KR101202737B1 - 재조합 효모를 이용한 글리세롤로부터 에탄올의 제조방법 - Google Patents

재조합 효모를 이용한 글리세롤로부터 에탄올의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글리세롤로부터 에탄올을 생산하기 위한 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 유래의 pdc와 adhB 유전자를 메탄올 이용효모인 한세눌라 폴리모르파에 도입하고 또한 보다 효과적인 글리세롤 이용을 위해 크렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae ) 유래의 dhaD 및 dhaKLM 유전자를 추가로 도입하여, 상기 유전자가 과발현된 재조합 효모를 이용하는 것을 특징으로 하는 에탄올 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 재조합 균주를 이용한 에탄올의 제조방법을 이용하면, 발효를 통하여 글리세롤로부터 에탄올의 생산량을 증가시키는 효과가 있다.

Description

재조합 효모를 이용한 글리세롤로부터 에탄올의 제조방법 {Method for Producing Ethanol from Glycerol by Using Recombinant Yeast}
본 발명은 글리세롤로부터 에탄올을 생산하기 위한 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 유래의 파이루베이트 디카르복실라아제(pdc; pyruvate decarboxylase)와 알코올 디하이드로지네이즈(adhB; alcohol dehydrogenase Ⅱ)를 코딩하는 유전자를 메탄올 이용효모인 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)에 도입하고 또한 보다 효과적인 글리세롤 이용을 위해 크렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae) 유래의 글리세롤 디하이드로게나아제(dhaD; glycerol dehydrogenase) 및 디하드록시아세톤 키나아제(dhaKLM; dihydroxyacetone kinase)를 코딩하는 유전자를 추가로 도입하여, 상기 유전자가 과발현된 재조합 효모를 이용하는 것을 특징으로 하는 에탄올 제조방법에 관한 것이다.
현재, 바이오 디젤 전체생산의 약 10%(w/w)는 제조 공정의 주된 부산물로서 만들어지는 폐 글리세롤로부터 만들어진다(Johnson and Taconi, 2007). 이러한 폐 글리세롤은 기존의 전통적인 글리세롤시장의 가격에 영향을 미칠 뿐 아니라, 직접 환경에 방출될 수 없기 때문에 처리비용 등, 중요한 환경 문제도 포함하고 있다(da Silva et al. 2009). 따라서 저비용의 폐 글리세롤을 이용하여 연료 및 생리 활성 물질을 포함한 산업적으로 가치 있는 물질로 전환하기 위한 방법개발이 한창 진행중이다.
글리세롤은 락토바실러스 속(genus Lactobacillus), 클로스트리듐 속(genus Clostridium), 엔테로박터 속(genus Enterobacter), 크렙시엘라 속(genus Klebsiella)을 포함한 박테리아 이외의 대부분의 미생물에서는 비 발효성 물질이다. 최근 곤잘레스 연구그룹은 대장균으로부터 혐기성 발효에 의해 글리세롤로부터 새로운 대사 물질인 연료와 화학제품을 생산했다(Dharmadi et al. 2006; Gonzalez et al. 2008; Murarka et al. 2008). 게다가 글리세롤로부터의 에탄올 생산 비용은 옥수수 유래의 설탕으로부터 생산한 가격과 비교해 40%보다 낮은 수준이다(Yazdani and Gonzalez, 2007). 따라서 글리세롤로부터 에탄올 및 부산물의 효과적인 발효전환을 위한 대장균의 유전공학적 기법개발이 탄력을 받고 있다 (Yazdani and Gonzalez 2008; Durnin et al. 2009).
메탄올 이용효모(methylotrophic yeast)인 한세눌라 폴리모르파는 이종 단백질 생산(Gellissen, 2002) 등에 이용되는 가장 중요한 효모 (yeast) 중 하나이다. 더욱이 한세눌라 폴리모르파는 바이오메스 구성물질인 헤미셀룰로즈로부터 유래된 오탄당인 자일로즈를 발효시킬 수 있으므로 에탄올 생산에 유용한 잠재력을 가지고 있다(Ryabova et al. 2003; Guerra et al. 2005).
