CN113862206A - 一种大肠埃希氏菌及其在制备免疫蛋白生物制剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，特涉及一种大肠埃希氏菌及其在制备免疫蛋白生物制剂中的应用。大肠埃希氏菌Escherichia coli已于2021年6月24日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCC No.22767。所述菌株在作为高效表达目标蛋白的宿主细胞中的应用。本发明获得菌株大肠埃希氏菌Escherichia coli,其具有遗传性状稳定，易于培养，抵抗杂菌能力强的特点；将其作为宿主细胞应用至植物免疫蛋白规模化生产，可以实现植物免疫蛋白的高效表达。

Description

一种大肠埃希氏菌及其在制备免疫蛋白生物制剂中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特涉及一种大肠埃希氏菌及其在制备免疫蛋白生物制剂中的应用。
背景技术
植物免疫蛋白包括来自苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白(ICP)及植物免疫蛋白类物质。从目前来看，植物免疫蛋白是已鉴定种类中最多品类最丰富的激发子类型，其中包括Nep1-like protein、RXLR蛋白家族、过敏反应诱导蛋白Hrip1、MoHrip2、Harpin等几十种免疫激活蛋白，其本身不会影响环境及环境中的非靶标有益微生物或昆虫，具有重要的应用前景。从植物病原菌中直接获取免疫蛋白非常困难，通过构建大肠杆菌、酵母菌等生物工程菌来实现批量生产是切实可行的，其中宿主细胞的特性对植物免疫蛋白的获取起到决定性作用，因此寻找并实现高产率、高活性的植物免疫蛋白的宿主细胞并且实现规模化生产是十分必要的。
五味子灰霉病主要为害五味子叶片和果实，首先在叶缘或叶尖处开始发病，逐渐扩展形成不规则形病斑，后期病斑较干脆易破裂，随着病斑扩大病斑呈灰褐色并出现灰色霉层，叶片向内卷曲。果实发病初期呈水渍状小点，向内凹陷，随着病情发展，病斑逐渐扩大，呈深褐色，皱缩，边缘明显，严重时整个果实皱缩变黑，最后产生灰色霉层；随着种植面积的扩大，病害问题日益突出，给五味子的产量和品质都带来了很大影响；因此筛选绿色、环保的药剂应用于五味子病害的防治具有十分重要的意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种大肠埃希氏菌及其在制备植物免疫蛋白制剂中的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种大肠埃希氏菌，大肠埃希氏菌Escherichia coli已于2021年6 月24日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCC No.22767。
一种大肠埃希氏菌的应用，所述菌株在作为高效表达目标蛋白的宿主细胞中的应用。
一种高效植物免疫蛋白，免疫蛋白为SEQ ID NO:1中所示的氨基酸。
Seq ID No.1所示。
MPGMSLNTSGLGASTMQISIGGAGGNNGLLGTSRQNAGLGGNSALGLGGGNQNDTVNQLAGLLT GMMMMMSMMGGGGLMGGGLGGGLGNGLGGSGGLGEGLSNALNDMLGGSLNTLGSKGGNNTTSTT NSPLDQALGINSTSQNDDSTSGTDSTSDSSDPMQQLLKMFSEIMQSLFGDGQDGTQGSSSGGKQ PTEGEQNAYKKGAGMSLNTSGLGASTMQISIGGAGGNNGLLGTSRQNAGLGGNSALGLGGGNQN DTVNQLAGLLTGMMMMMSMMGGGGLMGGGLGGGLGNGLGGSGGLGEGLSNALNDMLGGSLNTLG SKGGNNTTSTTNSPLDQALGINSTSQNDDSTSGTDSTSDSSDPMQQLLKMFSEIMQSLFGDGQD GTQGSSSGGKQPTEGEQNAYKKGA
所述的免疫蛋白由408个氨基酸组成，包含4个结构域，每个结构域包含一个稳定的α螺旋及其连接的富含酸性氨基酸的亲水性酸性单位；结构域来源相同，并且每个单独的结构域都具有引起植物过敏性坏死反应的能力；通过结构域的有序重复来实现过敏性坏死反应能力的倍数提升及植物真菌病害的有效防治。
所述的免疫蛋白工程菌株构建如下步骤，
以pET32a质粒为模板，通过EcoRⅠ/XholⅠ双酶切的方法，将免疫蛋白表达基因克隆至pET32a质粒EcoRⅠ/XholⅠ双酶切位点之间；将重组质粒pET32a-SH转化菌株Escherichiacoli(CGMCC No.22767)，该菌株质粒稳定、免疫蛋白表达量高，且来自于海洋，抗性较强。
