CN1696153A

CN1696153A - 白菜软腐菌的HarpinEccs蛋白及相关蛋白质的络合和应用

Info

Publication number: CN1696153A
Application number: CN 200510020665
Authority: CN
Inventors: 吴伯骥; 汤承; 张珏
Original assignee: Chengdu Pairun Boilogical Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Wu Boji
Priority date: 2005-04-05
Filing date: 2005-04-05
Publication date: 2005-11-16

Abstract

本发明涉及白菜软腐菌的Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质的络合及应用。将白菜软腐菌的Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质与金属离子发生络合形成蛋白激发子，使其对几乎所有植物的作用均表现出更强的抗病、防虫和抗逆功能活性；Harpin_Eccs蛋白激发子的原产生菌胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)白菜软腐菌变种CSDS001菌株；Harpin_Eccs蛋白激发子的氨基酸酸序列为SEQ ID.No1。络合态的蛋白激发子对几乎所有植物的作用均表现为广谱抗病、驱虫和抗逆性，并促进植物生长，提高产量，对盆花和苗木还有良好的塑型作用。

Description

白菜软腐菌的HarpinEccs蛋白及相关蛋白质的络合和应用

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，特别是涉及一种胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)白菜软腐菌变种CSDS001菌株hrpN_Eccs基因以及此基因通过生物技术方法提高植物多功能活性和广谱抗性并改良植物品质的应用。

背景技术

微生物蛋白农药是对多种农作物具有很强生物活性的一类蛋白质药物。按作用机理不同又可分为传统微生物蛋白农药和新型微生物蛋白农药。传统微生物蛋白农药主要是来自苏云金芽孢杆菌(Bt)的杀虫晶体蛋白(ICP)，新型微生物蛋白农药主要是蛋白激发子类物质，它与传统微生物蛋白农药最大的区别在于其不直接杀灭害虫和病原物，而是激发植物自身的抗病防虫基因的表达，并促进植物生长。其中具有代表性的有过敏蛋白(Harpin)、隐地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)等。

过敏蛋白(Harpin)主要是由欧文氏菌属(Erwinia)细菌产生的一类能激发植物过敏反应(HR)的蛋白质(30-40kda)，可诱导植物体内一系列基因的表达，激活植物自身的生长系统和防卫系统，从而使植物能抵御多种病害的侵染，并获得促长增产的效果。1992年，韦忠民等首先从梨火疫欧文氏杆菌(E.amylovora)中克隆并表达出这类过敏蛋白(Harpin)基因，并首次提出Harpin蛋白诱导植物HR可能与抗病性有关，即Harpin蛋白具有诱导植物抗病的功能，由此推动了新型微生物蛋白农药研究的兴起。经过约10年的努力，以此为背景的美国Eden生物科技公司成功开发和研制出具有广谱抗病防虫功能的新型微生物蛋白农药Messenger，该产品以其对大田作物和经济作物抗病增产方面良好的效果以及对绿色无公害农业卓越的贡献，曾两度获美国环境保护委员会颁发的总统绿色化学挑战奖。

隐地蛋白(Cryptogein)是由隐地疫霉分泌产生的蛋白类激发子(10-15kda)。该蛋白能在极低浓度(100pmol/ml)下诱导烟草产生HR，并使植物获得广谱抗病性，同时产生与防卫反应相关的物质如乙烯、植保素、病程相关蛋白(PR)等。法国Tepfer等首次将该蛋白基因成功导入烟草，并使烟草植株表现抗黑胫病作用。

激活蛋白(Activate Protein)是从交链孢菌、纹枯病菌、黄渠霉菌、葡萄孢菌、稻瘟菌、青霉菌、镰刀菌等多种真菌中筛选、分离、纯化出的一种新型蛋白(40-70kda)。与过敏蛋白(Harpin)和隐地蛋白(Cryptogein)不同，该蛋白不能诱导烟草的过敏反应，但对烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒等多种病毒病和蚜虫的控制效果在75％以上，并能促长增产。研究表明，激活蛋白主要是通过激活植物体内的分子免疫系统，提高植物的自身免疫力，而使植物获得广谱抗病性；并通过激发植物体内的一系列代谢调控，促进植物根茎叶生长和叶绿素含量提高，从而达到提高作物产量的目的。