이에 본 발명자들은 글리세롤로부터 에탄올 생산을 개발하고 개량하기 위해 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 유래의 pdc 및 adhB 유전자를 메탄올 이용효모인 한세눌라 폴리모르파에 도입하고 또한 보다 효과적인 글리세롤 이용을 위해 크렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae ) 유래의 dhaD 및 dhaKLM 유전자를 추가로 도입한 상기 유전자가 과발현된 재조합 효모를 제작하여 에탄올의 제조방법에 관한 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 에탄올 생산관련 외래유전자 및 글리세롤 이용관련 외래유전자를 한세눌라 폴리모르파에 도입하여, 에탄올 생산관련 외래유전자 및 글리세롤 이용관련 외래유전자가 과발현된 재조합 효모를 이용하여 글리세롤로부터 에탄올을 생산하기 위한 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 한셀루나 폴리모르파에 pdc 및 adhB 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는, 에탄올 고생성능을 가지는 재조합 효모를 제공한다.
본 발명은 또한, 한셀루나 폴리모르파에 pdc 및 adhB 유전자가 도입되어 있고, dhaD 및 dhaKLM 유전자 중 하나 이상이 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 재조합 효모를 제공한다.
본 발명은 또한, 한셀루나 폴리모르파에 pdc 및 adhB 유전자가 도입되어 있는 재조합 효모를 배양하여 에탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 에탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 한셀루나 폴리모르파에 pdc 및 adhB 유전자가 도입되어 있고, dhaD 및 dhaKLM 유전자 중 하나 이상이 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 효모를 글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 에탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 에탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, pdc 및 adhB 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는, 에탄올 고생성능을 가지는 재조합 효모의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, pdc 및 adhB 유전자가 도입되어 있고, dhaD 및 dhaKLM 유전자 중 하나 이상이 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는, 글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 재조합 효모의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 한세눌라 폴리모르파에 에탄올 생산관련 유전자 및 글리세롤 이용관련 유전자를 도입한 재조합 효모를 제공하여, 발효를 통하여 글리세롤로부터 에탄올 생산량을 증가시키는 방법을 제공하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 pdc 유전자, adhB 유전자 및 dhaDKLM유전자를 함유하는 에탄올 생산을 위한 재조합벡터의 제조과정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 재조합 균주에서 글리세롤로부터 에탄올의 생산 대사 경로를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 재조합 균주의 에탄올 생산량 및 성장곡선을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 파이루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자 및 알코올 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는, 에탄올 고생성능을 가진 재조합 효모에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 기탁번호 KCTC 11687BP인 에탄올 고생성능을 가지는 재조합 효모에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 파이루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자 및 알코올 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 글리세롤 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 디하이드록시아세톤 키나아제를 코딩하는 유전자 중 하나 이상이 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는, 글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 재조합 효모에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 기탁번호 KCTC 11688BP 인 글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 재조합 효모에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 파이루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 속 유래 pdc이고, 상기 알코올 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 속 유래 adhB인 것을 특징으로 하는, 에탄올 고생성능을 가진 재조합 효모일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 글리세롤 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 크렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae ) 속 유래의 dhaD이고, 상기 디하이드록시아세톤 키나아제를 코딩하는 유전자는 크렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae) 속 유래의 dhaKLM인 것을 특징으로 하는, 글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가진 재조합 효모일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 파이루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자 및 알코올 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 효모를 배양하여 에탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 에탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 