一种高效植物免疫蛋白制剂，制剂含所述免疫蛋白。
将免疫蛋白转化至所述菌株中，而后发酵培养控制溶氧30～60％，得免疫蛋白发酵液纯化后与保护剂复配得制剂。
所述保护剂占免疫蛋白发酵液按体积比为2～6％；其中，保护剂为海藻糖。
将所述免疫蛋白转化至所述菌株于LB培养基中获得种子液，将种子液按体积比为5～10％接种到种子发酵培养基中，发酵温度为35～37℃，种子发酵罐转速为150～200rpm/min，溶氧30～60％，罐压为0.02～0.08Mpa，培养6～10h，得到免疫蛋白发酵种子液；将免疫蛋白发酵种子液接入液体发酵培养基中，接种体积百分比为8～12％，发酵温度为35～37℃，液体发酵罐转速为80～160rpm/min，溶氧30～60％，罐压为0.02～0.08Mpa，培养 26～30h，得到免疫蛋白发酵液；免疫蛋白发酵液加入8M尿素缓冲液提取2～ 3h，然后进行过滤得到纯化后的免疫蛋白。
所述种子发酵培养基和液体发酵培养基的初始pH值均为6.7～7.5。
种子发酵培养基、液体发酵培养基组分为：碳源3～50g/L,氮源20～ 100g/L，无机盐0.5～50g/L，消泡剂0.05～1g/L，其余为水，pH为6.7～ 7.5。
所述高效植物免疫蛋白制剂更进一步的制备为：
(1)取含有植物免疫蛋白基因的大肠埃希氏工程菌株划线培养，挑取单菌落接种摇瓶培养，制成摇瓶种子液；
(2)在种子发酵培养罐中配制种子发酵培养基，其中所述种子发酵培养基的初始pH值是6.7～7.5；
(3)将摇瓶种子液接种到种子发酵培养基中发酵培养，接种体积百分比为5～10％，发酵温度为35～37℃，种子发酵罐转速为150～200rpm/min，溶氧30～60％，罐压为0.02～0.08Mpa，培养6～10h，得到发酵种子液；
(4)将发酵种子液接入液体发酵培养基中，接种体积百分比为8～12％，发酵温度为35～37℃，液体发酵罐转速为80～160rpm/min，溶氧30～60％，罐压为0.02～0.08Mpa，培养26～30h，得到免疫蛋白发酵液。
(5)将得到的免疫蛋白发酵液加入8M尿素缓冲液提取2～3h，然后进行过滤得到免疫蛋白原液，与保护剂复配后进行冷冻干燥。
(6)采用5～10％SDS-PAGE凝胶电泳，配合imageJ软件的使用，分析并计算免疫蛋白的含量。
其中，种子发酵培养基和液体发酵培养基的初始pH值均为6.7～7.5。
其中，步骤(2)包括：
对种子发酵培养基进行高温灭菌，种子发酵培养基包括如下组分含量：碳源3～50g/L,氮源20～100g/L，无机盐0.5～50g/L，消泡剂0.05～1g/L，其余为水，灭菌温度为121～125℃，压力为0.103～0.168MPa，灭菌20～ 30min,灭菌后的种子发酵培养基的pH值6.8～7.5。
其中，步骤(4)包括：
对液体发酵培养基进行高温灭菌，液体发酵培养基包括如下组分含量：碳源3～50g/L,氮源20～100g/L，无机盐0.5～50g/L，消泡剂0.05～1g/L，其余为水，灭菌温度为121～125℃，压强为0.103～0.168MPa，灭菌20～ 30min，灭菌后的液体发酵培养基的pH值6.8～7.5。
上述两种培养基中，碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜、甘油中的任意一种或几种任意比例的组合；氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母膏、玉米浆、硫酸铵、氯化铵中的任意一种或几种任意比例的组合；无机盐为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸锰、硫酸铜、硫酸锌、硫酸亚铁中的一种或几种任意比例的组合。
其中，步骤(5)包括：
免疫蛋白发酵液加入的8M尿素缓冲液包括如下组分：0.1M磷酸钠，10mM Tris缓冲液，pH8.0。
其中，步骤(1)包括：
取免疫蛋白甘油菌，平板划线培养，挑取单菌落，接入摇瓶中的LB液体培养基，35～37℃，150～200rpm/min，震荡培养8～12h，生长至OD6000.6～ 0.8，即为免疫蛋白种子液；
其中，LB培养基的pH值为6.5～7.5，按重量份，所述LB液体培养基包括蛋白胨7～14份，酵母粉8～15份，氯化钠4～1.8份。
