CN1944663A - 一种燕麦蛋白ace抑制肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种燕麦蛋白ACE(血管紧张素转化酶)抑制肽的制备方法，属于燕麦精深加工技术领域。本发明以燕麦麸为原料，经粉碎、酶法预处理、碱法提取、离心分离、上清液等电点沉淀、沉淀加水均质后再添加碱性蛋白酶水解、离心后上清液经离子交换色谱、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱分离，得到四种新的燕麦蛋白ACE抑制肽A、B、C和D，并利用串联质谱对其结构进行了鉴定，并测定其半抑制率IC50值。本发明方法设计科学合理，对于实现燕麦资源的综合利用和提高其附加值具有重要的意义。

Description

一种燕麦蛋白ACE抑制肽的制备方法
技术领域
一种燕麦蛋白ACE抑制肽的制备方法，属于燕麦深加工技术领域。
背景技术
燕麦是一类重要的禾谷类粮食作物。与其它的各类谷物相比，燕麦具有更高的营养价值和保健功能，被誉为是谷类食品中最好的全价食品之一。随着人们对自身饮食健康的日益重视，全球燕麦消费量持续增长，国际市场对燕麦的需求量很大。然而目前我国燕麦深加工技术相对比较落后，市场上燕麦类食品品种单一，导致我国燕麦供人食用部分不足总产量的4％，这种情况不仅造成了资源的极大浪费，而且限制了我国燕麦产业的进一步发展。
燕麦蛋白不仅营养价值丰富，能满足人体需求，此外还具有潜在的降血压功能，因此本发明以燕麦麸为原料，充分利用燕麦蛋白的特有功效进行燕麦蛋白ACE(血管紧张素转化酶)抑制肽的研制，并作为一种新型的食品配料添加于食品中，以望达到营养与保健的双重目的，同时实现燕麦资源的综合利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种燕麦蛋白ACE抑制肽的制备方法，所得产品具有营养和保健两方面的优越性。
本发明的技术方案：以燕麦麸为原料，经粉碎，加水和复合多糖酶ViscozymeL进行酶法预处理后，调节提取液至碱性环境提取燕麦麸蛋白，离心分离，上清液等电点沉淀，所得沉淀加水均质后，再添加碱性蛋白酶进行水解反应，离心分离，上清液中的肽组分经色谱技术进行分离纯化，最终得到四种单一的燕麦蛋白ACE抑制肽组分，分别为燕麦蛋白ACE抑制肽A、B、C和D。
(1)原料的粉碎
要求对原料燕麦麸进行粉碎，并过40目筛网。原料粉碎效果越好，越有利于燕麦麸中蛋白的提取。
(2)燕麦麸的酶法预处理
料液比
燕麦麸与水的质量比例为1∶10，减小用水量会导致燕麦蛋白提取率偏低，增加用水量又会导致成本过高，生产负荷加大。因此比较适宜的料液比为1∶10。
酶反应的温度和时间
原料酶法预处理过程采用复合多糖酶Viscozyme L(120FBG/mL)，加酶量300FBG/100g燕麦麸，调节pH为4.5～5.0，酶的最适反应温度40～45℃。延长酶预处理时间有利于反应完全，但反应时间过长会增加生产周期，故本发明的酶反应时间为2小时。
(3)燕麦麸蛋白的提取
原料燕麦麸酶法预处理后有利于下一步蛋白的溶出。燕麦麸蛋白较好的溶出条件为碱性条件与较高的温度下。但pH不宜过高，否则容易导致有毒物质生成；同时温度也不能过高，否则容易导致淀粉糊化影响蛋白溶出。因此适宜的蛋白提取条件为pH值9.5，50℃下搅拌浸提30min。
(4)离心分离
采用三足式离心机能将蛋白提取液有效分离，离心条件为3000r/min、20min，取上清液。
(5)上清液处理
燕麦蛋白的等电点在pH4.5左右，因此将上一步所得的蛋白提取液pH值调至4.5后能最大程度上实现燕麦蛋白的沉淀。调pH过程采用HCl溶液，提取液很快变混浊，悬浊液离心分离(3000r/min、20min)，得沉淀。
(6)沉淀加水混匀后均质
按1∶20的比例在沉淀中加水混匀并均质，均质过程有利于蛋白分子的分散，有利于下一步的酶解过程；
(7)蛋白酶解
燕麦麸蛋白酶解生产ACE抑制肽过程使用的蛋白酶最佳为碱性蛋白酶(Alcalase 3.0T酶活为3.0AU/g)，该酶的最佳作用温度和pH分别为60℃和7.5，酶底比E/S＝1.33％条件下作用90min所得产物的ACE抑制活性能达到最佳。酶解反应结束后，为了阻止蛋白酶的进一步作用，对残余酶活力进行灭酶处理，将酶解液升温至90℃，并保持10min灭酶。
(8)离心分离
酶解液中可溶性的小肽组分具有很强的ACE抑制活性，为达到活性组分的富集，要对酶解产物进行离心分离。酶解液冷却至室温后采用三足式离心机离心分离(3000r/min、30min)回收上清液；
(9)上清液中活性组分的分离纯化
离子交换色谱分离：所得上清液直接上离子交换色谱进行第一步分离，色谱条件为：分离介质DEAE Sepharose Fast Flow；起始缓冲液0.02mol/L、pH4.0HAc-NaAc缓冲液，含0～1mol/L的NaCl缓冲溶液线性梯度洗脱；
凝胶过滤色谱分离：收集离子交换色谱分离所得高ACE抑制活性组分上凝胶过滤色谱进行第二步分离，色谱条件为：分离介质Sephadex G-25；蒸馏水洗脱；
反相高效液相色谱分离：收集凝胶过滤色谱分离所得高ACE抑制活性组分上反相液相色谱进行第三步分离：色谱条件为：Lichrospher C18反相柱，洗脱条件，0～10min，0～20％B；10～20min，20～35％B；20～30min，35～100％B；30～34min，100～0％B；34～40min，100％A；(A：5％乙腈+0.05％三氟乙酸和其余为水；B：80％乙腈+0.05％三氟乙酸和其余为水)。
经三步纯化工艺后，共得到四种单一的高ACE抑制活性肽组分，分别为燕麦蛋白ACE抑制肽A、B、C和D。
(10)肽片段结构鉴定
对四种新发现的肽段利用MALDI-TOF/TOF进行结构鉴定，氨基酸序列分别为AYKPIRSK、APRGF、GGDIIRPG和EGGYR，其半抑制率IC50值分别为10.6μM、31.6μM、113.8μM和77.3μM。
本发明的有益效果：采用本发明方法制备的燕麦蛋白ACE抑制肽活性强，能有效地起到降压作用，可以同时发挥出营养和保健两方面的作用。
附图说明
图1燕麦蛋白ACE抑制肽制备工艺流程示意图。
具体实施方式
实施例1
取经过粉碎、过40目筛的15kg燕麦麸，加入150L水搅拌混匀，加热至45℃，调pH至4.5～5.0，加复合多糖酶Viscozyme L 0.375L，酶解反应2h，升温至50℃，并调pH至9.5，继续搅拌30min后，离心分离(3000r/min、20min)，收集上清液调pH至4.5，离心分离(3000r/min、20min)得沉淀1.35kg，加27L水混匀后均质，调温度和pH分别至60℃和7.5，加碱性蛋白酶Alcalase 3.0T 18g反应90min，升温至90℃，并保持10min灭酶，冷却至室温后，离心分离(3000r/min、30min)得上清液，依次上离子交换色谱、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱进行分离，共得到四种强ACE抑制活性的肽组分。
实施例2
取经过粉碎、过40目筛的10kg燕麦麸，加入100L水搅拌混匀，加热至40℃，调pH至4.5～5.0，加复合多糖酶Viscozyme L 0.25L，酶解反应2h，升温至50℃，并调pH至9.5，继续搅拌30min后离心分离(3000r/min、20min)，收集上清液调pH至4.5，离心分离(3000r/min、20min)，得沉淀0.9kg，加18L水混匀后均质，调温度和pH分别至60℃和7.5，加碱性蛋白酶Alcalase 3.0T 12g反应90min，升温至90℃，并保持10min灭酶，冷却至室温后，离心分离(3000r/min、30min)，得上清液，依次上离子交换色谱、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱进行分离，共得到四种强ACE抑制活性的肽组分。

