CN103333228A

CN103333228A - 一种来源于果胶杆菌的蛋白HrpNX3及其基因与应用

Info

Publication number: CN103333228A
Application number: CN2013102396920A
Authority: CN
Inventors: 谢华; 马荣才; 杨丽萍; 赵亮
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2013-06-17
Filing date: 2013-06-17
Publication date: 2013-10-02
Anticipated expiration: 2033-06-17
Also published as: CN103333228B

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种来源于果胶杆菌的蛋白HrpN_X3及其基因与应用。本发明提供了一种来源于胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum的蛋白HrpN_X3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述蛋白HrpN_X3的编码基因hrpN_X3序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的HrpN_X3显著提高了模式植物拟南芥和名贵药材铁皮石斛对软腐病菌抗病性，可用于植物防治软腐病领域，具有广阔的应用前景和其巨大经济效益。

Description

一种来源于果胶杆菌的蛋白HrpNX3及其基因与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种来源于果胶杆菌的蛋白HrpN_X3及其基因与应用。

背景技术

Harpin蛋白是由植物革兰氏阴性病原菌（如Pectobacterium、Erwinia、Pseudomonas、Xanthomonas和Ralstonia）等hrp基因簇成员编码并通过III型分泌系统（T3SS）分泌的蛋白因子。由hrpN基因编码的Hrp蛋白是病原菌扩散中是重要的结构蛋白，在引起植物过敏反应的同时，诱导宿主植物产生抗体的主要蛋白，可使植物体获得对多种病原菌的广谱抗性，同时Hrp蛋白又具有调节植物的生长发育等生物学效应。对Erwinia amylovora菌株Ea321的hrpN基因编码的harpinEa蛋白生物学活性的研究，Eden Biosicence已开发出了高效安全的生物农药，其显著防病、抗虫和增产效果而引起广泛关注。研究表明，水稻黄单孢细菌（Xanthomonas oryzae）不同菌株来源的HrfA基因编码的Harpin蛋白在激发过敏性反应和诱导抗性中表现出不同的生物活性（李平，陆徐忠，邵敏，龙菊英，王金生.2004.水稻黄单胞细菌Harpin蛋白的遗传多样性及其诱导烟草过敏反应和抗病性功能，科学通报C辑，34(2):136-143）；果胶杆菌Pcc不同菌株来源hrpN基因编码的Harpin蛋白能均引起典型过敏性症状，但生物活性存在显著差异（汤承，2006，HarpinEcc蛋白对园艺植物的生物学效应及其诱导抗性的分子机制解析，西南大学博士学位论文）。

植物软腐病在世界范围内广泛发生，重要病原物有Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum（Pcc）（原Erwinia carotovora subsp.carotovora,Ecc）、Pectobacterium carotovorum subsp.atrosepticum（Pca）（原Erwinia carotovora subsp.atrosepticum,Eca）和Pectobacterium chrysanthemi（Pch）（又名Dickeya dadantii，原Erwinia chrysanthemi,Ech）。这些破坏性致病菌侵染植物贮藏器官和新鲜组织，能迅速导致植物组织解离、腐烂，产生枯萎、茎腐和软腐等症状，引起很多经济上重要的植物严重的经济损失，包括蔬菜作物（白菜和甘蓝类蔬菜、胡萝卜、番茄、马铃薯、洋葱、萝卜、辣椒和黄瓜等）、花卉植物（菊花、蝴蝶兰、紫罗兰和君子兰等）、名贵药材铁皮石斛等，以及模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）。软腐菌生存能力强且易于传播，加之缺乏有效的防治方法，该病害有扩散蔓延和逐年加重的趋势。虽然链霉素、新霉素和四环素等抗生素在一定程度上能够控制软腐病菌，但这些广谱性抗生素的大量使用，不仅出现了大量的耐药致病菌株，而且不利于环境、食品和人类的安全。因此，获得能显著提高植物对软腐病抗性的安全性生物农药具有重大意义。克隆和分离HrpN蛋白可以更好的应用于植物软腐病防治。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于果胶杆菌Pectobacterium carotovorum ssp.carotovorum（Pcc）菌株X3能显著提高植物对软腐病菌抗性的蛋白HrpN_X3。

