代谢途径，并且重组微生物还包含一种或多种由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的天然酶的缺失。
在某些实施方案中，重组微生物包含一种或多种由fps1多核苷酸编码的用于调节甘油合成的天然酶，包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化的工程化代谢途径，和包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化的工程化代谢途径，并且重组微生物还包含一种或多种由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的天然酶的缺失。
在某些实施方案中，重组微生物包含一种或多种由gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码的产生甘油的天然酶，包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化的工程化代谢途径以及包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化的工程化代谢途径，并且重组微生物还包含有效地连接于天然gpd2启动子多核苷酸的天然和/或异源gpd1多核苷酸。
在某些实施方案中，重组微生物包含一种或多种由gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码的用于产生甘油的天然酶，以及包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化的工程化代谢途径和包含通双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化的工程化代谢途径，还包含有效地连接于天然gpd2启动子多核苷酸的天然和/或异源gpd1多核苷酸以及一种或多种由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的天然酶的缺失。
在某些实施方案中，重组微生物包含一种或多种由gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码的用于产生甘油的天然酶和一种或多种由fps1多核苷酸编码的用于调节甘油合成的天然酶，以及包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化的工程化代谢途径和包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化的工程化代谢途径，还包含有效地连接于天然gpd2启动子多核苷酸的天然和/或异源gpd1多核苷酸。
在某些实施方案中，重组微生物包含一种或多种由gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码的用于产生甘油的天然酶和一种或多种由fps1多核苷酸编码的用于调节甘油合成的天然酶，以及包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化的工程化代谢途径和包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化的工程化代谢途径，还包含有效地连接于天然gpd2启动子多核苷酸的天然和/或异源gpd1多核苷酸和一种或多种由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的天然酶的缺失。
在一些实施方案中，一种或多种用于在重组微生物中产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失使甘油形成减少：超过约10%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；超过约20%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；超过约30%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；超过约40%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；超过约50%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；超过约60%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；超过约70%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；超过约80%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；超过约90%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；超过约95%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；或超过约99%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油。
在一些实施方案中，重组微生物产生选自如下的量的甲酸：在24小时内至少约0.012g/L；在48小时内至少约0.022g/L或在142小时内至少约2.5g/L。
在一些实施方案中，重组微生物产生选自如下的甲酸产率：比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约0.05倍的甲酸；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约0.1倍的甲酸；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约0.5倍的甲酸；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约1.0倍的甲酸；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约5.0倍的甲酸；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约10.0倍的甲酸；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约20.0倍的甲酸；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约30.0倍的甲酸；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约40.0倍的甲酸；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约50.0倍的甲酸；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约75.0倍的甲酸；或比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约100倍的甲酸。
在一些实施方案中，重组微生物产生选自如下的乙醇产率：比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约1%的乙醇；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约2%的乙醇；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约3%的乙醇；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约4%的乙醇；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约5%的乙醇；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约10%的乙醇；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约20%的乙醇；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约30%的乙醇；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约40%的乙醇；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约50%的乙醇；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约60%的乙醇；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约70%的乙醇；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约80%的乙醇；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约90%的乙醇；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约95%的乙醇；或比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约99%的乙醇。
在一些实施方案中，通过重组微生物或其中工程化的酶进行的碳水化合物源至乙醇的转化是在缺氧条件下进行的。
在一些实施方案中，重组微生物在缺氧条件下具有选自如下的乙酸摄取(g/L)；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约1%的乙酸摄取；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约10%的乙酸摄取；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约20%的乙酸摄取；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约30%的乙酸摄取；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约40%的乙酸摄取；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约50%的乙酸摄取；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约60%的乙酸摄取；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约70%的乙酸摄取；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约80%的乙酸摄取；和比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约90%的乙酸摄取。
在一些实施方案中，重组微生物以相较于无一种或多种天然酶(其用于产生甘油和/或调节甘油合成)的缺失的重组微生物更低的葡萄糖利用率产生更多的乙醇，其中葡萄糖利用率选自：比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约1%的每小时使用的葡萄糖；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约5%的每小时使用的葡萄糖；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约10%的每小时使用的葡萄糖；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约20%的每小时使用的葡萄糖；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约30%的每小时使用的葡萄糖；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约40%的每小时使用的葡萄糖；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约50%的每小时使用的葡萄糖；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约60%的每小时使用的葡萄糖；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约70%的每小时使用的葡萄糖；比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约80%的每小时使用的葡萄糖；和比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约90%的每小时使用的葡萄糖。
本发明的另一个方面涉及重组微生物，所述微生物包含：一种或多种用于调节甘油合成的酶，其中所述一种或多种异源酶被激活、上调或下调；和一种或多种在一个或多个工程化代谢途径中用于将碳水化合物源转化成乙醇的天然和/或异源酶，其中所述一种或多种天然和/或异源酶被激活、上调或下调。在某些实施方案中，一种或多种用于调节甘油合成的异源酶由fps1多核苷酸编码。在一个实施方案中，fps1多核苷酸来自大肠杆菌。
在一些实施方案中，上述重组微生物的工程化代谢途径之一包括丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化。在某些实施方案中，丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)转化成乙酰-CoA和甲酸。在一些实施方案中，PFL具有原核生物或真核生物来源。在一些实施方案中，PFL来自双歧杆菌属、埃希氏菌属、好热厌氧杆菌属、梭菌属、链球菌属、乳杆菌属、衣藻属、单鞭毛菌属、新丽鞭毛菌属或芽孢杆菌属的一种或多种。在一些实施方案中，PFL来自地衣芽胞杆菌、嗜热链球菌、胚芽乳杆菌、干酪乳杆菌、青春双岐杆菌、解纤维素梭菌、大肠杆菌、莱茵衣藻PflA、单鞭毛菌属E2或新丽鞭毛菌的一种或多种。在一个实施方案中，PFL来自青春双岐杆菌。
在一些实施方案中，上述重组微生物的工程化代谢途径之一包括乙酰-CoA至乙醇的转化。在一些实施方案中，乙酰-CoA被乙醛脱氢酶转化成乙醛，乙醛被醇脱氢酶转化成乙醇。在其它实施方案中，乙酰-CoA被双功能乙醛/醇脱氢酶转化成乙醇。在一些实施方案中，乙醛脱氢酶、醇脱氢酶或双功能乙醛/醇脱氢酶具有原核生物或真核生物来源。在一个实施方案中，乙醛脱氢酶来自C.phytofermentans。在某些实施方案中，双功能乙醛/醇脱氢酶来自埃希氏菌属、梭菌属、衣藻属、单鞭毛菌属或双歧杆菌属。在一些实施方案中，双功能乙醛/醇脱氢酶来自大肠杆菌、Clostridium phytofermentans、莱茵衣藻、单鞭毛菌属E2或青春双岐杆菌。在一个实施方案中，双功能乙醛/醇脱氢酶来自青春双岐杆菌或单鞭毛菌属E2。
在其它方面，重组微生物包含一种或多种由fdh1多核苷酸、fdh2多核苷酸或fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的天然酶的缺失。
在一些实施方案中，重组微生物产生乙醇。在其它实施方案中，重组微生物产生甲酸。在一些实施方案中，重组微生物选自酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、解脂耶罗维亚酵母、多形汉森酵母、红发夫酵母、实用假丝酵母、Arxulaadeninivorans、树干毕赤酵母、汉逊德巴利酵母、多型德巴利酵母、粟酒裂殖酵母、白色念珠菌和西方许旺酵母。在一个实施方案中，重组微生物是酿酒酵母。
在一些实施方案中，本发明的重组微生物还包含一种或多种天然和/或异源酶，所述酶在一个或多个工程化代谢途径中用于将木糖转化成木酮糖-5-磷酸和/或将阿拉伯糖转化成木酮糖-5-磷酸，其中一种或多种天然和/或异源酶被激活、上调或下调。
在一些实施方案中，本发明的重组微生物还包含一种或多种天然和/或异源酶，所述酶编码糖解酶，包括淀粉酶,纤维素酶,半纤维素酶,纤维素分解酶和淀粉分解辅助酶、菊糖酶,果聚糖酶和戊糖利用酶。在一个方面，糖解酶是淀粉酶，其中淀粉酶选自灰腐质霉（H.grisea）、嗜热子囊菌(T.aurantiacus)、埃默森篮状菌（T.emersonii）、里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蚁（C.lacteus）、台湾乳白蚁(C.formosanus)、高山象白蚁(N.takasagoensis）、澳大利亚矛颚家白蚁（C.acinaciformis）、达尔文澳白蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、扣囊复膜酵母(S.fibuligera)、C.lucknowense、黄胸散白蚁（R.speratus）、嗜热放线菌(Thermobfida fusca)、热纤梭菌(Clostridum thermocellum)、解纤维素梭菌、约氏梭菌(Clostridum josui)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilis)、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)、多糖降解菌(Saccharophagus degradans)、Piromyces equii、Neocallimastixpatricarum或拟南芥(Arabidopsis thaliana)。在另一个方面，糖酶解是来自扣囊复膜酵母菌的淀粉酶葡糖淀粉酶(glu-0111-CO)。
本发明的另一个方面涉及用于减少细胞甘油的方法，包括将生物质与本发明的重组微生物接触。本发明的其它方面涉及用于增加细胞质甲酸的方法，包括将生物质与本发明的重组微生物接触。本发明的另一个方面涉及用于将生物质转化成乙醇的方法，包括将生物质与本发明的重组微生物接触。在一些实施方案中，生物质包括木质纤维素生物质。在一些实施方案中，木质纤维素生物质选自草、柳枝稷、大米草、黑麦草、草芦、混合草原禾草、芒草、糖加工残渣、甘蔗渣、甘蔗秆、农业废物、稻秆、稻壳、大麦秆、玉米穗轴、谷类秆、小麦秆、芸苔秆、燕麦秆、燕麦壳、玉米纤维、秸杆、大豆秸杆、玉米秸杆、林业废物、再循环木浆纤维、纸污泥、锯屑、硬木、软木、龙舌兰及其组合。在一些实施方案中，生物质是玉米糖化醪或玉米淀粉。
在另一个方面，本发明还描述了表达用于从玉米淀粉产生燃料乙醇的酶的工业酵母菌株。
附图概述
图1显示了高产率代谢的示意图。
图2描述糖酵解途径。
图3显示糖酵解/发酵途径的示意图。
图4显示描述用于产生GPD1的标记的缺失的引物的位置的图谱。
图5显示描述用于从GPD1基因座除去标志物的引物的位置的图谱。
图6显示描述用于产生GPD2的标记的缺失的引物的位置的图谱。
图7显示描述用于从GPD2基因座除去标志物的引物的位置的图谱。
图8显示描述用于产生FDH1的标记的缺失的引物的位置的图谱。
图9显示描述用于从FDH1基因座除去标志物的引物的位置的图谱。
图10显示描述用于产生FDH2的标记的缺失的引物的位置的图谱。
图11显示描述用于从FDH2基因座除去标志物的引物的位置的图谱。
图12显示来自不同生物的PFL酶的比对。
图13显示48小时过程中甲酸产量的图。
图14显示微氧和缺氧条件下142小时结束时甲酸产量的图。
图15显示通过OD测量的72小时过程中本发明的菌株的生长的图。
图16显示72小时过程中本发明的菌株的甘油产量(g/L)的图。
图17显示72小时过程中本发明的菌株的乙醇产量(g/L)的图。
图18显示72小时过程中本发明的菌株的葡萄糖利用(g/L)的图。
图19显示通过OD测量的142小时过程中本发明的菌株的生长的图。
图20显示本发明的菌株的相对生长率(mOD/min)的图。
图21显示在50小时的发酵后本发明的菌株的乙醇产量(g/L)的图。
图22显示在50小时的发酵后本发明的菌株的乙醇产量(g/L)的图。
图23显示在50小时的发酵后本发明的菌株的甘油产量(g/L)的图。
图24显示在50小时的发酵后本发明的菌株的甘油产量(g/L)的图。
图25显示在72小时的发酵后葡萄糖利用(g/L)、甘油产量(g/L)和乙醇产量(g/L)的图。
图26显示描述大肠杆菌AADH在GPD1基因座上的整合的简图。
图27显示描述大肠杆菌AADH在FCY1基因座上的整合的简图。
图28显示用于PCR构建以及KT-MX和NT-MX整合盒至靶基因座的两个染色体中的整合的策略的示意图。
图29显示用于在靶基因座的两个染色体上用Mascoma Assembly替代整合的KT-MX和NT-MX选择盒的策略的示意图。
图30显示在M3625的FDH1位点整合的MA0370的分子图谱和基因分型。
图31显示包含用于对MA0370位点基因分型和测序的PCR产物的琼脂糖凝胶的图像。
图32显示在MA3625的FDH2位点整合的MA0280的分子图谱和基因分型。
图33显示包含用于对MA0280位点基因分型和测序的PCR产物的琼脂糖凝胶的图像。
图34显示在M3625的GPD2位点整合的MA0289的分子图谱和基因分型。
图35显示包含用于对MA0370位点基因分型和测序的PCR产物的琼脂糖凝胶的图像。
图36显示在M3625的FCY1位点整合的MA0317的分子图谱和基因分型。
图37显示包含用于对MA0317位点基因分型和测序的PCR产物的琼脂糖凝胶的图像。
图38显示描述利用菌株M2390、M2519、M2691、M3498和M3625进行的淀粉测定的结果的图。
图39显示细胞提取物(PflA、PflB、AdhE)和好氧培养物上清液(AE9)的抗肽Western印迹分析。
图40显示描述利用工程化的菌株M3465、M3625、M3679、M3680和M2390进行的甲酸裂解酶测定的结果的图。
图41显示描述利用工程化的菌株M3465、M3625、M3679和M3680进行的醇脱氢酶测定的结果的图。
图42显示描述描利用工程化的菌株M3625和M3680，使用50μg/mL AE9在室温(～25℃)对玉米淀粉进行的葡糖淀粉酶活性测定的结果的图。
图43A是显示用于表达GPD2和青春双岐杆菌pflA、pflB和adhE的启动子和终止子在M3624和M3515的GPD1基因座上的插入的示意图。
图43B是显示用于表达GPD1和青春双岐杆菌pflA、pflB和adhE的启动子和终止子在M3624和M3515的GPD2基因座上的插入的示意图。
图43C是显示M3624和M3515中的FDH1基因的缺失的示意图。
图43D是显示用于表达青春双岐杆菌pflA、pflB和adhE的启动子和终止子在M3624和M3515的FDH2基因座上的的插入的示意图。
图44A显示在由28%固体玉米糖化醪的发酵过程中由甘油还原菌株产生的甲酸的HPLC分析。
图44B显示在由28%固体玉米糖化醪的发酵过程中由甘油还原菌株产生的甘油的HPLC分析。
图44C显示在由28%固体玉米糖化醪的发酵过程中由甘油还原菌株产生的乙醇的HPLC分析。
图45A是显示用于表达青春双岐杆菌pflA、pflB和adhE的启动子和终止子在M3465的GPD2基因座上的插入的示意图。
图45B是显示M3465的FDH1基因的缺失的示意图。
图45C是显示用于表达青春双岐杆菌pflA、pflB和adhE的启动子和终止子在M3465的FDH2基因座上的插入的示意图。
图46A是显示用于表达青春双岐杆菌pflA、pflB和adhE的启动子和终止子在M3469的GPD1基因座上的插入的示意图。
图46B是显示M3469的FDH1基因的缺失的示意图。
图46C是显示用于表达青春双岐杆菌pflA、pflB和adhE的启动子和终止子在M3469的FDH2基因座上的插入的示意图。
图47显示在30%固体玉米糖化醪的发酵过程中由甘油还原菌株产生的乙醇滴度的HPLC分析。
图48显示在30%固体玉米糖化醪的发酵过程中由甘油还原菌株产生的甘油滴度的HPLC分析。
图49显示通过青春双岐杆菌双功能醇脱氢酶(AdhE)催化的逆反应，其中乙醇被转化成乙醛。
图50显示通过AdhE进行的乙醛至乙酰CoA的转化的反应的图。
图51是显示用于表达青春双岐杆菌pflA、pflB和adhE的启动子和终止子在TB655的GPP1基因座上的插入的示意图。
图52是显示用于表达青春双岐杆菌pflA、pflB和adhE的启动子和终止子在TB656的GPP2基因座上的的插入的示意图。
图53是描述菌株TB655和TB656相较于菌株M3297的减少的甘油形成的图。
图54是描述菌株TB655和TB656相较于菌株M3297的增加的乙醇产率的图。
图55是描述菌株TB655、TB656和M3297的甲酸产生的图。
发明详述
定义
术语"异源的"，当用于指多核苷酸、基因、多肽或酶时，是指通常不在宿主生物中发现的多核苷酸、基因、多肽或酶。"异源的"还包括天然编码区或其部分，所述天然编码区或其部分以不同于对应的天然基因的形式(例如，不在其在生物体的基因组中的天然位置中)被引入源生物。异源多核苷酸或基因可通过例如基因转移引入宿主生物。异源基因可包括作为嵌合基因(其包含被重新引入天然宿主的非天然调控区)的部分的天然编码区。外来基因可包括插入非天然生物体的天然基因或嵌合基因。
术语"异源多核苷酸"意欲包括编码一个或多个多肽或多肽的部分或片段的多核苷酸。异源多核苷酸可来源于任何来源，例如真核生物、原核生物、病毒或合成多核苷酸片段。
术语"启动子"或"替代启动子"意欲包括可转录地控制其在天然状态下不转录地控制的目的基因的多核苷酸。在某些实施方案中，替代启动子的转录控制导致目的基因表达的增加。在某些实施方案中，替代启动子置于目的基因的5'。替代启动子可用于替代天然启动子，或除天然启动子外，还可使用替代启动子。替代启动子相对于其中使用其的宿主细胞可以是内源的，或其可以是引入宿主细胞的异源多核苷酸序列，例如相对于其中使用其的宿主细胞是外源的。
术语"基因”或“多核苷酸”或“多核苷酸序列"意欲包括核酸分子，例如多核苷酸，其包括编码多肽的开放阅读框架和可进一步包括非编码调控序列和内含子。此外，该术语意欲包括一个或多个被定位至功能基因座的基因。此外，该术语意欲包括用于选择的目的的特定基因。基因对于宿主细胞可以是内源的或可被重组地引入宿主细胞，例如作为以附加型形式维持的质粒或被稳定地整合进入基因组的质粒(或其片段)。除了质粒形式以外，基因还可以以例如线性DNA的形式存在。在某些实施方案中，基因或多核苷酸参与生物质至例如乙醇的生物转化的至少一个步骤。因此，该术语意欲包括任何编码多肽的基因，所述多肽是例如乙酸激酶(ACK)、磷酸乙酸转移酶(PTA)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)、醛脱氢酶(ADH)和/或醇脱氢酶(ADH)、乙酰-CoA转移酶(ACS)、乙醛脱氢酶(ACDH)、乙醛/醇脱氢酶(AADH)、甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)、甘油3-磷酸酶(GPP)、乙酰-CoA合成酶、硫解酶、CoA转移酶、乙酰乙酸脱羧酶、醇乙酰转移酶，D-木糖途径中的酶例如木糖异构酶和木酮糖激酶，L-阿拉伯糖途径中的酶例如L-阿拉伯糖异构酶和L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶。术语基因还意欲包括特定基因的全部拷贝，例如细胞中编码特定基因产物的全部DNA序列。
术语"转录控制"意欲包括在转录的水平上调节基因表达的能力。在某些实施方案中，转录，从而基因表达，通过在目的基因的编码区的5'末端附近替代或添加的替代启动子调节，从而导致改变的基因表达。在某些实施方案中，工程化一个或多个基因的转录控制以导致这样的基因的最佳(例如，以期望的比率)表达。该术语还包括本领域认识到的诱导型转录控制。
术语"表达"意欲包括至少在mRNA产量的水平上的基因的表达。
术语"表达产物"意欲包括表达的基因的所得产物，例如多肽。
术语"增加的表达"意欲包括至少在增加的mRNA产生的水平上，优选在多肽表达的水平上的基因表达的改变。术语"增加的产量"意欲包括相较于多肽的天然产量或酶促活性，在表达的多肽的量上、在多肽的酶促活性的水平上的升高或其组合。
术语"活性"和"酶促活性"可互换使用并且意欲包括当在有利的条件下产生时通常归功于选择的多肽的任何功能活性。通常地，选择的多肽的活性包括与产生的多肽相关的总的酶促活性。由宿主细胞产生的并且具有酶促活性的多肽可位于细胞的细胞内空间、与细胞结合、分泌进入细胞外环境或其组合。用于测定相较于分泌的活性的总活性的技术描述于本文中并且在本领域是已知的。
术语"木聚糖降解活性"意欲包括水解寡聚戊糖和多聚戊糖中的糖苷键的能力。
术语"阿拉伯糖降解活性"意欲包括水解寡聚戊糖和多聚戊糖中的糖苷键的能力。
术语"纤维素分解活性"意欲包括水解寡聚己糖和多聚己糖中的糖苷键的能力。纤维素分解活性还可包括使纤维素和半纤维素解聚或脱支的能力。
如本文中所用，术语"乳酸脱氢酶”或“LDH"意欲包括能够将丙酮酸转化成乳酸的酶。应理解，LDH还可催化羟基丁酸的氧化。LDH包括对应于酶委员会编号1.1.1.27的那些酶。
如本文中所用，术语"醇脱氢酶”或“ADH"意欲包括能够将乙醛转化成醇例如乙醇的酶。ADH还包括能够将丙酮转化成异丙醇的酶。ADH包括对应于酶委员会编号1.1.1.1的那些酶。
如本文中所用，术语"磷酸乙酸转移酶”或“PTA"意欲包括能够将乙酰磷酸盐转化成乙酰-CoA的盐。PTA包括对应于酶委员会编号2.3.1.8的那些酶。
如本文中所用，术语"乙酸激酶”或“ACK"意欲包括能够将乙酸转化成乙酰磷酸的酶。ACK包括对应于酶委员会编号2.7.2.1的那些酶。
如本文中所用，术语"丙酮酸甲酸裂解酶”或“PFL"意欲包括能够将丙酮酸转化成乙酰-CoA和甲酸的酶。PFL包括对应于酶委员会编号2.3.1.54的那些酶。
如本文中所用，术语"甲酸脱氢酶”或“FDH"意欲包括能够将甲酸和NAD+转化成NADH和CO2的酶。FDH包括对应于酶委员会编号1.2.1.2的那些酶。
如本文中所用，术语"乙醛脱氢酶”或“ACDH"意欲包括能够将乙酰-CoA转化成乙醛的酶。ACDH包括对应于酶委员会编号1.2.1.3的那些酶。
如本文中所用，术语"乙醛/醇脱氢酶"意欲包括能够将乙酰-CoA转化成乙醇的酶。乙醛/醇脱氢酶包括对应于酶委员会编号1.2.1.10和1.1.1.1的那些酶。
如本文中所用，术语"甘油-3-磷酸-脱氢酶”或“GPD"意欲包括能够将二羟丙酮磷酸转化成甘油-3-磷酸的酶。GPD包括对应于酶委员会编号1.1.1.8的那些酶。
如本文中所用，术语"甘油3-磷酸酶”或“GPP"意欲包括能够将甘油3-磷酸转化成甘油的酶。GPP包括对应于酶委员会编号3.1.3.21的那些酶。
如本文中所用，术语"乙酰-CoA合成酶”或“ACS"意欲包括能够将乙酸转化成乙酰-CoA的酶。乙酰-CoA合成酶包括对应于酶委员会编号6.2.1.1的那些酶。
如本文中所用，术语"硫解酶"意欲包括能够将乙酰-CoA转化成乙酰乙酰-CoA的酶。硫解酶包括对应于酶委员会编号2.3.1.9的那些酶。
如本文中所用，术语"CoA转移酶"意欲包括能够将乙酸和乙酰乙酰-CoA转化成乙酰乙酸和乙酰-CoA的酶。CoA转移酶包括对应于酶委员会编号2.8.3.8的那些酶。
如本文中所用，术语"乙酰乙酸脱羧酶"意欲包括能够将乙酰乙酸转化成丙酮和二氧化碳的酶。乙酰乙酸脱羧酶包括对应于酶委员会编号4.1.1.4的那些酶。
如本文中所用，术语"醇乙酰转移酶"意欲包括能够将乙酰-CoA和乙醇转化成乙酸乙酯的酶。醇乙酰转移酶包括对应于酶委员会编号2.3.1.84的那些酶。
术语"丙酮酸脱羧酶活性"意欲包括多肽酶促地将丙酮酸转化成乙醛和二氧化碳的能力(例如，"丙酮酸脱羧酶”或“PDC")。通常地，选择的多肽的活性包括与产生的多肽相关的总的酶促活性，包括例如酶的优良的底物亲和力、热稳定性、不同pH下的稳定性或这些属性的组合。PDC包括对应于酶委员会编号4.1.1.1。
术语"产乙醇的"意欲包括微生物从碳水化合物产生乙醇作为发酵产物的能力。该术语意欲包括但不限于天然存在的产乙醇生物体、具有天然存在的或诱导的突变的产乙醇生物体以及已被遗传修饰的产乙醇生物体。
术语"发酵"意欲包括籍以从碳水化合物产生乙醇(特别是作为发酵的产物)的酶促过程(例如，细胞或无细胞的，例如裂解物或纯化的多肽混合物)。
术语"分泌的"意欲包括多肽至周质空间或细胞外环境的移动。该术语"增加的分泌"意欲包括其中给定的多肽以升高的水平(即，以超过天然存在的分泌量)分泌的状况。在某些实施方案中，术语"增加的分泌"是指相较于天然存在的分泌水平为至少约10%或至少约100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更多的给定多肽的分泌的增加。
术语"分泌多肽"意欲包括单独地或与其它多肽组合地促进另一种多肽从细胞的细胞内空间至细胞外环境的运输的任何多肽。在某些实施方案中，分泌多肽包括所有足以赋予革兰阴性或革兰阳性宿主细胞或酵母宿主细胞分泌活性的必需分泌多肽。通常地，分泌蛋白质在单个区域或基因座中编码，可使用基因工程从一个宿主细胞分离并且转移至另一个宿主细胞。在某些实施方案中，分泌多肽来源于任何具有分泌活性的细菌细胞或任何具有分泌活性的酵母细胞。在某些实施方案中，分泌多肽来源于具有II型分泌活性的宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是嗜热细菌细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是酵母细胞。
术语"来源于"意欲包括从指定的来源分离(完整地或部分地)多核苷酸区段，或从指定的来源纯化多肽。该术语意欲包括例如从与指定的多核苷酸来源结合的序列或基于所述序列直接克隆、PCR扩增或人工合成。
术语"重组微生物”或“重组宿主细胞"意欲包括本发明的重组微生物的后代或衍生物。因为某些修饰可因突变或环境影响而在后续代中发生，这样的后代或衍生物实际上可以与亲代细胞不完全相同，但仍然包括在本文中使用的术语的范围内。
"嗜热的"意指在约45℃或更高的温度旺盛生长的生物。