一种高效植物免疫蛋白制剂的应用，所述高效植物免疫蛋白制剂在作为五味子灰霉病的抑制剂中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明获得菌株大肠埃希氏菌Escherichia coli,其具有遗传性状稳定，易于培养，抵抗杂菌能力强的特点；将其作为宿主细胞应用至植物免疫蛋白规模化生产，可以实现植物免疫蛋白的高效表达。
(2)本发明所述植物免疫蛋白的特点是通过堆积HR结构域和有序的重复单位来增强植物抗病性，将其转入至大肠埃希氏菌使其正确折叠并实现高效表达进而获得高活性的植物免疫蛋白制剂，该制剂尤其是对五味子灰霉病的防治效果显著。
附图说明
图1为本发明实施例提供的植物免疫蛋白制剂SDS-PAGE凝胶电泳图。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明的内容，但不限制本发明的保护范围。
实施例1
大肠埃希氏菌(Vibrio fumissii)的分离及鉴定
1、菌株的分离
取1g海洋沉积物样品，分别稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，随后吸取100ul稀释后的样品在肉汤培养基中涂布扩增培养。将扩增培养后的菌体，均匀涂布在伊红美蓝培养基上，37℃恒温培养培养12～16h。挑取金属光泽的菌落，划线后进行纯培养，挑取单菌落置于L液体培养基中扩增培养。
2、菌株的鉴定
2.1、形态学鉴定
按照说明书操作进行革兰氏染色。接种环取环菌液，置于干净的载玻片上。经自然干燥或是酒精固定后，滴加一滴结晶紫染液，约1min后，清水冲洗，干燥后滴加碘液进行复染，同样经水洗后，经95％乙醇溶液脱色，滴加番红染液进行复染。水洗后，待玻片自然干燥后，于油镜下观察可见细菌为两端钝圆的革兰氏阴性、红色的短杆菌、无芽孢。
2.2、生理生化特征鉴定
分离所得菌株可以利用麦芽糖、葡萄糖、甘露醇和乳糖，能产酸又产气；吲哚试验、MR试验为阳性，氧化酶试验、V-P试验为阴性，该试验结果与大肠杆菌的生化鉴定相符合，判定分离菌株为大肠杆菌。
2.3、16SrDNA序列同源性分析
采用通用引物16F27，1492r扩增16SrDNA，得到DNA片段。将16SrDNA 序列结果用BLAST进行序列同源性比较，结果与大肠杆菌埃希氏菌 Escherichia coli(MN208097.1)的同源性99％。结合菌株形态、生理生化特征，最终确定所分离菌株为大肠杆菌埃希氏菌(Escherichia coli)。
大肠埃希氏菌Escherichia coli已于2021年6月24日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏号CGMCCNo.22767。
菌株序列为：
GCATGCGGGCAGCTACACATGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGA GTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGG TAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGAT GTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGG TCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG TGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTT CGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGT TACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGC GTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCC CGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAAT TCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTG GACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC CACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCG TTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCG CACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACAT