JP4528972B2 - 染色体組み込みマンノース発酵性ザイモモナス属細菌 - Google Patents
染色体組み込みマンノース発酵性ザイモモナス属細菌 Download PDFInfo
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Description
本発明は、染色体組み込みマンノース発酵性ザイモモナス（Zymomonas）属細菌、さらに詳しくは、外来遺伝子の染色体への組み込みにより、安定なマンノース発酵性を付与した、未利用セルロース系バイマスからの燃料用エタノールの製造に有用な新規ザイモモナス属細菌に関する。
建築廃材、製材廃チップ、稲藁、古紙などの未利用セルロース系バイオマスから微生物を用いて燃料用エタノールを効率よく生産するためには、その主要な成分であるヘミセルロースに由来するマンノースからのエタノール回収がキーとなる。燃料用エタノール生産に用いられる主な微生物としてサッカロミセス（Saccharomayces）属の酵母やザイモモナス属またはザイモバクター（Zymobacter）属の細菌が挙げられるが、サッカロミセス属酵母以外の微生物はマンノースからエタノールを生産することはできない。
しかしながら、ザイモモナス属細菌のエタノール生産性は酵母よりも３〜５倍優れており、このような細菌にマンノース発酵性を付与できれば、未利用セルロース系バイオマスからの燃料用エタノール生産に大きく貢献できる。
非特許文献１には、ザイモモナス属細菌にエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来のホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子をプラスミドに載せて導入し、マンノースでの生育を可能にした報告がある。しかし、この報告は、染色体への組み込みではなく、また、マンノースからのエタノール生産については言及されていない。
Appl. Envirom. Microbiol., 62(11), 4153-4161 (1996)
しかしながら、ザイモモナス属細菌のエタノール生産性は酵母よりも３〜５倍優れており、このような細菌にマンノース発酵性を付与できれば、未利用セルロース系バイオマスからの燃料用エタノール生産に大きく貢献できる。
非特許文献１には、ザイモモナス属細菌にエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来のホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子をプラスミドに載せて導入し、マンノースでの生育を可能にした報告がある。しかし、この報告は、染色体への組み込みではなく、また、マンノースからのエタノール生産については言及されていない。
Appl. Envirom. Microbiol., 62(11), 4153-4161 (1996)
本発明の目的は、マンノースを含有する原料からのエタノールの効率的な生産のために、ホスホマンノースイソメラーゼをコードする遺伝子をザイモモナス属細菌の染色体に組み込み、安定したマンノース発酵性を付与した組換え微生物を構築することを目的とする。
上記のごとく、ザイモモナス属細菌はマンノース発酵性を示さない。発酵可能なグルコースはグルコース輸送促進タンパク質（ＧＬＦ）により細胞内に取り込まれ、グルコース６リン酸になった後、ザイモモナス属細菌の解糖系であるエントナー・ドゥドロフ（Entner-Doudroff）経路に入りエタノールを発酵生産する。また、ＧＬＦにより細胞内に取り込まれたフルクトースは、フルクトキナーゼによりフルクトース６リン酸にリン酸化された後、この解糖系を経てエタノールへと変換される。しかし、マンノースは、ＧＬＦにより細胞内に取り込むことは可能とされているが、ザイモモナス属細菌はマンノースをエタノールに変換できない。
マンノースの発酵性を付与するためには、マンノースをフルクトース６リン酸へと変換した後、エントナー・ドゥドロフ経路へ効率良く導入する必要がある。すなわち、細胞内に取り込まれたマンノースは、フルクトキナーゼ（ＦＲＫ）によりマンノース６リン酸にまで代謝されると推定されるが、ザイモモナス属細菌はマンノース６リン酸をフルクトース６リン酸へと異性化するホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子が欠損しており、マンノースが解糖系へと導入されず、したがって、エタノールへと変換できないことになる。
本発明者らは、（１）ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子をザイモモナス属菌に導入することにより、マンノースを、エントナー・ドゥドロフ経路へ導入でき、最終的にエタノールを発酵生産することが可能であり、また、（２）ザイモモナス属菌を用いてのエタノール生産において市場を切り開くには、エタノールを高効率、低コストで生産する必要があり、ベクター導入株とは違い、導入した遺伝子の安定性が増し、マーカー等の薬剤の必要性がなくなる染色体への組み込みにより、上記目的が達成できると考えた。この考えに基づき、鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
マンノースの発酵性を付与するためには、マンノースをフルクトース６リン酸へと変換した後、エントナー・ドゥドロフ経路へ効率良く導入する必要がある。すなわち、細胞内に取り込まれたマンノースは、フルクトキナーゼ（ＦＲＫ）によりマンノース６リン酸にまで代謝されると推定されるが、ザイモモナス属細菌はマンノース６リン酸をフルクトース６リン酸へと異性化するホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子が欠損しており、マンノースが解糖系へと導入されず、したがって、エタノールへと変換できないことになる。
本発明者らは、（１）ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子をザイモモナス属菌に導入することにより、マンノースを、エントナー・ドゥドロフ経路へ導入でき、最終的にエタノールを発酵生産することが可能であり、また、（２）ザイモモナス属菌を用いてのエタノール生産において市場を切り開くには、エタノールを高効率、低コストで生産する必要があり、ベクター導入株とは違い、導入した遺伝子の安定性が増し、マーカー等の薬剤の必要性がなくなる染色体への組み込みにより、上記目的が達成できると考えた。この考えに基づき、鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）ホスホマンノースイソメラーゼをコードする外来遺伝子を、相同組換え法によるダブルクロスオーバーによってザイモモナス属細菌の染色体上の標的遺伝子内に組み込んでなるザイモモナス属細菌、