"嗜温的"意指在约20-45℃的温度旺盛生长的生物。
术语"有机酸"是本领域承认的。"有机酸"，如本文中所用，还包括某些有机溶剂例如乙醇。术语"乳酸"是指以游离酸或盐形式存在的有机酸2-羟基丙酸。乳酸的盐形式称为"乳酸盐"，无论中和剂是什么，即碳酸钙或氢氧化铵。术语"醋酸"是指以游离酸或盐形式存在的有机酸甲烷羧酸，也称为乙酸。醋酸的盐形式称为“乙酸盐”。
本发明的某些实施方案提供了某些基因或特定多核苷酸序列在嗜热或嗜温微生物内的“插入”(例如，添加、整合或引入)，所述基因或特定多核苷酸序列的插入可被理解为包括"遗传修饰”或“转化"，以便所述嗜热或嗜温微生物的所得菌株可被理解为被"遗传修饰的”或“转化的"。在某些实施方案中，菌株可以是细菌、真菌或酵母来源。
本发明的某些实施方案在嗜热或嗜温微生物中提供了某些基因或特定多核苷酸序列的"灭活”或“缺失"，所述基因或特定多核苷酸序列的"灭活”或“缺失"可被理解为包括"遗传修饰”或“转化"，以便所述嗜热或嗜温微生物的所得菌株可被理解为被“遗传修饰的”或“转化的”。在某些实施方案中，菌株可以是细菌、真菌或酵母来源。
术语"联合生物加工”或“CBP"是指牵涉酶促或微生物水解的生物质加工方案，所述方案通常包括4个生物介导的转化：(1)糖解酶(淀粉酶、纤维素酶和半纤维素酶)的产生；(2)存在于预处理的生物质中的碳水化合物组分至糖的水解；(3)己糖(例如，葡萄糖、甘露糖和半乳糖)的发酵；和(4)戊糖(例如，木糖和阿拉伯糖)的发酵。这4个转化在称为CBP的工艺配置(process configuration)中在单个步骤中发生，这与其它不太高度整合的配置的区别在于其不包括用于纤维素酶和/或半纤维素酶产生的专门处理步骤。
术语"CBP生物"意欲包括本发明的微生物，例如具有适合进行CBP的性质的微生物。
在本发明的一个方面，基因或特定多核苷酸序列被插入以激活它们编码的活性，例如酶的表达。在某些实施方案中，可将编码参与乙醇的代谢产生的酶(例如，代谢戊糖和/或己糖的酶)的基因添加至嗜温或嗜热生物中。在本发明的某些实施方案中，酶可赋予代谢戊糖的能力并且参与例如D-木糖途径和/或L-阿拉伯糖途径。
在本发明的一个方面，基因或特定多核苷酸序列被部分、大部分或完全缺失、沉默、灭活或下调以使它们编码的活性例如酶的表达失活。缺失提供最大的稳定性，因为不存在恢复功能的回复突变的可能性。或者，可通过插入破坏基因的功能和/或表达的核酸序列(例如，P1转导或本文中已知的其它方法)将基因部分、大部分或完全缺失、沉默、灭活或下调。术语"消除"和"敲除"可与术语"缺失"、"部分缺失"、"大部分缺失”或“完全缺失"互换使用。在某些实施方案中，可通过定向同源重组(以敲除有机酸的产生)来工程化目的嗜热或嗜温微生物的菌株。在其它实施方案中，RNAi或反义DNA(asDNA)可用于部分、大部分或完全沉默、灭活或下调特定目的基因。
在某些实施方案中，如本文中所述被靶向缺失或灭活的基因对于微生物的天然菌株可以是内源性的，从而可被理解为称为"天然基因”或“内源基因"。如果生物未曾进行遗传工程化或通过人工以有意地改变生物的遗传和/或表型构成的方式操作时，生物以“天然状态”存在。例如，野生型生物体可被认为以天然状态存在。在其它实施方案中，被靶向缺失或灭活的基因对于生物体可以是非天然的。
类似地，本文中描述的本发明的酶对于微生物的天然菌株可以是内源性的，从而可被理解为称为"天然的”或“内源的"。
术语"上调的"意指相较于天然宿主生物中的活性，活性的增加，例如酶的酶促活性的增加。
术语"下调的"意指相较于天然宿主生物中的活性，活性的减小，例如酶的酶促活性的减小。
术语"激活的"意指表达的或代谢上具有功能的。
术语"经改造适合于生长的"意指在其中生物不然不生长或其中生物生长缓慢或最低限度地生长的条件下对生长的生物的选择。因此，被认为经改造适合于在选择的条件下生长的生物比未经改造来适合在选择的条件下生长的生物生长更好。生长可通过本领域已知的任何方法来测量，包括但不限于光密度或比生长速率的测量。
术语"碳水化合来源"意欲包括碳水化合物的任何来源，包括但不限于生物质或碳水化合物例如糖或糖醇。"碳水化合物"包括但不限于单糖(例如，葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖或核糖)、糖衍生物(例如，山梨醇、甘油、半乳糖醛酸、鼠李糖、木糖醇)、二糖(例如，蔗糖、纤维二糖、麦芽糖或乳糖)、寡糖(例如，木寡聚糖,纤维糊精或麦芽糊精)和多糖(例如，木聚糖、纤维素、淀粉、甘露聚糖、藻酸盐或果胶)。
如本文中所用，"淀粉水解酶"可以是参与淀粉降解、代谢和/或水解的任何酶。术语"淀粉酶"是指将淀粉分解成糖的酶。淀粉酶存在于人唾液中，在唾液中其开始化学降解过程。包含许多淀粉但少量糖的食物例如米和马铃薯当它们被咀嚼时味道有点甜，因为淀粉酶将其一些淀粉在口中转化成糖。胰腺也产生淀粉酶(α-淀粉酶)来将饮食淀粉水解成可被其它酶转化成葡萄糖来为身体提供能量的二糖和三糖。植物和一些细菌也产生淀粉酶。所有淀粉酶是糖苷水解酶并且作用于α-1,4-糖苷键。一些淀粉酶例如γ-淀粉酶(葡糖淀粉酶)还作用于α-1,6-糖苷键。淀粉酶包括α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC3.2.1.2)和γ-淀粉酶(EC3.2.1.3)。α-淀粉酶是在钙不存在的情况下不能起作用的钙金属酶。通过在沿着淀粉链的随机位置上作用，α-淀粉酶分解长链碳水化合物，最终从直链淀粉产生麦芽三糖和麦芽糖，或从支链淀粉产生麦芽糖、葡萄糖或"极限糊精"。因为其可作用于底物上的任何地方，因此α-淀粉酶倾向于比β-淀粉酶更快速地作用。在动物中，其是主要的消化酶并且其最适pH为约6.7-7.0。淀粉酶的另一种形式β-淀粉酶还被细菌、真菌和植物合成。从非还原末端开始作用，β-淀粉酶催化第二个α-1,4糖苷键的水解，一次切掉两个葡萄糖单元(麦芽糖)。许多微生物产生淀粉酶来降解细胞外淀粉。除了切割直链淀粉和支链淀粉的非还原末端上的最后一个α(1-4)糖苷键，产生葡萄糖外，γ-淀粉酶还切割α(1-6)糖苷键。另一种淀粉水解酶是作用于麦芽糖和由α-、β-和γ-淀粉酶产生的其它短的麦芽低聚糖、将它们转化成葡萄糖的α-葡糖苷酶。另一种淀粉水解酶是支链淀粉酶。支链淀粉酶是特定种类的葡聚糖酶，一种淀粉水解外酶，其降解芽霉菌糖。芽霉菌糖被认为是通过α-1,6-糖苷键连接的麦芽三糖单元的链。支链淀粉酶(EC3.2.1.41)也称为芽霉菌糖-6-葡聚糖水解酶(脱支酶)。另一种淀粉水解酶异支链淀粉酶，将芽霉菌糖水解成异葡糖基麦芽糖(6-α-麦芽糖基葡萄糖)。异支链淀粉酶(EC3.2.1.57)也称为芽霉菌糖4-葡聚糖水解酶。"淀粉酶"可以是参与淀粉降解、代谢和/或水解的任何酶，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异支链淀粉酶和α-葡糖苷酶。
如本文中所用，"糖解酶"可以是参与碳水化合物降解、代谢和/或水解的任何酶，包括淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、纤维素分解和淀粉分解辅助酶、菊糖酶、果聚糖酶和戊糖利用酶。
生物质
生物质可包括本领域已知的或本文中描述的任何类型的生物质。例如，生物质可包括但不限于淀粉、糖和木质纤维素材料。淀粉材料可包括但不限于醪液例如玉米、小麦、黑麦、大麦、稻或高粱。糖材料可包括但不限于甜菜、朝鲜蓟根茎、甜高粱或藤条(cane)。术语"木质纤维素材料"、"木质纤维素底物"和"纤维质生物质"意指包含纤维素、半纤维素、木质素或其组合的任何类型的生物质，例如但不限于木质生物质,牧草,草本能源作物、非木本植物生物质、农业废物和/或农业残余物,林业废弃物和/或林业废物,造纸污泥和/或废纸污泥、废水处理污泥、城市固体废弃物,来自湿和干粉碎的玉米乙醇植物的玉米纤维和糖加工残渣。术语"半纤维素"、"半纤维素部分"和"半纤维素级分"意指木质纤维素材料的非木质素、非纤维素组分，例如但不限于半纤维素(即，包含木糖葡聚糖、木聚糖、葡糖醛酸聚糖、阿拉伯木聚糖、甘露聚糖、葡萄糖甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖等等)、果胶(例如，聚半乳糖醛酸(homogalacturonan)、鼠李半乳醛聚糖I和II以及木半乳糖醛酸)和蛋白聚糖(例如，阿拉伯半乳聚糖-蛋白质、伸展蛋白和富含脯氨酸的蛋白质)。
在非限定性实例中，木质纤维素材料可包括但不限于,木质生物质例如废弃木质纸浆纤维、锯屑、硬木、软木及其组合；草，例如柳枝稷、大米草、黑麦草、草芦、芒草或其组合；糖加工残渣，例如但不限于甘蔗渣；农业废物、例如但不限于稻秆、稻壳、大麦秆、玉米穗轴、谷类秆、小麦秆、芸苔秆、燕麦秆、燕麦壳和玉米纤维；秸杆，例如但不限于大豆秸杆、玉米秸杆；肉质植物，例如但不限于龙舌兰；和林业废物，例如但不限于再循环木浆纤维、锯屑、硬木(例如，白杨、橡木、枫木、桦木、柳树)、软木或其任意组合。木质纤维素材料可包含一个物种的纤维；或者，木质纤维素材料可包含源自不同木质纤维素材料的纤维的混合物。其它木质纤维素材料是农业废物，例如谷类杆,包括小麦秆,大麦秆,芸苔秆和燕麦秆；玉米纤维；秸杆，例如玉米秸杆和大豆秸杆；草，例如柳枝稷、草庐、大米草和芒草；或其组合。
纸污泥也是用于乳酸或乙酸生产的有机原料。纸污泥是从制浆和造纸产生的固体残渣，通常从初沉池中的处理废水取出。以$30/湿吨的处理成本，污泥处理的成本相当于$5/吨的被生产来销售的纸。湿污泥的处理成本极大地促使将材料转向其它用途，例如至乙醇的转化。本发明提供的处理是可广泛应用的。此外，糖化和/或发酵产物可用于产生乙醇或更高附加值的化学品，例如有机酸、芳族化合物、酯、丙酮和聚合物中间体。
甘油还原
厌氧生长条件需要内源电子受体的产生，例如辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。在细胞氧化还原反应中，NAD+/NADH这一对作为还原当量的储存库和载体起着至关重要的作用。Ansell,R.,等人,EMBO J.16:2179-87(1997)。产生NAD+的细胞甘油的产生用作在酵母的厌氧发酵过程中除去过量还原力的氧化还原阀(redox valve)。然而，甘油的产生是消耗ATP的浪费能量的过程并且导致还原的三碳化合物的损失。Ansell,R.,等人,EMBO J.16:2179-87(1997)。为了从起始葡萄糖分子产生甘油，甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)将二羟丙酮磷酸还原成甘油3-磷酸，甘油3-磷酸酶(GPP)使甘油3-磷酸脱磷酸成甘油。尽管是浪费能量的，但甘油的产生是厌氧生长所必需的代谢过程，因为删除GPD活性在厌氧条件下完全抑制生长。参见Ansell,R.,等人,EMBO J.16:2179-87(1997)。
GPD由两个同基因(isogene)gpd1和gpd2编码。GPD1在厌氧生长细胞中编码主要同种型，而GPD2是在氧气不存在的情况下(这刺激其表达)甘油产生所必需的。Pahlman,A-K.,等人,J.Biol.Chem.276:3555-63(2001)。GPD将二羟丙酮磷酸转化成甘油的第一步骤是速率控制性的。Guo,Z.P.,等人,Metab.Eng.13:49-59(2011)。GPP也由两个同基因gpp1和gpp2编码。当转换至厌氧条件时，GPP基因的缺失阻止生长，这表明GPP对于细胞对渗透和缺氧胁迫的耐受性是重要的。参见Pahlman,A-K.,等人,J.Biol.Chem.276:3555-63(2001)。
因为甘油是乙醇的厌氧产生的主要副产品，所以已进行了许多努力来除去甘油的细胞产生。然而，由于通过甘油合成产生的还原当量的原因，因此在不补偿该有价值的代谢功能的情况下不能进行甘油合成途径的删除。已进行了消除甘油产生和工程化交替电子受体的努力。Lidén,G.,等人,Appl.Env.Microbiol.62:3894-96(1996)；Medina,V.G.,等人,Appl.Env.Microbiol.76:190-195(2010)。Lidén和Medina都删除了gpd1和gpd2基因并且尝试使用另外的碳源来绕开甘油形成。Lidén将来自树干毕赤酵母的木糖还原酶工程化进入酿酒酵母gpd1/2缺失菌株。木糖还原酶活性在木糖存在的情况下促进甘油缺失菌株的厌氧生长。参见Lidén,G.,等人,Appl.Env.Microbiol.62:3894-96(1996)。Medina将来自大肠杆菌的乙醛脱氢酶mhpF工程化进入酿酒酵母gpd1/2缺失菌株来将乙酰-CoA转化成乙醛。乙醛脱氢酶活性在醋酸存在的情况下促进甘油缺失菌株的厌氧生长，但在葡萄糖作为唯一碳源存在的情况下则不。Medina,V.G.,等人,Appl.Env.Microbiol.76:190-195(2010)；也参见EP2277989。Medina指出在工业实现之前需要解决的关于含mhpF菌株的几个问题，包括相较于含GPD1和GPD2的酵母显著减弱的生长和产物形成率。
将流从甘油重新导向乙醇的另外的努力包括通过或不通过GPD1的同时敲除将非磷酸化NADP+-依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPN)工程化进入酵母。Bro,C.,等人,Metab.Eng.8:102-111(2006)；美国专利申请公布号US2006/0257983；Guo,Z.P.,等人,Metab.Eng.13:49-59(2011)。然而，存在控制甘油的产生和积累的其它细胞机制，包括甘油输出者例如FPS1，其不需要交替NADP+/NADPH偶联的工程化和甘油合成基因的缺失。Tamás,M.J.,等人,Mol.Microbiol.31:1087-1004(1999)。
FPS1是位于质膜中的通道蛋白，其在酵母渗透压调节中控制甘油的积累和释放。该菌株的无效突变体积累大量细胞内甘油，生长比野生型慢得多，并且以更慢的速率消耗糖底物。Tamás,M.J.,等人,Mol.Microbiol.31:1087-1004(1999)。尽管在缺氧条件下生长更慢，但fps1Δ菌株可用作消除NAD+-依赖性甘油活性的替代物。fps1Δ菌株具有减少的甘油形成，但仍然具有完全功能性的NAD+-依赖性甘油合成途径。或者，不删除内源FPS1，可将来自其它生物的FPS1或同源物的组成型活性突变体用于调节甘油合成，同时使NAD+-依赖性甘油活性保持完整。在本发明的调节FPS1的实施方案中，重组宿主细胞仍然可合成和保留甘油，并且获得相较于不能产生甘油的菌株改善的鲁棒性。
下面显示来自酿酒酵母的示例性FPS1序列。
酿酒酵母FPS1(核苷酸；编码序列加以下划线；SEQ ID NO：1):
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酿酒酵母FPS1(氨基酸；SEQ ID NO:2):
丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)
丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化通过丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)来进行。在大肠杆菌中，PFL是负责产生甲酸的主要酶。PFL是需要激活性酶PflAE(其由pflA编码)、活性的S-腺苷甲硫氨酸和单电子供体的PflB的二聚体。参见Waks,Z.和Silver,P.A.,Appl.Env.Microbiol.75:1867-1875(2009)。Waks和Silver工程化了酿酒酵母的菌株以分泌甲酸(通过添加来自大肠杆菌的PFL和AdhE和缺失内源甲酸脱氢酶)并使用大肠杆菌在两步骤法中产生氢。然而，Waks和Silver未将甲酸产生与甘油形成的除去组合，甲酸用作用于甘油还原的交替电子受体的用途未被提出或评价。
用于本发明的重组宿主细胞的PFL酶可来自细菌或真核生物来源。细菌PFL的实例包括但不限于地衣芽胞杆菌DSM13、地衣芽胞杆菌ATCC14580、嗜热链球菌CNRZ1066、嗜热链球菌LMG18311、嗜热链球菌LMD-9、胚芽乳杆菌WCFS1(基因登录号lp_2598)、胚芽乳杆菌WCFS1(基因登录号lp_3313)、胚芽乳杆菌JDM1(基因登录号JDM1_2695)、胚芽乳杆菌JDM1(基因登录号JDM1_2087)、干酪乳杆菌bl23、干酪乳杆菌ATCC334、青春双岐杆菌、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NCC2705、长双歧杆菌DJO10A、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)DSM10140、解纤维素梭菌或大肠杆菌。另外的PFL酶可来自PFL1家族、RNR pfl超家族或PFL2超家族。
来自细菌的pflA序列包括：
地衣芽胞杆菌DSM13(核苷酸；SEQ ID NO:3):
地衣芽胞杆菌DSM13(氨基酸；SEQ ID NO:4):
地衣芽胞杆菌ATCC14580(核苷酸；SEQ ID NO:5):
地衣芽胞杆菌ATCC14580(氨基酸；SEQ ID NO:6):
嗜热链球菌CNRZ1066(核苷酸；SEQ ID NO:7):
嗜热链球菌CNRZ1066(氨基酸；SEQ ID NO:8):
嗜热链球菌LMG18311(核苷酸；SEQ ID NO:9):
嗜热链球菌LMG18311(氨基酸；SEQ ID NO:10):
嗜热链球菌LMD-9(核苷酸；SEQ ID NO:11):
嗜热链球菌LMD-9(氨基酸；SEQ ID NO:12):
胚芽乳杆菌WCFS1(基因登录号：lp_2596)(核苷酸；SEQ IDNO:13):
胚芽乳杆菌WCFS1(基因登录号：lp_2596)(氨基酸；SEQ IDNO:14):
胚芽乳杆菌WCFS1(基因登录号：lp_3314)(核苷酸；SEQ IDNO:15):
胚芽乳杆菌WCFS1(基因登录号：lp_3314)(氨基酸；SEQ IDNO:16):
胚芽乳杆菌JDM1(基因登录号：JDM1_2660)(核苷酸；SEQID NO:17):
胚芽乳杆菌JDM1(基因登录号：JDM1_2660)(氨基酸；SEQID NO:18):
胚芽乳杆菌JDM1(基因登录号：JDM1_2085)(核苷酸；SEQID NO:19):
胚芽乳杆菌JDM1(基因登录号：JDM1_2085)(氨基酸；SEQID NO:20):
干酪乳杆菌bl23(核苷酸；SEQ ID NO:21):
干酪乳杆菌bl23(氨基酸；SEQ ID NO:22):
干酪乳杆菌ATCC334(核苷酸；SEQ ID NO:23):
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来自细菌的pflB序列包括：
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嗜热链球菌LMD-9(核苷酸；SEQ ID NO:45):
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解纤维素梭菌(氨基酸；SEQ ID NO:68):
大肠杆菌(核苷酸；SEQ ID NO:69):
大肠杆菌(氨基酸；SEQ ID NO:70):
真核生物PFL的实例包括但不限于莱茵衣藻PflA1、单鞭毛菌属E2或新丽鞭毛菌、Acetabularia acetabulum、雨生红球藻、团藻(Volvox carteri)、海洋真核微藻、绿色鞭毛藻(Ostreococcuslucimarinus)、金藻(Micromonas pusilla)、微单胞菌属(Micromonassp.)、坛紫菜和蓝载藻(Cyanophora paradoxa))、后鞭毛生物(寄生变形毛菌(Amoebidium parasiticum))、amoebozoan(Mastigamoebabalamuthi)、原生藻菌(stramenopile)(假微型海链藻(Thalassiosirapseudonana)(2))和粘着植物(haptophyte)(小定鞭金藻(Prymnesiumparvum))、M.pusilla、微单胞菌属海洋真核微藻(O.tauri)和绿藻(O.lucimarinus)),amoebozoan(M.balamuthi)和原生藻菌(假微型海链藻(T.pseudonana))。参见Stairs,C.W.,等人,"Eukaryotic pyruvateformate lyase and its activating enzyme were acquired laterally from afirmicute,"Mol.Biol.and Evol.,于2011年2月3日在http://mbe.oxfordjournals.org/上在线出版的。
来自真核生物的pflA序列包括：
莱茵衣藻PflA1(核苷酸；SEQ ID NO:71):
莱茵衣藻PflA1(氨基酸；SEQ ID NO:72):
新丽鞭毛菌(核苷酸；SEQ ID NO:73):
新丽鞭毛菌(氨基酸；SEQ ID NO:74):
来自真核生物的pfl1序列包括：
莱茵衣藻PflA(核苷酸；SEQ ID NO:75):
莱茵衣藻PflA(氨基酸；SEQ ID NO:76):
单鞭毛菌属E2(核苷酸；SEQ ID NO:77):
单鞭毛菌属E2(氨基酸；SEQ ID NO:78):
新丽鞭毛菌(核苷酸–部分CDS,失去起始；SEQ ID NO:79):
新丽鞭毛菌(氨基酸–部分CDS,失去起始；SEQ ID NO:80):
乙醛/醇脱氢酶
乙醛脱氢酶、醇脱氢酶和/或双功能乙醛/醇脱氢酶至细胞中的工程化可增加乙醇的产量。然而，因为乙醇的产生是氧化还原中性的，因此乙醛/醇脱氢酶活性不能用作甘油的产生给无氧代谢中的细胞提供的氧化还原平衡的替代。当Medina试图在酿酒酵母gpd1/2缺失菌株中表达来自大肠杆菌的乙醛脱氢酶mhpF时，菌株在葡萄糖作为唯一碳源存在的情况下在缺氧条件下不生长。Medina,V.G.,等人,Appl.Env.Microbiol.76:190-195(2010)；也参见EP2277989。相反地，甘油缺失菌株的厌氧生长需要醋酸的存在。然而，乙醛脱氢酶从未与PFL组合表达或用本发明的重组宿主细胞表达。此外，用改善的乙醛脱氢酶或使用双功能乙醛/醇脱氢酶(AADH)替代内源乙醛脱氢酶可积极地影响反应的体内动力学，从而提供改善的宿主菌株生长。
用于本发明的重组宿主细胞的AADH酶可来自细菌或真核细胞来源。细菌AADH的实例包括但不限于Clostridium phytofermentans、大肠杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、缓慢芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽胞杆菌、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜淀粉拟杆菌(Bacteroides amylophilus)、多毛拟杆菌(Bacteroides capillosus)、栖瘤胃拟杆菌(Bacteroides ruminocola)、猪拟杆菌(Bacteroides suis)、青春双岐杆菌、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短小乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布赫纳乳杆菌(Lactobacillus buchneri)(仅牛)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、干酪乳杆菌、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbruekii)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)(仅猪)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、胚芽乳杆菌、罗特氏乳杆菌(Lactobacillus reuterii)、肠膜样明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilacticii)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidpropionici)(仅牛)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、株薛氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、Enterococcus cremoris、二丁酮肠球菌(Enterococcus diacetylactis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、中间型肠球菌(Enterococcus intermedius)、乳酸肠球菌(Enterococcus lactis)或嗜热肠球菌(Enterococcus thermophilus)。
AdhE细菌序列包括：
Clostridium phytofermentans(核苷酸；SEQ ID NO:81):
Clostridium phytofermentans(氨基酸；SEQ ID NO:82):
大肠杆菌(核苷酸；SEQ ID NO:83):
大肠杆菌(氨基酸；SEQ ID NO:84):
青春双岐杆菌(氨基酸；SEQ ID NO:100):
凝结芽孢杆菌(氨基酸；SEQ ID NO:101):
地衣芽胞杆菌(氨基酸；SEQ ID NO：102):
屎肠球菌(Enterococcus faecium)TX1330(氨基酸；SEQ IDNO:103):
真核细胞AdhE的实例包括但不限于莱茵衣藻AdhE、单鞭毛菌属E2或新丽鞭毛菌。
来自真核细胞的AdhE序列包括：
莱茵衣藻AdhE(核苷酸；SEQ ID NO:85):
莱茵衣藻AdhE(氨基酸；SEQ ID NO:86):
单鞭毛菌属E2(核苷酸；SEQ ID NO:87):
单鞭毛菌属E2(氨基酸；SEQ ID NO:88):
联合生物加工
联合生物加工(CBP)是纤维质生物质的加工策略，其包括将4个生物介导的事件：酶产生、水解、己糖发酵和戊糖发酵合并成单个过程。执行该策略需要开发利用纤维素、半纤维素和其它生物质组分同时还以充分高的产率和浓度产生目的产物的微生物。CBP的可行性得到动力学和生物能分析的支持。参见van Walsum和Lynd(1998)Biotech.Bioeng.58:316。
CBP提供了相较于以专用糖解酶生产为特征的方法具有更低成本和更高效率的可能性。益处部分产生于避免的资金成本、底物和其它原料以及与糖解酶产生相关的效用。此外，几个因素支持更高水解率的实现，从而减少的使用CBP的反应器体积和资本投资，包括酶-微生物协同作用和嗜温生物和/或复合糖解系统的使用。此外，附着纤维素的分解纤维素微生物可能成功地与非附着微生物例如污染物竞争纤维素水解产物，这可增加基于微生物纤维素利用的工业过程的稳定性。开发能够进行CBP的微生物的进展正通过两个策略来进行：工程化天然存在的糖解微生物以改善产物相关性质，例如产率和滴度；和工程化显示高成品收率和滴度的非糖解微生物以表达使得能够利用淀粉、纤维素和半纤维素的异源糖解酶系统。
淀粉和纤维素降解
淀粉至组分糖单元的降解通过淀粉分解酶进行。淀粉酶是存在于人唾液中的淀粉分解酶的实例，在唾液中其开始化学降解过程。胰腺也产生淀粉酶(α淀粉酶)来将饮食淀粉水解成二糖和三糖，所述二糖和三糖被其它酶转化成葡萄糖来给身体提供能量。植物和一些细菌也产生淀粉酶。淀粉酶是糖苷水解酶并且作用于α-1,4-糖苷键。
几种淀粉分解酶参与淀粉水解。α-淀粉酶(EC3.2.1.1)(另名：1,4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶；糖原酶)是钙金属酶，即，在钙不存在的情况下完全不能作用。通过在沿着淀粉链的随机位置上作用，α-淀粉酶分解长链碳水化合物，最终从直链淀粉产生麦芽三糖和麦芽糖，或从支链淀粉产生麦芽糖、葡萄糖和"极限糊精"。因为其可在底物上任何地方作用，因此α-淀粉酶倾向于比β-淀粉酶更快地作用。淀粉酶的另一种形式β-淀粉酶(EC3.2.1.2)(别名：1,4-α-D-葡聚糖麦芽糖水解酶；糖原酶；糖原淀粉酶)催化第二α-1,4糖苷键水解，一次切除2个葡萄糖单元(麦芽糖)。第三淀粉酶是γ-淀粉酶(EC3.2.1.3)(别名：葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶；淀粉葡糖苷酶；外切-1,4-α-葡糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶酶体α-葡糖苷酶；1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶)。除了切割直链淀粉和支链淀粉的非还原末端上的最后一个α(1-4)糖苷键，产生葡萄糖外，γ-淀粉酶还将切割α(1-6)糖苷键。
第四酶α-葡糖苷酶作用于由α-、β-和γ-淀粉酶产生的麦芽糖和其它短的麦芽寡糖，将它们转化成葡萄糖。
3个主要类型的酶促活性降解天然纤维素。第一类型是内切葡聚糖酶(1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶；EC3.2.1.4)。内切葡聚糖酶在无定形纤维素的纤维素多糖链上随机切割，从而产生不同长度的寡聚糖和从而新的链末端。第二类型是外切葡聚糖酶，包括纤维糊精酶(1,4-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶；EC3.2.1.74)和纤维二糖水解酶(1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶；EC3.2.1.91)。外切葡聚糖酶以持续方式作用于纤维素多糖链的还原或非还原末端，释放葡萄糖(葡聚糖水解酶)或纤维二糖(纤维二糖水解酶)作为主要产物。外切葡聚糖酶还可作用于微晶纤维素，假定地从微晶结构剥离纤维素链。第三类型是β-葡糖苷酶(β-葡糖苷葡糖水解酶；EC3.2.1.21)。β-葡糖苷酶将可溶性纤维糊精和纤维二糖水解成葡萄糖单元。
即使先前已公开了表达用于从谷粒或淀粉产生燃料乙醇的酶的酵母菌株，但因所得菌株相对较弱的产生/耐受高水平乙醇的能力，该应用在基于谷粒的燃料乙醇工业中仍未商业化。例如，美国专利号7,226,776公开了表达乙醇原的多糖酶可从碳水化合物聚合物直接产生乙醇，但显示的最大乙醇滴度为3.9g/l。美国专利号5,422,267公开了酵母中的葡糖淀粉酶用于产生酒精性饮料的用途；然而，未公开乙醇的商业相关滴度。
异源糖解酶
根据本发明的方面，本发明的重组微生物的异源糖解酶的表达可有利地用于从生物质来源产生产物例如乙醇。例如，可异源地表达来自多种来源的纤维素酶以成功地增加乙醇产生的效率。糖解酶可来自真菌、酵母、细菌、植物、原生动物或白蚁来源。在一些实施方案中，糖解酶来自灰腐质霉（H.grisea）、嗜热子囊茵、埃默森篮状菌（T.emersonii）、里氏木霉、澳洲乳白蚁（C.lacteus）、台湾乳白蚁(C.formosanus)、高山象白蚁（N.takasagoensis）、澳大利亚矛颚家白蚁（C.acinaciformis）、达尔文澳白蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、扣囊复膜酵母、C.lucknowense、黄胸散白蚁（R.speratus）、嗜热放线菌、热纤梭菌、解纤维素梭菌、约氏梭菌、短小芽孢杆菌、粪碱纤维单胞菌、多糖降解菌、Piromyces equii、Neocallimastix patricarum或拟南芥。
在一些实施方案中，用于在本发明的重组微生物中表达的纤维素酶是共同未决的国际申请号PCT/US2011/039192(通过引用并入本文)的表4或7中公开的任何纤维素酶，或适合用于在适当的宿主细胞中表达的任何纤维素酶。在其它实施方案中，用于在本发明的重组微生物中表达的淀粉酶是任何淀粉酶例如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、支链淀粉酶或异支链淀粉酶旁系同源物或直系同源物、共同未决的国际申请号PCT/US2011/039192(通过引用并入本文)的表15-19中(优选表19中)公开的任何淀粉酶，或适合用于在适当的宿主细胞中表达的任何淀粉酶。在本发明的一些实施方案中，在相同的重组微生物中共表达来自单个生物体的多个糖解酶。在本发明的一些实施方案中，在相同的重组微生物中共表达来自不同生物体的多个糖解酶。具体地，可在相同的重组微生物中共表达来自2、3、4、5、6、7、8、9或更多个生物体的糖解酶。类似地，本发明可包括酵母菌株的共培养，其中酵母菌株表达不同的糖解酶。共培养可包括表达来自相同生物体或来自不同生物体的异源糖解酶的酵母菌株。共培养物可包括来自2、3、4、5、6、7、8、9或更多个生物体的表达糖解酶的酵母菌株。
用于本发明的重组微生物中表达的木质纤维素酶包括内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶。用于在本发明的重组微生物中表达的其它木质纤维素酶包括可作用于木质纤维素材料的辅助酶。木质纤维素酶可以是例如内切葡聚糖酶、葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、木糖苷酶、木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖酶、半乳糖苷酶、纤维二糖磷酸化酶、纤维糊精磷酸化酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木葡聚糖酶、木聚糖内切酶、葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖水解酶、膨胀素(swollenins)、葡糖醛酸酯酶、扩展蛋白、果胶酶和阿魏酰酯酶。在一些实施方案中，本发明的木质纤维素酶可以是用于降解期望的木质纤维素材料的任何适当的酶。