CCACGGAAGTTTCCAGAGATGAGAAGGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTG TCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGT TGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGAT GACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAG AGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGC AACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTT CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTT AACCTTCGGGAGGGCGCTACCACTTTATTTGCT
实施例2
利用本发明所获得的菌株大肠埃希氏菌Escherichia coli,将其作为宿主细胞进行1)植物免疫蛋白工程菌株的构建：
以pET32a质粒为模板，通过EcoRⅠ/XholⅠ双酶切的方法，将免疫蛋白表达基因克隆至pET32a质粒EcoRⅠ/XholⅠ双酶切位点之间获得重组质粒pET32a-SH；将重组质粒pET32a-SH转化大肠埃希氏菌株Escherichia coli(CGMCC No.22767)。
所述免疫蛋白表达基因克隆：以海棠火疫病DNA为模板，上游引物 SHs(SEQ IDNo.2)：5'-ATAGAATTCATGCCCGGGATGAGTCTGAATACC-3'(EcoRI 用下划线表示)；下游引物SHa(SEQ ID No. 3)：5'-CCGCTCGAGTGGAAAAAATATCCGTAAGACAAGCG-3' (XholI用下划线表示)；在50uL反应体系下进行,包括ExTaq聚合酶、150ng 上游引物和下游引物以及1ng模板DNA；反应条件：预变性95℃5min，30 个循环95℃30s变性，55℃45s退火，72℃90s延伸；延伸72℃7min。扩增获得免疫蛋白表达基因。植物免疫蛋白序列如Seq ID No.1所示。
Seq ID No.1
MPGMSLNTSGLGASTMQISIGGAGGNNGLLGTSRQNAGLGGNSALGLGGGNQNDTVNQLA GLLTGMMMMMSMMGGGGLMGGGLGGGLGNGLGGSGGLGEGLSNALNDMLGGSLNTLGSKGGNNT TSTTNSPLDQALGINSTSQNDDSTSGTDSTSDSSDPMQQLLKMFSEIMQSLFGDGQDGTQGSSS GGKQPTEGEQNAYKKGAGMSLNTSGLGASTMQISIGGAGGNNGLLGTSRQNAGLGGNSALGLGG GNQNDTVNQLAGLLTGMMMMMSMMGGGGLMGGGLGGGLGNGLGGSGGLGEGLSNALNDMLGGSL NTLGSKGGNNTTSTTNSPLDQALGINSTSQNDDSTSGTDSTSDSSDPMQQLLKMFSEIMQSLFG DGQDGTQGSSSGGKQPTEGEQNAYKKGA
(a)序列特征：
·长度：408
·类型：氨基酸序列
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：海棠火疫病
上述植物免疫蛋白由408个氨基酸组成，包含4个结构域，每个结构域包含一个稳定的α螺旋及其连接的富含酸性氨基酸的亲水性酸性单位；
2)菌种扩增
取上述获得大肠埃希氏菌Escherichia coli植物免疫蛋白工程菌株，进行平板划线纯化，选取单菌落接种装有50mL LB培养基的200mL容量的三角瓶中,37℃,100～200rpm/min，培养过夜,从中取1mL加入至装有500mL LB培养基2000mL容量的三角瓶中,37℃，100～200rpm/min,培养4～6h，即为扩增后的摇瓶种子液。
4)免疫蛋白发酵生产
免疫蛋白采用二级发酵进行生产。种子发酵罐为1000L，种子发酵培养基为600L；发酵罐为10000L发酵罐，发酵罐培养基为6000L。
发酵罐总容积为10000L,装料系数70％,顶部磁力搅拌：变频调速的转速在5～lOOOrpm/min之间，搅拌桨确保搅拌均匀，可方便拆卸，搅拌桨的型式为轴向流和径向流组合。罐内温度控制：夹套的热流体的可加热可降温。
具体为：
