CN114106584B - 桃色欧文氏菌粉色素的提纯工艺及其应用 - Google Patents

桃色欧文氏菌粉色素的提纯工艺及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种桃色欧文氏菌粉色素的提纯工艺及其应用，通过以下步骤，供试菌株的选取；供试培养基的选择；桃色欧文氏菌粉色素的制备；粉色素的提取纯化；粉色素的波长扫描；粉色素稳定性测试；粉色素对病原真菌的抑制性测试，为粉色素的提纯以及稳定性能的确定提供了理论型的依据，同时对土传病原的抑制实验，给粉色素的抑菌功能提供了准确的实验数据。

Description

桃色欧文氏菌粉色素的提纯工艺及其应用
技术领域
本发明涉及粉色素提纯以及粉色素对土传病原真菌作用效果领域，尤其涉及一种桃色欧文氏菌粉色素的提纯工艺及其应用。
背景技术
随着可持续发展理念的深入，绿色农业的兴起，植物土传病害的生物防治措施已越来越受人们的关注。土传病害是由生活在土壤中的病原菌以土为媒介从植物根部或茎部侵害植物的病害。常见的土传病原菌有尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、疫霉、腐霉和大丽轮枝菌等，由这些病原菌引起的枯萎病、根腐病、早疫病和青枯病等毁灭性病害严重者会使得作物减产60％以上甚至绝收。
目前，农业生产中对于土传病害的防控手段应用最为广泛的是栽培抗病品种和使用化学杀菌剂，但是抗病品种培养周期长且不能消除土壤富集病原菌的威胁，杀菌剂虽具备成本低、使用方便等特点，但近年来人们对食品安全和环境的日益重视，使得更绿色环保且无药剂残留的生物防治方法成为国内外研究热点。研究指出，用生物防治的措施在土壤中接种人工选育的拮抗菌和促生菌，或对植物施用一些菌株的发酵产物或代谢物质，可以有效降低土传病害的发生率，提高作物产量。
因此，在菌株的次生代谢产物中挖掘相关物质已成为研究病害防治的重要手段之一，其中桃色欧文氏菌粉色素由于对土传染病具有很好的拮抗效果，所以研究桃色欧文氏菌粉色素的有效提纯方法以及具体对各类土传病原真菌的拮抗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种桃色欧文氏菌粉色素的提纯工艺及其应用，以解决上述技术问题
为解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种桃色欧文氏菌粉色素的提纯工艺及其应用，其特征在于：包括如下步骤：
1)供试菌株的选取，包括:
分离自紫花苜蓿种子的桃色欧文氏菌(Cp2)和番茄早疫病菌、油菜菌核病菌、马铃薯丝核病菌、黄瓜枯萎病菌及苜蓿根腐病菌5种真菌；
2)供试培养基的选择,包括：
营养琼脂培养基(NA)：牛肉膏，3g；蛋白胨，10g；NaCl，5g；水，1000mL；琼脂，15-20g，以用于Cp2菌株的培养和短期保存；
King’s B培养基：蛋白胨，20g；K2HPO4，1.15g；MgSO4·7H2O，1.5g；甘油，10mL；水，1000mL；琼脂，15-20g，用于Cp2粉色素的培养与富集；
马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：土豆，200g；葡萄糖，20g；琼脂，15-20g；以用于病原真菌的培养及对照；
粉色素PDA培养基(PPPDA)：在PDA培养基的基础上加入体积比为20％的粉色素(OD340＝0.785)提取液,以用于5种病原真菌的抑菌活性研究；
3)桃色欧文氏菌粉色素的制备；
4)粉色素的提取纯化；
5)粉色素的波长扫描；
6)粉色素稳定性测试；
7)粉色素对病原真菌的抑制性测试。
优选的，步骤2)中，所述营养琼脂培养基和King’s B培养基PH值选择7.0-7.2，同时在121℃灭菌20min，所述PDA培养基的PH值为自然状态下PH，同时在121℃下灭菌20min。
优选的，步骤3)中，所述桃色欧文氏菌粉色素的制备选用接种环刮取NA培养平板的菌体，单线法接种于King’s B培养基，28℃黑暗条件下培养72h左右，至菌体内包含大量色素时用药匙刮取，备用。
优选的，步骤4)中，所述粉色素的提纯方法包括粉色素的粗提取和纯化，分别用有机溶剂浸提法和萃取法，收集培养平板内的菌体，用药匙刮取1.0g置于10mL离心管中，分别加入5mL蒸馏水、氯仿、乙酸乙酯、异戊醇、石油醚、冰醋酸、正丁醇和无水乙醇中浸泡2h，同时此过程中每隔30min用涡旋振荡器震荡1min，再用12000rpm的离心机离心15min后收集上清液，观察粉色素在各溶剂中的溶解状况，选择最佳浸提溶液和萃取溶液，从而得到纯色素提取液。