在本发明的某些实施方案中，木质纤维素酶可以是内切葡聚糖酶、葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、木糖苷酶、木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖酶、半乳糖苷酶、纤维二糖磷酸化酶、纤维糊精磷酸化酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木葡聚糖酶、木聚糖内切酶、葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖水解酶、膨胀素(swollenins)、葡糖醛酸酯酶、扩展蛋白、果胶酶和阿魏酰酯酶旁系同源物或直系同源物。在具体实施方案中，木质纤维素酶来源于共同未决的国际申请号PCT/US2011/039192(通过引用并入本文)的表4和7中命名的任何物种。
木糖代谢
木糖是可被多种生物代谢成有用的产物的五碳单糖。存在两个主要的木糖代谢途径，每一个途径在它们利用的特征酶上是独特的。一个途径称为"木糖还原酶-木糖醇脱氢酶"或XR-XDH途径。木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)是用于该木糖降解的方法的两种主要的酶。由XYL1基因编码的XR负责木糖至木糖醇的还原，并且借助于辅因子NADH或NADPH。随后木糖醇被XDH(所述XDH通过XYL2基因表达)氧化成木酮糖，并且专门地利用辅因子NAD+来实现。由于该途径需要不同的辅因子以及它们可被使用所达到的程度，不平衡可导致木糖醇副产品的过量产生以及期望的乙醇的无效产生。已在实验室中测试了XR和XDH酶水平的不同表达以试图最优化木糖代谢途径的效率。
木糖代谢的另一个途径称为"木糖异构酶"(XI)途径。酶XI负责木糖至木酮糖的直接转化，并且不通过木糖醇中间产物来进行。两个途径都产生木酮糖，尽管使用的酶不同。在木酮糖产生后，XR-XDH和XI途径通过由基因XKS1编码的酶木酮糖激酶(XK)进行，以进一步将木酮糖修饰成木酮糖-5-磷酸，随后其进入磷酸戊糖途径以进一步分解代谢。
关于在木糖代谢过程中通过磷酸戊糖途径的流的研究已显示限制该步骤的速度可有益于至乙醇的发酵的效率。可提高乙醇产量的对该流的修饰包括a)降低磷酸葡糖异构酶活性，b)删除GND1基因，和c)删除ZWF1基因(Jeppsson等人,Appl.Environ.Microbiol.68:1604-09(2002))。由于磷酸戊糖途径在代谢过程中产生额外的NADPH，因此限制该步骤可帮助修正NAD(P)H与NAD+辅因子之间的已很明显的不平衡并减少木糖醇副产物。比较两个木糖代谢途径的另一个实验显示XI途径最能够代谢木糖以产生最大乙醇产率，然而XR-XDH途径达到快得多的乙醇产生速率(Karhumaa等人,MicrobCell Fact.2007Feb5;6:5)。也参考国际公布号WO2006/009434，通过引用将其整体并入本文。
在一些实施方案中，本发明的重组微生物具有使用上述酶的一种或多种代谢木糖的能力。
阿拉伯糖代谢
阿拉伯糖是可被多种生物代谢成有用的产物的五碳单糖。L-阿拉伯糖经发现广泛地分布在不同植物组织的许多杂多糖例如阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖、木聚糖和阿拉伯木聚糖中。土壤中的芽孢杆菌属的种类参与植物材料分解的早期，枯草芽孢杆菌分泌3种酶，内切阿拉伯聚糖酶和两种阿拉伯糖苷酶，所述酶能够从植物细胞释放阿拉伯糖基寡聚物和L-阿拉伯糖。
微生物的L-阿拉伯糖代谢的3个途径已进行了描述。许多细菌，包括大肠杆菌，使用阿拉伯糖异构酶(AraA；E.C.5.3.1.4),核酮糖激酶(AraB；E.C.2.7.1.16)和磷酸核酮糖差向异构酶(AraD；E.C.5.1.3.4)来相继地将L-阿拉伯糖通过L-核酮糖和L-核酮糖5-磷酸转化成D-木酮糖-5-磷酸。参见，例如，Sa-Nogueira I,等人,Microbiology143:957–69(1997)。D-木酮糖-5-磷酸随后进入磷酸戊糖途径以进一步分解代谢。在第二途径中，L-阿拉伯糖通过阿拉伯糖脱氢酶(ADH)、阿拉伯糖酸内酯(AL)和阿拉伯糖酸脱水酶(AraC)的连续作用转化成L-2-酮-3-脱氧阿糖酸酯(L-KDA)。参见，例如，Watanabe,S,等人,J.Biol.Chem.281：2612-2623(2006)。L-KDA还可在两个替代途径中被代谢：1)L-KDA通过L-KDA脱水酶和KGSA脱氢酶经2-酮戊二半醛(KGSA)至2-酮戊二酸的转化，或2)L-KDA通过L-KDA醛缩酶至丙酮酸和羟基乙醛的转化。在第三真菌途径中，L-阿拉伯糖通过酶例如NAD(P)H-依赖性醛糖还原酶(AR)、L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶(ALDH)、L-木酮糖还原酶(LXR)、木糖醇脱氢酶(XylD)和木酮糖激酶(XylB)经由L-阿拉伯糖醇、L-木酮糖和木糖醇转化成D-木酮糖-5-磷酸。这些和其它参与阿拉伯糖代谢和调控的蛋白质可见于http://www.nmpdr.org/FIG/wiki/rest.cgi/NmpdrPlugin/SeedViewer？page=Subsystems;subsystem=L-Arabinose_utilization,2011年3月21日访问的，将其通过引用整体并入本文。
AraC蛋白调节其自己合成和Ara系统的其它基因的表达。参见Schleif,R.,Trends Genet.16(12):559-65(2000)。在大肠杆菌中，AraC蛋白正和负调节L-阿拉伯糖的摄取和分解代谢所需的蛋白质的表达。AraC的同源物例如鼠李糖操纵子的调控蛋白RhaR和RhaS已被鉴定，其包含与AraC的DNA结合结构域同源的区域(Leal,T.F.和deSa-Nogueira,I.,FEMS Microbiol Lett.241(1):41-48(2004))。这样的阿拉伯糖调控蛋白称为AraC/XylS家族。也参见，Mota,L.J.,等人,Mol.Microbiol.33(3):476-89(1999)；Mota,L.J.,等人,J Bacteriol.183(14):4190-201(2001)。
在大肠杆菌中，L-阿拉伯糖穿过大肠杆菌胞质膜的转运需要高亲和力转运操纵子araFGH、低亲和力转运操纵子上的结合蛋白依赖性系统araE、质子协同转运蛋白的表达。其它阿拉伯糖转运蛋白包括马克斯克鲁维酵母和季也蒙毕赤酵母鉴定的，美国专利号7,846,712(将其通过引用并入本文)中公开的那些阿拉伯糖转运蛋白。
在一些实施方案中，本发明的重组微生物具有使用一种或多种上述酶代谢阿拉伯糖的能力。
微生物
本发明包括多个用于开发具有进行CBP所需的底物利用与产物形成性质的组合的微生物的策略。"天然纤维素分解策略"包括工程化天然存在的纤维素分解性微生物来改善产物相关性质，例如产率和滴度。"重组纤维素分解策略"包括工程化显示高产品收率和滴度的天然非纤维素分解性微生物，以表达使得能够利用纤维素或半纤维素或两者的异源纤维素酶系统。
许多细菌具有通过糖酵解过程将简单己糖发酵成酸性和pH中性产物的能力。糖酵解途径是冗余的，并且包括一系列酶促步骤，通过所述步骤六碳葡萄糖分子通过多个中间产物分解成两个分子的三碳化合物丙酮酸。该过程导致ATP(生物能提供)和还原型辅因子NADH的净产生。
丙酮酸是代谢的重要中间化合物。例如，在好氧条件下，丙酮酸可被氧化成乙酰辅酶A(乙酰-CoA)，其随后进入三羧酸循环(TCA)，这继而产生合成前体、CO2和还原型辅因子。随后辅因子通过将氢当量经由一系列酶促步骤捐赠给氧而被氧化，从而导致水和ATP的形成。该能量形成过程称为氧化磷酸化。
在缺氧条件下(无可获得的氧)，发酵发生，其中有机化合物的降解产物用作氢供体和受体。来自糖酵解的过量NADH在牵涉有机底物的还原的反应中被氧化成产物，例如乳酸盐和乙醇。此外，ATP在称为底物水平磷酸化的过程中从有机酸例如醋酸的产生再生。因此，糖酵解和丙酮酸代谢的发酵产物包括多种有机酸、醇和CO2。
大多数兼性厌氧菌通过丙酮酸脱氢酶(PDH)和三羧酸循环(TCA)需氧地代谢丙酮酸。在缺氧条件下，用于丙酮酸代谢的主要能量途径是通过丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)途径来产生甲酸和乙酰-CoA。随后将乙酰-CoA通过磷酸乙酸转移酶(PTA)和乙酸激酶(ACK)转化成醋酸，共产生ATP，或经乙醛脱氢酶(ACDH)和醇脱氢酶(ADH)还原成乙醇。为了维持还原当量的平衡，在丙酮酸至乳酸盐的还原过程中，通过乳酸脱氢酶(LDH)将从糖酵解产生的过量NADH再氧化成NAD+。NADH还可在乙酰-CoA至乙醇的还原过程中被ACDH和ADH再氧化，但这在具有功能性LDH的细胞中是次要反应。
宿主细胞
用于本发明的宿主细胞包括任何原核或真核细胞；例如，选自细菌、藻类和酵母细胞的微生物。适合于本发明的宿主细胞是例如气单胞菌属(Aeromonas)、曲霉菌属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红球菌属(Rhodococcus)、酵母菌属(Saccharomyces)和链霉菌属(Streptomyces)的微生物。
在一些实施方案中，宿主细胞是微生物。在一个实施方案中，微生物是酵母。根据本发明，酵母宿主细胞可以例如来自酵母菌属、克鲁维酵母属、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kloeckera)、许旺酵母属(Schwanniomyces)和子囊菌酵母属(Yarrowia)。作为宿主细胞的酵母物种可包括例如酿酒酵母、博伊丁酵母、S.barnetti、少孢酵母、葡萄汁酵母、糖化酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母或脆壁克鲁维酵母。在一些实施方案中，酵母选自酿酒酵母、裂殖酵母、白色念珠菌、巴斯德毕赤酵母、树干毕赤酵母、解脂耶罗维亚酵母、多形汉森酵母、红发夫酵母、产朊假丝酵母(Candida utilis)、Arxula adeninivorans、汉逊德巴利酵母、多型德巴利酵母、粟酒裂殖酵母和西方许旺酵母。在一个具体实施方案中，酵母是酿酒酵母。在另一个实施方案中，酵母是耐热酿酒酵母。根据本文中的教导，适当的宿主的选择被在本领域技术人员的范围内。
在一些实施方案中，宿主细胞是油脂性细胞。油脂性宿主细胞可以是油脂性酵母细胞。例如，油脂性酵母宿主细胞可来自布拉霉属、念珠菌属、隐球菌属、小克银霉属、油脂酵母属、被孢霉菌属、毛霉菌属、须霉属、腐霉菌属、圆红冬孢酵母属、红酵母属、毛孢子菌属或子囊菌酵母属。根据本发明，油脂性宿主细胞可以是油脂性微藻宿主细胞。例如，油脂性微藻宿主细胞可来自破囊壶菌属(Thraustochytrium)或裂殖壶菌属(Schizochytrium)。随后可使用常规脂质转酯过程从油脂性生物产生的甘油三酯产生生物柴油。在一些具体实施方案中，油脂性宿主细胞可用于分泌合成的脂质。使用油脂性宿主细胞的实施方案是有利的，因为它们可从木质纤维素原料产生生物柴油，所述原料相对于油料种子底物更便宜，可更稠密地生长，显示更慢的生命周期二氧化碳发射，并且可栽种在边际土地(marginal land)上。
在一些实施方案中，宿主细胞是耐热宿主细胞。通过允许外部产生的纤维素酶和产乙醇宿主细胞在相似的温度范围内最佳地发挥性能，耐热宿主细胞可特别地用于同步糖化和发酵过程。
耐热宿主细胞可包括例如东方伊萨酵母,Pichia mississippiensis,墨西哥毕赤酵母、粉状毕赤酵母、仙人掌棒孢酵母、葡萄牙棒孢酵母、Candida mexicana、多形汉森酵母和克鲁维酵母宿主细胞。在一些实施方案中，耐热细胞是酿酒酵母菌株或其它酵母菌株，所述酵母菌株经改造适合在高温下生长，例如通过在抑制细菌生长的高温下选择生长来进行。
在一些具体的实施方案中，宿主细胞是克鲁维酵母宿主细胞。例如，克鲁维酵母宿主细胞可以是乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、K.blattae、K.phaffii、亚罗克鲁维酵母、K.aestuarii、K.dobzhanskii、K.wickerhamii、K.thermotolerans或克鲁雄酵母宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是乳酸克鲁维酵母或马克斯克鲁维酵母宿主细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是马克斯克鲁维酵母宿主细胞。
在一些实施方案中，耐热宿主细胞可在高于约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃或约42℃的温度生长。在本发明的一些实施方案中，耐热宿主细胞可在高于30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、或约43℃、或约44℃、或约45℃或约50℃的温度从纤维素产生乙醇。
在本发明的一些实施方案中，耐热宿主细胞可在约30℃至60℃、约30℃至55℃、约30℃至50℃、约40℃至60℃、约40℃至55℃或约40℃至50℃的温度生长。在本发明的一些实施方案中，耐热宿主细胞可在约30℃至60℃、约30℃至55℃、约30℃至50℃、约40℃至60℃、约40℃至55℃或约40℃至50℃的温度从纤维素产生乙醇。
在一些实施方案中，宿主细胞具有代谢木糖的能力。关于木糖利用技术的开发的详细信息可见于下列出版物：Kuyper M等人FEMSYeast Res.4：655-64(2004),Kuyper M等人FEMS Yeast Res.5:399-409(2005)和Kuyper M等人FEMS Yeast Res.5:925-34(2005)(将所述文献通过引用整体并入本文)。例如，木糖利用可通过异源表达例如来自缺氧真菌单鞭毛菌属E2的木糖异构酶基因XylA，过表达5个参与木酮糖至糖酵解中间产物的转化的酿酒酵母酶(木酮糖激酶、核酮糖5-磷酸异构酶、核酮糖5-磷酸表异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶)和删除编码醛糖还原酶的GRE3基因以使木糖醇产量降至最低，来在酿酒酵母中实现。
在一些实施方案中，宿主细胞具有代谢阿拉伯糖的能力。例如，阿拉伯糖利用可通过异源表达例如阿拉伯糖异构酶、核酮糖激酶或磷酸核酮糖差向异构酶的一种或多种来实现。
宿主细胞可包含抗生素标记或可以不包含抗生素标记。
在某些实施方案中，宿主细胞是嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)、高温厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、梭菌属(Clostridium)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、糖球菌属(Saccharococcus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、热解纤维素果汁杆菌属(Caldicellulosiruptor)、Anaerocellum或厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)的微生物。在某些实施方案中，宿主细胞是选自如下的细菌：热产硫磺热厌氧杆菌（Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes）、嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium aotearoense)、嗜热厌氧解多糖杆菌(Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum)、玉米热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium zeae)、木聚糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium xylanolyticum)、解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)、布氏嗜热厌氧细菌(Thermoanaerobium brockii)、热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)、热硫化氢高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)、产乙醇热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)和氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brocki)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、解纤维素梭菌、Clostridium phytofermentans、热葡糖苷酶地牙抱杆菌(Clostridium straminosolvens)、热葡糖苷酶芽胞杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、Saccharococcus caldoxylosilyticus、喜温链球菌(Saccharoccus thermophilus)、坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacilluscampinasensis)、Bacillus flavothermus、Anoxybacillus kamchatkensis、Anoxybacillus gonensis、Caldicellulosiruptor acetigenus、Caldicellulosiruptor saccharolyticus、热解纤维素果汁杆菌(Caldicellulosiruptor kristjanssonii)、Caldicellulosiruptor owensensis、Caldicellulosiruptor lactoaceticus和嗜热厌氧纤维降解菌（Anaerocellum thermophilum）。在某些实施方案中，宿主细胞是热纤梭菌、解纤维素梭菌或解糖热厌氧杆菌。
密码最优化的多核苷酸
编码异源纤维素酶的多核苷酸可以是密码子优化的。本文使用的术语“密码子优化的编码区”意思是：通过将至少一个或一个以上或很多个密码子替换为生物体的基因中更经常使用的一个或多个密码子，而使核酸编码区适应在该给定生物的细胞中的表达。
一般而言，生物中高度表达的基因偏向于被该生物中最丰富的tRNA种类所识别的密码子。这种偏向的一种度量是“密码子适应指数”或称“CAI”，其测定在何种程度上，用于编码特定基因中的每个氨基酸的密码子是在来自该生物的高度表达的基因的参照组中最经常存在的启动子。
本发明的密码子优化的序列的CAI对应于大约0.8至1.0，大约0.8至0.9，或大约1.0。密码子优化的序列可以进一步被修饰以在特定生物中表达，这取决于该生物的生物学限制性。例如，可以从序列中除掉大量的"A"或"T"的串(例如超过4、4、5、6、7、8、9或10个连续碱基的串)，如果已知这些序列对转录产生不利影响。此外，可以为了分子克隆的目的除去特定的限制性酶位点。此类限制性酶位点的实例包括PacI、AscI、BamHI、BglII、EcoRI和XhoI。另外，可以检查DNA序列中的长度为10个碱基或更长的正向重复序列、反向重复序列和镜像重复序列，可以通过将密码子替换为“第二最佳”密码子，即在特定生物（针对该生物进行序列的优化）中发生的频率第二高的密码子，从而对它们进行人工修饰。
包含编码任意多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的变异允许编码基因的序列的差异。由于每个密码子由3个核苷酸组成，并且构成DNA的核苷酸限定在4种特定的碱基，所以有64种可能的核苷酸组合，其中61种编码氨基酸（其余3种密码子编码终止翻译的信号）。本文表1中提供了“遗传密码”，其显示了哪种密码子编码哪种氨基酸。结果是，很多氨基酸被不止一种密码子代表。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸被4种三元组所编码，丝氨酸和精氨酸被6种三元组编码，而色氨酸和甲硫氨酸仅由1种三元组编码。这种简并性允许DNA碱基组成在很大范围内变化，但不改变DNA所编码的蛋白质的氨基酸序列。
表1：标准遗传密码
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很多生物显示出对编码插入到生长中的肽链中的特定氨基酸的特定密码子的使用偏向。不同生物之间的密码子优选性或密码子偏向、密码子使用的差异受到遗传密码的简并性的影响，并且在很多生物中有完善的研究。密码子偏向通常与信使RNA（mRNA）的翻译效率相关，信使RNA的翻译效率又被认为尤其依赖于被翻译的密码子的特性以及特定的转运RNA（tRNA）分子的可利用性。细胞中所选的tRNA的主导性一般是肽合成中最常使用的密码子的反映。因此，可以基于密码子优化调整基因以便在给定生物中进行优化的基因表达。
鉴于对于多种动物、植物和微生物物种而言大量的基因序列是可以获得的，所以可以计算出密码子使用的相对频率。密码子使用表是可以容易地获得的，例如http://phenotype.biosci.umbc.edu/codon/sgd/index.php(2008年5月7日访问)或http://www.kazusa.or.jp/codon/(2011年2月28日访问),并且这些表格可以按多种方式进行改编。参见Nakamura,Y等人"Codon usage tabulated from the international DNA sequencedatabases:status for the year2000"Nucl.Acids Res.28:292(2000)。下文表2提供了酵母的密码子使用表格，其是从GenBank Release128.0[2002年2月15日]计算而来的。该表格使用的是mRNA命名法，所以表格使用的是存在于RNA中的尿嘧啶（U）而非存在于DNA中的胸腺嘧啶（T）。该表格进行了改编所以频率的计算是针对每种氨基酸，而非针对所有64种密码子。
表2：酿酒酵母基因的密码子选择
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通过使用该表格或类似表格，本领域普通技术人员可以将频率应用于任何给定的多肽序列，并产生密码子优化的编码区的核酸片段，其编码多肽，但是其使用针对给定物种的优化的密码子。可以通过多种不同的方法设计密码子优化的编码区。
在一种方法中，密码子使用表用于发现用于任何给定氨基酸的单一的使用频率最高的密码子，并且在该特定氨基酸出现在多肽序列中时，每次都使用该密码子。例如，参见上文表2，对于亮氨酸而言，频率最高的密码子是UUG，其使用频率是27.2%。因此，给定氨基酸序列中所有的亮氨酸残基都被分配UUG密码子。
在另一种方法中，密码子的实际频率在编码序列中随机分布。因此，使用该方法进行优化时，如果假定的多肽序列具有100个亮氨酸残基，则，参照表2中酿酒酵母中的使用频率，大约5个或5%的亮氨酸密码子将是CUC，大约11个或11%的亮氨酸密码子将是CUG，大约12个或12%的亮氨酸密码子将是CUU，大约13个或13%的亮氨酸密码子将是CUA，大约26个或26%的亮氨酸密码子将是UUA，大约27个或27%的亮氨酸密码子将是UUG。
这些频率将随机遍布于编码假定的多肽的编码区中的亮氨酸密码子中。如本领域普通技术人员将理解：使用该方法时序列中密码子的分布可以有很大变化。但是，序列总是编码相同的多肽。
当使用上述方法时，术语“大约”用于精确说明给定氨基酸的密码子频率的百分数。本文使用的“大约”定义为比给定数值多1个氨基酸或少1个氨基酸。如果使用频率分数大于或等于0.50，则将氨基酸的整数数值“五入”；如果使用频率分数小于或等于0.49，则将其“四舍”。再次以人基因中亮氨酸的使用频率为例，假设一个多肽具有62个亮氨酸残基，则密码子使用的频率分数这样计算：62乘以每种密码子的频率。因此，62的7.28%等于4.51个UUA密码子，或"大约5”即4、5或6个UUA密码子；62的12.66%等于7.85个UUG密码子或"大约8"即7、8或9个UUG密码子；62的12.87%等于7.98个CUU密码子或"大约8”即7、8或9个CUU密码子；62的19.56%等于12.13个CUC密码子或"大约12”即11、12或13个CUC密码子；62的7.00%等于4.34个CUA密码子或"大约4”即3、4或5个CUA密码子；62的40.62%等于25.19个CUG密码子或"大约25”即24、25或26个CUG密码子。
可以通过计算每种氨基酸的密码子频率，然后为多肽序列随机分配密码子，人工地以优化的频率随机分配密码子以编码给定的多肽序列。另外，本领域普通技术人员可以容易地获得多种算法和计算机软件程序。例如，Lasergene Package中的"EditSeq"函数，其可以从DNAstar,Inc.,Madison,WI获得；VectorNTI Suite中的backtranslation函数，其可以从InforMax,Inc.,Bethesda,MD获得；以及GCG--Wisconsin Package中的"backtranslate"函数，其可以从Accelrys,Inc.,San Diego,CA获得。另外，公众可以获得多种资源以进行编码区序列的密码子优化，例如www.entelechon.com/2008/10/backtranslation-tool/(2011年2月28日访问)的"backtranslation"函数和可以从emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/backtranseq(2011年2月28日访问)获得的"backtranseq"函数。本领域普通技术人员还可以通过基本的数学函数轻易地实现构建初步算法以基于给定的频率分配密码子。
使用本领域普通技术人员熟知的标准的和常规的分子生物学操作，可以获得多种选择以合成通过上文描述的任意方法设计的密码子优化的编码区。在一种方法中，通过标准方法合成一系列互补的寡核苷酸对（oligonucleotide pair），每个长度是80-90个核苷酸并且跨越想要的序列的长度。合成这些寡核苷酸对，从而实现在退火之后，它们形成80-90个碱基对的双链片段，其包含粘末端，例如，将所述对中的每个寡核苷酸合成为延伸超出与对中的另一寡核苷酸互补的区域3、4、5、6、7、8、9、10或更多个碱基。每对寡核苷酸的单链末端设计为与另一对寡核苷酸的单链末端退火。使寡核苷酸对退火，然后使大约5至6个这些双链片段通过粘性单链末端退火在一起，然后将它们连接在一起并克隆进入标准的细菌克隆载体，例如可以从Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA获得的
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载体。然后通过标准方法将构建体测序。几个这样的构建体（由5至6个80-90个碱基对片段的片段组成）连接在一起，即制备大约500个碱基对的片段，从而在一系列质粒构建体中代表完整的想要的序列。然后使用合适的限制性酶切割这些质粒的插入子，并连接在一起以形成最终的构建体。然后将最终的构建体克隆进入标准的细菌克隆载体并测序。另外的方法对于技术人员是完全显而易见的。此外，基因合成可以容易地从商业途径获得。
在另外的实施方式中，将全长的多肽序列针对给定物种进行密码子优化，产生编码整个多肽的密码子优化的编码区，然后，从原始的密码子优化的编码区制备密码子优化的编码区的核酸片段，其编码多肽的片段、变体和衍生物。本领域普通技术人员熟知的是，如果基于密码子在给定物种中的使用频率为全长编码区随机分配密码子，则编码片段、变体和衍生物的核酸片段将不一定是针对给定物种完全密码子优化的。但是，与天然密码子使用相比，此类序列与想要的物种的密码子使用之接近程度仍然要高得多。该方法的优点在于，合成编码给定多肽的每个片段、变体和衍生物的密码子优化的核酸片段虽然是常规操作，但是是耗时的，并且花费巨大。
转座子
为了选择已进入宿主的外来DNA，优选将DNA稳定地维持在目的生物中。关于质粒，存在两个这可籍以发生的方法。一个是通过复制型质粒的使用。这些质粒具有被宿主识别并且允许质粒作为稳定的自主染色体外元件（其在细胞分裂过程中被分离进入子细胞）复制的复制起始点。第二方法通过将质粒整合进入染色体来发生。这主要通过同源重组来发生，并且导致整个质粒或质粒的部分插入宿主染色体。因此，质粒和可选择标记作为一段完整的染色体的复制并且分离进入子细胞。因此，通过使用选择标记确认质粒DNA在转化事件中是否进入细胞需要复制型质粒的使用或将质粒重组至染色体中的能力。这些资格并不能总是得到满足，尤其当操作不具有一套遗传工具的生物时。
一个避免关于质粒相关标记的问题的方法是通过使用转座子。转座子可移动的DNA元件，其由被称为转座酶的酶促机器识别的镶嵌式DNA（mosaic DNA）序列界定。转座酶的功能是将转座子DNA随机插入宿主或靶DNA。可通过标准遗传工程将选择标记物克隆进入转座子。可在体外反应中将所得的DNA片段偶联至转座酶机器，随后可通过电穿孔将复合物引入靶细胞。标记物至染色体上的稳定插入仅需要转座酶机器的功能，从而减轻了对同源重组或复制型质粒的需要。
与转座子的整合相关的随机性质具有以诱变的形式发挥作用的额外有利方面。可建立包含转座子突变体的合并（amalgamation）的文库。这些文库可用于筛选或选择以产生具有期望的表型的突变体。例如，可筛选CBP生物的转座子文库的产生更多乙醇或更少乳酸和/或更多醋酸的能力。
天然纤维素分解策略
天然存在的纤维素分解微生物是用于通过天然策略进行CBP生物开发的起始点。厌氧菌和兼性厌氧菌是特别有益的。主要目的是工程化生物质至溶剂包括但不限于丙酮、异丙醇、乙酸乙酯或乙醇的代谢。与例如乙醇产生相关的混合酸发酵的代谢工程化在嗜温、非纤维素分解性肠细菌的情况下已获得成功。适当的基因转移技术的最近发展允许该类型的工作利用纤维素分解细菌来进行。
重组纤维素分解策略
具有期望的产物形成性质的非纤维素分解微生物是用于通过重组纤维素分解策略进行CBP生物开发的起始点。此开发的主要目的是工程化异源纤维素酶系统，使得能够在预处理的木质纤维素上生长和发酵。纤维素酶的异源产生主要利用以高产率产生乙醇的细菌宿主（大肠杆菌、奥克西托克雷白杆菌（Klebsiella oxytoca）和运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis））和酿酒酵母来进行。纤维素酶在奥克西托克雷白杆菌的菌株中的表达导致增加的水解产率–但在无添加的纤维素酶的情况不生长-对于微晶纤维素，和在无定形纤维素上的厌氧生长。虽然有十几种糖解酶已在酿酒酵母中功能性表达，但作为这样的表达的结果在纤维素上的厌氧生长从未被明确地证明。