（２）外来遺伝子がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来である上記（１）記載の細菌、
（３）標的遺伝子が、レバンスクラーゼ遺伝子である上記（１）記載の細菌、
（４）ザイモモナス・モビリスである上記（１）記載の細菌、
（５）Zymomonas mobilis Z6 E2:manA（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５８１）である上記（４）記載の細菌等を提供するものである。
（１）ホスホマンノースイソメラーゼをコードする外来遺伝子を、相同組換え法によるダブルクロスオーバーによってザイモモナス属細菌の染色体上の標的遺伝子内に組み込んでなるザイモモナス属細菌、
（２）外来遺伝子がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来である上記（１）記載の細菌、
（３）標的遺伝子が、レバンスクラーゼ遺伝子である上記（１）記載の細菌、
（４）ザイモモナス・モビリスである上記（１）記載の細菌、
（５）Zymomonas mobilis Z6 E2:manA（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５８１）である上記（４）記載の細菌等を提供するものである。
本発明によれば、ホスホマンノースイソメラーゼをコードする遺伝子をザイモモナス属細菌に導入することより、ザイモモナス属細菌自体の有する優れたエタノール生産性を利用したマンノース発酵性を付与できる。また、染色体への組み込みにより、マーカー等の薬剤の必要性なく、安定なマンノース発酵性の付与が可能となる。したがって、この細菌を用いることにより、マンノースを含有する原料からのエタノールの生産を効率的に行うことが可能となる。
本発明に従ってマンノース発酵性を付与するザイモモナス属細菌としては、ザイモモナス属の細菌であれば、特に限定するものではないが、通常、エタノール産生に使用されるザイモモナス・モビリスが好ましい。
本発明の組み換えザイモモナス属細菌を得るために使用するホスホマンノースイソメラーゼをコードする外来遺伝子は、マンノース分解能を有する供与体微生物から得ることができる。
供与体微生物としては、特に限定するものではなく、ザイモモナス属、エシェリヒア（Escherichia）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、アセトバクター（Acetobacter）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、リゾビウム（Rhizobium）属、アブロバクテリウム（Abrobacterium）属、サルモネラ（Salmonella）属およびシウドモナス（Pseudomonas）属に属する微生物が好適に用いられ、その中でもエシェリヒア・コリが好ましい。
供与体微生物のホスホマンノースイソメラーゼをコードするＤＮＡを分離、精製した後、種々の方法で切断して得られるＤＮＡ断片を調製する。さらに同様にして得られるベクターＤＮＡ断片とを、例えばＤＮＡリガーゼなどにより結合させ、ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子を含有する組換えＤＮＡを形成する。ＤＮＡの分離、精製、ＤＮＡ断片の調製、ＤＮＡリガーゼによる結合等は、市販のＤＮＡ抽出キットなどを用い、当該分野で公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）3rd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001）に記載の方法などに従って行なうことができる。
本発明の組み換えザイモモナス属細菌を得るために使用するホスホマンノースイソメラーゼをコードする外来遺伝子は、マンノース分解能を有する供与体微生物から得ることができる。
供与体微生物としては、特に限定するものではなく、ザイモモナス属、エシェリヒア（Escherichia）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、アセトバクター（Acetobacter）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、リゾビウム（Rhizobium）属、アブロバクテリウム（Abrobacterium）属、サルモネラ（Salmonella）属およびシウドモナス（Pseudomonas）属に属する微生物が好適に用いられ、その中でもエシェリヒア・コリが好ましい。
供与体微生物のホスホマンノースイソメラーゼをコードするＤＮＡを分離、精製した後、種々の方法で切断して得られるＤＮＡ断片を調製する。さらに同様にして得られるベクターＤＮＡ断片とを、例えばＤＮＡリガーゼなどにより結合させ、ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子を含有する組換えＤＮＡを形成する。ＤＮＡの分離、精製、ＤＮＡ断片の調製、ＤＮＡリガーゼによる結合等は、市販のＤＮＡ抽出キットなどを用い、当該分野で公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）3rd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001）に記載の方法などに従って行なうことができる。
染色体への組み込みは、公知の相同組換え法によるダブルクロスオーバーによって行うことができる。すなわち、ザイモモナス属細菌の染色体上の適当な標的遺伝子をクローニングした後、試験管内でクローン化した該染色体標的遺伝子の中にホスホマンノースイソメラーゼをコードする外来遺伝子を挿入し、この外来遺伝子の上流と下流に標的遺伝子の一部が連結されたＤＮＡを調製し、これをザイモモナス属細菌の染色体上の標的遺伝子内に組み込む。 例えば、図１に示すごとく、ザイモモナス・モビリスの染色体ＤＮＡ上には、レバンスクラーゼ遺伝子（以下Ｅ２と称する）とインベルターゼ遺伝子(以下、Ｅ３と称する)が配位しており、この二つの酵素はザイモモナス・モビリスの細胞表層に提示され、スクロースを基質としてフルクトースを遊離し、転移反応を触媒してレバンを形成する。そのＥ２部位をターゲットにして、相同組換え法を用いたダブルクロスオーバーによりホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子組み込み、Ｅ２を欠損させる。その結果、レバンを形成するフルクトースからエタノールの生産が可能となり、一方では、ベクター導入株とは違い、導入した遺伝子の安定性が増し、マーカー等の薬剤の必要性がなくなり、さらに、キシロース代謝系遺伝子といった他の遺伝子を導入することもできる。