파이루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자 및 알코올 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 글리세롤 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 디하이드록시아세톤 키나아제를 코딩하는 유전자 중 하나 이상이 추가로 도입되어 있는 재조합 효모를 글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 에탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 에탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 파이루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자 및 알코올 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는, 에탄올 고생성능을 가지는 재조합 효모의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 파이루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자 및 알코올 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 글리세롤 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 디하이드록시아세톤 키나아제를 코딩하는 유전자 중 하나 이상이 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는, 글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 재조합 효모의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 효모는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 효모는 한세눌라 폴리모르파인 것이 바람직하나, 에탄올 생산에 활용될 수 있는 효모이면 이에 국한되는 것은 아니고, 에탄올 생산에 활용될 수 있는 효모인 사카로미세스(Saccharomyces), 피치아 (Pichia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 글리세롤 디하이드로게나아제 및 상기 디하이드록시아세톤 키나아제를 코딩하는 유전자는 크렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae ) 속 유래의 dahD 및 dahKLM에 국한되는 것은 아니고, 글리세롤 발효 미생물인 락토바실러스 속(genus Lactobacillus), 클로스트리듐 속(genus Clostridium), 엔테로박터 속(genus Enterobacter) 유래의 dhaD 및 dahKLM일 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 서열번호 1 및 2의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 파이루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자를 증폭하고, 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 알코올 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자를 증폭하였다. 또한, 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 글리세롤 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 증폭하고, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 디하이드록시아세톤 키나아제를 코딩하는 유전자를 증폭하였다. 이러한 에탄올 관련 외래 유전자 및 글리세롤 이용관련 외래 유전자들의 과발현을 유도하기 위하여, 서열번호 13 및 14의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 GAPDH 프로모터를 증폭하고, 서열번호 15 및 16의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 AXO 터미네이터를 증폭한 후, Leucine을 선별마커로 사용할 수 있는 한세눌라 폴리모르파 발현벡터 pYHSA161에 클로닝하여 pYH-pdc-adhB, pYH-dhaDKLM 및 pYH-pdc-adhB-dhaDKLM 를 제조하였다. 그 다음, 제조한 플라스미드를 한셀루나 폴리모르파 효모에 형질전환시키고, Leucine를 선별마커로 활용하여 형질전환된 균주를 Leucine을 포함하지 않는 최소배지에 도말한 다음, 3~4일 후에 얻어진 형질전환된 균주들을 YPD 액체배지에서 24시간마다 4~5일간 계대배양하여 에탄올 발현벡터를 안정화한 후, YPD plate에서 3계대배양한 후 에탄올 생산주를 획득하였다.
본 발명에서 GAPDH 프로모터는 매우 강력하면서도 탄소원에 따른 별도의 발현 유도 과정이 필요없는 프로모터로써, 본 발명의 각각의 유전자의 상류에 GAPDH 프로모터를 연결하여 유전자의 과발현을 유도하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 재조합 균주를 2％ 글리세롤을 탄소원으로 하여 생산된 에탄올 생산량을 분석한 결과, pdc 및 adhB 유전자를 도입한 재조합 균주의 경우에 에탄올 생산량이 증가함을 확인하였고, dhaD 및 dhaKLM 유전자를 추가로 도입한 재조합 균주의 경우에는 에탄올 생산량이 더욱 증가함을 확인하였다.
본 발명에 따른 재조합 효모를 글리세롤을 탄소원으로 함유하는 배지에서 배양하여 에탄올이 생성되는 것은 글리세롤이 글리세롤 디하이드로게나아제에 의해 디하이드록시아세톤으로 전환되고, 디하이드록시아세톤이 디하이드록시아세톤 키나아제에 의해 인산기를 전달받은 후 파이루베이트로 전환된 다음, 파이루베이트 디카르복실라아제에 의해 아세트알데히드로 전환되고, 알코올 디하이드로지네이즈에 의해 에탄올로 전환되는 것으로 추정할 수 있다(도 2).
본 발명에서, '선별마커'란 특정 유전자의 산물을 말하는 것으로, 이 산물을 포함하는 미생물은 포함되지 않은 미생물에는 나타나지 않는 특별한 형질을 나타내어 쉽게 구별할 수 있게 된다.
본 발명에서, '최소배지'란 통상 영양요구성 돌연변이주를 선택하기 위한 배지로, 야생형 균이 자라는데 필요한 최소한의 성분만을 함유한 배지를 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
pdc , adhB 및 dhaDKLM 유전자 과발현 균주의 제조
파이루베이트 디카르복실라아제와 알코올 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자 및 글리세롤 디하이드로게나아제 및 디하이드록시아세톤 키나아제를 코딩하는 유전자를 수득하기 위하여, 각각 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 균주 및 크렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae)를 배양하여, 염색체 DNA를 수득하였다.