本发明的方面涉及嗜热或嗜温微生物用作宿主来通过天然纤维素分解策略进行修饰的用途。它们在生物技术的加工应用中的潜能源自它们在相对高的温度以伴随的高代谢速率生长的能力、物理和化学上稳定的酶的产生以及升高的终产物产率。嗜热细菌的主要组包括真细菌和古细菌。嗜热真细菌包括：向光细菌（phototropic bacteria），例如蓝藻菌、紫细菌和绿细菌；革兰阳性细菌，例如芽孢杆菌属（Bacillus）、梭菌属（Clostridium）、乳酸菌和放线菌属（Actinomyces）；和其它真细菌属，例如硫杆菌属、螺旋体属、脱硫肠状菌属（Desulfotomaculum）、革兰阴性需氧菌、革兰阴性厌氧菌和栖热袍菌属（Thermotoga）。产甲烷菌（Methanogens）、极端嗜热(本领域承认的术语)和热原体（Thermoplasma）被认为在古细菌内。在某些实施方案中，本发明涉及栖热菌属的革兰阴性器官营养嗜热菌、革兰阳性真细菌属，例如梭菌属（Clostridium），并且其还包括杆菌和球菌属，真细菌属的组中的属，例如热袍菌属（Thermosipho）和栖热孢菌属（Thermotoga），古细菌的组，例如热球菌属(Thermococcus)、热变形菌属(Thermoproteus)(杆状的)、热丝菌属(Thermofilum)(杆状的)、热网菌属(Pyrodictium)、酸菌属(Acidianus)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、热棒菌属(Pyrobaculum)、焦球菌属(Pyrococcus)、热盘菌属(Thermodiscus)、葡萄嗜热菌属(Staphylothermus)、脱硫球菌属(Desulfurococcus)、古球菌属(Archaeoglobus)和甲烷火菌属(Methanopyrus)。可适合于本发明的嗜热或嗜温菌（包括细菌、原核生物和真菌）的一些实例包括但不限于：热硫梭菌(Clostridiumthermosulfurogenes)、解纤维素梭菌、热纤梭菌、热硫化氢梭菌(Clostridium thermohydrosulfuricum)、乙酸菌热醋酸梭状芽胞杆菌(Clostridium thermoaceticum)、热解糖梭菌(Clostridiumthermosaccharolyticum)、酒石酸梭菌(Clostridium tartarivorum)、Clostridium thermocellulaseum、Clostridium phytofermentans、热葡糖苷酶地牙抱杆菌、Thermoanaerobacterium thermosaccarolyticum、解糖热厌氧杆菌、乙酸乙基嗜热拟杆菌(Thermobacteroidesacetoethylicus)、布氏嗜热厌氧细菌、产甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、Anaerocellum thermophilium、隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum)、Thermoproteus neutrophilus、Thermofilumlibrum、Thermothrix thioparus、Desulfovibrio thermophilus、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、Hydrogenomonas thermophilus、野生型嗜热菌(Thermomicrobium roseum)、黄色栖热菌(Thermus flavas)、红色栖热菌（Thermus ruber）、强烈火球菌（Pyrococcus furiosus）、水生栖热菌（Thermus aquaticus）、嗜热栖热菌（Thermusthermophilus）、嗜热光合绿曲菌（Chloroflexus aurantiacus）、海滨嗜热球菌（Thermococcus litoralis）、Pyrodictium abyssi、脂肪嗜热芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）、温泉红藻（Cyanidiumcaldarium）、嗜热蓝藻层理鞭枝藻（Mastigocladus laminosus）、Chlamydothrix calidissima、Chlamydothrix penicillata、Thiothrixcarnea、微细席藻（Phormidium tenuissimum）、Phormidiumgeysericola、Phormidium subterraneum、Phormidium bijahensi、Oscillatoria filiformis、铅色聚球藻（Synechococcus lividus）、嗜热光合绿曲菌、布氏热网菌(Pyrodictium brockii)、硫氧化硫杆菌(Thiobacillus thiooxidans)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius)、嗜热硫杆菌(Thiobacillus thermophilica)、脂肪嗜热芽孢杆菌、Cercosulcifer hamathensis、Vahlkampfia reichi、瓜形膜袋虫（Cyclidium citrullus）、奔马指霉（Dactylaria gallopava）、灰蓝聚球藻（Synechococcus lividus）、细长聚球藻（Synechococcus elongatus）、Synechococcus minervae、Synechocystis aquatilus、温泉隐球藻（Aphanocapsa thermalis）、钻头颤藻（Oscillatoria terebriformis）、两栖颤藻（Oscillatoria amphibia）、Oscillatoria germinata、Oscillatoriaokenii、Phormidium laminosum、Phormidium parparasiens、墙生束藻（Symploca thermalis）、Bacillus acidocaldarias、凝结芽孢杆菌、Bacillus thermocatenalatus、地衣芽胞杆菌、短小芽孢杆菌（Bacilluspamilas）、浸麻芽孢杆菌（Bacillus macerans）、环状芽胞杆菌（Bacilluscirculans）、孢芽胞杆菌（Bacillus laterosporus）、短芽孢杆菌（Bacillusbrevis）、枯草芽孢杆菌、球形杆菌（Bacillus sphaericus）、致黑脱硫肠状菌（Desulfotomaculum nigrificans）、嗜热链球菌、嗜热乳杆菌（Lactobacillus thermophilus）、保加利亚乳杆菌、嗜热双歧杆菌、Streptomyces fragmentosporus、嗜热硝基链霉菌、Streptomycesthermovulgaris、嗜热假诺卡氏菌（Pseudonocardia thermophila）、普通嗜热放线菌（Thermoactinomyces vulgaris）、甘蔗高温放线菌（Thermoactinomyces sacchari）、Thermoactinomyces candidas、弯曲高温单孢菌（Thermomonospora curvata）、绿色热单孢菌（Thermomonospora viridis）、柠檬高温单孢菌（Thermomonosporacitrina）、Microbispora thermodiastatica、Microbispora aerata、Microbispora bispora、二叉双歧放线菌（Actinobifida dichotomica）、产色双歧放线菌（Actinobifida chromogena）、青灰小多孢菌（Micropolyspora caesia）、干草恩小多孢菌（Micropolyspora faeni）、Micropolyspora cectivugida、Micropolyspora cabrobrunea、热绿小多孢菌（Micropolyspora thermovirida）、绿黑小多孢菌（Micropolysporaviridinigra）、Methanobacterium thermoautothropicum、产乙酸热角军纤维素菌(Caldicellulosiruptor acetigenus)、Caldicellulosiruptorsaccharolyticus、热解纤维素果汁杆菌、Caldicellulosiruptorowensensis、Caldicellulosiruptor lactoaceticus、其变体和/或其后代。
在具体实施方案中，本发明涉及选自解纤维素梭菌、热纤梭菌和解糖热厌氧杆菌的嗜热细菌。
在某些实施方案中，本发明涉及选自Fervidobacteriumgondwanense、Clostridium thermolacticum、Moorella sp.和Rhodothermus marinus的嗜热细菌。
在某些实施方案中，本发明涉及热厌氧杆菌属（Thermoanaerobacterium）或高温厌氧杆菌属（Thermoanaerobacter）的嗜热细菌，包括但不限于选自：热产硫磺梭菌（Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes）、嗜热厌氧杆菌、嗜热厌氧解多糖杆菌、玉米热厌氧杆菌、木聚糖热厌氧杆菌、解糖热厌氧杆菌、布氏嗜热厌氧细菌、热解糖热厌氧杆菌、热硫化氢高温厌氧杆菌、嗜热厌氧乙醇菌和氏热厌氧杆菌的种，其变体及其后代。
在某些实施方案中，本发明涉及土芽孢杆菌属（Geobacillus）、糖球菌属（Saccharococcus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）和厌氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus）的微生物，包括但不限于选自：热葡糖苷酶芽胞杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、Saccharococcus caldoxylosilyticus、喜温链球菌、坎皮纳斯类芽孢杆菌、Bacillus flavothermus,Anoxybacillus kamchatkensis,Anoxybacillusgonensis的种，其变体及其后代。
在某些实施方案中，本发明涉及选自如下的嗜温细菌：多糖降解菌；约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)；产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)；亨氏梭菌（Clostridium hungatei）；Clostridium phytofermentans；解纤维素梭菌；阿氏梭状杆菌(Clostridium aldrichii)；白蚁梭菌（Clostridium termitididis）；解纤维醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)；产乙醇醋弧菌（Acetivibrioethanolgignens）；多食醋弧菌(Acetivibrio multivorans)；溶纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)；和Alkalibacter saccharofomentans,其变体和其后代。
通过天然纤维素分解策略的生物开发
用于CBP的生物开发的一个方法始于天然利用纤维素、半纤维素和/或其它生物质组分的生物，随后对所述生物进行遗传工程化以增强成品收率和耐受性。例如，热纤梭菌是属于具有报导的最高纤维素利用率之列的嗜热细菌。其它目的生物是利用木糖的嗜热菌例如解糖热厌氧杆菌和热解糖热厌氧杆菌。有机酸的产生可负责通常与这些生物相关的低浓度的产生的乙醇。因此，一个目的是通过代谢工程消除这些生物的醋酸和乳酸的产生。许多努力已付诸于开发用于上述靶生物的基因转移系统，并且多个来自天然的热纤梭菌分离株已被表征。参见McLaughlin等人(2002)Environ.Sci.Technol.36:2122。嗜热糖解细菌的代谢工程化是吸引人的活跃领域，最近已报导解糖梭菌的乳酸脱氢酶的敲除。参见Desai等人(2004)Appl.Microbiol.Biotechnol.65:600。在该生物中敲除乙酸激酶和磷酸乙酸转移酶也是可能的。
通过重组纤维素分解策略的生物开发
用于CBP的生物开发的替代方法包括通过表达异源纤维素酶系统和可能地其它特征来赋予微生物在木质纤维素材料上生长的能力，所述微生物天然地具有高成品产率和耐受性。例如，酿酒酵母已被工程化来表达超过二十几种不同的糖解酶。参见Lynd等人(2002)Microbiol.Mol.Biol.Rev.66:506。
然而在文献中，纤维质水解主要是在酶促定向的知识范畴的背景中进行，CBP加工策略需要根据微生物范畴来考虑纤维质水解。该微生物范畴天然地导致对不同基本问题、生物、纤维质系统的强调，并且相较于酶促范畴设立了里程碑。在本说明书中，热纤梭菌因其在纤维素上的高生长速率与其用于CBP的潜在效用而成为模型生物。
在某些实施方案中，用于本发明的生物可适用于称为同步糖化和发酵(SSF)的方法，所述方法意欲包括将所述微生物和/或一种或多种重组宿主（或其提取物，包括纯化的或未纯化的提取物）用于复合糖(即，纤维质生物质)的同时降解或解聚和该糖残基通过发酵至乙醇的生物转化。
乙醇产生
根据本发明，重组微生物可用于从生物质产生乙醇，所述生物质在本文中称为木质纤维素材料、木质纤维素底物或纤维质生物质。产生乙醇的方法可以例如通过将生物质与本文中描述的和共同拥有的美国专利申请公布号2011/0189744A1、美国专利申请公布号2011/0312054A1、美国专利申请公布号2012/0003701、国际申请公布号PCT/US2009/065571、国际申请公布号PCT/US2009/069443、国际申请公布号PCT/US2009/064128、国际申请公布号PCT/IB2009/005881和PCT/US2009/065571（将其每一个的内容通过引用并入本文）中描述的重组微生物接触来实现。
可按照本发明使用许多纤维质底物。用于纤维素活性测定的底物基于它们在水中的溶解性可分成两类：可溶性和不溶性的。可溶性底物包括纤维糊精或衍生物、羧甲基纤维素(CMC)或羟乙基纤维素(HEC)。不溶性底物包括晶体纤维素、微晶纤维素(Avicel)、无定形纤维素，例如磷酸膨胀纤维素(PASC)、染色的或荧光纤维素以及预处理的木质纤维素生物质。这些底物通常是高度有序的纤维质材料，从而仅是略溶性的。
应理解，适当的木质纤维素材料可以是包含可溶性和/或不溶性纤维素的任何原料，其中不溶性纤维素可以以晶体或非晶体形式存在。在不同的实施方案中，木质纤维素生物质包括例如木材、玉米、玉米秸杆、锯屑、树皮、叶、农业和林业残渣、草例如柳枝稷、反刍动物消化产物、市政废弃物、造纸厂废水、报纸、纸板或其组合。
在一些实施方案中，本发明涉及用于通过将纤维质底物与本发明的重组微生物接触来水解纤维质底物例如上述纤维质底物的方法。在一些实施方案中，本发明涉及用于通过将纤维质底物与包含表达异源纤维素酶的酵母细胞的共培养物接触来水解纤维质底物，例如上述纤维质底物的方法。
在一些实施方案中，本发明涉及用于发酵纤维素的方法。此类方法可以例如通过在包含不溶性纤维素的培养基中培养宿主细胞或共培养物以允许进行纤维素的糖化和发酵来实现。
根据本发明，乙醇的产生可在至少约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃或约50℃的温度进行。在本发明的一些实施方案中，耐热宿主细胞可在高于约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、或约43℃、或约44℃、或约45℃、或约50℃的温度从纤维素产生乙醇。在本发明的一些实施方案中，耐热宿主细胞可在约30℃至60℃、约30℃至55℃、约30℃至50℃、约40℃至60℃、约40℃至55℃或约40℃至50℃的温度从纤维素产生乙醇。
在一些实施方案中，产生乙醇的方法可包括将纤维质底物与重组微生物或本发明的共培养物接触，以及另外地将纤维质底物与外部产生的纤维素酶接触。示例性外部产生的纤维素酶是商购可得的并且对于本领域技术人员来说是已知的。
在一些实施方案中，方法包括以特定的速率产生乙醇。例如，在一些实施方案中，乙醇以至少约0.1mg/小时/升、至少约0.25mg/小时/升、至少约0.5mg/小时/升、至少约0.75mg/小时/升、至少约1.0mg/小时/升、至少约2.0mg/小时/升、至少约5.0mg/小时/升、至少约10mg/小时/升、至少约15mg/小时/升、至少约20.0mg/小时/升、至少约25mg/小时/升、至少约30mg/小时/升、至少约50mg/小时/升、至少约100mg/小时/升、至少约200mg/小时/升、至少约300mg/小时/升、至少约400mg/小时/升或至少约500mg/小时/升的速率产生。
在一些实施方案中，本发明的宿主细胞可以以超过在相同条件下生长的对照菌株（例如，野生型菌株）至少约0.1mg/小时/升、至少约0.25mg/小时/升、至少约0.5mg/小时/升、至少约0.75mg/小时/升、至少约1.0mg/小时/升、至少约2.0mg/小时/升、至少约5.0mg/小时/升、至少约10mg/小时/升、至少约15mg/小时/升、至少约20.0mg/小时/升、至少约25mg/小时/升、至少约30mg/小时/升、至少约50mg/小时/升、至少约100mg/小时/升、至少约200mg/小时/升、至少约300mg/小时/升、至少约400mg/小时/升或至少约500mg/小时/升的速率产生乙醇。在一些实施方案中，可在任何外部添加的纤维素酶不存在的情况下产生乙醇。
可使用本领域已知的任何方法测量乙醇产量。例如，可使用HPLC分析评估发酵样品中的乙醇的量。许多乙醇测定试剂盒可商购获得，所述试剂盒使用例如基于醇氧化酶的测定。根据本文中的教导，测定乙醇产量的方法在本领域技术人员的能力范围内。美国能源部(DOE)提供了用于计算理论乙醇产率的方法。因此，如果已知C6糖（即，葡聚糖、半乳聚糖、甘露聚糖）的重量百分比，则可通过应用如下换算因子来测定每干吨总的C6聚合物以加仑表示的乙醇的理论产率：
(1.11磅的C6糖/磅的聚合物糖)x(0.51磅的乙醇/磅的糖)x(2000磅的乙醇/吨的C6聚合物糖)x(1加仑的乙醇/6.55磅的乙醇)x(1/100%)，其中将因子(1加仑的乙醇/6.55磅的乙醇)作为乙醇在20℃的比重。
并且如果已知C5糖（即，木聚糖、阿拉伯聚糖）的重量百分比，则可通过应用如下换算因子来测定每干吨总的C5聚合物以加仑表示的乙醇的理论产率：
(1.136磅的C5糖/磅的C5多聚体糖)x(0.51磅的乙醇/磅的糖)x(2000磅的乙醇/吨的C5聚合物糖)x(1加仑的乙醇/6.55磅的乙醇)x(1/100%)，其中将因子(1加仑的乙醇/6.55磅的乙醇)作为乙醇在20℃的比重。
由此得出，通过将每干吨总的C6聚合物以加仑表示的乙醇的理论产率加上每干吨总的C5聚合物以加仑表示的乙醇的理论产率，给出了每干吨原料以加仑表示的乙醇的总理论产率。
通过应用该分析，DOE提供了每干吨原料以加仑表示的乙醇的理论产率的下列实例：玉米粒，124.4；玉米秸杆，113.0；稻草，109.9；轧棉废料，56.8；森林抚育间伐，81.5；硬木锯屑，100.8；蔗渣，111.5；和混合纸，116.2。重要地要指出，这些是理论产率。DOE警告取决于原料的性质和使用的方法，实际产率可在理论产率的60%至90%之间变化，并且还声明"然而，实现高产率可能花费很高，因此更低的产率加工通常可更具成本效益。"(同前)。
实施例
现一般性地描述本发明，通过参考下列实施例可更容易地理解本发明，所述实施例仅用于举例说明本发明的某些方面和实施方案的目的，并且无意限定本发明。
实施例1
通过交替电子受体的工程化改善乙醇产率
本实施例描述了通过工程化酵母细胞的交替电子受体来减少或消除甘油的途径。甘油是在酵母的厌氧生长过程中的糖代谢的不期望的副产品。在葡萄糖上厌氧生长过程中产生的甘油的量已由Medina,VG,等人,Appl.Env.Microbiol.76：190-95(2010)经验地测定：
56mmol葡萄糖→1g生物质+88mmol乙醇+95mmol CO2+11mmol甘油+1.7mmol乙酸
假定甘油的产生主要为了再生NAD+以继续进行糖酵解，则用于甘油产生的半反应是(Medina,VG,等人,Appl.Env.Microbiol.76：190-95(2010))：
0.5葡萄糖+NADH+H++ATP→甘油+NAD++ADP+Pi
下列途径描述了工程化上述半反应中的甘油的交替电子受体，工程化在葡萄糖上厌氧生长过程中乙醇产率的增加（通过使用改善的将葡萄糖转化成乙醇的酶活性和/或删除内源产生甘油或调节甘油的基因）。
1.1酵母的甲酸途径的工程化
从葡萄糖产生甲酸可提供与甘油相似的还原当量，如在下面半反应中显示的：
0.5葡萄糖+NADH+H++ADP+Pi→甲酸+NAD++ATP+乙醇
除了平衡细胞的氧化还原限制外，该途径还提供增加的ATP产率并且导致如下的总体厌氧生长公式：
56mmol葡萄糖→1g生物质+99mmol乙醇+95mmol CO2+11mmol甲酸+1.7mmol乙酸
作为至甘油的交替电子受体的甲酸途径中的工程化导致12.5%的乙醇理论产率的增加。可被靶向以工程化这样的增加的酶包括丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)和甲酸脱氢酶(FDH)。参见图1。
1.1.1PFL的表达
通过PFL进行丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化。因此，为了在酵母中产生甲酸，可表达PFL。PFL在来自多种来源的细菌中是常见的。强劲产氢细菌（例如来自梭菌属、热厌氧杆菌属）或其它厌氧细菌可能导致增加的生产率。PFL的实例包括但不限于地衣芽胞杆菌、嗜热链球菌、胚芽乳杆菌、干酪乳杆菌、青春双岐杆菌、解纤维素梭菌、大肠杆菌、莱茵衣藻PflA、单鞭毛菌属E2或新丽鞭毛菌。参见下面的实施例4和表1。
1.1.2FDH的缺失
为了防止酵母将甲酸转化成CO2和NADH，可缺失或下调内源FDH基因。缺失或下调fdh1、fdh2或这两个基因可增强本发明的重组微生物的氧化还原平衡和乙醇产率。
1.2改善乙酰-CoA至乙醇的转化
为了改善乙酰-CoA至乙醇的转化，可用改善的醛脱氢酶(例如，来自C.phytofermentans或其它来源)替代或补充内源酵母基因来将乙酰-CoA转化成乙醛，或用双功能乙醛/醇脱氢酶(AADH)将乙酰-CoA转化成乙醛以及将乙醛转化成乙醇。通过一个或多个这样的酶的工程化，可增加乙酰-CoA至乙醇的转化的体内动力学，从而提供宿主菌株的改善的生长。双功能醇/醛脱氢酶可来自多种微生物来源，包括但不限于大肠杆菌、醋酪酸梭状芽孢杆菌（C.acetobutylicum）、T.saccharolyticum、热纤梭菌、C.phytofermentans、Piromyces SP E2或青春双岐杆菌。
1.3甘油途径的缺失或下调
缺失或改变甘油形成基因的表达将减少或阻断甘油的内源产生并且可增强乙酸摄取。gpd1、gpd2或这两个基因的缺失和/或gpp1、gpp2或这两个基因的缺失可用于消除甘油形成和增加乙醇产率。然而，甘油的完全消除可能不适用于工业目的。参见Guo,ZP.,等人,Metab.Eng.13：49-59(2011)。因此，不是完全除去这些甘油形成基因的任一个、全部或一些，而是可改变或下调这些基因中的一个或多个来减少甘油形成和增加乙醇产率。
实施例2
缺失或下调甘油调节性基因FPS1以改善乙醇产率
不是通过缺失或改变甘油形成基因来下调甘油产生或除了通过缺失或改变甘油形成基因来下调甘油产生以外，可通过缺失或改变甘油调节基因来下调甘油产生。FPS1是负责甘油的流出的水甘油通道蛋白。fps1Δ菌株具有减少的甘油形成，但仍然具有完全功能性的NAD+-依赖性甘油合成途径。除了删除FPS1以外，可表达来自其它生物的FPS1或其同源物的组合成型活性突变体来改变甘油产生。因为这样的FPS1缺失或改变菌株仍然可合成和保留甘油，相对于不能产生甘油的菌株可观察到改善的鲁棒性。
fps1Δ菌株的无效突变体因细胞内甘油积累而在缺氧条件下比野生型生长慢得多。Tamás,M.J.,等人,Molecular Microbiol.31(4)：1087-1104(1999)。然而，初步数据表明与青春双岐杆菌PFL结合的青春双岐杆菌双功能AADH在fps1Δ菌株中的表达可使得fps1Δ菌株能够厌氧生长(参见实施例7和图22和24)。此外，当在包含ADH和PFL的甘油突变型菌株中单独地删除FPS1时，还观察到显著改善的渗透耐受性。增加的对渗透胁迫的抗性通过fps1Δ突变体在几种不同的高克分子渗透压重量浓度培养基（包含1M氯化钠、1M山梨醇和1M木糖醇）中的改善的生长的观察来测定。通过标记物回收(从而导致FPS1编码序列的大区域的缺失(下文中的天然和缺失的序列))产生fps1Δ突变体。
FPS1基因座的序列(编码序列加以下划线；SEQ ID NO：104)：
aacgcggctgatgcttttatttaggaaggaatacttacattatcatgagaacattgtcaagggcattctgatacgggccttccatcgcaagaaaaaggcagcaacggactgagggacggagagagttacggcataagaagtagtaggagagcagagtgtcataaagttatattattctcgtcctaaagtcaattagttctgttgcgcttgacaatatatgtcgtgtaataccgtcccttagcagaagaaagaaagacggatccatatatgttaaaatgcttcagagatgtttctttaatgtgccgtccaacaaaggtatcttctgtagcttcctctattttcgatcagatctcatagtgagaaggcgcaattcagtagttaaaagcggggaacagtgtgaatccggagacggcaagattgcccggccctttttgcggaaaagataaaacaagatatattgcactttttccaccaagaaaaacaggaagtggattaaaaaatcaacaaagtataacgcctattgtcccaataagcgtcggttgttcttctttattattttaccaagtacgctcgagggtacattctaatgcattaaaagacatgagtaatcctcaaaaagctctaaacgactttctgtccagtgaatctgttcatacacatgatagttct aggaaacaatctaataagcagtcatccgacgaaggacgctcttcatcacaaccttcacatcatcac tctggtggtactaacaacaataataacaataataataataataataacagtaacaacaacaacaac ggcaacgatgggggaaatgatgacgactatgattatgaaatgcaagattatagaccttctccgcaa agtgcgcggcctactcccacgtatgttccacaatattctgtagaaagtgggactgctttcccgattca agaggttattcctagcgcatacattaacacacaagatataaaccataaagataacggtccgccgag tgcaagcagtaatagagcattcaggcctagagggcagaccacagtgtcggccaacgtgcttaaca ttgaagatttttacaaaaatgcagacgatgcgcataccatcccggagtcacatttatcgagaagga gaagtaggtcgagggctacgagtaatgctgggcacagtgccaatacaggcgccacgaatggcag gactactggtgcccaaactaatatggaaagcaatgaatcaccacgtaacgtccccattatggtgaa gccaaagacattataccagaaccctcaaacacctacagtcttgccctccacataccatccaattaat aaatggtcttccgtcaaaaacacttatttgaaggaatttttagccgagtttatgggaacaatggttat gattattttcggtagtgctgttgtttgtcaggtcaatgttgctgggaaaatacagcaggacaatttcaa cgtggctttggataaccttaacgttaccgggtcttctgcagaaacgatagacgctatgaagagttta acatccttggtttcatccgttgcgggcggtacctttgatgatgtggcattgggctgggctgctgccgtg gtgatgggctatttctgcgctggtggtagtgccatctcaggtgctcatttgaatccgtctattacatta gccaatttggtgtatagaggttttcccctgaagaaagttccttattactttgctggacaattgatcggt gccttcacaggcgctttgatcttgtttatttggtacaaaagggtgttacaagaggcatatagcgattg gtggatgaatgaaagtgttgcgggaatgttttgcgtttttccaaagccttatctaagttcaggacggc aatttttttccgaatttttatgtggagctatgttacaagcaggaacatttgcgctgaccgatccttatac gtgtttgtcctctgatgttttcccattgatgatgtttattttgattttcattatcaatgcttccatggcttat cagacaggtacagcaatgaatttggctcgtgatctgggcccacgtcttgcactatatgcagttggatt tgatcataaaatgctttgggtgcatcatcatcatttcttttgggttcccatggtaggcccatttattggt gcgttaatgggggggttggtttacgatgtctgtatttatcagggtcatgaatctccagtcaactggtct ttaccagtttataaggaaatgattatgagagcctggtttagaaggcctggttggaagaagagaaat agagcaagaagaacatcggacctgagtgacttctcatacaataacgatgatgatgaggaatttgg agaaagaatggctcttcaaaagacaaagaccaagtcatctatttcagacaacgaaaatgaagcag gagaaaagaaagtgcaatttaaatctgttcagcgcggcaaaagaacgtttggtggtataccaaca attcttgaagaagaagattccattgaaactgcttcgctaggtgcgacgacgactgattctattgggtt atccgacacatcatcagaagattcgcattatggtaatgctaagaaggtaacatgagaaaacagacaagaaaaagaaacaaataatatagactgatagaaaaaaatactgcttactaccgccggtataatatatatatatatatatatttacatagatgattgcatagtgttttaaaaagctttcctaggttaagctatgaatcttcataacctaaccaactaaatatgaaaatactgacccatcgtcttaagtaagttgacatgaactcagcctggtcacctactatacatgatgtatcgcatggatggaaagaataccaaacgctaccttccaggttaatgatagtatccaaacctagttggaatttgccttgaacatcaagcagcgattcgatatcagttgggagcatcaatttggtcattggaataccatctatgcttttctcctcccatattcgcaaaagtagtaagggctcgttatatacttttgaatatgtaagatataattctatatgatttagtaatttattttctatacgctcagtatttttctgcagttgtcgagtaggtattaaacgcaaaagaagtccatccttttcatcattcaaatggacatcttggcaaagggcccagttatggaaaatctgggagtcatacaacgattgcagttggctatgccactcctggtaaggaatcatcaagtctgataattctgttttttagccctttttttttttttttcatg
fps1Δ突变的序列(fps1编码序列的部分未被删除(加以下划线的)，并且被删除的区域以Δ表示；SEQ ID NO：105)：
aacgcggctgatgcttttatttaggaaggaatacttacattatcatgagaacattgtcaagggcattctgatacgggccttccatcgcaagaaaaaggcagcaacggactgagggacggagagagttacggcataagaagtagtaggagagcagagtgtcataaagttatattattctcgtcctaaagtcaattagttctgttgcgcttgacaatatatgtcgtgtaataccgtcccttagcagaagaaagaaagacggatccatatatgttaaaatgcttcagagatgtttctttaatgtgccgtccaacaaaggtatcttctgtagcttcctctattttcgatcagatctcatagtgagaaggcgcaattcagtagttaaaagcggggaacagtgtgaatccggagacggcaagattgcccggccctttttgcggaaaagataaaacaagatatattgcactttttccaccaagaaaaacaggaagtggattaaaaaatcaacaaagtataacgcctattgtcccaataagcgtcggttgttcttctttattattttaccaagtacgctcgagggtacattctaatgcattaaaagacΔgattcgcattatggtaatgctaagaaggtaacatgagaaaacagacaagaaaaagaaacaaataatatagactgatagaaaaaaatactgcttactaccgccggtataatatatatatatatatatatttacatagatgattgcatagtgttttaaaaagctttcctaggttaagctatgaatcttcataacctaaccaactaaatatgaaaatactgacccatcgtcttaagtaagttgacatgaactcagcctggtcacctactatacatgatgtatcgcatggatggaaagaataccaaacgctaccttccaggttaatgatagtatccaaacctagttggaatttgccttgaacatcaagcagcgattcgatatcagttgggagcatcaatttggtcattggaataccatctatgcttttctcctcccatattcgcaaaagtagtaagggctcgttatatacttttgaatatgtaagatataattctatatgatttagtaatttattttctatacgctcagtatttttctgcagttgtcgagtaggtattaaacgcaaaagaagtccatccttttcatcattcaaatggacatcttggcaaagggcccagttatggaaaatctgggagtcatacaacgattgcagttggctatgccactcctggtaaggaatcatcaagtctgataattctgttttttagccctttttttttttttttcatg
实施例3
产生具有缺失的或下调的甘油产生途径的酵母菌株
为了产生具有改变的甘油产生的酵母菌株，可通过产生下列遗传背景来删除或下调内源甘油产生或调节基因：
Figure BDA0000420902410000721
通过删除下列基因的一个或多个来产生甘油消除背景的菌株：gpd1、gpd2、fdh1、fdh2和/或fps1。已通过删除下列基因的一个或多个：gpd1、gpd2、fdh1、fdh2和/或fps1，和通过在gpd2启动子的控制下表达GPD1(命名为gpd2Δ::GPD1)来产生了甘油减少背景的菌株。这些其中从gpd2启动子表达GPD1的菌株产生了相对于野生型菌株更少量的甘油。
3.1甘油消除菌株gpd1Δgpd2Δfdh1Δfdh2Δ的产生
为了产生甘油消除菌株gpd1Δgpd2Δfdh1Δfdh2Δ，使用下列方法。通过对插入遗传元件使用正向选择和通过对除去遗传元件使用负选择来产生所有遗传修饰。参见图4-11。通过PCR扩增遗传元件，随后将其转化进入宿主菌株，随后选择和筛选期望的修饰。来自酿酒酵母的天然gpd1、gpd2、fdh1、fdh2和缺失后所得的基因座的序列列于下文中。
GPD1基因座的序列(编码序列加以下划线；SEQ ID NO：89)：