综上所述，新型微生物蛋白农药在作用机理方面类似动物的免疫防卫机制，对于多种作物具有诱导抗病防虫和促长增产的效果。近年来，随着具有此类生物活性蛋白的各种微生物不断被发现，在对这类活性蛋白功能基因的结构、序列及其作用机理的深入研究基础上，进一步研究使活性蛋白功能表现出更强的抗病、防虫和抗逆性具有明显的现实意义。

发明内容

发明中的目的是将蛋白激发子通过某种方式与某些特殊的金属离子发生络合，使其功能活性和作用效果明显提高。

将白菜软腐菌的Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质与金属离子发生络合形成蛋白激发子使其对几乎所有植物的作用均表现出更强的抗病、防虫和抗逆功能活性，Harpin_Eccs蛋白激发子的原产生菌胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovorasubsp.carotovora)白菜软腐菌变种CSDS001菌株；Harpin_Eccs蛋白激发子的氨基酸酸序列为SEQ ID.No1。

具体实施方式

现就有关内容叙述如下：

1、白菜软腐菌的分离和鉴定该细菌在分类上属于胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp carotovora)白菜软腐菌变种，胡萝卜、白菜、芹菜都是其寄主植物。白菜软腐病多在白菜莲座末期开始发病。病株首先在短缩茎(俗称“葫芦”)处出现水浸状微黄色病斑，开始外观症状不明显，但随病情发展，白天植株外部叶片开始萎焉下垂，日落后可以恢复正常，发病严重时，叶球基部“葫芦”腐烂，呈褐色，散发出恶臭气味，叶球脱落。病菌有时也能从叶柄基部或叶球顶部伤口侵入，引起单个叶片或叶球自上而下腐烂。白菜带菌储藏期间，病情仍可发展，引起腐烂。

本菌株采自四川什邡国家无公害蔬菜生产基地。取1克被软腐菌(soft-rotting bacteria)严重感染的白菜(Chinese cabbage)组织置于1毫升磷酸缓冲液中，28℃温育10分钟；然后将悬液铺在LB平板上，28℃温育24小时；将单克隆菌落在无机平板上分别进行4种胞外酶的活性检测，这4种胞外酶分别是：果胶酶(pectate lyase)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)、蛋白酶(protease)和纤维素酶(cellulase)；选择2个具有明显胞外酶活性的单克隆菌落，分别接种进未感染细菌的新鲜白菜和芹菜组织中，28℃温育24小时。结果表明，所选择的2个单克隆菌落都能引起白菜和芹菜组织软腐和崩解。进一步检测表明，这2个单克隆菌落及其培养液能引起被注射接种的烟草叶片发生过敏反应。另外，所获得的白菜软腐病菌变种的菌落生长迅速、光滑，色泽淡白到乳黄。显微镜镜检表明：菌体呈短杆状，两端钝圆；大小1.0-2.0x0.5-0.7μm；单生或双生，少数串生；周围有鞭毛2-5根；不产生芽孢和荚膜；革兰氏染色阴性；兼性嫌气性。

按上述程序分离的白菜软腐细菌在分类上属于胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp carotovora)是基于以下事实：(1)该细菌适于生长的温度是25℃-34℃，而不是37℃；(2)该细菌大量分泌胞外酶的温度是28℃，而不是34℃；(3)该细菌只有生长在无机培养基上才大量产生胞外酶，而在像LB那样的富营养培养基上则不产生；(4)该细菌引起白菜和芹菜大量软腐或崩解的温度是28℃，而不是34℃；(5)该细菌能激发烟草叶片发生过敏反应。所有这些都与已报道的胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subspcarotovora)的资料相吻合。后来的事实进一步证明，从白菜软腐细菌中克隆的hrpN_Eccs基因与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subspcarotovora)的hrpN_Ecc基因具有90％以上的同源性，而其表达产物harpin_Eccs蛋白与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp carotovora)的harpin_Ecc蛋白也只有6个氨基酸的差别，同源性达98％以上。