자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 균주의 염색체 DNA를 각각 주형으로 하여 PCR 방법으로 파이루베이트 디카르복실라아제와 알코올 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자를 증폭하였다. 이에 사용된 프라이머쌍들의 염기서열은 아래와 같다.
<pdc 유전자 단편 증폭용 프라이머쌍>
서열번호 1 : 5-CCTCTAGA ATGAGTTATACTGTCGGTACCTATTTAGC-3 (pdc - XbaI-F)
서열번호 2 : 5-CCCTCGAG CTGCAG CTAGAGGAGCTTGTTAACAGGCTTAC-3
(pdc - XhoI - PstI-R)
<adhB 유전자 단편 증폭용 프라이머쌍>
서열번호 3 : 5-CCAGATCT ATGGCTTCTTCAACTTTTTATATTCC-3 (adhB - BglII-F)
서열번호 4 : 5-CCCTCGAG TCTAGA TTAGAAAGCGCTCAGGAAGAGTT-3
(adhB - XhoI - XbaI-R)
크렙시엘라 (Klebsiella pneumoniae ) MGH78578 균주의 염색체 DNA를 각각 주형으로 하여 글리세롤 디하이드로게나아제 및 디하이드록시아세톤 키나아제를 코딩하는 유전자를 PCR 방법으로 증폭하였으며, 이에 사용된 프라이머쌍들의 염기서열은 아래와 같다.
<dhaD 유전자 단편 증폭용 프라이머쌍>
서열번호 5 : 5-CCCGGG ATGCTAAAAGTTATTCAA-3 (dhaD - SmaI-F)
서열번호 6 : 5-CTCGAG TTAACGCGCCAGCCACTG-3 (dhaD - XhoI-R)
<dhaK 유전자 단편 증폭용 프라이머쌍>
서열번호 7 : 5-CCCGGG ATGAAAAAGCTGATTAAC-3 (dhaK - SmaI-F)
서열번호 8 : 5-CTCGAG TTAGTTTCCCCAGTTCAG-3 (dhaK - XhoI-R)
<dhaL 유전자 단편 증폭용 프라이머쌍>
서열번호 9 : 5-CCCGGG ATGTCACTGAACAGAACG-3 (dhaL - SmaI-F)
서열번호 10 : 5-CTCGAG TTACTCTTTGGCGGCGGC-3 (dhaL - XhoI-R)
<dhaM 유전자 단편 증폭용 프라이머쌍>
서열번호 11 : 5-CCCGGGATGGTAAACCTGGTTATT-3 (dhaM - SmaI-F)
서열번호 12 : 5-CTCGAGTTAGTCACGGATAAGGCG-3 (dhaM - XhoI-R)
상기 증폭된 pdc , adhB 및 dhaDKLM 유전자 DNA 단편을 pGEM T Easy 벡터(Promega, 미국)를 이용하여 클로닝하여 염기서열을 확인하였다. 각각의 유전자들의 과발현을 유도하기 위하여, 하기의 프라이머쌍을 사용하여, 각 유전자의 상류에 강력한 프로모터인 GAPDH 프로모터 (pGAP)을 삽입하고 하류에는 AXO 터미네이터(tT)를 각각의 유전자에 연결하였다 (도 1).