(1)在种子发酵培养罐中配制种子发酵培养基，种子发酵培养基的初始 pH值7.0；其中，种子发酵培养基包括如下组分：葡萄糖0.6％，酵母粉20％，糖蜜0.6％，酵母膏0.3％，蛋白胨20％，NaCl 0.5％，(NH4)2SO4 1％，MgSO4·7H2O 0.3％，MnSO4·H2O 0.03％，FeSO4·7H2O 0.03％，泡敌0.05％，其余为水，pH 为7.0。
(2)将摇瓶种子液接种到上述获得的种子发酵培养基中进行发酵培养，接种体积百分比为6％，发酵温度为37℃，种子发酵罐转速为160rpm/min，溶氧40％，罐压为0.05Mpa，培养8h，得到发酵种子液；
(3)在发酵培养罐中配制发酵培养基，其中所述发酵培养基的初始pH 值为7.0；
所述液体发酵培养基包括如下组分：葡萄糖1.2％，酵母粉15％，糖蜜 1.0％，酵母膏0.3％，蛋白胨12％，NaCl 0.5％，(NH4)2SO4 0.6％，MgSO4·7H2O 0.3％，MnSO4·H2O0.03％，FeSO4·7H2O 0.03％，泡敌0.05％，其余为水。
(4)将发酵种子液接入上述液体发酵培养基中，接种体积百分比为6％，发酵温度为37℃，种子发酵罐转速为160rpm/min，溶氧40％，罐压为 0.05Mpa，培养30h，得到植物免疫蛋白发酵液。
(5)结束培养后,保持搅拌速度为90rpm/min，缓慢加入尿素缓冲液至发酵液中，至尿素终浓度为8mol/L且完全溶解后继续搅拌30min；调节pH值 6.5,得到植物免疫蛋白原液。
所述8M尿素缓冲液包括如下组分：0.1M磷酸钠，10mM Tris缓冲液， pH8.0。
实施例3植物免疫蛋白制剂
将上述所得植物免疫蛋白原液与海藻糖按体积比6％混合，进行冷冻干燥，得到植物免疫蛋白制剂。采用5～10％SDS-PAGE凝胶电泳，配合imageJ 软件的使用，分析并计算免疫蛋白的含量(参见图1)。如图所示，泳道M： Marker,泳道1：BSA 1g/L,泳道2：BSA 0.5g/L,泳道3：BSA 0.25g/L,泳道 4：植物免疫蛋白制剂稀释20倍0.5g/L，泳道5：植物免疫蛋白制剂稀释 10倍1g/L，泳道6：植物免疫蛋白制剂稀释5倍2g/L。
实施例4hrpNEa植物免疫蛋白制剂
1)工程菌株构建
以pET32a质粒为模板，通过EcoRⅠ/XholⅠ双酶切的方法，将来源于梨火疫病的hrpNEa克隆至pET32a质粒EcoRⅠ/XholⅠ双酶切位点之间；将重组质粒pET32a-H转化Escherichia coli(CGMCC No.22767)，得到高表达免疫蛋白的菌株株系。
2)菌种扩增及蛋白表达
取植物免疫蛋白工程菌菌种，待融化后平板划线纯化，选取单菌落接种装有50mLLB培养基的200mL容量的三角瓶中,37℃,100～200rpm/min，培养过夜,从中取1mL加入至装有500mL LB培养基2000mL容量的三角瓶中,37℃，100～200rpm/min,培养4～6h，加入诱导剂进行蛋白表达。30h 培养结束后,保持搅拌速度为90rpm/min，缓慢加入尿素缓冲液至发酵液中，至尿素终浓度为8mol/L且完全溶解后继续搅拌30min；调节pH值6.5,得到植物免疫蛋白原液。
所述8M尿素缓冲液包括如下组分：0.1M磷酸钠，10mM Tris缓冲液， pH8.0。
3)植物免疫蛋白制剂
将上述所得植物免疫蛋白原液与其体积6％的海藻糖混合，进行冷冻干燥，得到植物免疫蛋白制剂。
应用例1植物免疫蛋白对植物真菌病害的防治效果
将上述实施例3获得的植物免疫蛋白制剂以及实施例4获得hrpNEa植物免疫蛋白制剂进行防效检测：
具体为：购买生长一致的五味子苗置于温室内，20棵为一个处理，分别用本发明所得植物免疫蛋白1～4ppm、hrpNEa植物免疫蛋白、市面出售的植物免疫蛋白产品作为阳性对照以及清水进行叶面喷雾，设三次重复，24h 后接种培养好的灰霉病菌，待空白对照发病后调查灰霉病的发生情况并记录调查结果(参见表1)，用DPS软件进行方差分析。
病情指数＝[(∑各级病叶数×该病级值)/(调查总叶数×9)]×100；
防效(％)＝(空白对照的病情指数-处理的病情指数/空白对照的病情指数)×100
采用9级分级标准：
0级：叶片无病斑
1级：病斑占叶片面积5％以下；
3级：病斑占叶片面积6％～10％；
5级：病斑占叶片面积11％～20％；
7级：病斑占叶片面积21％～40％；
9级：病斑占叶片面积40％以上。
表1
Figure RE-GDA0003359330670000081
﹡表示5％水平上的差异显著性
由上述可见本发明所得植物免疫蛋白对五味子灰霉病的防治效果明显，植物免疫蛋白各浓度处理的五味子灰霉病病情指数同清水对照、阳性对照及hrpNEa植物免疫蛋白都达到了差异显著水平，所述植物免疫蛋白各浓度处理的防效在91.07％～100.00％，各处理之间无显著差异。