tacaaacgcaacacgaaagaacaaaaaaagaagaaaacagaaggccaagacagggtcaatgagactgttgtcctcctactgtccctatgtctctggccgatcacgcgccattgtccctcagaaacaaatcaaacacccacaccccgggcacccaaagtccccacccacaccaccaatacgtaaacggggcgccccctgcaggccctcctgcgcgcggcctcccgccttgcttctctccccttccttttctttttccagttttccctattttgtccctttttccgcacaacaagtatcagaatgggttcatcaaatctatccaacctaattcgcacgtagactggcttggtattggcagtttcgtagttatatatatactaccatgagtgaaactgttacgttaccttaaattctttctccctttaattttcttttatcttactctcctacataagacatcaagaaacaattgtatattgtacaccccccccctccacaaacacaaatattgataatataaagatgtctgctgctgctga tagattaaacttaacttccggccacttgaatgctggtagaaagagaagttcctcttctgtttctttgaa ggctgccgaaaagcctttcaaggttactgtgattggatctggtaactggggtactactattgccaag gtggttgccgaaaattgtaagggatacccagaagttttcgctccaatagtacaaatgtgggtgttcg aagaagagatcaatggtgaaaaattgactgaaatcataaatactagacatcaaaacgtgaaatac ttgcctggcatcactctacccgacaatttggttgctaatccagacttgattgattcagtcaaggatgtc gacatcatcgttttcaacattccacatcaatttttgccccgtatctgtagccaattgaaaggtcatgtt gattcacacgtcagagctatctcctgtctaaagggttttgaagttggtgctaaaggtgtccaattgct atcctcttacatcactgaggaactaggtattcaatgtggtgctctatctggtgctaacattgccaccg aagtcgctcaagaacactggtctgaaacaacagttgcttaccacattccaaaggatttcagaggcg agggcaaggacgtcgaccataaggttctaaaggccttgttccacagaccttacttccacgttagtgt catcgaagatgttgctggtatctccatctgtggtgctttgaagaacgttgttgccttaggttgtggtttc gtcgaaggtctaggctggggtaacaacgcttctgctgccatccaaagagtcggtttgggtgagatc atcagattcggtcaaatgtttttcccagaatctagagaagaaacatactaccaagagtctgctggtg ttgctgatttgatcaccacctgcgctggtggtagaaacgtcaaggttgctaggctaatggctacttct ggtaaggacgcctgggaatgtgaaaaggagttgttgaatggccaatccgctcaaggtttaattacc tgcaaagaagttcacgaatggttggaaacatgtggctctgtcgaagacttcccattatttgaagccg tataccaaatcgtttacaacaactacccaatgaagaacctgccggacatgattgaagaattagatct acatgaagattagatttattggagaaagataacatatcatactttcccccacttttttcgaggctcttctatatcatattcataaattagcattatgtcatttctcataactactttatcacgttagaaattacttattattattaaattaatacaaaatttagtaaccaaataaatataaataaatatgtatatttaaattttaaaaaaaaaatcctatagagcaaaaggattttccattataatattagctgtacacctcttccgcattttttgagggtggttacaacaccactcattcagaggctgtcggcacagttgcttctagcatctggcgtccgtatgtatgggtgtattttaaataataaacaaagtgccacaccttcaccaattatgtctttaagaaatggacaagttccaaagagcttgcccaaggctcgacaaggatgtactttggaatatctatattcaagtacgtggcgcgcatatgtttgagtgtgcacacaataaaggtt
gpd1Δ突变的序列(gpd1编码序列的部分未被删除(加以下划线的)和被删除的区域的序列用Δ表示；SEQ ID NO：90)：
tacaaacgcaacacgaaagaacaaaaaaagaagaaaacagaaggccaagacagggtcaatgagactgttgtcctcctactgtccctatgtctctggccgatcacgcgccattgtccctcagaaacaaatcaaacacccacaccccgggcacccaaagtccccacccacaccaccaatacgtaaacggggcgccccctgcaggccctcctgcgcgcggcctcccgccttgcttctctccccttccttttctttttccagttttccctattttgtccctttttccgcacaacaagtatcagaatgggttcatcaaatctatccaacctaattcgcacgtagactggcttggtattggcagtttcgtagttatatatatactaccatgagtgaaactgttacgttaccttaaattctttctccctttaattttcttttatcttactctcctacataagacatcaagaaacaattgtatattgtacaccccccccctccacaaacacaaatattgataatataaagatgtctgctgctgctga tagΔtctacatgaagattagatttattggagaaagataacatatcatactttcccccacttttttcgaggctcttctatatcatattcataaattagcattatgtcatttctcataactactttatcacgttagaaattacttattattattaaattaatacaaaatttagtaaccaaataaatataaataaatatgtatatttaaattttaaaaaaaaaatcctatagagcaaaaggattttccattataatattagctgtacacctcttccgcattttttgagggtggttacaacaccactcattcagaggctgtcggcacagttgcttctagcatctggcgtccgtatgtatgggtgtattttaaataataaacaaagtgccacaccttcaccaattatgtctttaagaaatggacaagttccaaagagcttgcccaaggctcgacaaggatgtactttggaatatctatattcaagtacgtggcgcgcatatgtttgagtgtgcacacaataaaggtt
GPD2基因座的序列(编码序列加以下划线；SEQ ID NO：91)：
atagccatcatgcaagcgtgtatcttctaagattcagtcatcatcattaccgagtttgttttccttcacatgatgaagaaggtttgagtatgctcgaaacaataagacgacgatggctctgccattgttatattacgcttttgcggcgaggtgccgatgggttgctgaggggaagagtgtttagcttacggacctattgccattgttattccgattaatctattgttcagcagctcttctctaccctgtcattctagtattttttttttttttttttggttttacttttttttcttcttgcctttttttcttgttactttttttctagttttttttccttccactaagctttttccttgatttatccttgggttcttctttctactcctttagattttttttttatatattaatttttaagtttatgtattttggtagattcaattctctttccctttccttttccttcgctccccttccttatcaatgcttgctgtcaga agattaacaagatacacattccttaagcgaacgcatccggtgttatatactcgtcgtgcatataaaa ttttgccttcaagatctactttcctaagaagatcattattacaaacacaactgcactcaaagatgact gctcatactaatatcaaacagcacaaacactgtcatgaggaccatcctatcagaagatcggactct gccgtgtcaattgtacatttgaaacgtgcgcccttcaaggttacagtgattggttctggtaactgggg gaccaccatcgccaaagtcattgcggaaaacacagaattgcattcccatatcttcgagccagaggt gagaatgtgggtttttgatgaaaagatcggcgacgaaaatctgacggatatcataaatacaagaca ccagaacgttaaatatctacccaatattgacctgccccataatctagtggccgatcctgatcttttac actccatcaagggtgctgacatccttgttttcaacatccctcatcaatttttaccaaacatagtcaaac aattgcaaggccacgtggcccctcatgtaagggccatctcgtgtctaaaagggttcgagttgggctc caagggtgtgcaattgctatcctcctatgttactgatgagttaggaatccaatgtggcgcactatctg gtgcaaacttggcaccggaagtggccaaggagcattggtccgaaaccaccgtggcttaccaacta ccaaaggattatcaaggtgatggcaaggatgtagatcataagattttgaaattgctgttccacagac cttacttccacgtcaatgtcatcgatgatgttgctggtatatccattgccggtgccttgaagaacgtcg tggcacttgcatgtggtttcgtagaaggtatgggatggggtaacaatgcctccgcagccattcaaag gctgggtttaggtgaaattatcaagttcggtagaatgtttttcccagaatccaaagtcgagacctact atcaagaatccgctggtgttgcagatctgatcaccacctgctcaggcggtagaaacgtcaaggttg ccacatacatggccaagaccggtaagtcagccttggaagcagaaaaggaattgcttaacggtcaa tccgcccaagggataatcacatgcagagaagttcacgagtggctacaaacatgtgagttgaccca agaattcccattattcgaggcagtctaccagatagtctacaacaacgtccgcatggaagacctacc ggagatgattgaagagctagacatcgatgacgaatagacactctccccccccctccccctctgatctttcctgttgcctctttttcccccaaccaatttatcattatacacaagttctacaactactactagtaacattactacagttattataattttctattctctttttctttaagaatctatcattaacgttaatttctatatatacataactaccattatacacgctattatcgtttacatatcacatcaccgttaatgaaagatacgacaccctgtacactaacacaattaaataatcgccataaccttttctgttatctatagcccttaaagctgtttcttcgagctttttcactgcagtaattctccacatgggcccagccactgagataagagcgctatgttagtcactactgacggctctccagtcatttatgtgattttttagtgactcatgtcgcatttggcccgtttttttccgctgtcgcaacctatttccattaacggtgccgtatggaagagtcatttaaaggcaggagagagagattactcatcttcattggatcagattgatgactgcgtacggcagat
gpd2Δ突变的序列(删除完整编码区，其以Δ表示；SEQ ID NO：92)：
atagccatcatgcaagcgtgtatcttctaagattcagtcatcatcattaccgagtttgttttccttcacatgatgaagaaggtttgagtatgctcgaaacaataagacgacgatggctctgccattgttatattacgcttttgcggcgaggtgccgatgggttgctgaggggaagagtgtttagcttacggacctattgccattgttattccgattaatctattgttcagcagctcttctctaccctgtcattctagtattttttttttttttttttggttttacttttttttcttcttgcctttttttcttgttactttttttctagttttttttccttccactaagctttttccttgatttatccttgggttcttctttctactcctttagattttttttttatatattaatttttaagtttatgtattttggtagattcaattctctttccctttccttttccttcgctccccttccttatcΔctctgatctttcctgttgcctctttttcccccaaccaatttatcattatacacaagttctacaactactactagtaacattactacagttattataattttctattctctttttctttaagaatctatcattaacgttaatttctatatatacataactaccattatacacgctattatcgtttacatatcacatcaccgttaatgaaagatacgacaccctgtacactaacacaattaaataatcgccataaccttttctgttatctatagcccttaaagctgtttcttcgagctttttcactgcagtaattctccacatgggcccagccactgagataagagcgctatgttagtcactactgacggctctccagtcatttatgtgattttttagtgactcatgtcgcatttggcccgtttttttccgctgtcgcaacctatttccattaacggtgccgtatggaagagtcatttaaaggcaggagagagagattactcatcttcattggatcagattgatgactgcgtacggcagat
FDH1基因座的序列(编码序列加以下划线；SEQ ID NO：93)：
tatttttctatagatatttacactccgcaagtgcaaaaaaaaagcattatcgctaacgatcaagaggaactgagaccttattagttgtctttgttggcgtaacataaatttcttaggaaaagagaaaattatctcgaaggcaaaaataaaccaagcctcgagtttaatggttttctaaaaaacactttaaaaacagatcgccataaaaggagaagctccgtaggagaccgttttcgaaacctatgtagaaataaagggaaagctccaacggtttggataaatctttagaagcatagagtttatacaacattcagtacgaaatgtactctcgaaacgttctcttttcacggtgcttagtagcagaaaaaagtgtcggaaattacctattttgtcaccactcgaggataggcttgaaagagagttttaaccccaacttttctattttgcacttgtttggctatggtttaaaacattctgtttggaccaacagcccaagcggcttatcccttttctttttttcccttataatcgggaatttccttactaggaaggcaccgatactagaactccgaatgaaaaagacatgccagtaataaaactattttgatgttatgcggaatatactattcttggattattcactgttaactaaaagttggagaaatcactctgcactgtcaatcattgaaaaaaagaacatataaaagggcacaaaattgagtcttttttaatgagttcttgctgaggaaagtttagttaatatatcatttacgtaaaatatgcatattcttgtattgtgctttttttattcattttaagcaggaacaatttacaagtattgcaacgctaatcaaatcaaaataacagctgaaaattaatat gtcgaagggaaaggttttgctggttctttacgaaggtggtaagcatgctgaagagcaggaaaagtt attggggtgtattgaaaatgaacttggtatcagaaatttcattgaagaacagggatacgagttggtt actaccattgacaaggaccctgagccaacctcaacggtagacagggagttgaaagacgctgaaat tgtcattactacgccctttttccccgcctacatctcgagaaacaggattgcagaagctcctaacctga agctctgtgtaaccgctggcgtcggttcagaccatgtcgatttagaagctgcaaatgaacggaaaa tcacggtcaccgaagttactggttctaacgtcgtttctgtcgcagagcacgttatggccacaattttg gttttgataagaaactataatggtggtcatcaacaagcaattaatggtgagtgggatattgccggcg tggctaaaaatgagtatgatctggaagacaaaataatttcaacggtaggtgccggtagaattggat atagggttctggaaagattggtcgcatttaatccgaagaagttactgtactacgactaccaggaact acctgcggaagcaatcaatagattgaacgaggccagcaagcttttcaatggcagaggtgatattgt tcagagagtagagaaattggaggatatggttgctcagtcagatgttgttaccatcaactgtccattg cacaaggactcaaggggtttattcaataaaaagcttatttcccacatgaaagatggtgcatacttgg tgaataccgctagaggtgctatttgtgtcgcagaagatgttgccgaggcagtcaagtctggtaaatt ggctggctatggtggtgatgtctgggataagcaaccagcaccaaaagaccatccctggaggactat ggacaataaggaccacgtgggaaacgcaatgactgttcatatcagtggcacatctctggatgctca aaagaggtacgctcagggagtaaagaacatcctaaatagttacttttccaaaaagtttgattaccgt ccacaggatattattgtgcagaatggttcttatgccaccagagcttatggacagaagaaataagagtgattatgagtatttgtgagcagaagttttccggtctccttttgttcttgttttggcgtattctccactattcgtccatagcacatttataccttagctaaatattttgtaaagcaaaattttcgttatctcttaaaaaatagaagagcggtttattaatatcaaataattgaaactgctgatatggtagctatatacaaaatctgctgtcaaaatttggcagtaaacgatcttcacggtagcggttcaaataaagaggaaaagtctttctcccttactgtttttctggaatttggctcgtcgttaataacagaactaaagatacagtaaaaggagagatcgcaatcaacttcattaattgtaacagtagcataatcacaactgatcatctacactataaacagtttttatttctaattatgggcgcctggccggctcaaacattgtgcttttaagactccaaaagtatctgctgcagaaaagagccatataatgttaagtgttcagggataggttatcgcttactacttcaaacgtttcgaaggaaagccagggaagcctatatctgattccctgtttcataatccaatgcagccactagcttataattatttgaactatttgtcgaacatcacagtaataaaatccccagaaagttccacttgctgcatattggcacctgttgattcactctccatcacttttttgttagccgcccagcctagaaagtctttaaatacatctgaaatttttttttttttaacagtgcacccgtgcatcatacctcatgcaaggtacctttttttctcaaaggtattgtcttccattgaagtggcactatggcatgatgaaccctgagcatttctgaattcaacagaaccaaattgtccagaaataaatctgtccgacatgaattatgaaactttttttcaattaagtgaagagaattttgcagcgtcttaccattattttgacccattggtcgcatgtttgcgctttgacttcgagaaccatgttaaagcttacttgtacgacaaccaatgaagtatattacggcagtttttttggactgggtcaaaaaaagtgttgcataatcaaatcaggaacacattaaaatgttgtaaaatttgtcttagtatcacctgagtggttattcattacgtacta
fdh1Δ突变的序列(删除完整编码区，其以Δ表示；SEQ ID NO：94)：
tatttttctatagatatttacactccgcaagtgcaaaaaaaaagcattatcgctaacgatcaagaggaactgagaccttattagttgtctttgttggcgtaacataaatttcttaggaaaagagaaaattatctcgaaggcaaaaataaaccaagcctcgagtttaatggttttctaaaaaacactttaaaaacagatcgccataaaaggagaagctccgtaggagaccgttttcgaaacctatgtagaaataaagggaaagctccaacggtttggataaatctttagaagcatagagtttatacaacattcagtacgaaatgtactctcgaaacgttctcttttcacggtgcttagtagcagaaaaaagtgtcggaaattacctattttgtcaccactcgaggataggcttgaaagagagttttaaccccaacttttctattttgcacttgtttggctatggtttaaaacattctgtttggaccaacagcccaagcggcttatcccttttctttttttcccttataatcgggaatttccttactaggaaggcaccgatactagaactccgaatgaaaaagacatgccagtaataaaactattttgatgttatgcggaatatactattcttggattattcactgttaactaaaagttggagaaatcactctgcactgtcaΔtggcagtaaacgatcttcacggtagcggttcaaataaagaggaaaagtctttctcccttactgtttttctggaatttggctcgtcgttaataacagaactaaagatacagtaaaaggagagatcgcaatcaacttcattaattgtaacagtagcataatcacaactgatcatctacactataaacagtttttatttctaattatgggcgcctggccggctcaaacattgtgcttttaagactccaaaagtatctgctgcagaaaagagccatataatgttaagtgttcagggataggttatcgcttactacttcaaacgtttcgaaggaaagccagggaagcctatatctgattccctgtttcataatccaatgcagccactagcttataattatttgaactatttgtcgaacatcacagtaataaaatccccagaaagttccacttgctgcatattggcacctgttgattcactctccatcacttttttgttagccgcccagcctagaaagtctttaaatacatctgaaatttttttttttttaacagtgcacccgtgcatcatacctcatgcaaggtacctttttttctcaaaggtattgtcttccattgaagtggcactatggcatgatgaaccctgagcatttctgaattcaacagaaccaaattgtccagaaataaatctgtccgacatgaattatgaaactttttttcaattaagtgaagagaattttgcagcgtcttaccattattttgacccattggtcgcatgtttgcgctttgacttcgagaaccatgttaaagcttacttgtacgacaaccaatgaagtatattacggcagtttttttggactgggtcaaaaaaagtgttgcataatcaaatcaggaacacattaaaatgttgtaaaatttgtcttagtatcacctgagtggttattcattacgtacta
FDH2基因座的序列(编码区加以下划线；SEQ ID NO：95)：
tgtcgagacaatgtcattgcaagttatataaacattgtaatacatcacctcgatgaaagagaaactggaatgatagatctctttttctcaaaatttcgttaatatgtaataataaggttcctgatgtaatttgtttttgtacaaattattttagattctggaggttcaaataaaatatatattacagccaacgattaggggggacaagacttgattacacatttttcgttggtaacttgactcttttatgaaaagaaaacattaagttgaaggtgcacgcttgaggcgctcctttttcatggtgcttagcagcagatgaaagtgtcagaagttacctattttgtcaccatttgagaataagcttgaaagaaagttgtaaccccaacttttctatcttgcacttgtttggaccaacagccaaacggcttatcccttttcttttcccttataatcgggaatttccttactaggaaggcaccgatactataactccgaatgaaaaagacatgccagtaataaaaataattgatgttatgcggaatatactattcttggattattcactgttaactaaaagttggagaaatcactctgcactgtcaatcattgaaaaaaagaacatataaaagggcacaaaatcgagtcttttttaatgagttcttgctgaggaaaatttagttaatatatcatttacataaaacatgcatattattgtgttgtactttctttattcattttaagcaggaataattacaagtattgcaacgctaatcaaatcgaaataacagctgaaaattaatatgtcgaagggaaag gttttgctggttctttatgaaggtggtaagcatgctgaagagcaggaaaagttattggggtgtattga aaatgaacttggtatcagaaatttcattgaagaacagggatacgagttggttactaccattgacaag gaccctgagccaacctcaacggtagacagggagttgaaagacgctgaaattgtcattactacgccc tttttccccgcctacatctcgagaaacaggattgcagaagctcctaacctgaagctctgtgtaaccgc tggcgtcggttcagaccatgtcgatttagaagctgcaaatgaacggaaaatcacggtcaccgaagt tactggttctaacgtcgtttctgtcgcagagcacgttatggccacaattttggttttgataagaaacta taatggtggtcatcaataagcaattaatggtgagtgggatattgccggcgtggctaaaaaatgagt atgatctggaagacaaaataatttcaacggtaggtgccggtagaattggatatagggttctggaaa gattggtcgcatttaatccgaagaagttactgtactacgactaccaggaactacctgcggaagcaat caatagattgaacgaggccagcaagcttttcaatggcagaggtgatattgttcagagagtagagaa attggaggatatggttgctcagtcagatgttgttaccatcaactgtccattgcacaaggactcaagg ggtttattcaataaaaagcttatttcccacatgaaagatggtgcatacttggtgaataccgctagag gtgctatttgtgtcgcagaagatgttgccgaggcagtcaagtctggtaaattggctggctatggtggt gatgtctgggataagcaaccagcaccaaaagaccatccctggaggactatggacaataaggacc acgtgggaaacgcaatgactgttcatatcagtggcacatctctgcatgctcaaaagaggtacgctc agggagtaaagaacatcctaaatagttacttttccaaaaagtttgattaccgtccacaggatattatt gtgcagaatggttcttatgccaccagagcttatggacagaagaaataagagtgattatgagtatttgtgagcagaagttttccggtctccttttgttcttgttttggcgtattctccactattcgtccatagcacatttataccttagctaaatattttgtaaagcaaaattttcgttatctcttaaaaaatagaagagcggtttattaatatcaaataattgaaactgctgatatggtagctatatacaaaatctgctgtcaaaatttggcagtaaacgatcttcacggtagcggttcaaataaagaggaaaagtccttctcccttactgtttttctggaatttggctcgtcgttaataacagaactaaagatacagtaaaaggagagatcgcaatcaacttcattaattgtaacagtagcataatcacaactggttatctgcgttatagacaattcttactcacaatgatgggcgcttagttggctgtaaacgtcgctttttaaaactccgaaaagttaccgctacagaaaaaaaccataaatgtatgctagttgcgcagagaggtttagggtccaaaatttactaccctgtcgctcactacagcgactgtcccgaattaagcccgaagagacgcagaactgttgtatgaacctcatgaaaccactgatcttgaagatttagaccttcagaatcgttttcaattagaagtatacaagaagtctttgtacaataatgtcaagacagagctctgaattatagttcagccttgttattttttttt
fdh2Δ突变的序列(删除完整编码区，其以Δ表示；SEQ ID NO：96)：