<GAPDH 프로모터 증폭용 프라이머쌍>
서열번호 13 : 5-GCGGCCGC GCTAGCCCTTTGCTCAATGCCGTTTT-3 (pGAP- NotI - NheI-F)
서열번호 14 : 5-GCGGCCGC ACTAGT GGATCC CCCGGG ATTGTTTCTATATTATCTTT-3
(pGAP- NotI - SpeI - BamHI - SmaI -R)
<AXO 터미네이터 증폭용 프라이머쌍>
서열번호 15 : 5-GGATCC CTCGAGCCTTAGACATGACTGTTCCT-3 (tT- BamHI - XhoI-F)
서열번호 16 : 5-ACTAGTAAGCTTGCACAAACGAACTT-3 (tT- SpeI -R)
GAPDH 프로모터에 연결된 pdc , adhB 및 dhaDKLM 유전자들을 아미노산 Leucine을 선별마커로 사용가능한 한세눌라 폴리모르파 발현벡터 pYHSA161벡터(Heo et al., FEMS Yeast Research 4: 175-184, 2003)에 재클로닝하여 각각 pYH-pdc-adhB 및 pYH-dhaDKLM 플라스미드를 제작하였으며, 또한, pdc , adhB 및 dhaDKLM 유전자를 동시에 발현하기 위한 pYH-pdc-adhB-dhaDKLM 플라스미드를 제작하였다. pYHSA161벡터는 pKS 벡터를 backbone으로 하여 한세눌라 폴리모르파 균주에서 선별이 가능할 수 있도록 아미노산 Leucine을 선별 마커로 사용하기 위하여 Leucine gene을 도입하여 클로닝하였고 또한 target gene을 다수 도입하기 위하여 일종의 항생제 유전자인 G418 gene을 도입하여 제작되었다. 또한, pYHSA161벡터는 플라스미드의 자체 복제(replication)가 가능할 수 있도록 ARS(Auto replication sequence)를 포함하는 특징을 가진 플라스미드이다. 제작된 상기 pYH-pdc-adhB, pYH-dhaDKLM 및 pYH-pdc-adhB-dhaDKLM 플라스미드를 각각 전통적인 효모 형질전환법인 DMSO 및 Lithium acetate 를 사용하는 방법으로 H. polymorpha DL1-L 게놈 유전자에 도입하여 재조합 균주를 제조하였으며, 숙주세포 H. polymorpha DL1-L을 대조군 균주로 사용하였다. H. polymorpha DL1-L은 Leucine을 선별 마커로서 사용할 수 있으므로 형질전환된 균주를 Leucine를 포함하지 않는 최소배지에 도말한 다음, 3-4일 후에 얻어진 형질전환 균주들을 모두 pooling 하여 YPD 액체배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 글루코즈)에서 매 24시간 마다 4-5일간 계대배양하여 게놈 DNA에 에탄올 발현벡터를 안정화하였다. 이후 G418(Geneticin) 농도를 각각 0 mg/mL, 2 mg/mL, 4 mg/mL로 달리하여 발현벡터의 다중카피수 도입을 유도하여 최종적으로 형질전환된 균주들을 YPD plate에서 3 계대배양후 에탄올 생산주를 획득하였고, pYH-pdc-adhB로 형질전환된 재조합 균주, pYH-pdc-adhB-dhaDKLM로 형질전환된 재조합 균주를 한국생명공학연구원 유전자은행에 각각 KCTC 11687BP, KCTC 11688BP의 수탁번호로 기탁하였다.
재조합 균주의 에탄올 생산성 분석
실시예 1에서 제작된 pYH-pdc-adhB 및 pYH-pdc-adhB-dhaDKLM 플라스미드가 형질전환된 재조합 균주의 에탄올 생산성을 분석하기 위하여, 상기 재조합 균주들을 2% 글리세롤을 탄소원으로 하여 생산된 에탄올 생산량을 HPLC 분석법을 통하여 정량하였다. 배양 조건은 배양볼륨 100 ml/250 ml, 배양온도 30°C, 현탁속도 100 rpm에서 8일간 배양하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 형질전환된 재조합균주는 대조군에 비하여 세포 증식은 약간 감소하는 반면 에탄올 생산량은 대조군(0.83g/L)에 비하여 HpDL1-L/pYH-pdc-adhB균주는 약 3.3배 증가한 2.74g/L의 에탄올 생산을, HpDL1-L/pYH-pdc-adhB-dhaDKLM균주는 조금 더 증가한 약 3.8 배 증가한 3.08g/L의 높은 에탄올 생산량(고생성능)을 나타내었다.