优选的，步骤5)中，所述粉色素的扫描用紫外分光广度计光谱扫描模式扫描纯色素溶液在间隔为1nm时200-800nm的波长，以确定粉色素的特征波长。
优选的，步骤6)中，所述粉色素的性能测试包括：光稳定性测试、温度稳定性测试、PH稳定性测试、金属离子稳定性测试、氧化还原稳定性测试。
优选的，步骤7)中，所述粉色素对病原真菌的抑制性能研究方法为用直径为5mm的打孔器在培养的菌落边缘同一圆周上打取菌饼，接入PDA(对照)和PPPDA培养基中央，每组处理三次重复，置于25℃恒温箱中黑暗培养。以对照组菌落边缘接近皿壁时为时间结点，期间连续每天用十字交叉法测量各处理的菌落直径(即为生长速率)，并计算生长抑制率；
生长抑制率(％)＝(对照菌落的直径-处理菌落直径)/(对照菌落的直径-菌饼直径)×100％。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过对桃色欧文氏菌Cp2粉色素的理化性质，即稳定性能测试以及对病原真菌的抑制性能的研究，可以得出粉色素在在提纯制取时最佳的方法以及粉色素的性能确定，同时可得出对多种土传病原菌具有良好的抑制作用，从而为粉色素的提纯和制备奠定了基础和对植株土传病的防害起到的促进，进而更加能够从绿色环保的方向对植株进行防害。
附图说明
图1为本发明实施例1中不同比例浸提剂和萃取剂纯化粉色素的示意图；
图2为本发明实施例2中粉色素的波长扫描曲线图；
图3为本发明实施例3中光对稳定性能的测试的对照实验图；
图4为本发明实施例3中温度对粉色素稳定性的影响实验图；
图5为本发明实施例3中PH值对粉色素稳定性能测试图；
图6为本发明实施例3中氧化剂对粉色素稳定性的影响实验图；
图7为本发明实施例3中还原剂对粉色素稳定性的影响实验图；
图8为本发明实施例4中粉色素在PDA和PPPDA中对番茄早疫病菌的抑制效果对比实验图；
图9为本发明实施例4中粉色素对番茄早疫菌的生长情况的影响折线以及柱状图；
图10为本发明实施例4中粉色素在PDA和PPPDA中对油菜菌核病菌的抑制效果对比实验图；
图11为本发明实施例4中粉色素在对油菜菌核病菌的抑制效果折线以及柱状图；
图12为本发明实施例4中粉色素在PDA和PPPDA中对马铃薯丝核病菌的抑制效果实验对比图；
图13为本发明实施例4中粉色素对马铃薯丝核病菌的生长情况的影响折线以及柱状图；
图14为本发明实施例4中粉色素在PDA和PPPDA中对黄瓜枯萎病菌的抑制效果实验对比图；
图15为本发明实施例4中粉色素对黄瓜枯萎病菌的生长情况的影响的折线以及柱状图；
图16为本发明实施例4中粉色素在PDA和PPPDA中对苜蓿根腐病菌的抑制效果实验对比图；
图17为本发明实施例4中粉色素对苜蓿根腐病菌的生长情况的影响的折形及柱状图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
下面结合附图描述本发明的具体实施例。
实施例1
粉色素的提取纯化过程中，有机溶剂的选择，通过设置不用溶剂种类进行溶解性的对照，如表1所示：
表1粉色素在有机溶剂的溶解性
注：“-”表示不溶于该溶液；“+”表示溶于该溶液，数量越多溶解性越大。
通过菌体中色素在八类溶剂中的溶解情况可知，该色素极易溶于该色素极易溶于冰醋酸中，其次为无水乙醇和蒸馏水，因此该粉色素为水溶性色素。另外该粉色素还可溶于正丁醇，微溶于乙酸乙酯。但是不溶于氯仿、异戊醇和石油醚中。因此，根据溶解情况及溶剂特性综合考虑，选择乙醇作为浸提液，氯仿作为萃取剂。
同时设置粉色素在不同乙醇浓度梯度下进行溶解，以选取最适乙醇浓度，如表2所示：
表2粉色素在乙醇溶液的溶解性
结合表1和表2所选择的浸提剂75％乙醇和萃取剂氯仿在粉色素提取过程中由于两种溶剂比例的变化会出现三种情况，如图1所示，A、B和C分别是纯化时氯仿和无水乙醇比例接近1:1，大于1:1和小于1:1的示意图。本试验在提取粉色素时将氯仿加入含75％乙醇的粗色素提取液中静置片刻待有明显分层即达到A的效果后收集“色素+水”相即可。
由上述对比组试验结合附图1可知，该粉色素的最佳浸提溶剂为75％乙醇，萃取剂为氯仿。
实施例2