鉴于所分离的细菌菌株的来源不同，包括寄主植物不同和地区差异性，以及hrpN基因和Harpin蛋白质的同源性、遗传多样性和差异性，我们将所分离的白菜软腐菌菌株定名为“Erwinia carotovora subsp.carotovora strainCSDS001”，而将从该菌株中克隆出的hrpN基因及其编码产物Harpin蛋白分别定名为“hrpN_Eccs基因”和“Harpin_Eccs蛋白”。

2、hrpN_Eccs基因和Harpin_Eccs蛋白的分子属性hrpN_Eccs基因和Harpin_Eccs蛋白的有关序列特征见Gene Bank(基因注册号：bankit698770 AY939927)。

hrpN_Eccs基因具有以下分子属性：(1)编码区共计有1071个核甘酸密码子；

(2)富含甘氨酸密码子，缺少半胱氨酸密码子；(3)与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌褐腐致病菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)Ecc71和Eccl菌株的hrpN_Ecc基因分别享有93％和92％的同源性；(4)与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌黑腐致病菌(Erwinia carotovora subsp.atrosepitica)SCR11043和SCR11039菌株的hrpN_Ecc基因分别享有89％和88％的同源性。

Harpin_Eccs蛋白的氨基酸酸序列为SEQ ID.No1，具有以下分子属性：(1)序列中共356个氨基酸残基，其中各氨基酸组成分别为：Met22、Asn20、Gly75、Leu40、Ser41、Ala28、Gln24、Ile13、Lys17、Thr13、Asp16、Phe10、Va17、Arg5、Glu9、Trp2、Tyr4、His1、Pro9；(2)分子量35.58kda；(3)等电点pI：5.26；(4)与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)褐腐致病变种的Harpin_Ecc蛋白相比，分子中有6个位点发生了氨基酸替换，分别为Ser₇₀→Gly₇₀、Gly₁₁₃→Ser₁₁₃、Ala₁₁₅→Val₁₁₅、Gly₂₄₉→Ala₂₄₉、Arg₃₁₇→Ala₃₁₇、Lys₃₅₂→Gln₃₅₂；(5)富含甘氨酸Gly和较多的疏水性氨基酸亮氨酸Leu，分别占氨基酸数目总量的21％和11％，尤其是在第1、2个突变氨基酸Gly₇₀和Ser₁₁₃之间，其丰度分别高达56％和28％；(6)缺乏半胱氨酸Cys；(7)对温度特稳定，在100℃沸水中耐受10-15分钟仍有活性；(8)没有四级结构。

3、Harpin_Eccs相关蛋白质Harpin_Eccs蛋白相关的蛋白激发子包括：(1)与Harpin_Eccs蛋白具有较高同源性的Harpin类蛋白质，如Harpin_Ecc、Harpin_Ea、Harpin_Ech、Harpin_pst、Harpin_psg、Harpin_pss等；(2)通过基因重组方式获得的具有Harpin功能活性的Harpin_Eccs融合蛋白及其它Harpin融合蛋白，如Harpin_Eccs+Harpin_Ecc、Harpin_Eccs+Harpin_Ea、Harpin_Eccs+Harpin_Ech、Harpin_Ecc+Harpin_Eca、Harpin_Ecc+Harpin_Ech、Harpin_Ea+Harpin_Ech等；(3)具有Harpin蛋白类似活性和功能的其它蛋白激发子，如来源于卵菌(Phytophthora)的隐地蛋白(Cryptogein，10-15kda)和来源于真菌(Alternaria)的激活蛋白(Activate Protein，40-70kda)以及其它相关蛋白质等。