应用例2植物免疫蛋白应用
本发明涉及所述的植物免疫蛋白制剂在诱导植物反应中的应用,所述的植物反应包括，促进植物营养吸收及生长发育，增强植物广谱抗病性及抗逆性包括抗寒、抗旱、抗涝、耐盐碱，增产,延长存储时间等。
本发明还涉及使用实施例3获得的植物免疫蛋白制剂诱导植物反应的方法，所述的诱导方法为:对植物或植物种子施用所述的植物免疫蛋白制剂。
所述的对植物或植物种子施用所述的植物免疫蛋白制剂的步骤为，
(1)对植物幼苗或成株喷施所述植物免疫蛋白制剂；
(2)以浸种的方式在栽培前浸泡植物根茎或块茎；
所述的植物免疫蛋白制剂喷施或浸种时按照如下浓度浸种或兑水喷施，同时以清水作为对照。
根据不同作物采用不同使用方法，浸种、拌种、叶面喷施均可：
(1)小麦及水稻等作物，在作物苗期和快速生长期，每亩共喷施作物叶面2～3次，使用浓度0.5～1ppm，出苗一周后，苗高比对照增长10％；
(2)玉米及花生等作物，在作物苗期和快速生长期，每亩共喷施作物叶面2～3次，使用浓度1～3ppm，出苗两周后，生物量比对照增长18％；
(3)苹果、樱桃等作物从新叶舒展期开始使用，直到收获前每隔15-20 天喷施1次，共喷3～5次，使用浓度3～5ppm，可溶性糖含量比对照增加 5％；
(3)以种子或根茎(比如土豆、红薯)等作物埋土种植的，可以在种植前先浸种或兑水均匀喷施种子、果实表面，使用浓度2～3ppm；增产12％以上；
(4)叶菜类作物，苗期喷施一次,2～3周喷施一次至采摘，使用浓度 0.25～0.5ppm，出苗整齐，抗旱抗寒。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 烟台水禾土生物科技有限公司
<120> 一种大肠埃希氏菌及其在制备免疫蛋白生物制剂中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 408
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Pro Gly Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met
1 5 10 15
Gln Ile Ser Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr
20 25 30
Ser Arg Gln Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly
35 40 45
Gly Gly Asn Gln Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu Thr
50 55 60
Gly Met Met Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met Gly
65 70 75 80
Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Leu Gly Glu Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser
100 105 110
Leu Asn Thr Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr
115 120 125
Asn Ser Pro Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln Asn
130 135 140
Asp Asp Ser Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro
145 150 155 160
Met Gln Gln Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe
165 170 175
Gly Asp Gly Gln Asp Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gln
180 185 190
Pro Thr Glu Gly Glu Gln Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Ala Gly Met Ser
195 200 205
Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser Ile Gly