Claims (3)

1、一种燕麦蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征是以燕麦麸为原料，经粉碎，加水和复合多糖酶Viscozyme L进行酶法预处理后，调节提取液至碱性环境提取燕麦蛋白，离心分离，上清液等电点沉淀，所得沉淀加水均质后，再添加碱性蛋白酶进行水解反应，离心分离，所得上清液经色谱分离技术，得到高活性的燕麦蛋白ACE抑制肽，工艺为：
(1)原料粉碎：原料燕麦麸进行粉碎，过40目筛网；
(2)酶法预处理：粉碎后的燕麦麸按1∶10的质量比例加水，调节pH值至4.5～5.0、温度40～45℃后，加入复合多糖酶Viscozyme L，加酶量300FBG/100g燕麦麸，酶解时间为2h；
(3)碱性环境提取燕麦麸蛋白：酶法预处理后提取液调节pH值至9.5，50℃下搅拌浸提30分钟；
(4)离心分离：将反应料液经3000转/分钟、离心分离20分钟，取上清液；
(5)上清液等电点沉淀：上清液用HCl调pH值至4.5后，将所得悬浊液经3000转/分钟、离心分离20分钟，得沉淀；
(6)沉淀加水均质：按1∶20的比例在沉淀中加水混匀并均质；
(7)加蛋白酶水解：均质后的溶液调pH值7.5，温度60℃，按酶底比E/S＝1.33％的比例添加碱性蛋白酶Alcalase 3.0T作用90分钟；酶解结束后升温至90℃、10分钟灭酶；
(8)离心分离：酶解液冷却至室温后3000转/分钟、离心分离30分钟，取上清液；
(9)纯化：离心后上清液采用离子交换色谱、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱分离纯化出四种单一的燕麦蛋白ACE抑制肽组分，分别为燕麦蛋白ACE抑制肽A、B、C和D。
(10)对纯化出的燕麦蛋白ACE抑制肽A、B、C和D组分进行结构鉴定，得出燕麦蛋白ACE抑制肽的氨基酸序列。
2、根据权利要求1所述燕麦蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征是过程中所用复合多糖酶Viscozyme L酶活为120FBG/mL，碱性蛋白酶Alcalase 3.0T酶活为3.0AU/g。
3、根据权利要求1所述燕麦蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征是所制备得到的燕麦蛋白ACE抑制肽A、B、C和D组分进行半抑制率IC50值测定，分别为10.6μM、31.6μM、113.8μM和77.3μM。
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