4、Harpin_Eccs及相关蛋白质的络合络合是生物有机体中包括Harpin_Eccs蛋白在内的所有蛋白质及其它有机高分子化合物的基本化学属性。即利用机体中的相关离子或原子作中心离子或原子，以蛋白质及其它有机化合物分子为配位体，在一定pH和温度条件下发生结合或键合反应。其基本过程包括：首先形成“活性中间体”，然后循“多点挂钩、柔顺结合、最大成键”的反应原则，通过电荷控制和轨道控制这种电价性和共价性作用，最后结合形成稳定的络合物分子复合体。中心离子或原子也称络合物的形成体，是络合物的核心部分，位于络离子或络分子的中心，一般多是带正电荷的阳离子，但也有电中性原子甚至带负电荷的阴离子作为中心离子的。中心离子或原子绝大多数是金属离子，其中的过渡金属离子是较强的络合物形成体，而一些具有高氧化态的非金属元素的离子如Si⁴⁺和P⁵⁺等也是较常见的中心离子。配位体是络离子或络分子中同中心离子络合的离子或分子。在每一配位体中，直接同中心离子络合的原子称配位原子。经常作为配位原子的主要是非金属的N、O、S、C等原子和卤素原子等。配位体中所含配位原子的数目称为配位体基数，一个配位体中可能含有一个配位原子即单基配位体或多个配位原子即多基配位体。直接同中心离子或原子络合的配位原子的数目称为该中心离子或原子的配位数。一般中心离子或原子的配位数为2、4、6、8，其中最常见的是4和6。简单配位化合物由单基配位体与中心离子简单配位而形成，这类络合物一般没有环状结构，在溶液中容易发生逐级解离现象，称为维尔纳型络合物。螯合物又称内络合物，由中心离子和多基配位体络合而成，具有环状结构，稳定性高，很少发生逐级解离现象，是目前应用最广和在生物界普遍存在的一类络合物，如血红蛋白、叶绿素、细胞色素等。如果一个配位体中有一个或两个配位原子同时与两个中心离子络合，从而使内界含有两个或两个以上的中心离子，这样的络合物称多核络合物。很多金属都能形成多核络合物，如饮用水工业常用的聚合氯化铝和聚合氯化铁等。植物在其正常生理活动中需要11种必需大量或常量营养元素和14种微量营养元素，这些元素的原子或离子既可充当中心离子，又可充当配位体中的配位原子，而蛋白质是有机分子中最常见又最容易被络合的的有机配位化合物。

Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质的络合反应，主要特征是：(1)Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质充当有机配位化合物，其中充当配位原子的是分子中部分氮、氧、硫、碳和卤素原子等；(2)充当络合中心离子或原子的是钙、镁、铁、钴、铜、锌、锰等碱土金属或过渡金属元素的离子或原子，以及这些元素的二元或多元结合态，即金属络离子或络合物；(3)络合中心离子或原子与Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质中的配位原子在适宜条件下发生络合或多元络合反应形成Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质的络合物；(4)络合反应条件包括：共处理PH1-14，预处理时间0-48小时，络合处理温度0℃-80℃，络合处理时间0-48小时。络合反应时，反应混合液需用电磁场或超声波进行不间断的振荡或回流，必要时可间以适当时间的静置处理。络合反应时，络合中心离子或原子与活性有机配位化合物的质量配比依据二者的荷电属性、电荷当量以及络合反应的性质而定。

5、Harpin_Eccs及相关蛋白质络合物的性质Harpin_Eccs及相关蛋白质络合物基于其络合物的化学属性和其本身的功能活性而表现出稳定、高效和功能活性更优的特点。首先，这些蛋白质在结构和性质上均具有功能性的亲水性和疏水性基团，以及带正电荷和负电荷的电性基团，在通常情况下容易吸湿、光解和氧化。经与中心离子发生络合反应以后，由于相互间依靠共价键、电荷转移、离子键、离子-偶极、偶极-偶极、氢键、范德华力、疏水作用等形成空间和电性上彼此互恰的和匹配更优的刚性结构，从而使其稳定性增强。其次，这些活性有机配位化合物大多具有柔性结构，难以与作用靶点达到理想的匹配。经与中心离子发生络合反应以后，形成的络合物分子复合体在空间和电性上增加了结构的刚性和与作用靶点的匹配性，从而使其功能活性表现出高效性。有研究表明，蛋白质在pH2.8的酸性介质中，肽键可质子化为亲水基团，其侧链疏水基团聚集成疏水核，形成类似阳离子表面活性剂胶束，其表面带有较多正电荷，容易吸引带负电荷的酸性分子在其表面聚集，从而对金属络合物产生增敏作用。另外，金属络合物中的金属离子由于配位不饱和，还可与蛋白质的肽键N和O发生配位反应，形成具有五元环结构的多元络合物，这样金属离子与蛋白质之间已不是单纯的电荷相互作用，而是进一步发生混配络合反应，使产物更加稳定。