tgtcgagacaatgtcattgcaagttatataaacattgtaatacatcacctcgatgaaagagaaactggaatgatagatctctttttctcaaaatttcgttaatatgtaataataaggttcctgatgtaatttgtttttgtacaaattattttagattctggaggttcaaataaaatatatattacagccaacgattaggggggacaagacttgattacacatttttcgttggtaacttgactcttttatgaaaagaaaacattaagttgaaggtgcacgcttgaggcgctcctttttcatggtgcttagcagcagatgaaagtgtcagaagttacctattttgtcaccatttgagaataagcttgaaagaaagttgtaaccccaacttttctatcttgcacttgtttggaccaacagccaaacggcttatcccttttcttttcccttataatcgggaatttccttactaggaaggcaccgatactataactccgaatgaaaaagacatgccagtaataaaaataattgatgttatgcggaatatactattcttggattattcactgttaactaaaagttggagaaatcactctgcactgtcaatcattgaaaaaaagaacatataaaagggcacaaaatcgagtcttttttaatgagttcttgctgaggaaaatttagttaatatatcatttacataaaacatgcatattattgtgttgtactttctttattcattttaagcaggaataattacaagtattgcaacgctaatcaaatcgaaataacagctgaaaattaatΔtaagagtgattatgagtatttgtgagcagaagttttccggtctccttttgttcttgttttggcgtattctccactattcgtccatagcacatttataccttagctaaatattttgtaaagcaaaattttcgttatctcttaaaaaatagaagagcggtttattaatatcaaataattgaaactgctgatatggtagctatatacaaaatctgctgtcaaaatttggcagtaaacgatcttcacggtagcggttcaaataaagaggaaaagtccttctcccttactgtttttctggaatttggctcgtcgttaataacagaactaaagatacagtaaaaggagagatcgcaatcaacttcattaattgtaacagtagcataatcacaactggttatctgcgttatagacaattcttactcacaatgatgggcgcttagttggctgtaaacgtcgctttttaaaactccgaaaagttaccgctacagaaaaaaaccataaatgtatgctagttgcgcagagaggtttagggtccaaaatttactaccctgtcgctcactacagcgactgtcccgaattaagcccgaagagacgcagaactgttgtatgaacctcatgaaaccactgatcttgaagatttagaccttcagaatcgttttcaattagaagtatacaagaagtctttgtacaataatgtcaagacagagctctgaattatagttcagccttgttattttttttt
3.2包含gpd2Δ::GPD1的甘油减少菌株的产生
如上所述构建甘油减少菌株gpd2Δ::GPD1。gpd1Δ/gpd1Δgpd2Δ/gpd2Δ::GPD1/GPD1的序列提供于下文中。
GPD2基因座上的GPD1的序列(插入的GPD1加以下划线；SEQID NO：97)：
agtaactgtgacgatatcaactctttttttattatgtaataagcaaacaagcacgaatggggaaagcctatgtgcaatcaccaaggtcgtcccttttttcccatttgctaatttagaatttaaagaaaccaaaagaatgaagaaagaaaacaaatactagccctaaccctgacttcgtttctatgataataccctgctttaatgaacggtatgccctagggtatatctcactctgtacgttacaaactccggttattttatcggaacatccgagcacccgcgccttcctcaacccaggcaccgcccccaggtaaccgtgcgcgatgagctaatcctgagccatcacccaccccacccgttgatgacagcaattcgggagggcgaaaaataaaaactggagcaaggaattaccatcaccgtcaccatcaccatcatatcgccttagcctctagccatagccatcatgcaagcgtgtatcttctaagattcagtcatcatcattaccgagtttgttttccttcacatgatgaagaaggtttgagtatgctcgaaacaataagacgacgatggctctgccattgttatattacgcttttgcggcgaggtgccgatgggttgctgaggggaagagtgtttagcttacggacctattgccattgttattccgattaatctattgttcagcagctcttctctaccctgtcattctagtattttttttttttttttttggttttacttttttttcttcttgcctttttttcttgttactttttttctagttttttttccttccactaagctttttccttgatttatccttgggttcttctttctactcctttagattttttttttatatattaatttttaagtttatgtattttggtagattcaattctctttccctttccttttccttcgctccccttccttatcaatgtctgctgctgctgatagattaaacttaa cttccggccacttgaatgctggtagaaagagaagttcctcttctgtttctttgaaggctgccgaaaag cctttcaaggttactgtgattggatctggtaactggggtactactattgccaaggtggttgccgaaaa ttgtaagggatacccagaagttttcgctccaatagtacaaatgtgggtgttcgaagaagagatcaat ggtgaaaaattgactgaaatcataaatactagacatcaaaacgtgaaatacttgcctggcatcact ctacccgacaatttggttgctaatccagacttgattgattcagtcaaggatgtcgacatcatcgttttc aacattccacatcaatttttgccccgtatctgtagccaattgaaaggtcatgttgattcacacgtcag agctatctcctgtctaaagggttttgaagttggtgctaaaggtgtccaattgctatcctcttacatcac tgaggaactaggtattcaatgtggtgctctatctggtgctaacattgccaccgaagtcgctcaagaa cactggtctgaaacaacagttgcttaccacattccaaaggatttcagaggcgagggcaaggacgtc gaccataaggttctaaaggccttgttccacagaccttacttccacgttagtgtcatcgaagatgttgc tggtatctccatctgtggtgctttgaagaacgttgttgccttaggttgtggtttcgtcgaaggtctagg ctggggtaacaacgcttctgctgccatccaaagagtcggtttgggtgagatcatcagattcggtcaa atgtttttcccagaatctagagaagaaacatactaccaagagtctgctggtgttgctgatttgatcac cacctgcgctggtggtagaaacgtcaaggttgctaggctaatggctacttctggtaaggacgcctgg gaatgtgaaaaggagttgttgaatggccaatccgctcaaggtttaattacctgcaaagaagttcac gaatggttggaaacatgtggctctgtcgaagacttcccattatttgaagccgtataccaaatcgttta caacaactacccaatgaagaacctgccggacatgattgaagaattagatctacatgaagattagacactctccccccccctccccctctgatctttcctgttgcctctttttcccccaaccaatttatcattatacacaagttctacaactactactagtaacattactacagttattataattttctattctctttttctttaagaatctatcattaacgttaatttctatatatacataactaccattatacacgctattatcgtttacatatcacatcaccgttaatgaaagatacgacaccctgtacactaacacaattaaataatcgccataaccttttctgttatctatagcccttaaagctgtttcttcgagctttttcactgcagtaattctccacatgggcccagccactgagataagagcgctatgttagtcactactgacggctctccagtcatttatgtgattttttagtgactcatgtcgcatttggcccgtttttttccgctgtcgcaacctatttccattaacggtgccgtatggaagagtcatttaaaggcaggagagagagattactcatcttcattggatcagattgatgactgcgtacggcagatagtgtaatctgagcagttgcgagacccagactggcactgtctcaatagtatattaatgggcatacattcgtactcccttgttcttgcccacagttctctctctctttacttcttgtatcttgtctccccattgtgcagcgataaggaacattgttctaatatacacggatacaaaagaaatacacat
实施例4
PFL和AADH酶的克隆和表征
为了鉴定用于本发明的菌株的PFL酶，几种PFL酶被鉴定来用于克隆和功能分析。参见表1。通过fcyΔ::ADHE gpd1Δ::ADHEgpd2Δfdh1Δfdh2Δ(M2158)背景中每一个PFL的基于质粒的表达来测定功能性。图22显示在20%玉米糖化醪中的发酵性能。基于高于M2085的产率增加的存在或不存在，PFL被测定为是有功能的。基于图13中显示的数据，解纤维梭菌PFL被测定为无功能的。被列为M1992+pMU2481的菌株是M2085+表达解纤维梭菌PFL的质粒。该菌株似乎不产生甲酸。
表1.PFL酶的分析
Figure BDA0000420902410000841
如实施例7中显示的，测试的9个PFL酶中的8个可使得能够进行本文中描述的甘油消除和甘油减少技术。这些PFL酶中的6个的比对示于图12中。残基中的4个残基不存在于解纤维梭菌中，但在其它PFL酶中是保守的(在图12中以星号标示)。在青春双岐杆菌PFL的位置640上存在18个氨基酸的插入，所述插入不存在于其它PFL酶中。真核生物PFL(单鞭毛菌和衣藻属)具有据报导参与线粒体靶向的N末端延伸。该序列的缺失可在酿酒酵母中改善这些酶的性能。这些差异可提供鉴定用于本发明的菌株的其它PFL酶的洞察力。
为了鉴定用于本发明的菌株的AADH酶，几种AADH酶被鉴定来用于克隆和功能分析。参见表2。功能性可通过分析下面表3中所列的和图20中所示的数据来进行测定。如果包含基因型gpd1Δgpd2Δ+给定的AADH的菌株具有比菌株gpd1Δgpd2Δ更快的厌氧生长(图20)并且存在乙酸消耗的证据（表3），则AADH酶被测定为是有功能的。
表2.AADH酶的分析
生物 功能 SEQ ID NO：
大肠杆菌 有 84
Clostridium phytofermentans 有 82
莱茵衣藻 有 86
单鞭毛菌属E2 有 88
青春双岐杆菌 有 100
当将甘油缺失菌株厌氧生长时，它们不能生长或发酵并且在糖酵解过程中不能消耗糖。然而，如果这些甘油缺失菌株用AADH补充的话，则菌株能够在培养基中补充乙酸的情况下生长。图20显示亲代菌株、甘油缺失菌株和4个表达来自大肠杆菌(Eco)、Clostridiumphytofermentans(Cph)、莱茵衣藻(Chl)和单鞭毛菌属E2(Pir)的AADH的甘油缺失菌株的生长速率。如图20中显示的，所有4个基因可恢复高于甘油缺失菌株的生长水平（如通过点线显示的），表明存在功能性AADH。
由上述菌株以及其它菌株产生的产品收率和乙酸的转化示于表3中。甘油缺失菌株不能消耗糖或产生乙醇。亲代菌株产生甘油和乙醇但不能转化培养基中的乙酸（最初以～2g/L存在），从而产生0.41g/g葡萄糖的乙醇产率，与厌氧乙醇产率一致。然而，补充有AADH的甘油缺失菌株能够消耗葡萄糖和产生乙醇，但不产生甘油，或甘油产量相较于亲代菌株(Chl AADH)显著减少。参见表3。在这些甘油缺失突变体中，乙酸水平也减少，从而导致比通过亲代菌株获得的更高的乙醇产率(计算为产生的乙醇克数/克消耗的葡萄糖)。
表3.表达AADH的甘油缺失菌株的成品产率和醋酸转化
Figure BDA0000420902410000861
Figure BDA0000420902410000871
a克/升
b产生的乙醇克数/克消耗的糖
实施例5
PFL和AADH的表达和甲酸的检测
为了检查本发明的酵母菌株的甲酸的表达，将大肠杆菌PFL克隆在FDH缺失菌株中并且在其中表达。菌株M1992+pMU2483具有FDH1和FDH2的缺失和表达大肠杆菌PflA和PflB的质粒。该菌株通过用表达解纤维梭菌PFL(pMU2481)或大肠杆菌PFL(pMU2483)的质粒转化菌株M1992(fdh1Δfdh2Δ)来构建。
将菌株在用pH6.5的HEPES缓冲的YNB培养基中培养，按照制造商的说明书，使用来自Megazymes(目录号K-FORM)的甲酸检测试剂盒测量甲酸。如图13中显示的，在24小时和48小时的生长后，分别测量到约0.0125g/L和0.023g/L的甲酸。通过在酿酒酵母中过表达大肠杆菌PFL已获得相似的结果。Waks和Silver,Appl.Env.Microbiol.75：1867-75(2009)。
PFL也在表达AADH的菌株中共表达。参见图14。M2085是具有基因型gpd1Δgpd2Δfdh1Δfdh2Δ的背景菌株，并且M2032具有基因型gpd1Δgpd2Δ。这两种菌株即使在乙酸存在的情况下都不能厌氧生长。通过将多个拷贝的大肠杆菌AADH整合在M2085背景中的GPD1和FCY1基因座来产生M2158。整合方案示于图26和27中，M2158的对应核苷酸序列列于下面。一个拷贝的AADH由天然GPD1启动子驱动。参见图26。第二拷贝以相反方向取向，并且由果糖磷酸激酶启动子驱动。参见图26。关于AADH在FCY1中的整合，一个拷贝由ENO1启动子驱动，第二拷贝由PFK1启动子驱动。参见图27。M2182通过将表达青春双岐杆菌PFL的载体转化进入M2158背景来产生。
GPD1基因座上的M2158AADH整合的序列(核苷酸；SEQ IDNO：98)：
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GPD1基因座上的M2158AADH整合的序列(核苷酸；SEQ IDNO：99)：
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将这些菌株在缺氧和微氧条件下生长在含50g/L葡萄糖的YPD中，在142小时的时间段中测量甲酸。如图14中显示的，在142小时结束时，包含异源PFL和AADH的菌株产生比野生型菌株M139更多的甲酸。
实施例6
PFL和AADH的表达和乙醇的检测
本实施例的目的是确定甲酸的产生是否可赋予fdh、gpd和/或fps缺失菌株在厌氧生长。用表达来自解纤维梭菌(TB274)和大肠杆菌(TB275)的PflA/B盒的载体转化含有fdh1Δfdh2Δgpd1Δgpd2Δ遗传背景的酵母菌株(M2025)。这些菌株的每一个菌株还包含表达大肠杆菌AdhE的第二构建体。制备YPD培养基，将其添加至hungate管，用氮气吹扫氧，将管高压灭菌20分钟。在含有选择两种质粒的维持的抗生素的YPD培养基中制备TB274和TB275的预培养物，进行过夜。在YPD中制备M1901(M2025的亲代菌株)及M2025本身的预培养物，将其分别用作阳性和负对照。产生称为TB267的菌株，其仅包含双功能性ADH质粒。在YPD+选择质粒的抗生素中制备该菌株。该菌株控制ADH或可存在于YPD培养基中的其它电子受体的潜在作用。
将所有菌株接种至约0.05或更低的终OD。在第0、24、48和72小时测量每一个培养物的OD(图15)，制备样品，将其经历代谢物水平的HPLC测定。如所预期的，M1901菌株生长相当快，到24小时时消耗了所有糖底物。不能产生甘油的M2025和TB267菌株在该实验中未显示OD的显著增加。表达PFL和ADH的TB274和TB275菌株能够在24小时的延滞时间后生长。参见图15。这些数据表明TB274和TB275中引入的代谢途径不阻止细胞生长。
这些菌株中甘油的产量示于图16中。如所预期的M1901的厌氧生长伴随甘油的产生。在含PflA/B菌株TB274和TB275中观察到痕量的甘油，但这处于或低于不生长的负对照的水平。参见图16。这些数据，结合OD数据，表明PflA/B和AdhE的表达允许M2025的厌氧生长而无相关甘油产生。
乙醇的产量和葡萄糖浓度分别示于图17和18。M1901和TB274消耗全部糖，但约5g/L葡萄糖保留在TB275发酵中。参见图18。TB274相较于M1901具有11%的乙醇产率的增加。参见图17。产率的增加高于预期，并且可能部分地以消耗生物质来获得，尽管这未得到确定。
将含有PFL和AADH的菌株与其它工程化以表达AADH的菌株相比较。这些菌株的描述示于表4中。
表4.PFL表达的遗传背景
在氮气吹扫的瓶中测试这5个菌株。如图19中所示，在gdp1Δgpd2Δfdh1Δfdh2Δ背景中具有PFL和AADH表达盒的菌株M2182具有比仅包含双功能性ADH活性但根本不生长的菌株M2158更快的生长速率和达到更高的OD。参见图19。这些数据显示表达PFL和AADH活性的菌株比其它工程化功能性生长更好。高于这类其它工程化功能性的类似改善也在玉米糖化醪发酵中观察到(参见下面的实施例7)。
实施例7
从玉米糖化醪产生乙醇
本实验的目的是确定从下面表5中所列的生物克隆的PFL当用于20%糖化醪的发酵时是否可提供增加的乙醇产率。已在酵母中测试总共9个PFL的功能。在这些PFL中，仅解纤维梭菌PFL在玉米糖化醪发酵中对甘油合成突变体的生长无正面作用。此外，当使用包含解纤维梭菌PFL的菌株时，在甲酸测定中未观察到甲酸。未测试该菌株对玉米糖化醪发酵的性能。
在具有整合在gpd1Δgpd2Δfdh1Δfdh2Δ背景(M2085)的染色体中的大肠杆菌AADH的菌株M2158或M2275中测试8个PFL的功能，所述M2275除了其还具有gpd2Δ::GPD1甘油减少突变外与M2158相同。使用20%固体，在带有长颈振荡培养瓶中使用表5中所列的菌株进行两个单独的玉米糖化醪发酵实验。通过代谢物的HPLC分析评价菌株的性能。
表5.用于玉米糖化醪发酵的遗传背景
如图21和22中显示的，PFL的添加改善了仅包含AADH的菌株的乙醇产率。图23和24显示这些菌株如所预期的不产生甘油。已在用于该实验的工业糖化醪底物中观察到约4g/L的甘油。图25显示菌株M2326（其为甘油减少菌株）乙醇产率增加9%。
实施例8
下列实施例显示了酿酒酵母菌株M3625的产生。菌株M3625的基因型是：Δgpd2：青春双岐杆菌pflA/pflB/adhEΔfdh1Δfdh2::青春双岐杆菌pflA/pflB/adhE fcy1Δ::扣囊复膜酵母菌葡糖淀粉酶(glu-0111-CO)。菌株M2390被称为来自LaSaffre(pahc.com/Phibro/Performance-Products/Catalog/23/Ethanol-Red.html)的乙醇红（ethanol Red）(新)。
用于开发酿酒酵母菌株M3625的遗传修饰技术依赖于在酵母染色体内的特定的已知位点上插入青春双岐杆菌pflA、pflB、AdhE和扣囊复膜酵母菌glu-0111-CO的基因的定向整合。定向整合法产生具有稳定且容易表征的整合事件的转基因菌株。染色体整合，就其本质而言，相对于其它方法，减少异源DNA的任何动员的可能性和增强菌株稳定性。
MX盒是当期望在给定的染色体基因座中插入或删除遗传元件时最常用的工程化工具(Wach A,等人,Yeast10(13)：1793-1808(1994))。可回收的MX盒包含一个或多个使得能够进行显性和负选择的标记(Goldstein,A.L.和McCusker,J.H.,Yeast15：1541-1553(1999)；Ito-Harashima,S.和McCusker,J.H.,Yeast21：53–61(2004))。显性标记使得能够选择修饰，反选择标记使得随后能够通过Cre-Lox介导的重组(Güldener,Ulrich,等人,Nucleic Acids Research(1996)24(13)2519–2524)或侧翼连接盒的重复同源区之间的重组来除去标记系统。由于标记被除去，因此可在随后的工程化步骤中使用它们，它们确保无不期望的外来遗传物质保留在菌株中。
为了在M3625中产生稳定的纯合整合，开发了两个基于新型HSV-胸苷激酶(TDK)的MX盒。胸苷激酶在酿酒酵母中的表达导致对化合物氟-脱氧尿嘧啶(FUDR)的敏感性。FUDR的细胞毒性依赖于参与嘧啶代谢的两个酶：胸苷激酶(Tdk)和胸苷酸合成酶(ThyA)的存在。Tdk将FUDR转化成氟-dUMP(F-dUMP)，所述氟-dUMP是ThyA的共价抑制剂并且是多种真核生物的反选择的基础(Czako,M.和L.Marton,(1994)Plant Physiol104：1067-1071；Gardiner,D.M.和B.J.Howlett,(2004)Curr Genet45：249-255；Khang,C.H.,等人,(2005)Fungal Genet Biol42：483-492；Szybalski,W.(1992)Bioessays14：495-500)。
将HSV-TDK表达盒独立地融合至两个最常使用的显性可选择标记，所述标记赋予对药物G418(Kan)或诺尔丝菌素(Nat)的抗性(Goldstein,A.L.和McCusker,J.H.,Yeast15：1541-1553(1999))。两个双表达盒（称为KT-MX和NT-MX）的转化使得能够正向选择至两个染色体中的整合，如图28A中举例说明的。转化的缺失装配件包含4个PCR产物，与靶位点的上游同源的5'侧翼(p1)、KT-MX盒(p2)、NT-MX盒(p3)和与靶位点的下游同源的3'侧翼(p4)。每一个组分单独地使用产生每一个PCR产物的同源重叠延伸的引物来进行扩增。参见表7和8。图28A中弯曲的虚线代表了KT/NT-MX盒与5'侧翼之间的同源性，弯曲实线代表了与3'侧翼的同源性。对于每一轮工程化，侧翼连接靶位点的上游和下游区域的PCR扩增子被设计来包含KT-MX和NT-MX盒的同源尾。在侧翼和标记都被转化后，在含有G418和Nat的YPD培养基上进行选择。参见图28B。图28B显示在用KT-MX和NT-MX替代靶位点后染色体的示意图。
在M3625的构建中采取的每一个工程化步骤后，随后删除和/或用期望的表达盒(Mascoma Assembly)替代所有标记物，从而导致不含抗生素标记的菌株(图29)。图29显示转化的Mascoma Assembly包含一定量的PCR产物，这取决于期望的工程化事件(pX)、与靶位点的上游同源的5'侧翼(p1)和与靶位点的下游同源的3'侧翼(p4)。每一个组分单独地使用产生同源重叠延伸的引物来进行扩增。图29中的重叠曲线代表这些PCR产物的末端上的同源性。图29B显示在FUDR上选择后和用Mascoma Assembly替代遗传标记后染色体的示意图。标记去除的确认通过southern印迹、PCR和选择培养基上的稀释平板技术来进行评价，如下文所述。
在M3625的构建过程中修饰4个基因座。使用表6中所列的Mascoma Assembly将上述整合法策略用于FDH1、GPD1和GPD2基因座。在图30-37中提供了描述每一个Mascoma Assembly的组分的详细分子图谱。
表6.M3625中包含的遗传修饰
表7.用于菌株M3625的产生的引物
Figure BDA0000420902410001062
Figure BDA0000420902410001071
表8.用于产生菌株M3625的引物的序列
Figure BDA0000420902410001072
MA0370的基因分型和测序
为了确认在插入MA370后检测到FDH1，使用引物X17826和X16944从M2390和M3625的基因组DNA扩增PCR产物。预期结果列于表10中，使用的引物的序列列于表11中。描述MA0370整合位点的分子图谱示于图30中，该分子图谱描述了用于除去KT-MX和NT-MX标记的侧翼的位置和用于基因分型的引物的位置。参见图30(5'侧翼，酿酒酵母FDH1上游的侧翼区域；3'侧翼–酿酒酵母FDH1下游的侧翼区域。区域AA–扩增的和已测序的染色体DNA区域)。引物对X15556/X15871用于FDH15'侧翼，引物对X15870/X15553用于FHD13'侧翼以产生图30中显示的装配件。用于使用的装配件的引物的序列见于表9中。显示用于确定基因型的PCR产物的琼脂糖凝胶图像示于图31中(泳道1：1KB阶梯；泳道2：M2390(X17826/X16944)；泳道3：M3625(X17826/X16944))(参见表11)。
表9.用于产生MA0370整合位点的引物
Figure BDA0000420902410001081
为了测定M3625MA0370位点的确切DNA序列，在5个独立的PCR反应中从M3625菌株的基因组DNA扩增区域AA。纯化所有PCR产物，在Dartmouth College测序设施中利用Sanger法进行测序。
表10.用于MA0370基因分型的引物和基因分型的结果的概述
泳道 模板DNA 引物 预期尺寸(bp) 观察到的正确尺寸
1 1KB阶梯 N/A N/A N/A
2 M2390 X17826/X16944 4386bp 是
3 M3625 X17826/X16944 3237 是
表11.用于MA0370基因分型的引物的序列
引物 序列 SEQ ID NO
X17826 Tcgctaacgatcaagaggaactg 152
X16944 Tacacgtgcatttggacctatc 153
MA0280的基因分型和测序
为了确认MA280被插入在FDH2位点上，从M3625基因组DNA扩增PCR产物。引物和预期的基因分型结果列于表13中。用于对MA0280进行基因分型和测序的引物列于表14中。描述MA0280整合位点的分子图谱示于图32中。该分子图谱描述了用于替代KT-MX和NT-MX标记和插入MA0280表达盒的侧翼的位置。用于基因分型的引物的位置示于图谱中。参见图32(M3625菌株的MA0280位点的图谱上的特征描述；FDH25’侧翼区-酿酒酵母FDH2上游侧翼区；PFK1p-酿酒酵母PFK1基因启动子；ADHE-青春双岐杆菌ADHE编码基因；HXT2t-酿酒酵母HXT2基因终止子；ENO1p-酿酒酵母ENO1基因启动子；PFLB-青春双岐杆菌PFLB编码基因；ENO1t-酿酒酵母ENO1基因终止子；ADH1p-酿酒酵母ADH1基因启动子；PFLA-青春双岐杆菌PFLA编码基因；PDC1t-酿酒酵母PDC1基因终止子；FBA1t-酿酒酵母FBA1基因终止子；TPI1p-酿酒酵母TPI1基因启动子；FDH23'侧翼区-酿酒酵母FDH2下游侧翼区。区域BA-BE，扩增的和测序的染色体DNA区域)。引物对X16096/X17243用于FDH25'侧翼，引物对X16738/X16620用于pPFK1-ADH-HXT2，引物对X16621/X13208用于pENO1-PFL-ENO1t，引物对X13209/X17242用于pADH1-PFL-PDC1t，引物对X17241/X16744用于pTPI-ADH-FBA1trc，引物对X17244/X11845用于FDH25'侧翼以产生图32中显示的装配件。用于产生图32中显示的装配件的引物的序列见于表12。显示用于对MA0280位点基因分型和序列的PCR产物的琼脂糖凝胶图像示于图33(泳道1：1KB阶梯；泳道2：M3625(17413/15810)；泳道3：M3625(17834/14554)；泳道4：M3625(16291/15229)；泳道5：M3625(16503/11317)；泳道6：(16241/16946)；泳道7：1KB阶梯)(参见表14)。
表12.用于产生MA0280整合位点的引物
Figure BDA0000420902410001101
为了测定M3625MA0280位点的确切DNA序列，在5个独立的PCR反应中从M3625菌株的基因组扩增区域BA-BE。纯化所有PCR产物，在Dartmouth College测序设施中通过Sanger法进行测序。
表13.用于MA0280基因分型的引物和基因分型的结果的概述
泳道 模板DNA 引物 预期的尺寸(bp) 观察到的正确尺寸
1 1KB阶梯 N/A N/A N/A
2 M3625 17413/15810 5567 有
3 M3625 17834/14554 3686 有
4 M3625 16291/15229 2569 有
5 M3625 16503/11317 4352 有
6 M3625 16241/16946 2478 有
7 1KB阶梯 N/A N/A N/A
表14.用于MA0280的基因分型的引物的序列
引物 序列 SEQ ID NO
17413 Ggattcttcgagagctaaga 154
15810 Gacttgcagggtaggctagctagaatt 155
17834 Gctgcttcgaggtattgaca 156
14554 Ggctcttcattgagcttagaaccc 157
16291 Aactggaccgatcttattcgt 158
15229 Agtccactgcggagtcatttcaaag 159
16503 Ctgccagcgaattcgactctgcaat 160
11317 Cagtcgctgtagtgagcgacagggtagtaa 161
16241 Ctttgcattagcatgcgta 162
16946 Taggtcgagaccagaatgcatgt 163
MA0289的基因分型和测序
为了确认MA0289在GPD2位点被插入，从M3625基因组DNA扩增PCR产物。引物和预期的基因分型结果列于表16。用于MA0289的基因分型的引物的序列列于表17中。描述MA0289整合位点的分子图谱示于图34中。该分子图谱描述用于替代KT-MX和NT-MX标记和插入MA0280表达盒的侧翼的位置。用于基因分型的引物的位置标示于图谱上。参见图34(M3625菌株的MA0280位点的图谱上的特征；GPD25'侧翼-酿酒酵母GPD2上游侧翼区；ADHE-青春双岐杆菌ADHE编码基因；HXT2t-酿酒酵母HXT2基因终止子；PDC1t-酿酒酵母PDC1基因终止子；PFLA-青春双岐杆菌PFLA编码基因；ADH1p-酿酒酵母ADH1基因启动子；ENO1t-酿酒酵母ENO1基因终止子；PFLB-青春双岐杆菌PFLB编码基因；ENO1p-酿酒酵母ENO1基因启动子；FBA1t-酿酒酵母FBA1基因终止子；TPI1p-酿酒酵母TPI1基因启动子；GPD23'侧翼-酿酒酵母GPD2下游侧翼区；区域CA-CF–扩增的并且已测序的染色体DNA区域)。引物对X15473/X17460用于GPD25'侧翼，引物对X17459/X17289用于ADH-HXT2，引物对X17290/X13209用于pADH1-PFL-PDC1trc,引物对X13208/X15735用于pENO1-PFL-ENO1trc，引物对X15736/X17457用于pTPI-ADH-FBA1trc，引物对X17458/X15476用于GPD23'侧链以产生图34中显示的装配件。用于产生图34中显示的装配件的引物的序列见于表15中。显示用于MA0280位点的基因分型和测序的PCR产物的琼脂糖凝胶图像示于图35中(泳道1：1KB阶梯；泳道2：M3625(17413/15810)；泳道3：M3625(17834/14554)；泳道4：M3625(16291/15229)；泳道5：M3625(16503/11317)；泳道6：(16241/16946)；泳道7：1KB阶梯)。
表15.用于产生MA0289整合位点的引物
为了测定M3625MA0289位点的确切DNA序列，在5个独立的PCR反应中从M3625菌株的基因组DNA扩增区域CA-CF。纯化所有PCR产物，在Dartmouth College的测序设施中通过Sanger法进行测序。
表16.用于MA0289基因分型的引物和基因分型结果的概述
Figure BDA0000420902410001141
表17.用于MA0289的基因分型的引物的序列
引物 序列 SEQ ID NO
16939 Atgctgatgcatgtccacaaag 164
16940 Ccttatcagtcaattgaggaaag 165
16807 Gcgatgagctaatcctgagccat 166
14567 Tggttccaccattattatgttggt 167
17834 Gctgcttcgaggtattgaca 168
14557 Ctaaaccgtggaatatttcggatat 169
16640 Cctcatcagctctggaacaacga 170
14552 Gatccgagcttccactaggatagc 171
17586 Gcagtatgcaagtctcatgctg 172
16806 Gaacttgcaggcaccgatcttca 173
MA0317的基因分型和测序
为了确认MA0317在FCYl位点被插入，从M3625基因组DNA扩增PCR产物。引物和预期的基因分型结果列表表19中。用于MA0317的基因分型的引物的序列列于表20中。描述MA0317整合位点的分子图谱示于图36中。该分子图谱描述用于用MA0317替代FCY1基因的侧翼的位置和用于基因分型的位置或引物。参见图36(M3625的MA0371位点的图谱上的特征描述；FCY15'侧翼–酿酒酵母FCY1上游侧翼区；ENO1p-酿酒酵母ENO1基因启动子；AE9–扣囊复膜酵母菌glu0111编码基因；ENO1t-酿酒酵母ENO1基因终止子；PDC1t-酿酒酵母PDC1终止子；ADH1p-酿酒酵母ADH1基因启动子；FCY13'侧翼-酿酒酵母FCY1下游侧翼区；区域FA-FE，扩增的和已测序的染色体DNA区域)。引物对X18868/X18844用于FCY5'侧翼，引物对X18845/X15464用于pENO-AE9-ENO1t，引物对X15465/X11750用于pADH1-AE9-PDC1t，引物对X15479/X18869用于FCY3'侧翼以产生图36中显示的装配件。用于产生图36中显示的装配件的引物的序列见于表18。显示用于确定基因型的PCR产物的琼脂糖凝胶图像示于图37中(泳道1：1KB阶梯；泳道2：M3625(13092/17586)；泳道3：M3625(10871/14554)；泳道4：M3625(16291/17887)；泳道5：M3625(16640/16509)；泳道6：M3625(13246/13095)；泳道7：1KB阶梯)。