染色体上の標的遺伝子としては、このレバンスクラーゼ遺伝子の他に、例えば、インベルターゼ遺伝子、乳酸脱水素酵素遺伝子等があげられる。
染色体上の標的遺伝子としては、このレバンスクラーゼ遺伝子の他に、例えば、インベルターゼ遺伝子、乳酸脱水素酵素遺伝子等があげられる。
得られた本発明の組換えザイモモナス属細菌は、従来の細菌と同様にしてマンノースを含む原料からのエタノール生産に使用できる。
以下、参考例および実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
参考例では、エシェリヒア・コリ（E. coli）由来のホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子（manA）のクローニングと、ザイモモナス・モビリス（Zm. mobilis）への導入を示す。また、フルクトキナーゼがマンノース発酵性の律速であると予想され、セルフクローニングにより発現を強化させることにより、さらなるエタノール発酵生産の向上が期待されるので、Zm. mobilis由来のフルクトキナーゼ遺伝子（frk）を導入した例と、これら遺伝子を効率よく発現させることによるマンノース発酵性付与の検討結果も示す。
実施例は、染色体組み込み用ベクターの構築と、Ｅ２部位へのmanAの導入を示す。
参考例および実施例で使用したプライマーは、公知のZm. mobilis由来グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子配列（J. Bacteriol. Vol.169 (12), 5653-5662, 1987）、公知のE. coli由来のmanAの塩基配列（Gene 32 (1-2), 41-48 (1984)）、公知のZm. mobilis由来のfrkの塩基配列（J. Bacteriol. 174 (11), 3455-3460 (1992)）、公知のZn. mobilisゲノムＥ２配列（Biosci. Biotech. Biochem., 59(2), 289-293 (1995) DNAのAccession number D17524 (DDBJ, EMBL)）に基づいて設計した表１に示すプライマーである。
［表１］
manAプライマー
manA(1)（配列番号１）：CGGAATTCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTATCG
manA(2)（配列番号２）：CTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGCAAAAACTCATTAACTCAGTGCAA
manA(3)（配列番号３）：TTGCACTGAGTTAATGAGTTTTTGCATGTTTATTCTCCTAACTTATTAAG
manA(4)（配列番号４）: CGCGGATCCTTACAGCTTGTTGTAAACACGCGCTA
frkプライマー
frk(1)（配列番号５）：CGCGGATCCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTATC
frk(2)（配列番号６）：CTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGAAAAACGATAAAAAAATTTATGGA
frk(3)（配列番号７）：TCCATAAATTTTTTTATCGTTTTTCATGTTTATTCTCCTAACTTATTAAG
frk(4)（配列番号８）：GGCGTCGACTTCCAAAATCCCTTTTCGGTTAAGAA
E2プライマー
E2(1) （配列番号９） :ACTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGTTGAATAAAGCAGGCATTGCAGA
E2(2) （配列番号１０）:GCTCTAGATCATTATTTATTCAATAAAGACAGGGC
E2(3) （配列番号１１）:AGCAAATAATTTCTGGGATTTCCGC
E2(4) （配列番号１２）:AGGCCGCTCCGTCTGG
以下、参考例および実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
参考例では、エシェリヒア・コリ（E. coli）由来のホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子（manA）のクローニングと、ザイモモナス・モビリス（Zm. mobilis）への導入を示す。また、フルクトキナーゼがマンノース発酵性の律速であると予想され、セルフクローニングにより発現を強化させることにより、さらなるエタノール発酵生産の向上が期待されるので、Zm. mobilis由来のフルクトキナーゼ遺伝子（frk）を導入した例と、これら遺伝子を効率よく発現させることによるマンノース発酵性付与の検討結果も示す。
実施例は、染色体組み込み用ベクターの構築と、Ｅ２部位へのmanAの導入を示す。
参考例および実施例で使用したプライマーは、公知のZm. mobilis由来グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子配列（J. Bacteriol. Vol.169 (12), 5653-5662, 1987）、公知のE. coli由来のmanAの塩基配列（Gene 32 (1-2), 41-48 (1984)）、公知のZm. mobilis由来のfrkの塩基配列（J. Bacteriol. 174 (11), 3455-3460 (1992)）、公知のZn. mobilisゲノムＥ２配列（Biosci. Biotech. Biochem., 59(2), 289-293 (1995) DNAのAccession number D17524 (DDBJ, EMBL)）に基づいて設計した表１に示すプライマーである。
［表１］
manAプライマー
manA(1)（配列番号１）：CGGAATTCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTATCG
manA(2)（配列番号２）：CTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGCAAAAACTCATTAACTCAGTGCAA
manA(3)（配列番号３）：TTGCACTGAGTTAATGAGTTTTTGCATGTTTATTCTCCTAACTTATTAAG