因此，Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质被络合以后，表现以下属性：(1)稳定性更高，对高温、光照、酸碱具有更强的耐受性和耐储性；(2)功能活性更强，能提早启动或激发植物的反应系统，效率更高；(3)使用功能的广谱性和作用植物的广谱性提高；(4)作用时间更长。

6、Harpin_Eccs及相关蛋白质络合物的功能Harpin类蛋白在诱导植物广谱性的防虫、抗病、抗逆以及促长增产方面的作用是无需置疑的。最近的研究表明，Harpin类蛋白可能在植物的信号通路中起着重要作用。研究人员用Harpin处理拟南芥，发现拟南芥中Cl、Ca、K、H、Cu、Zn离子通道以及各种氧化酶被激活，这些氧化酶包括ACC合成酶、抗坏血酸氧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、Cu分子伴侣前体等等。现在通常认为，植物细胞壁中广泛存在Harpin蛋白的受体，即Harpin结合蛋白(Harpin-binding proteins，HrBP)，Harpin可以通过与这些受体蛋白HrBP结合激活植物中的多条信号通路。这些信号通路大致可以分为以下三类：(1)与植物抗病和驱虫相关的信号通路的激活，包括过敏反应与细胞死亡、离子交换通道、水杨酸途径、茉莉酸途径、苯丙氨酸解氨酶介导的途径以及其它一些抗性基因介导的途径；(2)与促进植物生长相关的信号通路的激活，包括一般的生长调节因子、胚轴延伸转录因子、生长转录因子、乙烯反应元件结合蛋白系以及蔗糖合成酶和其他胚胎形成酶等；(3)与植物抗逆相关的信号通路的激活，包括热休克蛋白、COR基因和耐盐锌蛋白等。另外可能还存在一条比较特殊的不依赖于NPR1介导的植物对细菌抗性的信号通路。

Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质络合物与其它Harpin类蛋白一样，能诱导或激发植物体内一系列基因的表达，包括防卫系统的基因和生长系统的基因，使植物获得对各种病原性细菌、真菌、病毒及有害昆虫的系统获得性的广谱抗性，并促进生长和提高产量。具体表现在：(1)能有效防治植物的细菌性病害，如各种蔬菜、粮食和经济作物的软腐病、环腐病、黑腐病、黑斑病、黑胫病、黑星病、黑粉病、叶枯病、青枯病、斑枯病、蔓枯病、纹枯病、枯萎病、炭疽病、角斑病、褐斑病、褐纹病、紫斑病、疮痂病、菌核病、白叶枯病、白粉病、白斑病、白锈病、锈病等；(2)能有效防治植物的真菌性病害，如各种蔬菜、粮食和经济作物的霜霉病、灰霉病、叶霉病、煤霉病、疫霉病、早疫病、晚疫病、绵疫病等；(3)能有效防治植物的病毒性病害，如白菜孤丁病、蕃茄花叶病、烟草花叶病、白菜褪绿斑驳病毒病、白菜花叶斑驳病毒病以及由X-和Y-病毒复合感染引起的马铃薯病毒病等；(4)能有效防治植物的有害昆虫，如蚜虫、菜蛾、菜粉蝶、棉铃虫、烟青虫、玉米钻孔虫、马铃薯瓢虫、甜菜甲虫、粉螨、金针虫、蝼蛄、蝇、粉虱等；(5)提高植物的抗逆性，包括对干旱、高温、低温、盐碱的抗性等；(6)促进生长和提高产量；(7)延长植物产品的储存时间；(8)对盆花和苗木还有良好的塑型作用。

下面以实施例方式对本发明中的来自白菜软腐菌的Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质的络合和应用作进一步说明：

实施例1络合中心离子的筛选

我们对植物生长发育和代谢中必需的十一种大量元素氢、碳、氮、氧、钠、镁、磷、硫、氯、钾、钙和十四种微量元素氟、硅、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、硒、钼、锡、碘等元素的离子化合物、络合物或络离子进行了筛选试验，筛选出的离子化合物、络合物或络离子包括：醋酸盐、磷酸盐、碳酸盐、可溶性碘化物、锰酸盐、高锰酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、氯酸盐、次氯酸盐、硫酸盐、硫代硫酸盐、硒酸盐、亚硒酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐等