表18.用于产生MA0317整合位点的引物
Figure BDA0000420902410001151
Figure BDA0000420902410001161
为了测定M3625MA0317位点的确切的DNA序列，在5个独立的PCR反应中从M3625菌株的基因组DNA扩增区域FA-FE。纯化全部PCR产物，在Dartmouth College的测序设施中通过Sanger法进行测序。
表19.用于MA0317基因分型的引物和基因分型的结果的概述
Figure BDA0000420902410001162
表20.用于MA0317的基因分型的引物的序列
引物 序列 SEQ ID NO
13092 Ccacaccatagacttcagccttcttag 174
17586 Gcagtatgcaagtctcatgctg 175
10871 Cgttcgctgtagcatacttagctat 176
14554 Ggctcttcattgagcttagaaccc 177
16291 Aactggaccgatcttattcgt 178
17887 Actgcctcattgatggtggta 179
16640 Cctcatcagctctggaacaacga 180
16509 Gtatgattgcggttatctgtcgc 181
13246 Cctatggatgttgtaccatgcc 182
13095 Ccaatatcttgcagtccatcctcgtcgc 183
图38显示淀粉测定的结果，显示了M3625中的淀粉降解活性。如共同未决的国际申请号PCT/US2011/039192（通过引用整体并入本文）中所述进行测定。
Western印迹蛋白质检测：
抗-PflA、抗-PflB、抗-GA(AE9)和抗-AdhE抗体：
为了检测许多工程化进入酵母菌株的酶的存在和帮助表征所述酶，在Lampire Biological Products,Pipersville,PA在兔中产生抗与工程化蛋白质具有序列相似性的合成肽的多克隆抗体。表11描述了用作兔的免疫原的肽：
表21.用于抗体产生的免疫原
蛋白质 免疫原 SEQ ID NO
Sf GA (AE9) 完整的纯化的蛋白质 106
DNKNRYKINGNYKAGC
NSGKKHIVESPQLSSRGGC
CDHIDDNGQLTEEINRYTG
Ba pflA CQNPDTWKMRDGKPVYYE 107
GLTSSEENVENVAKIC
Ba pflB WEGFTEGNWQKDIDVRDC 108
KQRDKDSIPYRNDFTECPEC
CNTITPDGLGRDEEEERIGN
Ba AdhE DAKKKEEPTKPTPEEKLC 109
CKNLGVNPGKTPEEGVEN
CGSYGGNSVSGVNQAVN
对于所有合成肽，添加末端Cys以进行缀合。将肽和纯化的GA蛋白缀合至KLH，随后注射进入兔。将50天的方案用于抗体产生，使用ELISA监测针对免疫原的各种取血。在于Western印迹中测试这些针对来自工程化酵母菌株的裂解物的多克隆抗体后，使用蛋白G柱纯化来自阳性免的血清。将纯化的抗体透析进入PBS，通过在280nm的吸光度测定浓度，将抗体用于进一步评价菌株。在利用SDS-PAGE评价后，抗体的纯度显示大于90%。
针对合成肽产生的抗体用于细胞提取物和培养上清液中的每一种工程化蛋白质的Western印迹检测，如下文中描述的。
菌株生长条件：
将细胞从冷藏原液涂板在YPD(20g/L蛋白胨,10g/L酵母提取物,20g/L葡萄糖)琼脂上进行48小时，用于在50mL培养管中接种于25mLYPD(20g/L蛋白胨,10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖)中。在以250rpm振荡的条件下，将细胞在35℃需氧生长8小时，随后取出1mL以接种装有含有7mg/L麦角固醇、289mg/L乙醇和544mg/L Tween80的50mL YPD(20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖)的密封的CO2吹扫的血清瓶。随后在以250rpm振荡的条件下在35℃将这些培养物缺氧生长过夜(～16h)。通过离心收获细胞，用25mL去离子水洗涤。将所得的湿细胞沉淀用于PflA、PflB和AdhE的Western印迹检测。
将用于接种血清瓶的需氧培养物返回摇动培养箱中温育另外40小时。在温育结束时，通过离心沉淀细胞，回收上清液，使用10kDa分子量截留值(MWCO)的滤膜浓缩约10倍。将所得的浓缩物用于细胞外AE9葡糖淀粉酶的Western印迹检测。
细胞裂解和样品制备：
为了进行PflB和AdhE的Western印迹，通过在珠粒破碎机中用0.5mm的直径的珠粒进行机械破碎和以4800rpm搅拌来匀浆细胞。将100μL湿细胞添加至100mM磷酸钠缓冲液pH7.4中的含有1mM苯甲磺酰基氟化物(PMSF)、2mM二硫苏糖醇(DTT)和1%二甲基亚砜(DMSO)的匀浆缓冲液。搅拌细胞，进行6个循环，每个循环10秒，在循环之间于冰上冷却。通过离心沉淀细胞碎片，回收上清液。将15μL所得的上清液添加至15μL含有50mM DTT的2X浓缩的SDS-PAGE样品缓冲液，随后加载至4-20%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶上。
为了进行PflA的Western印迹检测，通过将40μL湿细胞添加至40μL含有50mM DTT的2X浓缩的SDS-PAGE样品缓冲液来裂解细胞。随后将混合物在室温温育30分钟，随后在100℃加热2分钟。通过离心沉淀细胞，将30μL的上清液装载至4-20%Tris-甘油SDS-PAGE凝胶上。
为了进行AE9分析，将15μL的浓缩的需氧性培养上清液添加至15μL含有50mM DTT的2X浓缩的SDS-PAGE样品缓冲液，随后加载至4-20%Tris-甘油SDS-PAGE凝胶。
在凝胶电脉后，将蛋白质转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，随后用含有按重量体积比(w/v)2%的牛血清白蛋白(BSA)的Tris缓冲盐溶液(TBS；10mM Tris,150mM氯化钠pH7.5)封闭过夜。随后除去封闭溶液，将第一肽抗体于含有Tween20的Tris缓冲盐溶液(TBST；含有0.1%v/v Tween20的TBS)中稀释至约2μg/mL，随后添加至每一张膜。在1小时的温育后，弃去第一抗体，将膜在10mM Tris,500mM氯化钠,0.1%Tween20pH7.5(THST)中洗涤3次，每次5分钟。将第二抗体，具有辣根过氧化物酶标记的山羊抗-兔抗体，以1:7500稀释于TBST中，随后添加至印迹，温育1小时。随后弃去第二抗体，再次用THST洗涤3次，每次5分钟。随后弃去洗涤溶液，添加增强化学发光(ECL)底物，使用凝胶成像照相机通过一系列复合曝光来读取印迹。
如图39中显示的，对于抗-PflA、PflB和AdhE第一抗体，在每一个实验菌株中检测到具有大致正确的分子量的条带，然而在背景对照菌株(M2390)中未检测到条带。对于抗-AE9，在工程化以表达蛋白质的菌株(M3625和M3680)中检测到条带，但在其它菌株中未检测到条带。参见图39。对于PflB似乎存在2个不同的条带，这可表明因需氧性细胞裂解条件而产生的蛋白质的含氧切割。
丙酮酸甲酸裂解酶活性测定：
丙酮酸甲酸裂解酶(PflB)在氧不存在的情况下被Pfl激活酶(PflA)激活并且催化丙酮酸与CoA至甲酸和乙酰-CoA的反应。当将提取物添加至包含丙酮酸、CoA和DTT的反应混合物时，通过测量甲酸的产量来测量细胞提取物中的PflB的活性。
菌株生长条件：
将细胞从冷藏原液涂板在YPD(20g/L蛋白胨,10g/L酵母提取物,20g/L葡萄糖)琼脂上进行48小时，用于在50mL培养管中接种25mLYPD(20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、20g/L葡萄糖)。在以250rpm振荡的条件下在35℃需氧地生长细胞8小时，随后取出1mL来接种装有含有7mg/L麦角固醇、289mg/L乙醇和544mg/L Tween80的50mL YPD(20g/L蛋白胨,10g/L酵母提取物,20g/L葡萄糖)的密封的CO2吹扫的血清瓶中。随后在以250rpm振荡的条件下，在35℃将这些培养物厌氧生长过夜(～16h)。通过离心收获细胞，在厌氧培养室中用25mL去离子水进行洗涤。
细胞裂解和样品制备：
通过在珠粒破碎机中用0.5mm的直径的珠粒进行机械破碎和以4800rpm搅拌来在厌氧培养室中匀浆细胞。将100μL湿细胞添加至100mM磷酸钠缓冲液pH7.4中的含有1mM PMSF、2mM DTT和1%DMSO的匀浆缓冲液。搅拌细胞，进行6个循环，每个循环10秒，在循环之间于冰上冷却。通过以14,100x g离心10分钟沉淀细胞碎片，回收上清液，通过0.22μm的滤膜进行澄清。将所得提取物直接用于活性测定。
Pfl活性测定：
2X浓缩的测定底物混合物由20mM丙酮酸钠、0.11mM CoA和20mM DTT组成。称取试剂重量，将其带入厌氧培养室，添加至10mL的100mM磷酸钠缓冲液pH7.4，所述缓冲液已充分脱气。将100μL细胞提取物添加至100μL浓缩的测定混合物中，在环境温度(～29℃)温育30分钟。随后从厌氧培养室取出样品，在100℃于加热块中加热90秒，随后在冰上冷却以沉淀蛋白质。通过以15,000x g离心10分钟除去沉淀。使用可获自Megazyme International Ireland,Bray,Co.Wicklow,Ireland的甲酸测定试剂盒来分析所得上清液的甲酸浓度。
将剩余细胞提取物以1:8稀释于100mM磷酸钠缓冲液pH7.4，使用BCA总蛋白测定法测定总的蛋白质含量。将Pfl测定样品的甲酸浓度针对样品的总蛋白浓度进行标准化。
如图40中显示的，具有工程化的Pfl活性的实验菌株(M3465,M3625,M3679和M3680)在与反应混合物温育后，显示比背景对照菌株(M2390)显著更高量的甲酸存在。
醇脱氢酶E(AdhE)酶促活性测定
AdhE是通过乙醛作为中间产物催化从乙酰-CoA形成乙醇的细胞内双功能酶。这通过一系列乙醛脱氢酶活性和醇脱氢酶活性作用来实现。酿酒酵母菌株具有天然醇脱氢酶(Adh)活性；这些活性测定的意图是显示Adh活性被工程化菌株保留，并且存在另外的乙醛脱氢酶活性(来自AdhE)。
醇脱氢酶活性：
如上所述，青春双岐杆菌双功能醇脱氢酶(AdhE)具有2个主要功能。一个功能是将乙醛转化成乙醇。该可逆反应利用NADH作为辅因子。为了评价该酶的存在和确保其具有期望的活性，开发了一种测定法来评价其中将乙醇转化成乙醛的逆反应。参见图49。反应速率通过在340nm的NADH吸光度来监测。
菌株生长条件：
将细胞从冷藏原液涂点在YPD(20g/L蛋白胨,10g/L酵母提取物,20g/L葡萄糖)琼脂板上，在35℃温育过夜。从该板接种具有25mLYPD(20g/L蛋白胨,10g/L酵母提取物,20g/L葡萄糖)的50mL振动沉管，在35℃,250rpm温育过夜。在4℃以5000rpm离心培养物5分钟，用去离子(DI)水洗涤，随后在4℃以5000rpm离心5分钟，用DI水第二次洗涤，在4℃以5000rpm离心5分钟，随后将其置于冰上。
细胞裂解和样品制备：
将100μL湿细胞沉淀用移液器转移至具有500μL100mMNa2PO4,2.5mM MgCl2,0.5mM CaCl2pH7.4缓冲液和6μL100mM苯甲磺酰基氟化物(PMSF)的Zymo Research BashingBead0.5mm管中。使用MP FastPrep-24（设置至以4.0m/s运行10秒，进行3次，在每一次运行之间于冰上冷却10秒）通过机械破碎来裂解细胞。重复该过程3次，每一次运行之间在冰上冷冻1分钟。随后使用Eppendorf离心机5424以15,000rpm离心每一个管10分钟。取出上清液，将其转移至2mL管。将1μL的New England Biolabs DNAse I添加至每一个管。将管颠倒，置于设置在37℃的培养箱中进行30分钟。从培养箱取出管，将样品转移至0.22μm过滤离心管，将管以10,000rpm离心2分钟。拉出50μL的样品，将其在单独的样品管中用450μL100mMNa2PO4pH7.4稀释，随后置于冰上。
醇脱氢酶活性测定：
用于测定AdhE的醇脱氢酶活性的测定改造自Vallee,B.L.和Hoch,F.L.的方法,Proc Natl Acad Sci USA(1955)41(6)：327–338。将100μL0.1M Na4P2O7pH9.6缓冲液、32μL2M乙醇和1.66μL0.025MNAD+添加至96孔板的每一个孔。在将裂解物添加至反应混合物后，反应的总体积等于153.66μL，产生65mM Na4P2O7pH9.6缓冲液、416.5mM乙醇和0.27mM NAD+的终浓度。为了开始反应，将20μL1:10稀释的裂解物用移液器转移至每一个孔中，观察340nm处的吸光度，使用Spectramax M2和Softmax软件记录1.7分钟。以一式两份进行每一个样品以确保重现性。将Thermo Scientific’s BCA Protein Assay试剂盒用于测量来自产生的裂解物的总蛋白质浓度。该数据用于在分析过程中标准化从实际反应产生的数据。
表22.醇脱氢酶活性测定的数据
Figure BDA0000420902410001231
工程化的菌株的醇脱氢酶活性。p-值基于单尾T检验。
背景菌株M2390在本测定中表现如所预期的。虽然其不具有工程化进入其基因组的AdhE，但其仍然表达野生型醇脱氢酶，从而在醇脱氢酶测定中具有活性。其它具有工程化进入它们的基因组的AdhE的菌株应当已表达双功能酶，并且鉴于总蛋白质的浓度在用于测定的每一个样品中是相等的，应当更具活性。由于p值小于0.05，因此M3625显示统计上显著的比背景菌株更高的活性。然而，其它菌株具有大于0.05的p值，表明即使存在活性的增加（如通过超过背景活性的变化%所显示的）它们也在背景菌株的误差内。参见表22。在标准化蛋白质浓度后，数据的图解表示法显示每一个菌株在1.7分钟的反应期中比背景菌株M2390更具活性。图41显示以在1.7分钟的反应中，以μmol NADH/mg的总蛋白质对时间绘制的每一个菌株的活性。
基于这些结果，该测定显示了所有菌株的醇脱氢酶活性。然而，M2390相较于其它菌株活性较低，并且NAD+至NADH的转化更慢，从而表明工程化AdhE存在于每一个菌株中，并且其显示出适当地发挥作用。
乙醛脱氢酶活性：
AdhE的第二活性是将乙醛转化成乙酰辅酶A的可逆反应。该活性对于酿酒酵母菌株不是天然的，并且应当仅存在于工程化菌株中。为了评价该酶的存在和确保其具有期望的活性，开发了一种测定法来测量通过AdhE进行的乙醛至乙酰CoA的转化。通过340nm处的NADH吸光度来监测反应速率。反应的图解提供于图50中。
菌株生长条件：
将菌株从冷藏原液涂点在YPD(20g/L蛋白胨,10g/L酵母提取物,20g/L葡萄糖)琼脂板上，在35℃温育过夜。从该板接种具有25mLYPD(20g/L蛋白胨,10g/L酵母提取物,20g/L葡萄糖)的50mL振动沉管，在35℃,250rpm温育过夜。在4℃以5000rpm离心培养物5分钟，用DI水洗涤，随后在4℃以5000rpm离心5分钟，用DI水第二次洗涤，在4℃以5000rpm离心5分钟，随后将其置于冰上。
细胞裂解和样品制备：
将100μL湿细胞沉淀用移液器转移至具有500μL100mMNa2PO4、2.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2pH7.4缓冲液和6μL100mM苯甲磺酰基氟化物(PMSF)的Zymo Research BashingBead0.5mm管中。使用MP FastPrep-24（设置至以4.0m/s运行10秒，进行3次，在每一次运行之间于冰上冷却10秒）通过机械破碎来裂解细胞。重复该过程3次，每一次运行之间在冰上冷冻1分钟。随后使用Eppendorf离心机5424以15,000rpm离心每一个管10分钟。取出上清液，将其转移至2mL管。将1μL的New England Biolabs DNAse I添加至每一个管。将管颠倒，置于设置在37℃的培养箱中进行30分钟。从培养箱取出管，将样品转移至0.22μm过滤离心管，随后使用Eppendorf离心机5424将管以10,000rpm离心2分钟。拉出50μL的样品，将其在单独的样品管中用450μL100mM Na2PO4pH7.4稀释，随后置于冰上。
乙醛脱氢酶活性测定：
将800μL50mM Na4P2O7pH9.6、50μL0.025M NAD+、50μL1M乙醛和50μL1:10稀释的裂解物添加至Plastibrand micro UV-比色杯中。将比色杯置于设置至在340nm读取吸光度的Shimadzu UV-1700中。将50μL的2mM CoA利用移液器转移进入比色杯，随后通过轻轻地吸打比色杯中的内容物来混合，监测吸光度，进行5分钟。所得的每一个试剂的终浓度为40mM Na4P2O7pH9.6、1.25mM NAD+、50mM乙醛和0.1mM CoA。以一式二份进行每一个样品以确保重现性。将Thermo Scientific’s BCA Protein Assay试剂盒用于测量来自产生的裂解物的总蛋白质浓度。将该数据用于在分析过程中标准化从实际反应产生的数据。
醇脱氢酶(乙醛脱氢酶活性)测定的数据示于表23中。注意，用于该测定的裂解物是用于先前部分详述的醇脱氢酶测定的相同裂解物。
表23.乙醛脱氢酶活性
Figure BDA0000420902410001261
乙醛脱氢酶活性。p值基于单尾T检验。
背景菌株M2390在本测定中表现如所预期的。野生型菌株应当不具有乙醛脱氢酶活性，如通过本测定显示的。具有工程化进入它们的基因组的AdhE的其它菌株应当表达蛋白质并且具有乙醛脱氢酶活性。在全部工程化菌株(M3465、M3625、M3679和M3680)中观察到该活性，活性的误差最小并且p值小于0.05。
甲酸脱氢酶活性
在菌株M3465、M3625、M3679和M3680中，将甲酸脱氢酶从基因组敲除以期平衡与所经历的不同工程化步骤的氧化还原。背景菌株M2390应当具有基因完整性。为了确保天然酿酒酵母甲酸脱氢酶基因被除去，开发了酶促测定。甲酸脱氢酶在消耗NAD+的情况下催化甲酸至二氧化碳的转化。
甲酸+NAD+→CO2+NADH
FDH
酶促活性可通过测量340nm处的NADH形成来进行监测。
菌株生长条件：
将M2390、M3465、M3625、M3679和M3680从冷藏原液涂点在YPD(20g/L蛋白胨,10g/L酵母提取物,20g/L葡萄糖)琼脂板上，在35℃温育过夜。从该板接种具有25mL YPD+24mM甲酸钠的50mL振动管，在35℃,250rpm温育过夜(20g/L蛋白胨,10g/L酵母提取物,20g/L葡萄糖)。在4℃以5000rpm离心培养物5分钟，用DI水洗涤，随后在4℃以5000rpm离心5分钟，用DI水第二次洗涤，在4℃以5000rpm离心5分钟，随后将其置于冰上。
细胞裂解和样品制备：
将100μL湿细胞沉淀用移液器转移至具有500μL100mMNa2PO4、2.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2pH7.4缓冲液和6μL100mM苯甲磺酰基氟化物(PMSF)的Zymo Research BashingBead0.5mm管中。使用MP FastPrep-24（设置至以4.0m/s运行10秒，进行3次，在每一次运行之间于冰上冷却10秒）通过机械破碎来裂解细胞。重复该过程3次，每一次运行之间在冰上冷冻1分钟。随后使用Eppendorf离心机5424以15,000rpm离心每一个管10分钟。取出上清液，将其转移至2mL管。将1μL的New England Biolabs DNAse I添加至每一个管。将管颠倒，置于设置在37℃的培养箱中进行30分钟。从培养箱取出管，将样品转移至0.22μm过滤离心管，随后使用Eppendorf离心机5424将管以10,000rpm离心2分钟。
甲酸脱氢酶活性测定：
将800μL62.5mM K2PO4pH7.0、50μL40mM NAD+和50uL1M甲酸钠添加至Plastibrand micro UV-比色杯中。将比色杯置于设置至读取340nm处的吸光度和空白的Shimadzu UV-1700中。将100μL的未稀释的裂解物样品利用移液器转移进入比色杯，随后通过轻轻地吸打比色杯中的内容物来混合，监测吸光度，进行2.5分钟。所得的每一个试剂的终浓度为50mM磷酸钾、2mM NAD+和0.05M甲酸钠。以一式二份进行每一个样品以确保重现性。
表24.工程化菌株的Fdh活性
Figure BDA0000420902410001281
如表24中显示的，FDH敲除菌株(M3465、M3625、M3679和M3680)不显示任何甲酸脱氢酶活性。背景菌株M2390具有最小活性。过表达FDH的正对照菌株M3631具有活性，并且产生被观察到和记录的显著量的NADH。
AE9葡糖淀粉酶活性测定：
扣囊复膜孢酵母GLU1葡糖淀粉酶(AE9)从淀粉产生葡萄糖。
在粗制玉米淀粉上测定细胞外AE9葡糖淀粉酶活性以确定葡糖淀粉酶活性在工程化菌株的需氧性培养物上清液中的存在。将细胞进行需氧性培养，通过离心除去，测定所得的上清液的活性，将其与来自不包含AE9的菌株M2390的上清液相比较。
细胞生长条件：
将细胞涂板在YPD(20g/L蛋白胨,10g/L酵母提取物,20g/L葡萄糖)琼脂上进行48小时，用于在50mL培养管中接种25mL YPD(20g/L蛋白胨,10g/L酵母提取物,20g/L葡萄糖)。在以250rpm振荡的条件下在35℃需氧培养细胞48小时。48小时后，通过离心除去细胞，回收上清液。
样品制备：
通过经过0.22μm滤膜的过滤澄清回收的需氧培养物上清液，使用10kDa分子量截留值滤器浓缩约10倍。随后使用纯化的AE9作为标准，通过苯基反相(苯基-RP)HPLC法分析保留的浓缩物的AE9浓度。将样品稀释至50μg/mL的AE9浓度，并直接用于活性测定。
葡糖淀粉酶活性测定：
在50mM醋酸钠缓冲液pH5.0中制备2.2%(重量比体积)玉米淀粉溶液。在96孔测定板中，将50μL的上清液(调整至50μg/mL的AE9浓度)添加至450μL2.2%淀粉。在不振荡的条件下将板在室温温育，在第1、2、5、10、30、120和210分钟取出50μL的样品。在初始酶添加后，以及在每一次取样后利用移液器抽吸以混合孔。通过测定还原糖的3,5-二硝基水杨酸(DNS)法分析样品。
如图42中所示，M3625和M3680的需氧性培养物上清液显示出相似的对粗制玉米淀粉的活性，如通过DNS分析(Somogyi,M.,Noteson Sugar Determination,JBC(200)45(1952))测量的。M2390上清液的淀粉分解活性在本测定中是可忽略的。
上述数据显示pflA、pflB和AdhE存在于菌株M3625中，并且具有恰当的活性。背景菌株以及正对照（当fdh过表达时）中看到的Fdh活性不存在于工程化菌株中，这表明该基因被成功敲除。
实施例9
下列实施例显示酿酒酵母菌株M3624的乙醇产率。菌株M3624的基因型为：Δgpd1::GPD2-青春双岐杆菌pflA/pFlB/adhEΔgpd2::GPD1-青春双岐杆菌pflA/pflB/adhEΔfdh1Δfdh2::青春双岐杆菌pflA/pflB/adhE。按照上文实施例8中中使用的相同方法产生菌株M3624。菌株M3624的详细分子图谱示于图43A-D中。图43A显示了在GPD1基因座上的插入；从GPD1启动子表达的GPD2；PFK2t-PFK2终止子；HXT2t-HXT2终止子；pADH1-ADH1启动子；PDC1term-PDC1终止子；FBA1term-FBA1终止子；pTPI1-TPI1启动子；Scer ENO1ter-ENO1终止子。图43B显示了GPD2基因座上的插入；从GPD2启动子表达的GPD1；TDH3term-TDH3终止子；pPFK1-PFK1启动子；HXT2t-HXT2终止子；PDC1term-PDC1终止子；pADH1-ADH1启动子；S.cer ENO1ter-ENO1终止子；FBA1term-FBA1终止子；pTPI1-TPI1启动子。图43C显示了FDH1基因的缺失；产生FDH1的缺失的侧翼区域。图43D显示了FDH2基因座上的插入；pPFK1-PFK1启动子,S.cer ENO1ter-ENO1终止子；pADH1-ADh1启动子；FBA1term-FBA1终止子；PDC1term-PDC1终止子；pTPI-TPI1启动子。
图44中显示的数据显示3.4%的乙醇产率增加是通过甘油的减少和甲酸的产生获得的。M2390是对照菌株，M3515和M3624被工程化为具有基因型Δgpd1::GPD2-青春双岐杆菌pflA/pflB/adhEΔgpd2::GPD1-青春双岐杆菌pflA/PFlB/adhE fdh1Δfdh2Δ::青春双岐杆菌pflA/pflB/adhE。M3027被工程化为具有基因型Δgpd1Δgpd2::GPD1-青春双岐杆菌pflA/PFlB/adhE fdh1Δfdh2Δ::青春双岐杆菌pflA/pflB/adhE.。图框A显示甲酸的浓度的测量，图框B显示甘油浓度的测量，图框C显示乙醇浓度的测量。
已在4个单独的基因座上对M3515和M3624进行了工程化。GPD1基因从GPD2启动子表达，GPD2基因从GPD1启动子表达，FDH1和FDH2基因已被删除。此外，如图43A、B和D中所示，表达青春双歧杆菌pflA、pflB和adhE基因。
实施例10
下列实施例显示酿酒酵母菌株M3465和M3469的乙醇产率。菌株M3465的基因型为：Δgpd2::青春双岐杆菌pflA/pflB/adhEΔfdh1Δfdh2::青春双岐杆菌pflA/pflB/adhE。菌株M3469的基因型为：Δgpd1::青春双岐杆菌pflA/pflB/adhE fdh1Δfdh2Δ::青春双岐杆菌pflA/pflB/adhE。按照上文实施例8中使用的相同方法产生菌株M3465和M3469。菌株M3465和M3469的详细分子图谱分别示于图45A-C和46A-C。图45A显示GPD2基因座上的插入；pPFK1-PFK1启动子；HXT2t-HXT2终止子；PDC1term-PDC1终止子；pADH1-ADH1启动子；S.cer ENO1ter-ENO1终止子；FBA1term-FBA1终止子；pTPI1-TPI1启动子。图45B显示FDH1基因的缺失；产生FDH1的缺失的侧翼区域。图45C显示FDH2基因座上的插入；pPFK1-PFK1启动子；S.cer ENO1ter-ENO1终止子；pADH1-ADh1启动子；FBA1term-FBA1终止子；PDC1term-PDC1终止子；pTPI-TPI1启动子。图46A显示GPD1基因座上的插入；pPFK1-PFK1启动子；HXT2t-HXT2终止子；PDC1term-PDC1终止子；pADH1-ADH1启动子；S.cer ENO1ter-ENO1终止子；FBA1term-FBA1终止子；pTPI1-TPI1启动子。图46B显示FDH1基因的缺失；产生FDH1的缺失的侧翼区域。图46C显示FDH2基因座上的插入；pPFK1-PFK1启动子,S.cer ENO1ter-ENO1终止子；pADH1-ADh1启动子；FBA1term-FBA1终止子；PDC1term-PDC1终止子；pTPI-TPI1启动子。
该实施例显示乙醇产率的增加取决于甘油减少的水平。利用M3465（其包含GPD2、FDH1和FDH2基因的缺失和青春双岐杆菌pflA、pflB和adhE基因从GPD2和FDH2基因座的表达）进行的30%的固体玉米糖化醪的发酵导致1.5%的乙醇滴度的增加。如图47中所示，利用M3469（其包含GPD1、FDH1和FDH2基因的缺失和青春双岐杆菌pflA、pflB和adhE基因从GPD1和FDH2基因座的表达）进行的30%的固体玉米糖化醪的发酵导致2.5%的乙醇滴度的增加。M2390是对照亲本菌株。如图48中显示的，利用M3465和M3469的玉米糖化醪的发酵分别导致低～15%的甘油和低30%的甘油水平。图47和48中所示的M2390是对照菌株。
实施例11
减少甘油形成的替代方法是通过甘油3-磷酸磷酸酶(GPP)基因的缺失。酵母菌属包含两个拷贝的基因GPP1和GPP2。下面的数据显示青春双岐杆菌pflA、pflB和adhE在包含FDH1、FDH2和GPP1或GPP2的缺失的背景中的表达导致减少的甘油形成(图53；菌株比较，min buff培养基，葡萄糖40g/L,厌氧发酵,35℃–72hr)和增加的乙醇产率(图54；菌株比较，min buff培养基，葡萄糖40g/L,厌氧发酵，35℃–72hr)。还观察到甲酸的产生。参见图55(菌株比较，minbuff培养基，葡萄糖40g/L，厌氧发酵，35℃–72hr)。
经工程化以测量甘油形成、乙醇产率和甲酸产量的菌株是酿酒酵母菌株M3297、TB655和TB656。按照上文实施例8中使用的相同方法产生菌株M3297、TB655和TB656。菌株M3297的基因型是：Δfdh1Δfdh2::pflA/pflB/adhE。该菌株仅包含FDH基因的缺失+pflA、pflB和AdhE的表达。菌株TB655的基因型是：Δfdh1Δfdh2::pflA/pflB/adhEΔgpp1::pflA/pflB/adhE。该菌株包含FDH基因的缺失、pflA、pflB和AdhE的表达和GPP1的缺失。参见图51。菌株TB656的基因型是：Δfdh1Δfdh2::pflA/pflB/adhEΔgpp2::pflA/pflB/adhE。该菌株包含FDH基因的缺失、pflA、pflB和AdhE的表达和GPP1的缺失。参见图52。
使用上述方法测量由菌株TB655和TB656产生的乙醇、甘油和甲酸的量。相较于对照菌株M3297，菌株TB655和TB656显示统计上显著的产生的乙醇、甘油和甲酸的量的变化。相对于菌株M3297，菌株TB655(gpp1突变体)显示1.3%的乙醇滴度的增加，10%的甘油的减少和100%的产生的甲酸的增加，而菌株TB656(gpp2突变体)显示0.95%的乙醇滴度的增加，6.1%的甘油形成的减少和100%的产生的甲酸的增加。这些结果显示GPP突变与代谢工程方案的新型组合在厌氧生长过程中平衡氧化还原。
通过引用并入
本文中引用的全部美国专利和美国公布的专利申请通过引用并入本文。
等同物
本领域技术人员将认识到，或能够仅使用常规实验确定本文中描述的本发明的特定实施方案的许多等同物。此类等同物期望被包括在下列权利要求中。
Figure IDA0000420902470000051
Figure IDA0000420902470000061
Figure IDA0000420902470000071
Figure IDA0000420902470000091
Figure IDA0000420902470000101
Figure IDA0000420902470000111
Figure IDA0000420902470000121
Figure IDA0000420902470000131
Figure IDA0000420902470000151
Figure IDA0000420902470000161
Figure IDA0000420902470000171
Figure IDA0000420902470000181
Figure IDA0000420902470000191
Figure IDA0000420902470000201
Figure IDA0000420902470000211
Figure IDA0000420902470000221
Figure IDA0000420902470000231
Figure IDA0000420902470000241
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Figure IDA0000420902470000281
Figure IDA0000420902470000291
Figure IDA0000420902470000301
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Figure IDA0000420902470000321
Figure IDA0000420902470000341
Figure IDA0000420902470000351
Figure IDA0000420902470000361
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Claims (95)

1.一种重组微生物，其包含：
(a)一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失；和
(b)在一个或多个工程化代谢途径中用于将碳水化合物源转化成乙醇的一种或多种天然和/或异源酶，其中所述一种或多种天然和/或异源酶被激活、上调或下调。
2.权利要求1的重组微生物，其中所述重组微生物产生比不具有所述一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的对照重组微生物更少的甘油。
3.权利要求1或2的重组微生物，其中所述碳水化合物源是生物质。
4.权利要求1-3的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpd1多核苷酸、gpd2多核苷酸或gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码。
5.权利要求4的重组微生物，其还包含有效地连接于天然gpd2启动子多核苷酸的天然和/或异源gpd1多核苷酸。
6.权利要求1-3的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpp1多核苷酸、gpp2多核苷酸或gpp1多核苷酸和gpp2多核苷酸编码。
7.权利要求1-6的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于调节甘油合成的天然酶由fps1多核苷酸编码。
8.权利要求1-7的任一项的重组微生物，其中所述工程化代谢途径之一包含丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化。