manA(4)（配列番号４）: CGCGGATCCTTACAGCTTGTTGTAAACACGCGCTA
frkプライマー
frk(1)（配列番号５）：CGCGGATCCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTATC
frk(2)（配列番号６）：CTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGAAAAACGATAAAAAAATTTATGGA
frk(3)（配列番号７）：TCCATAAATTTTTTTATCGTTTTTCATGTTTATTCTCCTAACTTATTAAG
frk(4)（配列番号８）：GGCGTCGACTTCCAAAATCCCTTTTCGGTTAAGAA
E2プライマー
E2(1) （配列番号９） :ACTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGTTGAATAAAGCAGGCATTGCAGA
E2(2) （配列番号１０）:GCTCTAGATCATTATTTATTCAATAAAGACAGGGC
E2(3) （配列番号１１）:AGCAAATAATTTCTGGGATTTCCGC
E2(4) （配列番号１２）:AGGCCGCTCCGTCTGG
（１）E. coli由来manAのクローニング
表１にまとめた合成オリゴヌクレオチドの組み合わせにより、目的遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。
まず、Zm. mobilisの野生株 (IFO13756）のクロモゾームＤＮＡ（Chr. DNA）を鋳型として１次ＰＣＲを行い、gapプロモーターを増幅させた。同様に、E. coli K12株のChr. DNAを鋳型とし、manAを増幅させた。次に、２つのＰＣＲ産物を用いてヘテロ二本鎖を形成し、２次ＰＣＲを行い、gap-manA断片を構築して、ベクターpUC118のHincIIサイトにライゲーションさせ、E. coli JM109株へ形質転換した。
挿入断片のシークエンスを行った結果、データベースに登録されているmanAの塩基配列と一致したことからpUC118-manAとした。
表１にまとめた合成オリゴヌクレオチドの組み合わせにより、目的遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。
まず、Zm. mobilisの野生株 (IFO13756）のクロモゾームＤＮＡ（Chr. DNA）を鋳型として１次ＰＣＲを行い、gapプロモーターを増幅させた。同様に、E. coli K12株のChr. DNAを鋳型とし、manAを増幅させた。次に、２つのＰＣＲ産物を用いてヘテロ二本鎖を形成し、２次ＰＣＲを行い、gap-manA断片を構築して、ベクターpUC118のHincIIサイトにライゲーションさせ、E. coli JM109株へ形質転換した。
挿入断片のシークエンスを行った結果、データベースに登録されているmanAの塩基配列と一致したことからpUC118-manAとした。
（２）Zm. mobilis由来frkのクローニング
Zm. mobilisのChr. DNAを鋳型として１次ＰＣＲを行い、gapプロモーターとfrkを増幅させた。次に、２つのＰＣＲ産物を用いてヘテロ二本鎖２を形成し、次ＰＣＲを行い、gap-frk断片を構築した。構築したgap-frk断片を平滑化し、ベクターpUC118のHincIIサイトにライゲーションさせ、E. coli JM109株へ形質転換した。
挿入断片のシークエンスを行った結果、データベースに登録されているfrkの塩基配列と一致したことからpUC118-frkとした。
図２にこのクローニング操作をまとめる。
Zm. mobilisのChr. DNAを鋳型として１次ＰＣＲを行い、gapプロモーターとfrkを増幅させた。次に、２つのＰＣＲ産物を用いてヘテロ二本鎖２を形成し、次ＰＣＲを行い、gap-frk断片を構築した。構築したgap-frk断片を平滑化し、ベクターpUC118のHincIIサイトにライゲーションさせ、E. coli JM109株へ形質転換した。
挿入断片のシークエンスを行った結果、データベースに登録されているfrkの塩基配列と一致したことからpUC118-frkとした。
図２にこのクローニング操作をまとめる。
Zm. mobilis導入のための人工マンノースオペロンの構築
pSTV29-manAの構築：E. coli用ベクターpSTV29とpUC118-manAをEcoRIおよびBamHIで消化し切り出した。その断片のライゲーション反応を行った。クロラムフェニコール耐性（Cmr）、X-gal、ＩＰＴＧ入り寒天培地にプレーティングし、形質転換したpSTV29-manAについて、欠損lacZ遺伝子であるためX-galによるカラーセレクションを行った。その結果、manAの増幅断片を確認することができ、さらにBamHI、EcoRIで消化確認したところ３．０ kbp、１．４ kbpにバンドが検出された。以上からpSTV29-manAを構築することができたことを確認した。
図３にこの構築操作をまとめる。
pSZ1-manAの構築：構築したpSTV29-manAおよび、E. coliとZm. mobilis間のシャトルベクターpZA323内のザイモモナス由来遺伝子部位からpSZ1-manAの構築を試みた。まず、pSTV29-manAをHindIIIで消化しＢＡＰ処理（アルカリフォスファターゼ１μＬ、３０分×２）をした後、ＤＮＡ断片を切り出した。pZA323もHindIIIで消化後、pZA3部位を切り出した。ベクター２μＬ、挿入断片５μＬの割合で混合し、ライゲーション反応を一晩行った。それをE. coli JM109に形質転換してクロラムフェニコール（Cm）１００μＬ入りＬＢ寒天培地に塗布した。多数のコロニーが形成しており、それからプラスミド抽出を行い、SalIとHindIIIで消化確認したところ、それぞれ５．８ kbp、４．４ kbp、１．４ kbpの位置にバンドが検出された。以上のことより、pSZ1-manA（５．８ kbp）が構築できたことを確認した。
図４にこの構築操作をまとめる。
pSZ1-manA-frkの構築：先に構築したpSZ1-manA（５．８ kbp）をBamHIおよびSalIで切り出し、アルカリホスファターゼ処理した。また、frk（１．２ kbp）断片はpUC118-frkからBamHIおよび SalIで切り出した。これら二つの断片をライゲーションし、E. coli JM109の形質転換を行った。生育したコロニーから適当なコロニーを選びプラスミド抽出を行い、BamHIおよびSalIで消化確認を行った。BamHI消化では７．０ kbp、BamHIとSalIの両方で消化した時には５．８ kbpと１．２ kbpの位置にバンドが見られ、これをもってpSZ1-manA-frkを構築できたことを確認した。