210 215 220
Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gln Asn Ala
225 230 235 240
Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn Gln Asn
245 250 255
Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Met Met Met Met
260 265 270
Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu Gly Gly
275 280 285
Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu Gly Leu
290 295 300
Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr Leu Gly
305 310 315 320
Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro Leu Asp
325 330 335
Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln Asn Asp Asp Ser Thr Ser
340 345 350
Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln Gln Leu Leu
355 360 365
Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Asp Gly Gln Asp
370 375 380
Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gln Pro Thr Glu Gly Glu
385 390 395 400
Gln Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Ala
405

Claims (10)

1.一种大肠埃希氏菌，其特征在于：大肠埃希氏菌Escherichia coli已于2021年6月24日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCC No.22767。
2.一种权利要求1所述大肠埃希氏菌的应用，其特征在于：所述菌株在作为高效表达目标蛋白的宿主细胞中的应用。
3.一种高效植物免疫蛋白，其特征在于：免疫蛋白为SEQ ID NO:1中所示的氨基酸。
4.一种高效植物免疫蛋白制剂，其特征在于：制剂含权利要求3所述免疫蛋白。
5.按权利要求4所述高效植物免疫蛋白制剂，其特征在于：将免疫蛋白转化至权利要求1所述菌株中，而后发酵培养控制溶氧30～60％，得免疫蛋白发酵液纯化后与保护剂复配得制剂。
6.按权利要求5所述的高效植物免疫蛋白制剂，其特征在于：所述保护剂占免疫蛋白发酵液按体积比为2～6％；其中，保护剂为海藻糖。
7.按权利要求6所述的高效植物免疫蛋白制剂，其特征在于：将所述免疫蛋白转化至权利要求1所述菌株于LB培养基中获得摇瓶种子液，将摇瓶种子液按体积比为5～10％接种到种子发酵培养基中，发酵温度为35～37℃，种子发酵罐转速为150～200rpm/min，溶氧30～60％，罐压为0.02～0.08Mpa，培养6～10h，得到免疫蛋白发酵种子液；将免疫蛋白发酵种子液接入液体发酵培养基中，接种体积百分比为8～12％，发酵温度为35～37℃，液体发酵罐转速为80～160rpm/min，溶氧30～60％，罐压为0.02～0.08Mpa，培养26～30h，得到免疫蛋白发酵液；免疫蛋白发酵液加入8M尿素缓冲液提取2～3h，然后进行过滤得到免疫蛋白原液。
8.按权利要求7所述的高效植物免疫蛋白制剂，其特征在于：所述种子发酵培养基和液体发酵培养基的初始pH值均为6.7～7.5。
9.按权利要求7或8所述的高效植物免疫蛋白制剂，其特征在于：种子发酵培养基、液体发酵培养基组分为：碳源3～50g/L,氮源20～100g/L，无机盐0.5～50g/L，消泡剂0.05～1g/L，其余为水，pH为6.7～7.5。
10.一种权利要求4所述高效植物免疫蛋白制剂的应用，其特征在于：所述高效植物免疫蛋白制剂在作为五味子灰霉病的抑制剂中的应用。
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