粉色素的扫描波长选择，通过提取的色素，进行200-800nm下波长扫描，结合附图2可知，波长为340nm时得到最大OD值0.943，即该制得的粉色素最大的吸收波长为340nm。
实施例3
粉色素稳定性能的研究：
1.光对稳定性能的测试
设置光照和黑暗两种情况处理下，观察粉色素OD值的变化,结合附图3可知，无论是在光照条件下还是在黑暗条件下，随着处理时间的增长粉色素的稳定性与对照0h无显著差异(p>0.05)，而且同一时间段下光照与黑暗处理下的粉色素OD值也无显著差异。
注：不同小写字母表示处理组内差异极显著(p<0.05)；“*”表示处理组间差异显著，“**”表示差异极显著(p<0.01)，下同。
2.温度对粉色素性能的测试
设置不同温度梯度处理下，粉色素OD值的变化，结合附图4所图可知，在0h时8个温度处理下的粉色素OD值之间均无显著差异，随着温度的上升2h后的吸光值整体呈现出上升趋势，但在4-30℃温度条件下粉色素的OD值无显著差异，在40℃后各温度处理下差异显著(p<0.05)，120℃时达到最大OD值但也仅是4℃的1.01倍，差异不大，并且2h后80℃和120℃处理下的粉色素OD值与0h时差异极显著(p<0.01)，但二者仍是0h时的1.01倍。
3.PH值对粉色素稳定性能测试
通过设置不同PH值时，粉色素OD值变化进行对比；
如附图5A所示，pH值为1-7时粉色素的OD值在0和2h整体都呈现下降趋势，0h时粉色素的OD值在pH值为4-7时差异不显著但与1-3之间差异极显著(p<0.05)，且pH为7时的OD值是pH为1的0.88倍；2h时粉色素的OD值在pH为5-7时差异不显著但与1-4之间差异极显著(p<0.05)，且pH为7时的OD值是pH为1的0.84倍。此外，pH在酸性条件1、3和4时0和2h之间差异显著，其余pH下粉色素的OD值均无显著差异，整体变化趋势类似。如附图5B所示，pH值在8-14时粉色素的OD值在0h时呈现下降趋势，但在2h时先下降后上升趋势。当pH值在8-10时0h和2h下的粉色素OD值差异极不显著，而且同一时间处理下的OD值变化不大，但是当pH在11-14时0h和2h下的OD值差异极显著(p<0.01)，在pH为14时，0h下的OD值是2h的0.80倍。
4.金属离子对粉色素稳定性能的测试
通过添加不同金属离子于粉色素内，进行对比，观察粉色素的残留和颜色的改变，如下表3：
表3金属离子对粉色素稳定性的影响
由表3可知，与对照CK相比较，0h时9种金属离子对粉色素的OD值影响不大，但在2h后粉色素在部分金属离子中颜色发生变化，粉色素的残存率[29]也有所差异。其中加入Na+、K+、Mn2+和Ca2+的粉色素OD值在2h后虽有降低但差异较小，通过肉眼对粉色素溶液的观察发现颜色只有轻微的变浅。Mg2+对粉色素有一定的消色作用且在2h后的残存率是对照的77.4％。Fe2+和Fe3+均会使得粉色素的颜色加深，且Fe2+离子的增色作用更加显著是CK的1.86倍，Fe3+离子在使得粉色素颜色加深的同时还产生了絮状沉淀。Cu2+和Zn2+离子会使得粉色素在2h后分别变成草绿色和浅绿色。
5.氧化剂和还原剂对粉色素的稳定性能的测试
设置不同浓度梯度的氧化剂H2O2和还原剂Na2SO3，进行对比试验；
结合附图6可知，随着体积分数为10％的H2O2含量的增加粉色素的OD值在0h和2h时均有不同程度的下降，且色素OD值在2h后的整体下降趋势更加明显。0h时，粉色素的OD值在含量为2％-10％时均与对照(10％H2O2含量为0)差异极显著(p<0.05)。2h时，粉色素的OD值在各个含量之间差异显著，且含量为2％时粉色素OD值是对照的80％，之后OD值虽有下降但整体趋势变化不大；
结合附图7可知，随着100g·L-1Na2SO3含量百分比的增加，在0h时粉色素OD值整体为先上升后下降趋势，在含量为2％时达到最大值OD值是对照(100g·L-1Na2SO3含量为0)的1.01倍，在含量为4％-10％时逐渐下降8％时为最小值是对照的0.98倍，整体维持在一个相对稳定的水平。在2h时，随着还原剂含量百分比的增加粉色素OD值逐渐上升，当含量为4％-10％时色素OD值的差异均不显著，且在这段含量范围内的4％和6％时达到最大值，是对照的1.03倍，分别是对应0h时的含量百分比的1.03和1.04倍。
综上所述，该制得的粉色素具有较好的光稳定性、温度稳定性和抗还原性；强酸和强碱对其稳定性影响较大；Cu2+和Zn2+对其颜色有较大影响，Fe2+和Fe3+会使得粉色素颜色加深。