図５にこの構築操作をまとめる。
pSTV29-manAの構築：E. coli用ベクターpSTV29とpUC118-manAをEcoRIおよびBamHIで消化し切り出した。その断片のライゲーション反応を行った。クロラムフェニコール耐性（Cmr）、X-gal、ＩＰＴＧ入り寒天培地にプレーティングし、形質転換したpSTV29-manAについて、欠損lacZ遺伝子であるためX-galによるカラーセレクションを行った。その結果、manAの増幅断片を確認することができ、さらにBamHI、EcoRIで消化確認したところ３．０ kbp、１．４ kbpにバンドが検出された。以上からpSTV29-manAを構築することができたことを確認した。
図３にこの構築操作をまとめる。
pSZ1-manAの構築：構築したpSTV29-manAおよび、E. coliとZm. mobilis間のシャトルベクターpZA323内のザイモモナス由来遺伝子部位からpSZ1-manAの構築を試みた。まず、pSTV29-manAをHindIIIで消化しＢＡＰ処理（アルカリフォスファターゼ１μＬ、３０分×２）をした後、ＤＮＡ断片を切り出した。pZA323もHindIIIで消化後、pZA3部位を切り出した。ベクター２μＬ、挿入断片５μＬの割合で混合し、ライゲーション反応を一晩行った。それをE. coli JM109に形質転換してクロラムフェニコール（Cm）１００μＬ入りＬＢ寒天培地に塗布した。多数のコロニーが形成しており、それからプラスミド抽出を行い、SalIとHindIIIで消化確認したところ、それぞれ５．８ kbp、４．４ kbp、１．４ kbpの位置にバンドが検出された。以上のことより、pSZ1-manA（５．８ kbp）が構築できたことを確認した。
図４にこの構築操作をまとめる。
pSZ1-manA-frkの構築：先に構築したpSZ1-manA（５．８ kbp）をBamHIおよびSalIで切り出し、アルカリホスファターゼ処理した。また、frk（１．２ kbp）断片はpUC118-frkからBamHIおよび SalIで切り出した。これら二つの断片をライゲーションし、E. coli JM109の形質転換を行った。生育したコロニーから適当なコロニーを選びプラスミド抽出を行い、BamHIおよびSalIで消化確認を行った。BamHI消化では７．０ kbp、BamHIとSalIの両方で消化した時には５．８ kbpと１．２ kbpの位置にバンドが見られ、これをもってpSZ1-manA-frkを構築できたことを確認した。
図５にこの構築操作をまとめる。
（１）Zm. mobilisへのマンノースオペロン遺伝子の導入
構築したpSZ1-manAを用いて、Zm. mobilis IFO13756（以下、Zm. mobilis Z6と称する）の形質転換を行った。５〜１０μＬのプラスミドをコンピテントセルと混合しエレクトロポレーション法により形質転換を行い、遺伝子の導入を行った。形質転換株からプラスミド抽出後、ＰＣＲを行ったところ、１．４ kbpに遺伝子の増幅が見られ、manA遺伝子の導入を確認した。同様に、pSZ1-manA-frkによるZm. mobilis Z6の形質転換を行った。エレクトロポレーション後、プラスミドの抽出を行い、E. coli JM109[pSZ1-manA-frk]と比較してmanAおよびfrk遺伝子の導入を確認した。また、ネガティブコントロールとして、構築したpSZ1を用いて、同様にZm. mobilis Z6の形質転換を行った。５μＬのpSZ1をコンピテントセルと混合してエレクトロポレーション法により形質転換を行った。プラスミド抽出後、JM109[pSZ1]から得たプラスミドと比較してpSZ1の導入を確認した。
（２）Zm. mobilis内でのマンノースオペロン遺伝子の発現
導入した遺伝子の発現を確認するため、Zm. mobilis Z6および遺伝子組換え体を用いて酵素活性測定を行った。無細胞抽出液を２０ｍＭ ＫＰＢで一晩透析して酵素液とし、ＰＭＩ活性とＦＫ活性を測定した。
結果を表２に示す。
［表２］
表２に示すごとく、Zm. mobilis Z6はＰＭＩ活性を示さず、微弱なＦＫ活性を持つことを確認した。また、ネガティブコントロールのpSZ1を導入した形質転換株においても同様であった。しかし、manAと共にfrkを導入することによりＰＭＩ活性が約２倍程度上昇しており、組換え株は野性株およびネガティブコントロールに比べてみると大幅な活性増加を明らかにした。２％マンノース培地で培養した場合でもfrkを導入することによりＰＭＩ活性に大幅な増加が見られた。一方、ＦＫ活性ではfrkの導入による活性値の著しい活性上昇は認められなかった。マンノース培地を用いるとＰＭＩ活性は増加し、ＲＭ培地ではＦＫ活性の増加が見られた。
構築したpSZ1-manAを用いて、Zm. mobilis IFO13756（以下、Zm. mobilis Z6と称する）の形質転換を行った。５〜１０μＬのプラスミドをコンピテントセルと混合しエレクトロポレーション法により形質転換を行い、遺伝子の導入を行った。形質転換株からプラスミド抽出後、ＰＣＲを行ったところ、１．４ kbpに遺伝子の増幅が見られ、manA遺伝子の導入を確認した。同様に、pSZ1-manA-frkによるZm. mobilis Z6の形質転換を行った。エレクトロポレーション後、プラスミドの抽出を行い、E. coli JM109[pSZ1-manA-frk]と比較してmanAおよびfrk遺伝子の導入を確認した。また、ネガティブコントロールとして、構築したpSZ1を用いて、同様にZm. mobilis Z6の形質転換を行った。５μＬのpSZ1をコンピテントセルと混合してエレクトロポレーション法により形質転換を行った。プラスミド抽出後、JM109[pSZ1]から得たプラスミドと比較してpSZ1の導入を確認した。
（２）Zm. mobilis内でのマンノースオペロン遺伝子の発現
導入した遺伝子の発現を確認するため、Zm. mobilis Z6および遺伝子組換え体を用いて酵素活性測定を行った。無細胞抽出液を２０ｍＭ ＫＰＢで一晩透析して酵素液とし、ＰＭＩ活性とＦＫ活性を測定した。
結果を表２に示す。
［表２］
表２に示すごとく、Zm. mobilis Z6はＰＭＩ活性を示さず、微弱なＦＫ活性を持つことを確認した。また、ネガティブコントロールのpSZ1を導入した形質転換株においても同様であった。しかし、manAと共にfrkを導入することによりＰＭＩ活性が約２倍程度上昇しており、組換え株は野性株およびネガティブコントロールに比べてみると大幅な活性増加を明らかにした。２％マンノース培地で培養した場合でもfrkを導入することによりＰＭＩ活性に大幅な増加が見られた。一方、ＦＫ活性ではfrkの導入による活性値の著しい活性上昇は認められなかった。マンノース培地を用いるとＰＭＩ活性は増加し、ＲＭ培地ではＦＫ活性の増加が見られた。