试验表明，碱土金属和过渡金属元素的离子化合物、络合物或络离子中的金属离子可作为首选的络合中心离子，它们能与作为配位体的Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质发生不同程度的络合反应或多元络合反应，并能形成稳定、高效和功能活性更优的二元至多元的Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质络合物。

实施例2络合反应的流程控制

在多元络合反应中，控制好反应条件十分重要。主要是：Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质与络离子的反应质量比、PH值、反应温度、静置处理时间、反应处理时间和反应器反应方式如静置、搅拌、回流、震荡、电磁场震荡等。我们通过设计正交试验，建立了相应的优化条件组合。

基本操作流程如下：(1)在反应容器中，加入适量的Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质等配位化合物，并稀释成一定的反应浓度；(2)按中心离子与配位化合物的化合价配比再加入相应的金属盐如硫酸锰等；(3)加热至45℃-55℃，不断搅拌或振荡，并控制PH7.0～7.5，反应时间6-8小时；(4)用EDTA法测定螯合率；(5)络合产物再经红外光谱KBr测定，如果COO(-1)和NH₃(+1)的伸展振动都向低波数位移，表明COO(-1)和NH₃(+1)与加入的金属离子配位，形成了络合物。

实施例3 蛋白络合物的稳定性检测

我们将按实施例2的方法流程获得的Harpin_Eccs蛋白络合物与未经络合处理的Harpin_Eccs蛋白对各种极端条件的稳定性或耐受性进行了比较，结果如下：

在100℃条件下，Harpin_Eccs蛋白20分钟后基本丧失活性，而该蛋白的钙-络合物和铁-络合物40分钟后仍有活性，80分钟后才逐渐丧失活性。

在pH14条件下，Harpin_Eccs蛋白10分钟后丧失活性，而该蛋白的钙-络合物和铁-络合物30分钟内仍保持活性，50分钟后丧失活性。

在pH1条件下，Harpin_Eccs蛋白100分钟后丧失活性，而该蛋白的钙-络合物和铁-络合物200分钟内仍保持活性，500分钟后丧失活性。

在10000Lux强光照条件下，Harpin_Eccs蛋白60分钟后丧失活性，而该蛋白的钙-络合物和铁-络合物200分钟内仍保持活性，500分钟后丧失活性。

以上结果表明，Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质被金属离子络合后，其稳定性或耐受性明显增强。

实施例4蛋白络合物的剂型设计

Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质络合物在制备、储存和应用中的可能的剂型有：原药包括固体即原粉和液体即原油；储存和应用的产品剂型包括可湿性粉剂、水剂、缓释剂以及与其他肥料或杀菌剂、杀虫剂的混合制剂等。另外，Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质络合物制剂的相关辅料和助剂，包括大量食品级的可溶性营养成分及少量关键成分。由于这类蛋白络合物及其制剂无毒无公害，使用时无需特殊的防护。

实施例5蛋白络合物的使用方法和要求

应用Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质络合物时，(1)处理植物的适宜方法包括：浸种、拌种、种子包衣、蘸根、叶面喷雾、注射、花果喷涂等。(2)处理植物的适宜条件包括：选择适宜的用药时间和用药时的环境气象条件；可湿性粉剂或水剂应用无氯的河水、井水、地下水或自来水配成要求的使用浓度；切忌与酸、碱混合；药品应保存在阴凉干燥处。(3)处理植物的具体要求包括：整个生长季节均适于用药。一般在植物长出1-5片真叶时即开始用药；一季作物可施药1-6次，每次间隔7-15天；植物病害发生前用药效果最佳；使用时已配制好的药液建议在24小时内用完。

实施例6 Harpin_Eccs蛋白络合物的应用举例

我们用Harpin_Ea蛋白、Harpin_Eccs蛋白和络合-Harpin_Eccs蛋白制剂按标准品比试验方法对多种作物进行了试验。其中Harpin_Ea蛋白为来自美国Eden生物科技公司的Messenger产品，Harpin_Eccs蛋白和络合-Harpin_Eccs蛋白为我们自己制备的Harpin蛋白制剂。试验中所使用的蛋白制剂浓度均为20μg/ml。每种作物均在幼苗期开始用药，用药方法为叶面喷雾，累计喷雾3次，每次喷雾相间7-15天。最后统计分析产量，获得了如下结果：