本发明的另一目的是提供编码上述蛋白HrpN_X3的基因hrpN_X3。

本发明的另一目的是提供包含上述hrpN_X3基因的重组表达载体pET30a(+)-hrpN_X3。

本发明的另一目的是提供包含上述hrpN_X3基因的重组菌株BL21(Lyss)-hrpN_X3。

本发明的另一目的提供上述蛋白HrpN_X3的应用。

本发明从菌株Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum X3中分离得到一种新的HrpN蛋白，HrpN_X3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MLNSLGGGASLQITIKAGGNGGLFQSQSSQNGGSPSQSAFGGQRSNIAEKLSDIMTTMMFMGSMMGGGMGGGLGGLGSSLGGLGGGLLGGGLGSSLGSGLGSALGGGLGGALGAGMNAMNPSAMMGSLLFSALEDLLGGGMSQQQGGLFGNKQPSSPEISAYTQGVNDALSAILGNGLSQTKGQTPPLQLGNNGLQGLSGAGAFNQLGSTLGMSVGQKAGLQELNNISTHNDSPTRYFVDKEDRAMAKEIGQFMDQYPEVFGKPEYQKDNWQTAKQDDKSWAKALSKPDDDGMTKGSMDKFMKAVGMIKSAVAGDTGNTNLNARGNGGSSLGIDAAMIGDRIVNMGLKKLSS

根据本发明的编码上述蛋白HrpN_X3的基因hrpN_X3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，含有1059个碱基；其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，由352个氨基酸组成。

SEQ ID NO.2：

ATGCTTAATTCTCTTGGTGGCGGAGCTTCTCTGCAAATCACGATCAAGGCGGGCGGTAACGGCGGTTTATTTCAATCTCAGTCTTCACAGAATGGCGGATCGCCATCGCAGTCAGCGTTTGGTGGCCAGCGTAGCAACATCGCAGAAAAACTGTCCGATATCATGACAACCATGATGTTCATGGGCAGCATGATGGGCGGTGGCATGGGTGGTGGGCTCGGTGGTTTAGGCAGCAGTCTGGGCGGACTCGGCGGCGGTTTGCTGGGTGGCGGTCTCGGTAGTAGCCTTGGCAGCGGGCTGGGCAGTGCGCTCGGTGGTGGATTAGGCGGGGCGCTGGGTGCTGGCATGAATGCCATGAATCCATCGGCCATGATGGGTAGCTTGCTGTTTAGCGCGCTGGAAGATCTGCTGGGCGGCGGCATGTCGCAGCAGCAGGGGGGGCTGTTCGGCAACAAACAGCCGTCGTCGCCGGAAATTTCTGCCTATACCCAAGGCGTTAACGATGCGCTGTCCGCTATTCTGGGCAATGGCCTGAGCCAGACGAAAGGGCAAACGCCACCGCTGCAACTGGGCAATAACGGTCTGCAAGGCCTGAGCGGTGCGGGTGCGTTCAATCAACTGGGTAGCACGCTGGGGATGAGCGTTGGGCAAAAAGCCGGTTTGCAGGAACTGAACAACATCAGCACGCACAACGACAGCCCGACGCGTTACTTCGTCGATAAAGAAGACCGGGCGATGGCGAAAGAAATTGGTCAGTTTATGGATCAATATCCTGAAGTCTTCGGTAAGCCGGAATACCAGAAAGATAACTGGCAGACGGCGAAGCAGGATGACAAATCCTGGGCGAAAGCGCTGAGCAAGCCGGATGATGACGGCATGACCAAAGGCAGCATGGATAAATTCATGAAGGCGGTCGGCATGATCAAGAGCGCGGTGGCGGGTGACACCGGCAATACTAACCTGAATGCTCGCGGCAATGGCGGTTCGTCTCTGGGCATTGATGCGGCGATGATCGGTGACCGTATCGTCAACATGGGGTTGAAGAAGCTCTCCAGCTAA

本发明还提供了含上述hrpN_X3基因的重组表达载体，以及包含上述hrpN_X3基因的重组菌株。优选地，将p-hrpN_X3中hrpN_X3基因用Kpn I和EcoR I双酶切下后，与同样用Kpn I和EcoR I双酶切的原核表达载体pET-30a（+）进行连接，构建重组表达载体pET30a（+）-hrpN_X3，转化到表达菌株E.coli BL21(Lyss)中，获得重组菌株BL21(Lyss)-hrpN_X3。

本发明的HrpN_X3明显提高了模式植物拟南芥和名贵药材铁皮石斛对软腐病菌抗病性，可用于植物防治软腐病领域，具有广阔的应用前景和其巨大经济效益。

附图说明

图1重组蛋白HrpN_X3的诱导表达，M，蛋白分子量Marker；1，未经IPTG诱导含有pET30a（+）-hrpN_X3重组表达菌体BL21(Lyss)；2，经IPTG诱导含有空载体pET-30a（+）重组表达菌体BL21(Lyss)；3，经IPTG诱导含有pET30a（+）-hrpN_X3重组表达菌体BL21(Lyss)。

图2重组蛋白HrpN_X3的提纯，M，蛋白分子量Marker；1，提纯的重组蛋白HrpN_X3；2，重组蛋白HrpN_Pcc71。

图3重组蛋白HrpN_X3诱导烟草叶片过敏反应，1，PBS对照；2，3，4，5和6：分别5、10、20、50、100μl HrpN蛋白PBS重悬液（浓度为0.3ug/ml）。