育種Zm. mobilisによるマンノース発酵性試験
マンノース発酵性遺伝子を導入した形質転換体を、２％マンノース培地１０ｍＬに植菌し、３０℃で前培養し、そこから１ｍＬ採取して１００ｍＬの２％グルコース、２％マンノース、２％グルコース＋２％マンノース培地に植え継いだ。１２時間毎に増殖測定（ＯＤ６１０）およびＨＰＬＣ測定用にサンプリングを行った。
結果を図６に示す。
manA導入Zm. mobilis：２％マンノースのみで培養を行った場合、マンノースを７２〜８４時間に消費して、理論収率に近いエタノールを生産した。一方、グルコースとマンノースの混合培地では相乗効果による発酵性の向上が認められ、マンノースのみと比べ１２〜３６時間の短縮が見られ、並行発酵が可能であることが明らかになった。さらに、４％マンノースでは、理論収率のエタノール生産を達成しており、混合培地において発酵時間の短縮も可能であることが明らかになった。
manAとfrk導入Zm. mobilis：２％マンノースのみで培養を行った場合、エタノール変換には３６〜４８時間を要した。また、グルコースとマンノースの混合培地ではマンノースのみに比べ発酵時間は約１２時間短縮した。さらに、４％マンノースでのmanAとfrk導入株においては理論収率のエタノール生産性を示した。
以上の結果から、Zm. mobilisにmanAのみの導入により、新たにマンノース発酵性を付与することに成功したことが判明。さらに、グルコースとマンノースの混合条件下では、マンノースのみに比べて発酵速度の向上と並行発酵が可能であることを明らかなった。
マンノース発酵性遺伝子を導入した形質転換体を、２％マンノース培地１０ｍＬに植菌し、３０℃で前培養し、そこから１ｍＬ採取して１００ｍＬの２％グルコース、２％マンノース、２％グルコース＋２％マンノース培地に植え継いだ。１２時間毎に増殖測定（ＯＤ６１０）およびＨＰＬＣ測定用にサンプリングを行った。
結果を図６に示す。
manA導入Zm. mobilis：２％マンノースのみで培養を行った場合、マンノースを７２〜８４時間に消費して、理論収率に近いエタノールを生産した。一方、グルコースとマンノースの混合培地では相乗効果による発酵性の向上が認められ、マンノースのみと比べ１２〜３６時間の短縮が見られ、並行発酵が可能であることが明らかになった。さらに、４％マンノースでは、理論収率のエタノール生産を達成しており、混合培地において発酵時間の短縮も可能であることが明らかになった。
manAとfrk導入Zm. mobilis：２％マンノースのみで培養を行った場合、エタノール変換には３６〜４８時間を要した。また、グルコースとマンノースの混合培地ではマンノースのみに比べ発酵時間は約１２時間短縮した。さらに、４％マンノースでのmanAとfrk導入株においては理論収率のエタノール生産性を示した。
以上の結果から、Zm. mobilisにmanAのみの導入により、新たにマンノース発酵性を付与することに成功したことが判明。さらに、グルコースとマンノースの混合条件下では、マンノースのみに比べて発酵速度の向上と並行発酵が可能であることを明らかなった。
（１）染色体組込み用ベクターpUZE2d'-manAの構築
染色体組込み用ベクターをＥ２部位をターゲットにして行った構築図を図７に示す。
ベクターpUZE2d（４．８ kb）をNdeI処理、平滑化、ついでＢＡＰP処理してＤＮＡを切出した。また、pUC118-manA（４．８ kb）からPgap-manA（１．５ kb）をBamHIとEcoRIで消化し、平滑化し、manA断片を切出した。その後ライゲーション・ハイ（Ligation high）とＴ４リガーゼを用いて4℃、16℃で一晩ライゲーションさせ、ヒート・ショック（Heat shock）法によりE. coli JM109の形質転換を行い、プラスミド抽出を行った。その抽出したプラスミドからmanA(1)およびmanA(4)プライマーを用いて１．５ kbpのmanA断片をＰＣＲにより確認した。さらに、EcoRVとKpnIで消化したところ、Ｅ２遺伝子と順方向であることを示す４．８ kbp、１．５ kbp断片であることを示す５．３ kbp断片のバンドを検出した。このとから、これをプラスミドpUZE2d'-manAとした。
（２）Zm. mobilis染色体ＤＮＡへのmanAの組込み確認
Zm. mobilis Z6株に対して、高濃度のプラスミド溶液を用いたエレクトロポレーション法により形質転換を行った。次に、３回の継代培養を行い２％マンノース−ＲＷプレートに塗布した。その後３日から約２週間培養を続け、生育した大きなコロニーを任意に選び出し、２％マンノース−ＲＭ液体培地に接種した。生育した菌体懸濁液を集菌し、一度滅菌MilliQ水で洗浄後、１ｍＬの滅菌MilliＱ水に懸濁してＤＮＡ抽出用サンプルとした。その抽出液５０μＬの内１μＬからmanAプライマーmanA(1)、manA(4)およびE2プライマーE2(1)、E2(2)によるＰＣＲ増幅を行った。その結果、manAプライマーによる増幅では、manA断片（1.5 kbp）が、また、E2プライマーによる増幅では２．８ kbpにバンドが検出された。これは、Ｅ２（１．３ kbp）にmanA（１．５ kbp）を組込んだ断片の２．８ kbpに合致することから、染色体ＤＮＡ上のＥ２部位にmanAが挿入されたことが裏付けられた。
manAが染色体に組み込まれた菌株は、Zymomonus mobilis Z6 E2:manAと命名（略称ZymomonasE2M）し、平成１７年７月１日から、茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６の、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０５８１の下で寄託してある。
（３）染色体へ組込んだmanAの発現
染色体へmanAを組込んだ３種の株を用いて、manAの発現を確認するためＰＭＩ、ＦＫ活性測定を行った。また炭素源の違いによる活性値の比較も行った。
その結果を表３に示す。
［表３］
染色体組込み株のグルコース培地での場合以外では、ベクター導入株より高いＰＭＩ活性値を有しており、活性値は比較的近似していたことから遺伝子が安定して複製し発現していることが判明した。
（４）染色体組込み株の発酵性試験
染色体組込み株をグリセロールストックから２％マンノース−ＲＭ培地に植菌し、そのＯＤ６１０ｎｍ＝０．８〜１．０付近もしくは対数増殖期後期の菌体懸濁液１２０μＬを新鮮な２％糖濃度の培地１２ｍＬへ接種し、経時的にサンプリングし、生育度の測定とＨＰＬＣ分析を行った。