9.权利要求1-8的任一项的重组微生物，其中所述工程化代谢途径之一包括包括乙酰-CoA至乙醇的转化。
10.权利要求1-9的任一项的重组微生物，其还包含一种或多种由fdh1多核苷酸、fdh2多核苷酸或fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的天然酶的缺失。
11.权利要求1-10的任一项的重组微生物，其中所述微生物产生乙醇。
12.权利要求1-11的任一项的重组微生物，其中所述微生物产生甲酸。
13.权利要求1-12的任一项的重组微生物，其中所述微生物选自酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、解脂耶罗维亚酵母、多形汉森酵母、红发夫酵母、实用假丝酵母、Arxulaadeninivorans、树干毕赤酵母、汉逊德巴利酵母、多型德巴利酵母、粟酒裂殖酵母、白色念珠菌和西方许旺酵母。
14.权利要求13的重组微生物，其中所述微生物是酿酒酵母。
15.权利要求8-14的任一项的重组微生物，其中所述丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)转化成乙酰-CoA和甲酸。
16.权利要求15的重组微生物，其中所述PFL具有原核或真核生物来源。
17.权利要求16的重组微生物，其中所述PFL来自双歧杆菌属、埃希氏菌属、好热厌氧杆菌属、梭菌属、链球菌属、乳杆菌属、衣藻属、单鞭毛菌、新丽鞭毛菌属或芽孢杆菌属中的一种或多种。
18.权利要求16的重组微生物，其中所述PFL来自地衣芽胞杆菌、嗜热链球菌、胚芽乳杆菌、干酪乳杆菌、青春双岐杆菌、解纤维素梭菌、大肠杆菌、莱茵衣藻PflA、单鞭毛菌属E2或新丽鞭毛菌的一种或多种。
19.权利要求15-18的任一项的重组微生物，其中所述PFL来自青春双岐杆菌。
20.权利要求9-19的任一项的重组微生物，其中所述乙酰-CoA被乙醛脱氢酶转化成乙醛，并且其中所述乙醛被醇脱氢酶转化成乙醇。
21.权利要求9-19的任一项的重组微生物，其中所述乙酰-CoA被双功能乙醛/醇脱氢酶转化成乙醇。
22.权利要求20或21的重组微生物，其中所述乙醛脱氢酶、醇脱氢酶或双功能乙醛/醇脱氢酶具有原核或真核生物来源。
23.权利要求20的重组微生物，其中所述乙醛脱氢酶来自C.phytofermentans。
24.权利要求21的重组微生物，其中所述双功能乙醛/醇脱氢酶来自埃希氏菌属、梭菌属、衣藻属、单鞭毛菌属或双歧杆菌属。
25.权利要求21的重组微生物，其中所述双功能乙醛/醇脱氢酶来自大肠杆菌、Clostridium phytofermentans、莱茵衣藻、单鞭毛菌属E2或青春双岐杆菌。
26.权利要求24或25的重组微生物，其中所述双功能乙醛/醇脱氢酶来自青春双岐杆菌或单鞭毛菌属E2。
27.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码，并且其中所述工程化代谢途径之一包括通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化，以及所述工程化代谢途径之一包括通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，并且还包含一种或多种由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的天然酶的缺失。
28.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpp1多核苷酸和gpp2多核苷酸编码，并且所述工程化代谢途径之一包括通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化。
29.权利要求28的重组微生物，其中所述工程化代谢途径之一包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，并且还包含由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的一种或多种天然酶的缺失。
30.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于调节甘油合成的天然酶由fps1多核苷酸编码，并且其中所述工程化代谢途径之一包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化。
31.权利要求30的重组微生物，其中所述工程化代谢途径之一包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，并且还包含由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的一种或多种天然酶的缺失。
32.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于调节甘油合成的天然酶由fps1多核苷酸编码并且所述一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码，其中所述工程化代谢途径之一包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化，以及所述工程化代谢途径之一包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，并且还包含由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的一种或多种天然酶的缺失。
33.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于调节甘油合成的天然酶由fps1多核苷酸编码，并且其中所述工程化代谢途径之一包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化，以及所述工程化代谢途径之一包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，并且还包含由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的一种或多种天然酶的缺失。
34.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码，并且其中所述工程化代谢途径之一包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化，以及所述工程化代谢途径之一包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，并且还包含有效地连接于天然gpd2启动子多核苷酸的天然和/或异源gpd1多核苷酸。
35.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码，并且其中所述工程化代谢途径之一包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化，以及所述工程化代谢途径之一包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，并且还包含有效地连接于天然gpd2启动子多核苷酸的天然和/或异源gpd1多核苷和由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的一种或多种天然酶的缺失。
36.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码并且所述一种或多种用于调节甘油合成的天然酶由fps1多核苷酸编码，并且其中所述工程化代谢途径之一包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化，以及所述工程化代谢途径之一包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，并且还包含有效地连接于天然gpd2启动子多核苷酸的天然和/或异源gpd1多核苷酸。
37.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码并且所述一种或多种用于调节甘油合成的天然酶由fps1多核苷酸编码，并且其中所述工程化代谢途径之一包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化，以及所述工程化代谢途径之一包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，并且还包含有效地连接于天然gpd2启动子多核苷酸的天然和/或异源gpd1多核苷酸和由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的一种或多种天然酶的缺失。
38.权利要求1-37的任一项的重组微生物，其中一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失使甘油形成减少：
(a)超过约10%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；
(b)超过约20%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；
(c)超过约30%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；
(d)超过约40%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；
(e)超过约50%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；
(f)超过约60%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；
(g)超过约70%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；
(h)超过约80%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；
(i)超过约90%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；
(j)超过约95%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油；或
(k)超过约99%的由不具有一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物产生的甘油。
39.权利要求1-38的任一项的重组微生物，其中所述重组微生物产生选自如下的量的甲酸：
(a)在24小时内至少约0.012g/L；
(b)在48小时内至少约0.022g/L；或
(c)在142小时内至少约2.5g/L。
40.权利要求1-39的任一项的重组微生物，其中所述重组微生物产生选自如下的甲酸产率：
(a)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约0.05倍的甲酸；
(b)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约0.1倍的甲酸；
(c)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约0.5倍的甲酸；
(d)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约1.0倍的甲酸；
(e)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约5.0倍的甲酸；
(f)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约10.0倍的甲酸；
(g)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约20.0倍的甲酸；
(h)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约30.0倍的甲酸；
(i)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约40.0倍的甲酸；
(j)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约50.0倍的甲酸；
(k)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约75.0倍的甲酸；或
(l)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约100倍的甲酸。
41.权利要求1-40的任一项的重组微生物，其中所述微生物产生选自如下的乙醇产率：
(a)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约1%的乙醇；
(b)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约2%的乙醇；
(c)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约3%的乙醇；
(d)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约4%的乙醇；
(e)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约5%的乙醇；
(f)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约10%的乙醇；
(g)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约20%的乙醇；
(h)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约30%的乙醇；
(i)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约40%的乙醇；
(j)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约50%的乙醇；
(k)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约60%的乙醇；
(l)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约70%的乙醇；
(m)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约80%的乙醇；
(n)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约90%的乙醇；
(o)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约95%的乙醇；或
(p)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物产生的多至少约99%的乙醇。
42.权利要求1-41的任一项的重组微生物，其中碳水化合物源至乙醇的转化是在缺氧条件下进行的。
43.权利要求1-42的任一项的重组微生物，其中所述重组微生物在缺氧条件下具有选自如下的乙酸摄取(g/L)；
(a)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约1%的乙酸摄取；
(b)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约10%的乙酸摄取；
(c)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约20%的乙酸摄取；
(d)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约30%的乙酸摄取；
(e)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约40%的乙酸摄取；
(f)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约50%的乙酸摄取；
(g)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约60%的乙酸摄取；
(h)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约70%的乙酸摄取；
(i)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约80%的乙酸摄取；和
(j)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物摄取的多至少约90%的乙酸摄取。
44.权利要求1-43的任一项的重组微生物，其中所述重组微生物以相较于无一种或多种用于产生甘油和/或调节甘油合成的天然酶的缺失的重组微生物更低的葡萄糖利用率产生更多的乙醇，其中所述葡萄糖利用率选自：
(a)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约1%的每小时使用的葡萄糖；
(b)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约5%的每小时使用的葡萄糖；
(c)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约10%的每小时使用的葡萄糖；
(d)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约20%的每小时使用的葡萄糖；
(e)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约30%的每小时使用的葡萄糖；
(f)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约40%的每小时使用的葡萄糖；
(g)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约50%的每小时使用的葡萄糖；
(h)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约60%的每小时使用的葡萄糖；
(i)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约70%的每小时使用的葡萄糖；
(j)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约80%的每小时使用的葡萄糖；和
(k)比由不具有一种或多种天然和/或异源酶的激活、上调或下调的重组微生物使用的少至少约90%的每小时使用的葡萄糖。
45.一种重组微生物，其包含：
(a)一种或多种用于调节甘油合成的异源酶，其中所述一种或多种异源酶被激活、上调或下调；和
(b)在一个或多个工程化代谢途径中用于将碳水化合物源转化成乙醇的一种或多种天然和/或异源酶，其中所述一种或多种天然和/或异源酶被激活、上调或下调。
46.权利要求45的重组微生物，其中所述一种或多种用于调节甘油合成的异源酶由fps1多核苷酸编码。
47.权利要求46的重组微生物，其中所述fps1多核苷酸来自大肠杆菌。
48.权利要求45-47的任一项的重组微生物，其中所述工程化代谢途径之一包括丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化。
49.权利要求45-48的任一项的重组微生物，其中所述工程化代谢途径之一包含乙酰-CoA至乙醇的转化。
50.权利要求45-49的任一项的重组微生物，其还包含由fdh1多核苷酸、fdh2多核苷酸或fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的一种或多种天然酶的缺失。
51.权利要求45-50的任一项的重组微生物，其中所述微生物产生乙醇。
52.权利要求45-51的任一项的重组微生物，其中所述微生物产生甲酸。
53.权利要求45-52的任一项的重组微生物，其中所述微生物选自酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、解脂耶罗维亚酵母、多形汉森酵母、红发夫酵母、实用假丝酵母、Arxulaadeninivorans、树干毕赤酵母、汉逊德巴利酵母、多型德巴利酵母、粟酒裂殖酵母、白色念珠菌和西方许旺酵母。
54.权利要求53的重组微生物，其中所述微生物是酿酒酵母。
55.权利要求48-54的任一项的重组微生物，其中所述丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)转化成乙酰-CoA和甲酸。
56.权利要求55的重组微生物，其中所述PFL具有原核或真核生物来源。
57.权利要求56的重组微生物，其中所述PFL来自双歧杆菌属,埃希氏菌属、好热厌氧杆菌属、梭菌属、链球菌属、乳杆菌属、衣藻属、单鞭毛菌、新丽鞭毛菌属或芽孢杆菌属的一种或多种。
58.权利要求56的重组微生物，其中所述PFL来自地衣芽孢杆菌、嗜热链球菌、胚芽乳杆菌、干酪乳杆菌、青春双岐杆菌、解纤维素梭菌、大肠杆菌、莱茵衣藻PflA、单鞭毛菌属E2或新丽鞭毛菌的一种或多种。
59.权利要求55-58的任一项的重组微生物，其中所述PFL来自青春双岐杆菌。
60.权利要求49-59的任一项的重组微生物，其中所述乙酰-CoA被乙醛脱氢酶转化成乙醛；并且其中所述乙醛被醇脱氢酶转化成乙醇。
61.权利要求49-59的任一项的重组微生物，其中所述乙酰-CoA被双功能乙醛/醇脱氢酶转化成乙醇。
62.权利要求60或61的重组微生物，其中所述乙醛脱氢酶、醇脱氢酶或双功能乙醛/醇脱氢酶具有原核或真核生物来源。
63.权利要求60的重组微生物，其中所述乙醛脱氢酶来自C.phytofermentans。
64.权利要求61的重组微生物，其中所述双功能乙醛/醇脱氢酶来自埃希氏菌属、梭菌属、衣藻属、单鞭毛菌属或双歧杆菌属。
65.权利要求64的重组微生物，其中所述双功能乙醛/醇脱氢酶来自大肠杆菌、Clostridium phytofermentans、莱茵衣藻、单鞭毛菌属E2或青春双岐杆菌。
66.权利要求64或65的重组微生物，其中所述双功能乙醛/醇脱氢酶来自青春双岐杆菌或单鞭毛菌属E2。
67.一种用于减少细胞甘油的方法，包括将生物质与根据权利要求1-66的任一项的重组微生物接触。
68.一种用于增加胞质甲酸的方法，包括将生物质与根据权利要求8-33或48-66的任一项的重组微生物接触。
69.一种用于将生物质转化成乙醇的方法，包括将生物质与根据权利要求1-66的任一项的重组微生物接触。
70.权利要求69的方法，其中所述生物质包含木质纤维素生物质。
71.权利要求70的方法，其中所述木质纤维素生物质选自草、柳枝稷、大米草、黑麦草、草芦、混合草原禾草、芒草、糖加工残渣、甘蔗渣、甘蔗秆、农业废物、稻秆、稻壳、大麦秆、玉米穗轴、谷类秆、小麦秆、芸苔秆、燕麦秆、燕麦壳、玉米纤维、秸杆、大豆秸杆、玉米秸杆、林业废物、再循环木浆纤维、纸污泥、锯屑、硬木、软木、龙舌兰及其组合。
72.权利要求69的方法，其中所述生物质是玉米糖化醪或玉米淀粉。
73.权利要求3的重组微生物，其中所述生物质包含木质纤维素生物质。
74.权利要求72的重组微生物，其中所述木质纤维素生物质选自草、柳枝稷、大米草、黑麦草、草芦、混合草原禾草、芒草、糖加工残渣、甘蔗渣、甘蔗秆、农业废物、稻秆、稻壳、大麦秆、玉米穗轴、谷类秆、小麦秆、芸苔秆、燕麦秆、燕麦壳、玉米纤维、秸杆、大豆秸杆、玉米秸杆、林业废物、再循环木浆纤维、纸污泥、锯屑、硬木、软木、龙舌兰及其组合。
75.权利要求3的重组微生物，其中所述生物质是玉米糖化醪或玉米淀粉。
76.权利要求1-66的任一项的重组微生物，其中所述微生物还包含一种或多种天然和/或异源酶，所述酶在一个或多个工程化代谢途径中用于将木糖转化成木酮糖-5-磷酸和/或将阿拉伯糖转化成木酮糖-5-磷酸，其中一种或多种天然和/或异源酶被激活、上调或下调。
77.权利要求1-66的任一项的重组微生物，其中所述工程化代谢途径之一包含碳水化合物源至一种或多种糖单元的转化。
78.权利要求77的重组微生物，其中所述工程化代谢途径包含一种或多种编码糖解酶的天然和/或异源酶。
79.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码，并且其中所述工程化代谢途径之一包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化，所述工程化代谢途径之一包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，以及所述工程化代谢途径之一包含通过糖解酶进行的碳水化合物源至一种或多种糖单元的转化，并且还包含由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的一种或多种天然酶的缺失。
80.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpp1多核苷酸和gpp2多核苷酸编码，并且所述工程化代谢途径之一包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化，以及所述工程化代谢途径之一包含通过糖解酶进行的碳水化合物源至一种或多种糖单元的转化。
81.权利要求80的重组微生物，其中所述工程化代谢途径之一包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，并且还包含由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的一种或多种天然酶的缺失。
82.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于调节甘油合成的天然酶由fps1多核苷酸编码，并且所述工程化代谢途径之一包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化，以及所述工程化代谢途径之一包含通过糖解酶进行的碳水化合物源至一种或多种糖单元的转化。
83.权利要求82的重组微生物，其中所述工程化代谢途径之一包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，并且还包含由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的一种或多种天然酶的缺失。
84.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于调节甘油合成的天然酶由fps1多核苷酸编码并且所述一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码，其中所述工程化代谢途径之一包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化，所述工程化代谢途径之一包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，以及所述工程化代谢途径之一包含通过糖解酶进行的碳水化合物源至一种或多种糖单元的转化，并且还包含由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的一种或多种天然酶的缺失。
85.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于调节甘油合成的天然酶由fps1多核苷酸编码，其中所述工程化代谢途径之一包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化，所述工程化代谢途径之一包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，以及所述工程化代谢途径之一包含通过糖解酶进行的碳水化合物源至一种或多种糖单元的转化，并且还包含由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的一种或多种天然酶的缺失。
86.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码，并且其中所述工程化代谢途径之一包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化，所述工程化代谢途径之一包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，以及所述工程化代谢途径之一包含通过糖解酶进行的碳水化合物源至一种或多种糖单元的转化，并且还包含有效地连接于天然gpd2启动子多核苷酸的天然和/或异源gpd1多核苷酸。
87.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码，并且其中所述工程化代谢途径之一包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化，所述工程化代谢途径之一包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，以及所述工程化代谢途径之一包含通过糖解酶进行的碳水化合物源至一种或多种糖单元的转化，并且还包含有效地连接于天然gpd2启动子多核苷酸的天然和/或异源gpd1多核苷酸和由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的一种或多种天然酶的缺失。
88.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码并且一种或多种用于调节甘油合成的天然酶由fps1多核苷酸编码，并且其中所述工程化代谢途径之一包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化，所述工程化代谢途径之一包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，以及所述工程化代谢途径之一包含通过糖解酶进行的碳水化合物源至一种或多种糖单元的转化，并且还包含有效地连接于天然gpd2启动子多核苷酸的天然和/或异源gpd1多核苷酸。
89.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpd1多核苷酸和gpd2多核苷酸编码，以及所述一种或多种用于调节甘油合成的天然酶由fps1多核苷酸编码，并且其中所述工程化代谢途径之一包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化，所述工程化代谢途径之一包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，以及所述工程化代谢途径之一包含通过糖解酶进行的碳水化合物源至一种或多种糖单元的转化，还包含有效地连接于天然gpd2启动子多核苷酸的天然和/或异源gpd1多核苷酸以及由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的一种或多种天然酶的缺失。
90.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpd2多核苷酸编码，并且其中所述工程化代谢途径之一包含通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化，所述工程化代谢途径之一包含通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，以及所述工程化代谢途径之一包含通过糖解酶进行的碳水化合物源至一种或多种糖单元的转化，并且还包含由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的一种或多种天然酶的缺失。
91.权利要求78-89的任一项的重组微生物，其中所述糖解酶选自淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、纤维素分解和淀粉分解辅助酶、菊糖酶、果聚糖酶和戊糖利用酶。
92.权利要求78-90的任一项的重组微生物，其中所述糖解酶来自微生物，所述微生物选自灰腐质霉（H.grisea）、嗜热子囊茵、埃默森篮状菌（T.emersonii）、里氏木霉、澳洲乳白蚁（C.lacteus）、台湾乳白蚁、高山象白蚁（N.takasagoensis）、澳大利亚矛颚家白蚁（C.acinaciformis）、达尔文澳白蚁、N.walkeri、扣囊复膜酵母、C.lucknowense、黄胸散白蚁（R.speratus）、嗜热放线菌、热纤梭菌、解纤维素梭菌、约氏梭菌、短小芽孢杆菌、粪碱纤维单胞菌、多糖降解菌、Piromyces equii、Neocallimastix patricarum、拟南芥和扣囊复膜酵母。
93.权利要求92的重组微生物，其中所述糖解酶是扣囊复膜酵母菌葡糖淀粉酶(glu-0111-CO)。
94.权利要求1-26的任一项的重组微生物，其中所述一种或多种用于产生甘油的天然酶由gpp1多核苷酸或gpp2多核苷酸编码，并且其中所述工程化代谢途径之一包括通过丙酮酸甲酸裂解酶进行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的转化。
95.权利要求94的重组微生物,其中所述工程化代谢途径之一包括通过双功能乙醛/醇脱氢酶进行的乙酰-CoA至乙醇的转化，并且还包括由fdh1多核苷酸和fdh2多核苷酸编码的一种或多种天然酶的缺失。
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