实施例4
粉色素对病原真菌的抑制性测试
分别设置粉色素在PDA和PPPDA培养基中，对不同植株的抑制性效果进行对比试验；
结合附图8-9可知，在第8d时对照组CK的菌落接近于皿壁，菌落在对照组CK和处理组PM的生长情况如图8所示。如图9所示，在第1-8d时，菌落在对照组CK上的生长速率随着处理时间的增加始终呈现上升趋势且在不同时间下差异极显著(p<0.05)。在第1-4d时，菌落在处理组PM上的生长速率差异不显著，到第5d时在处理组PM上的生长速率与第4d差异不显著但与第6-8d时差异极显著(p<0.05)。此外，处理组PM对番茄早疫病菌的生长抑制率在第1-3d时达到100％且和第4d时差异极不显著，在第4-5d时生长抑制率仍为90％以上，随后处理组PM的抑制效果显著下降但在第8d时菌圈生长速率仅为对照组CK的0.45倍，生长抑制率高达58.29％；
结合附图10-11可知，在第6d时对照组CK的菌落接近皿壁，菌落在对照组CK和处理组PM的生长情况如图10所示。如图11所示，在第1-6d时，菌落在对照组CK和处理组PM上的生长速率均呈上升趋势。但菌落在处理组PM上的生长速率在第1-2d和第3-5d内差异均不显著。处理组PM对油菜菌核的生长抑制率总体呈现先下降后上升趋势，在第3d时达到最小值83.14；
结合附图12-13可知，在第4d时对照组CK的菌落接近皿壁，但处理组PM上的菌饼没有进一步生长。如图13所示，对照组CK上的菌落生长速率随着时间的增加呈现逐渐上升到的趋势且在第4d时为7.76cm，但是处理组PM上的菌落一直未进一步生长且对马铃薯丝核的生长抑制率保持在100％；
结合附图14-15可知，在第11d时对照组CK和处理组PM上的菌落均接近于皿壁，但处理组PM上的菌落直径较CK小且菌落颜色相对较浅，在第1-11d时，菌落在对照组CK和处理组PM上的生长速率均呈上升趋势，且各个时间差异极显著(p<0.05)。在第1d时，处理组PM对黄瓜枯萎病菌的生长抑制率最大为89.45％，且在前4d生长抑制率高达70％，在第4d后生长抑制率持续下降，到第7-9d时差异不显著，但在第10d时达到最小值1.94％；
结合附图16-17可知，在第6d时对照组CK的菌落接近皿壁，菌落在两组培养基的生长情况如图16所示。如图17所示，在第1-6d时，菌落在对照组CK和处理组PM上的生长速率均呈上升趋势，且在各个时间内差异均极显著(p<0.05)。处理组PM对菌落的生长抑制率在第1-2d差异极不显著，且在前3d保持在60％以上，之后虽有下降但也仍然保持在40％以上。在第6d时生长抑制率达到最小值40.46％，且菌落在处理组PM上的生长速率是对照组CK的0.62倍。
注：CK为不加粉色素的对照组；PM为加入粉色素的处理组。
综上所述，该制得的粉色素可对番茄早疫病菌、油菜菌核病菌、马铃薯丝核病菌和苜蓿根腐病菌四类土传病害病原菌发挥较好的抑制作用，其中对马铃薯丝核病菌的抑制效果最佳，粉色素对该病原菌的生长抑制率在第1-4d可达到100％；其次为油菜菌核病菌和番茄早疫病菌，在第1-5d生长抑制率高达90％以上，且对油菜菌核病菌的抑制效果更佳；对苜蓿根腐病菌的抑制率也可在第1-3d达到60％以上。然而粉色素对黄瓜枯萎病菌的生长抑制率在第1-4d可以达到70％以上抑制效果较好，但是后期抑制效果下降显著。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (2)

1.桃色欧文氏菌粉色素的提纯工艺，其特征在于：包括如下步骤：
1)供试菌株的选取，包括:
分离自紫花苜蓿种子的桃色欧文氏菌(Cp2)和番茄早疫病菌、油菜菌核病菌、马铃薯丝核病菌、黄瓜枯萎病菌及苜蓿根腐病菌5种真菌；
2)供试培养基的选择,包括：
营养琼脂培养基(NA)：牛肉膏，3g；蛋白胨，10g；NaCl，5g；水，1000mL；琼脂，15-20g，以用于Cp2菌株的培养和短期保存；
King’s B培养基：蛋白胨，20g；K2HPO4，1.15g；MgSO4·7H2O，1.5g；甘油，10mL；水，1000mL；琼脂，15-20g，用于Cp2粉色素的培养与富集；
马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：土豆，200g；葡萄糖，20g；琼脂，15-20g；以用于病原真菌的培养及对照；