結果を図８に示す。
図８から明らかなごとく、マンノース培地では、グルコース培地での生育度に比べ約半分であったが３６時間までにマンノースを完全に消費し理論収率のエタノール生産力を有していた。混合培地においてはグルコース、マンノースともにスムーズな代謝と並行発酵が確認でき２日ほどで完全に消費した。ベクター導入株より安定した発酵性能を有していた。
染色体組込み用ベクターをＥ２部位をターゲットにして行った構築図を図７に示す。
ベクターpUZE2d（４．８ kb）をNdeI処理、平滑化、ついでＢＡＰP処理してＤＮＡを切出した。また、pUC118-manA（４．８ kb）からPgap-manA（１．５ kb）をBamHIとEcoRIで消化し、平滑化し、manA断片を切出した。その後ライゲーション・ハイ（Ligation high）とＴ４リガーゼを用いて4℃、16℃で一晩ライゲーションさせ、ヒート・ショック（Heat shock）法によりE. coli JM109の形質転換を行い、プラスミド抽出を行った。その抽出したプラスミドからmanA(1)およびmanA(4)プライマーを用いて１．５ kbpのmanA断片をＰＣＲにより確認した。さらに、EcoRVとKpnIで消化したところ、Ｅ２遺伝子と順方向であることを示す４．８ kbp、１．５ kbp断片であることを示す５．３ kbp断片のバンドを検出した。このとから、これをプラスミドpUZE2d'-manAとした。
（２）Zm. mobilis染色体ＤＮＡへのmanAの組込み確認
Zm. mobilis Z6株に対して、高濃度のプラスミド溶液を用いたエレクトロポレーション法により形質転換を行った。次に、３回の継代培養を行い２％マンノース−ＲＷプレートに塗布した。その後３日から約２週間培養を続け、生育した大きなコロニーを任意に選び出し、２％マンノース−ＲＭ液体培地に接種した。生育した菌体懸濁液を集菌し、一度滅菌MilliQ水で洗浄後、１ｍＬの滅菌MilliＱ水に懸濁してＤＮＡ抽出用サンプルとした。その抽出液５０μＬの内１μＬからmanAプライマーmanA(1)、manA(4)およびE2プライマーE2(1)、E2(2)によるＰＣＲ増幅を行った。その結果、manAプライマーによる増幅では、manA断片（1.5 kbp）が、また、E2プライマーによる増幅では２．８ kbpにバンドが検出された。これは、Ｅ２（１．３ kbp）にmanA（１．５ kbp）を組込んだ断片の２．８ kbpに合致することから、染色体ＤＮＡ上のＥ２部位にmanAが挿入されたことが裏付けられた。
manAが染色体に組み込まれた菌株は、Zymomonus mobilis Z6 E2:manAと命名（略称ZymomonasE2M）し、平成１７年７月１日から、茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６の、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０５８１の下で寄託してある。
（３）染色体へ組込んだmanAの発現
染色体へmanAを組込んだ３種の株を用いて、manAの発現を確認するためＰＭＩ、ＦＫ活性測定を行った。また炭素源の違いによる活性値の比較も行った。
その結果を表３に示す。
［表３］
染色体組込み株のグルコース培地での場合以外では、ベクター導入株より高いＰＭＩ活性値を有しており、活性値は比較的近似していたことから遺伝子が安定して複製し発現していることが判明した。
（４）染色体組込み株の発酵性試験
染色体組込み株をグリセロールストックから２％マンノース−ＲＭ培地に植菌し、そのＯＤ６１０ｎｍ＝０．８〜１．０付近もしくは対数増殖期後期の菌体懸濁液１２０μＬを新鮮な２％糖濃度の培地１２ｍＬへ接種し、経時的にサンプリングし、生育度の測定とＨＰＬＣ分析を行った。
結果を図８に示す。
図８から明らかなごとく、マンノース培地では、グルコース培地での生育度に比べ約半分であったが３６時間までにマンノースを完全に消費し理論収率のエタノール生産力を有していた。混合培地においてはグルコース、マンノースともにスムーズな代謝と並行発酵が確認でき２日ほどで完全に消費した。ベクター導入株より安定した発酵性能を有していた。
Zm. mobilisにマンノース発酵性を付与するためにはmanAのみを導入する方法と、マンノースからのエタノール発酵で律速であると推定されたfrkとのmanAの導入が考えられ、上記参考例におけるごとく、pSZ1-manAおよびpSZ1-manA-frkの２つのプラスミドをZm. mobilis株へ導入し、いずれもmanAが高発現してＰＭＩ活性が見られ、frkの導入によるＦＫ活性値の上昇、ＰＭＩ活性値の飛躍的上昇が認められた。しかし、組換え株を用いての発酵性試験を行った結果、マンノースからのエタノール発酵生産には必ずしもfrkの導入が発酵性能を向上させるために必要ではないということが判明した。
そこで、実施例におけるごとく、Zm. mobilisの実用菌を育種するため染色体に配位したＥ２をターゲットとし、構築した染色体組込みプラスミドを用いて、ダブルクロスオーバーにより染色体Ｅ２部位にmanAを挿入した染色体組込み株の開発に成功した。ＰＭＩ、ＦＫ活性測定を行ったところ、染色体に組込んだmanAはベクター導入株（manA+frk）のＰＭＩ活性値と同等あるいはそれ以上の活性値を有しており、発酵性試験も行ったところ、マンノースからのスムーズなエタノール発酵生産が確認できた。
かくして、本発明によれば、ホスホマンノースイソメラーゼをコードする外来遺伝子をザイモモナス属細菌の染色体に組み込むことにより、安定なマンノース発酵性の付与が可能となり、当該菌株を、マンノースを含有する原料からのエタノールの効率的な生産に利用することができる。
そこで、実施例におけるごとく、Zm. mobilisの実用菌を育種するため染色体に配位したＥ２をターゲットとし、構築した染色体組込みプラスミドを用いて、ダブルクロスオーバーにより染色体Ｅ２部位にmanAを挿入した染色体組込み株の開発に成功した。ＰＭＩ、ＦＫ活性測定を行ったところ、染色体に組込んだmanAはベクター導入株（manA+frk）のＰＭＩ活性値と同等あるいはそれ以上の活性値を有しており、発酵性試験も行ったところ、マンノースからのスムーズなエタノール発酵生産が確認できた。
かくして、本発明によれば、ホスホマンノースイソメラーゼをコードする外来遺伝子をザイモモナス属細菌の染色体に組み込むことにより、安定なマンノース発酵性の付与が可能となり、当該菌株を、マンノースを含有する原料からのエタノールの効率的な生産に利用することができる。