图4重组蛋白HrpN_X3处理对拟南芥和铁皮石斛Pcc BC1抗性影响。

具体实施方式

实施例1：Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum菌株hrpN_X3基因的克隆

提取Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum基因组DNA。

根据hrpN基因序列保守序列和原核表达载体多克隆位点（便于构建表达载体），设计跨越包含起始密码子和终止密码子在内的HrpN结构基因，并引入加有限制性内切酶Kpn I和EcoR I酶切位点以及保护性碱基的一对引物（划线部分为引入的酶切位点）：

F1:5’-CGGGTACCATGCTTAATTCTCTTGGTGGCG-3’

R1:5’-CCGAATTCTTAGCTGGAGAGCTTCTTCAACC-3’

以Pcc X3基因组总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃预变性5min；94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸7min。在1.0%的琼脂糖凝胶上得到预期大小片段，将该片段回收纯化后分别克隆到pGEM-TEasy载体上，获得重组克隆载体p-hrpN_X3，转化到大肠杆菌E.coli DH5a进行测序。获得基因hrpN_X3核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，含有1059个碱基；其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，由352个氨基酸组成，预测蛋白分子量为35.3kDa，经验证为新基因。

实施例2：重组HrpN_X3蛋白的高效表达与活性检测

经测序验证后，将p-hrpN_X3中hrpN_X3基因用Kpn I和EcoR I双酶切下后，与同样用Kpn I和EcoR I双酶切的原核表达载体pET-30a（+）进行连接，构建重组表达载体pET30a（+）-hrpN_X3，转化到表达菌株E.coli BL21(Lyss)中，获得重组菌株BL21(Lyss)-hrpN_X3，并经酶切和PCR鉴定后，以pET-30a（+）空载体的BL21(Lyss)为对照，加入1mmol/L IPTG诱导表达3h后，收集菌体进行小量表达试验，用12%SDS-PAGE检测表达情况（图1），如图1箭头指示，含hrpNX3重组表达菌体BL21(Lyss)-hrpN_X3在相对分子质量35～40kDa处有一条浓的目的蛋白带，符合预测蛋白分子量大小。经IPTG和乳糖诱导表达比较后，选用0.5%浓度的乳糖代替IPTG进行放大诱导表达，获得高表达量重组蛋白HrpN_X3。经水煮沸法、超声波和高压细胞破碎菌体细胞和硫酸铵分级蛋白提纯方法的比较后，选用高压细胞破碎和15%硫酸铵对重组蛋白进行分离纯化，进行SDS-PAGE检测（图2），在分子量35～40kDa处有单一目标条带，与来自对照菌株Pcc71的重组蛋白HrpN_Pcc71大小一致。

用5、10、20、50和100μl浓度为0.3ug/ml重组蛋白HrpN_X3和HrpN_Pcc71分别处理同一烟草W38叶片，验证蛋白活性，以PBS缓冲液为对照，24h后观察HrpN_X3和HrpN_Pcc71分别用量为10和50μl起能激发烟草过敏性坏死斑。

实施例3：重组HrpN_X3蛋白处理对拟南芥和铁皮石斛软腐病抗性的影响

选取同一批生长势基本一致的拟南芥和铁皮石斛幼苗作为受试材料。喷施30ug/ml HrpN_X3和HrpN_Pcc71，以PBS缓冲液为对照，24h后用针头轻轻在叶片表面划“十”字形伤口接种软腐病菌Pcc BC1，浓度2×10⁸CFU/ml，接种量为5ul，每份材料接种6株苗，每株苗3片叶，重复3次。置于28℃恒温气候箱中，保持相对湿度90%，光照周期为16h（光）/8h（暗）。经过HrpN_X3、HrpN_Pcc71和对照PBS处理过的拟南芥和铁皮石斛发病情况如图4所示。HrpN_X3和HrpN_Pcc71处理24h拟南芥病情从52.59%分别降为18.03%和41.47%，二者之间以及二者与对照之间均达到了极显著水平；HrpN_X3和HrpN_Pcc71处理24h铁皮石斛病情从54.56%分别降为20.12%和40.93%，二者之间与以及二者与对照之间均达到了极显著水平（表1）。

表1重组蛋白HrpNX3处理拟南芥和铁皮石斛软腐病情指数分析（接种后24h）

Claims

1.一种来源于果胶杆菌的蛋白HrpN_X3，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种来源于果胶杆菌的hrpN_X3基因，其特征在于，编码权利要求1所述的来源于果胶杆菌的蛋白HrpN_X3。

3.根据权利要求2所述的来源于果胶杆菌的hrpN_X3基因，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2所述基因重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pET30a（+）-hrpN_X3。

6.包含权利要求2所述基因的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组表达菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌。

8.权利要求1所述来源于果胶杆菌的蛋白HrpN_X3的应用。