粉色素PDA培养基(PPPDA)：在PDA培养基的基础上加入体积比为20％的粉色素(OD340＝0.785)提取液,以用于5种病原真菌的抑菌活性研究；
3)桃色欧文氏菌粉色素的制备
桃色欧文氏菌粉色素的制备选用接种环刮取NA培养平板的菌体，单线法接种于King’sB培养基，28℃黑暗条件下培养72h左右，至菌体内包含大量色素时用药匙刮取，备用；
4)粉色素的提取纯化
粉色素的提纯方法包括粉色素的粗提取和纯化，分别用有机溶剂浸提法和萃取法，收集培养平板内的菌体，用药匙刮取1.0g置于10mL离心管中，分别加入5mL蒸馏水、氯仿、乙酸乙酯、异戊醇、石油醚、冰醋酸、正丁醇和无水乙醇中浸泡2h，同时此过程中每隔30min用涡旋振荡器震荡1min，再用12000rpm的离心机离心15min后收集上清液，观察粉色素在各溶剂中的溶解状况，选择最佳浸提溶液和萃取溶液，从而得到纯色素提取液；
5)粉色素的波长扫描
粉色素的扫描用紫外分光广度计光谱扫描模式扫描纯色素溶液在间隔为1nm时200-800nm的波长，以确定粉色素的特征波长；
6)粉色素稳定性测试
粉色素的性能测试包括：光稳定性测试、温度稳定性测试、pH稳定性测试、金属离子稳定性测试、氧化还原稳定性测试；
7)粉色素对病原真菌的抑制性测试
粉色素对病原真菌的抑制性能研究方法为用直径为5mm的打孔器在培养的菌落边缘同一圆周上打取菌饼，接入PDA(对照)和PPPDA培养基中央，每组处理三次重复，置于25℃恒温箱中黑暗培养，以对照组菌落边缘接近皿壁时为时间结点，期间连续每天用十字交叉法测量各处理的菌落直径即为生长速率，并计算生长抑制率；
生长抑制率(％)＝(对照菌落的直径-处理菌落直径)/(对照菌落的直径-菌饼直径)×100％。
2.根据权利要求1所述的桃色欧文氏菌粉色素的提纯工艺，其特征在于：步骤2)中，所述营养琼脂培养基和King’s B培养基pH值选择7.0-7.2，同时在121℃灭菌20min，所述PDA培养基的pH值为自然状态下pH，同时在121℃下灭菌20min。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106867929A (zh) * 2016-12-21 2017-06-20 河北省科学院生物研究所 一种胡萝卜软腐欧文氏菌、其分泌的植物免疫激活蛋白及应用
CN106967631A (zh) * 2016-12-01 2017-07-21 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 粘细菌在制备捕食和抑制植物病原细菌的药物中的应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040259217A1 (en) * 2003-06-19 2004-12-23 Prabha Devi Plant mangrove-associated fungus Culvularia lunata and a simple and efficient method of obtaining high yield of pure mannitol from the same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106967631A (zh) * 2016-12-01 2017-07-21 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 粘细菌在制备捕食和抑制植物病原细菌的药物中的应用
CN106867929A (zh) * 2016-12-21 2017-06-20 河北省科学院生物研究所 一种胡萝卜软腐欧文氏菌、其分泌的植物免疫激活蛋白及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Erwinia persicina associated with a pink rot of parsley root in Germany;Nechwatal, J 等;JOURNAL OF PLANT DISEASES AND PROTECTION;第126卷(第2期);161-167 *

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