配列番号１：E. coliのmanAをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号２：E. coliのmanAをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号３：E. coliのmanAをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号４：E. coliのmanAをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号５：Zm. mobilisのfrkをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号６：Zm. mobilisのmanAをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号７：Zm. mobilisのmanAをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号８：Zm. mobilisのmanAをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号９：Zm. mobilisの染色体E2部位をコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号１０：Zm. mobilisの染色体E2部位をコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号１１：Zm. mobilisの染色体E2部位をコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号１２：Zm. mobilisの染色体E2部位をコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号２：E. coliのmanAをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号３：E. coliのmanAをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号４：E. coliのmanAをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号５：Zm. mobilisのfrkをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号６：Zm. mobilisのmanAをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号７：Zm. mobilisのmanAをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号８：Zm. mobilisのmanAをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号９：Zm. mobilisの染色体E2部位をコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号１０：Zm. mobilisの染色体E2部位をコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号１１：Zm. mobilisの染色体E2部位をコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号１２：Zm. mobilisの染色体E2部位をコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
Claims (1)
- ホスホマンノースイソメラーゼをコードするエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来の外来遺伝子を、相同組換え法によるダブルクロスオーバーによってザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）の染色体上のレバンスクラーゼ遺伝子内に組み込んでなるザイモモナス属細菌であるZymomonas mobilis Z6 E2:manA（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５８１）。
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005201801A JP4528972B2 (ja) | 2005-07-11 | 2005-07-11 | 染色体組み込みマンノース発酵性ザイモモナス属細菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=37752004
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996040952A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Genemedicine, Inc. | Plasmid for delivery of nucleic acids to cells and methods of use |
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|---|---|---|---|---|
| GB9602796D0 (en) * | 1996-02-12 | 1996-04-10 | Innes John Centre Innov Ltd | Genetic control of plant growth and development |
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2005
- 2005-07-11 JP JP2005201801A patent/JP4528972B2/ja active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996040952A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Genemedicine, Inc. | Plasmid for delivery of nucleic acids to cells and methods of use |
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| Publication number | Publication date |
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