(1)油菜Harpin_Ea蛋白、Harpin_Eccs蛋白和络合-Harpin_Eccs蛋白分别比对照增产17％、18％和22％。

(2)芹菜Harpin_Ea蛋白、Harpin_Eccs蛋白和络合-Harpin_Eccs蛋白分别比对照增产25％、11％和20％。

(3)马铃薯Harpin_Ea蛋白、Harpin_Eccs蛋白和络合-Harpin_Eccs蛋白分别比对照增产10％、20％和33％。

(4)辣椒Harpin_Ea蛋白、Harpin_Eccs蛋白和络合-Harpin_Eccs蛋白分别比对照增产16％、15％和20％。

以上结果表明，Harpin_Ea蛋白、Harpin_Eccs蛋白和络合-Harpin_Eccs蛋白3种蛋白制剂虽然都比对照有明显的增产效果，但络合-Harpin_Eccs蛋白比未经络合的Harpin_Ea蛋白和Harpin_Eccs蛋白明显具有更显著的增产效果。另外，更有趣的是，Harpin_Ea蛋白和Harpin_Eccs蛋白对不同作物的增产效果显然具有品种差异性，包括对该蛋白原产生菌寄主植物的不敏感性，但络合处理似乎恰恰能够消除Harpin蛋白对这些植物遗传上或生理上的不敏感性，从而使Harpin类蛋白激发子及其它活性蛋白质能够获得更广泛的用途。

实施例7、相关蛋白及其络合物生物学活性-过敏反应的试验

用Harpin_Ea蛋白、Harpin_Eccs蛋白和络合-Harpin_Eccs蛋白3种蛋白制剂对36种植物叶片进行过敏反应试验，24小时后，观察统计发生典型特征性过敏反应的植物种类数，以比较它们的生物学活性和诱导植物多功能生物学效应的能力。

观察结果是，它们诱发植物产生过敏反应的植物种类，按顺序是16种、26种和32种，过敏反应反应斑的大小和组织坏死程度上(过敏反应强度)，络合-Harpin_Eccs蛋白大于Harpin_Eccs蛋白，Harpin_Eccs蛋白又大于Harpin_Ea蛋白。

结果表明，络合-Harpin_Eccs蛋白的诱导能力和生物学活性强于Harpin_Eccs蛋白，Harpin_Eccs蛋白的诱导能力和生物学活性又强于Harpin_Ea蛋白。

实施例8、相关蛋白络合物的应用举例

我们用Harpin_Ecc、Harpin_Ea、Harpin_Ech、Harpin_pst、Harpin_psg、Harpin_pss、隐地蛋白和激活蛋白与这些蛋白的络合物作田间效果对比试验。试验材料为西红柿，用药浓度均为20μg/ml，用药方法为叶面喷雾，4叶幼苗期即开始用药，累计用药3次，每次相间7-15天，最后统计分析产量，结果如下：

络合-Harpin_Ecc、络合-Harpin_Ea、络合-Harpin_Ech、络合-Harpin_pst、络合-Harpin_psg、络合-Harpin_pss、络合-隐地蛋白和络合-激活蛋白分别比相应的Harpin_Ecc、Harpin_Ea、Harpin_Ech、Harpin_pst、Harpin_psg、Harpin_pss、隐地蛋白和激活蛋白增产12％-25％、16％-20％、13％-20％、11％-19％、16％-22％、9％-21％、7％-12％、6％-13％。这些结果进一步显示，Harpin类蛋白质、隐地蛋白质类和激活蛋白质类的蛋白激发子被络合后，其功能活性被进一步促进和加强。

序列表

<110>成都派润生物科技有限公司

<120>白菜软腐菌的Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质的络合和应用

<160>1

<170>PatentIn Version2.1

<210>1

<211>356

<212>PRT

<213>胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)

<400>1

Met Leu Asn Ser Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Gln Ile Thr Ile Lys