재조합 균주들의 효소활성 검증
실시예 1에서 제작한 재조합 균주들의 효소활성을 측정하기 위하여, 에탄올 생산주를 적정배지에서 배양한 다음, 50mM potassium phosphate buffer(pH 7.5)로 세척한 후 다시 녹여 sonication법으로 분쇄하였다. 파이루베이트 디카르복실라아제의 효소활성을 측정하기 위한 효소 활성분석 혼합액은 배양 균주 분쇄액에 imidazole hydrochloride buffer (pH 6.5) (40 mM), MgCl2 (5 mM), thiamine pyrophosphate (0.2 mM) 및 NADH(0.15 mM)을 첨가하고, alcohol dehydrogenase (Boehringer)가 88 U가 되도록 첨가하여 제조되었다. 그 다음, 50 mM 파이루베이트를 첨가하여 반응을 시작하였다. 반응은 30℃에서 30분간 반응한 뒤 340 nm에서 흡광도를 측정하였다.
알콜 디하이드로지네이즈의 효소활성을 측정하기 위한 효소 활성분석 혼합액은 배양 균주 분쇄액에 glycine-KOH buffer (pH 9.0) (50 mM) 및 NAD+ (1 mM)를 첨가하여 제조되었고, 제조된 혼합액에 100 mM ethanol을 첨가하여 반응을 시작하였다. 반응은 30℃에서 30분간 반응한 뒤 340 nm에서 흡광도를 측정하였다 (Postma E. et al, Appl Environ Microbiol ., 55: 468-477, 1989).
그 결과, 재조합 균주들의 효소활성은 표 1에 나타난 바와 같이, HpDL1-L/pYH-pdc-adhB균주와 HpDL1-L/pYH-pdc-adhB-dhaDKLM균주는 대조군인 HpDL1-L균주에 비하여 파이루베이트 디카르복실라아제 및 알코올 디하이드로지네이즈의 효소활성은 각각 약 21%, 28%와 70%, 63% 증가하였고, 글리세롤 디하이드로게나아제의 효소활성은 10% 와 54% 증가하였다.
에탄올 생산 재조합 균주의 효소활성(enzyme units)
Strain Pdc adhⅡ DhaD
H. polymerpha HpDL1-L 0.87
(100)		 0.80
(100)		 1.26
(100)
HpDL1-L/pYH-pdc-adhB 1.05
(121)		 1.36
(170)		 1.38
(110)
HpDL1-L/pYH-pdc-adhB-dhaDKLM 1.11
(128)		 1.30
(163)		 1.94
(154)
효소활성 단위는 unit/g 단백질로 나타내었고, 대조군과 재조합 균주의 효소활성을 비교하기 위하여 비율을 괄호 안에 표시하였다.
한국생명공학연구원 KCTC11687 20100422 한국생명공학연구원 KCTC11688 20100422
서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

  1. 파이루베이트 디카르복실라아제(pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자 및 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase Ⅱ)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는, 글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 재조합 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha).
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 기탁번호 KCTC 11687BP인 재조합 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha).
  4. 파이루베이트 디카르복실라아제(pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자 및 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase Ⅱ)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 글리세롤 디하이드로게나아제(glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 디하이드록시아세톤 키나아제(dihydroxyacetone kinase)를 코딩하는 유전자 중 하나 이상이 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는, 글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 재조합 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha).
  5. 삭제
  6. 제4항에 있어서, 기탁번호 KCTC 11688BP인 재조합 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha).
  7. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 파이루베이트 디카르복실라아제(pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 속 유래 pdc이고, 상기 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase Ⅱ)를 코딩하는 유전자는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 속 유래 adhB인 것을 특징으로 하는, 에탄올 고생성능을 가지는 재조합 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha).
  8. 제4항에 있어서, 상기 글리세롤 디하이드로게나아제(glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 크렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae ) 속 유래의 dhaD이고, 상기 디하이드록시아세톤 키나아제(dihydroxyacetone kinase)을 코딩하는 유전자는 크렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae ) 속 유래의 dhaKLM인 것을 특징으로 하는, 글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 재조합 효모.
  9. 제1항의 재조합 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)를 배양하여 에탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 에탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조방법.
  10. 제4항의 재조합 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)를 글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 에탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 에탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 재조합 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)는 기탁번호 KCTC 11687BP의 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 재조합 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)는 기탁번호 KCTC 11688BP의 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
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Biotechonol. Lett.(제30권, 제67-663면, 2008년).*
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Metabolic Engineering(제10권, 제340-351면, 2008년).*

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