1 5 10 15

Ala Gly Gly Asn Gly Gly Leu Phe Pro Ser Gln Ser Ser Gln Asn Gly

20 25 30

Gly Ser Pro Ser Gln Ser Ala Phe Gly Gly Gln Arg Ser Asn Ile Ala

35 40 45

Glu Gln Leu Ser Asp Ile Met Thr Thr Met Met Phe Met Gly Ser Met

50 55 60

Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly ser Ser Leu

65 70 75 80

Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu

85 90 95

Gly Ser Ser Leu Gly Ser Gly Leu Gly Ser Ala Leu Gly Gly Gly Leu

100 105 110

Ser Gly Val Leu Gly Ala Gly Met Asn Ala Met Asn Pro Ser Ala Met

115 120 125

Met Gly Ser Leu Leu Phe Ser Ala Leu Glu Asp Leu Leu Gly Gly Gly

130 135 140

Met Ser Gln Gln Gln Gly Gly Leu Phe Gly Asn Leu Gln Pro Ser Ser

145 150 155 160

Pro Glu Ile Ser Ala Tyr Thr Gln Gly Val Asn Asp Ala Leu Ser Ala

165 170 175

Ile Leu Gly Asn Gly Leu Ser Gln Thr Lys Gly Gln Thr Ser Pro Leu

180 185 190

Gln Leu Gly Asn Asn Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe

195 200 205

Asn Gln Leu Gly Ser Thr Leu Gly Met Ser Val Gly Gln Leu Ala Gly

210 215 220

Leu Gln Glu Leu Asn Asn Ile Ser Thr His Asn Asp Ser Pro Thr Arg

225 230 235 240

Tyr Phe Val Asp Lys Glu Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln

245 250 255

Phe Met Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Ala Glu Tyr Gln Lys

260 265 270

Asp Asn Trp Gln Thr Ala Lys Gln Glu Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala

275 280 285

Leu Ser Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Lys Gly Ser Met Asp Lys

290 295 300

Phe Met Lys Ala Val Gly Met Ile Lys Ser Ala Ile Ala Gly Asp Thr

305 310 315 320

Gly Asn Thr Asn Leu Ser Ala Arg Gly Asn Gly Gly Ala Ser Leu Gly

325 330 335

Ile Asp Ala Ala Met Ile Gly Asp Arg Ile Val Asn Met Gly Leu Gln

340 345 350

Lys Leu Ser Ser

355

Claims

1、白菜软腐菌的Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质的络合，其特征在于，将白菜软腐菌的Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质与金属离子发生络合形成蛋白激发子使其对几乎所有植物的作用均表现出更强的抗病、防虫和抗逆功能活性；Harpin_Eccs蛋白激发子的原产生菌为胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)白菜软腐菌变种CSDS001菌株；Harpin_Eccs蛋白激发子的氨基酸酸序列为SEQ ID.No1。

2、根据权利要求1所述之白菜软腐菌的Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质的络合，其特征在于，所述Harpin_Eccs蛋白相关的蛋白激发子包括：(1)与Harpin_Eccs蛋白具有较高同源性的Harpin类蛋白质；(2)通过基因重组方式获得的具有Harpin功能活性的Harpin_Eccs融合蛋白及其它Harpin融合蛋白；(3)具有Harpin蛋白类似活性和功能的其它蛋白激发子。

3、根据权利要求1或2所述之白菜软腐菌的Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质的络合，其特征在于，络合反应条件包括：共处理PH1-14，预处理时间0-48小时，络合处理温度0℃-80℃，络合处理时间0-48小时。络合反应时，反应混合液需用电磁场或超声波进行不间断的振荡或回流，必要时可间以适当时间的静置处理。

4、权利要求1或2或3所得之白菜软腐菌的Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质的络合产物的用途，其特征在于，Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质络合物功能活性适用的植物包括：各种自然条件和栽培条件下的所有被子植物和裸子植物，以及某些观赏性蕨类植物、林木或苗木以及各种牧草和绿化用草皮等。

5、根据权利要求4所述之白菜软腐菌的Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质的络合产物的用途，其特征在于，Harpin_Eccs蛋白及相关蛋白质活性络合物用于诱导或激发植物自身的抗病驱虫基因以及代谢基因的表达，使植物获得对各种病原性细菌、真菌、病毒及有害昆虫的系统获得性的广谱抗性，并促进生长和提高产量。