CN114917246A - 覆盆子多糖r2在制备抗肿瘤药物和抗炎制剂中的应用 - Google Patents

覆盆子多糖r2在制备抗肿瘤药物和抗炎制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了覆盆子多糖R2在制备抗肿瘤药物和抗炎制剂中的应用，所述的覆盆子多糖R2由以下步骤制得：取覆盆子干果粉碎、过筛，然后加水加热浸提，将浸提液浓缩和过滤，得覆盆子粗多糖；将覆盆子粗多糖脱蛋白，然后上DEAE琼脂糖凝胶柱，先用去离子水洗脱，再用0.3mol/L的NaCl溶液洗脱，最后用0.4mol/L的NaCl溶液洗脱，直至洗脱液不再含有多糖，合并0.4mol/L的NaCl溶液洗脱液，经透析后，得到覆盆子多糖R2。采用本发明的提取方法不影响覆盆子多糖的生物活性，所得到的多糖纯品在抗肿瘤、抗炎、保湿方面具有显著效果，且细胞毒性试验证明多糖在测试范围内无毒，可进一步用于保健品、药品及化妆品的开发。

Description

覆盆子多糖R2在制备抗肿瘤药物和抗炎制剂中的应用
技术领域
本发明属于植物活性成分领域，具体涉及覆盆子多糖R2在制备抗肿瘤药物和抗炎制剂中的应用。
背景技术
掌叶覆盆子为蔷薇科悬钩子属藤状灌木，因其叶片(多为五裂或七裂)形似手掌而得名，是一种药食同源植物。
2020版《中国药典》规定：覆盆子(Rubus idaeus L.)为蔷薇科植物华东覆盆子(又称掌叶覆盆子)的干燥果实，具有益肾固精缩尿、养肝明目的作用，可用于治疗遗精滑精、遗尿尿频、阳痿早泄、目暗昏花等证。覆盆子富含维生素A、维生素C、维生素E、17种氨基酸及锌、镁、钙等多种微量元素。覆盆子红熟果的平均可溶性固形物、可溶性总糖、可滴定酸含量分别为13.68％、111.8mg/g和1.27％，不仅含糖量高，风味佳，Vc含量远远高于同期上市的枇杷、杨梅等水果，还富含鞣花酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷等活性成分。
在我国，覆盆子在中药制剂和饮食中被长期广泛使用，是珍贵的药食同源物质。历代记载中覆盆子植株缺乏考证，品种不尽相同，以及地理原因，导致覆盆子成分具有差异性，功效不稳定，相关研究较少。目前关于覆盆子生物活性成分的研究还较少，相关药理作用及其机制研究不够深入充分。
发明内容
本发明的目的是提供覆盆子多糖R2在制备抗肿瘤药物和抗炎制剂中的应用，利用水提醇沉法对覆盆子进行多糖提取，并通过离子交换层析法对多糖进行分离纯化，透析冻干，由此提取分离出纯度较高、具有生物活性的多糖组分。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
覆盆子多糖R2在制备抗肿瘤药物和抗炎制剂中的应用；
所述的覆盆子多糖R2由以下步骤制得：
(1)取覆盆子干果粉碎、过筛，然后加水加热浸提，将浸提液浓缩和过滤，得覆盆子粗多糖；
(2)将覆盆子粗多糖脱蛋白，然后上DEAE琼脂糖凝胶柱，先用去离子水洗脱至少三个柱体积，再用0.3mol/L的NaCl溶液洗脱3-5个柱体积，最后用0.4mol/L的NaCl溶液洗脱，直至洗脱液不再含有多糖，合并0.4mol/L的NaCl溶液洗脱液，经透析后，得到覆盆子多糖R2；
步骤(1)所述的加热浸提是在80℃下浸提；
步骤(1)所述的过滤是在浓缩液中加入无水乙醇或乙醇溶液，使多糖醇沉后形成棕色絮状沉淀，静置后抽滤，所得沉淀为覆盆子粗多糖；
步骤(2)所述的脱蛋白包括以下步骤：
将覆盆子粗多糖加入超纯水溶解，在冰浴中缓慢加入三氯乙酸溶液，充分混合后静置；接着调pH值至7；5000～10000r/min离心5～10min，去除胶状蛋白沉淀，得多糖滤液；浓缩后加入95％乙醇溶液，不断搅拌使多糖均匀沉淀，随后于4℃下静置8～24h，取出，真空抽滤得沉淀，得到脱蛋白后的覆盆子多糖；
步骤(2)所述的透析包括以下步骤：
将NaCl溶液洗脱液浓缩后转入透析袋中于4℃透析24～96h，去除小分子杂质，透析袋内的保留液含有纯化后的覆盆子多糖R2；
所述透析袋的截留分子量为3000Da。
所述覆盆子多糖R2的单糖组成为：阿拉伯糖(Ara)：半乳糖醛酸(Gal-UA)：半乳糖(Gal)：鼠李糖(Rha)：木糖(Xyl)：葡萄糖醛酸(Glc-UA)：葡萄糖(Glc)：甘露糖(Man)：岩藻糖(Fuc)：古罗糖醛酸(Gul-UA)：核糖(Rib)＝33.74：24.53：19.03：11.96：4.09：3.14：1.40：0.87：0.71：0.41：0.12(质量百分比)。R2的糖骨架主要由阿拉伯糖构成。
所述的覆盆子优选掌叶覆盆子(Rubus idaeus L.)；
所述的肿瘤为宫颈癌、肝癌和结肠癌；
所述的抗肿瘤药物和抗炎制剂还含有其他活性成分和辅料(载体)；
所述的辅料(载体)优选缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等；
所述抗肿瘤药物和抗炎制剂的剂型为气雾剂、片剂、胶囊剂、滴丸、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质剂、透皮剂、口含剂、栓剂或冻干粉针剂等。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)采用本发明的方法可以完成大通量的多糖提取操作，适用于工业化大规模生产，DEAE-Sepharose fast flow离子交换层析柱脱色效果好，分离效果好，重复性好，减少了额外脱色步骤带来的多糖损耗，所得到的多糖组分杂质含量极少且性质稳定；
(2)采用本发明的提取方法不影响覆盆子多糖的生物活性，所得到的多糖纯品在抗肿瘤、抗炎、保湿方面具有显著效果，且细胞毒性试验证明多糖在测试范围内无毒，可进一步用于保健品、药品及化妆品的开发。
(3)R2由11种单糖组成，主要组成成分是阿拉伯糖与半乳糖，与现阶段发现的覆盆子的单糖组成差异显著，具有新颖性。
附图说明
图1是分析单糖组成的离子色谱图。
图2是RAW264.7细胞的存活率。
图3是Hela细胞的存活率。
图4是HepG2细胞的存活率。
图5是HCT116细胞的存活率。
图6是多糖对IL-6表达的影响效果图。
图7是多糖对IL-1β表达的影响效果图。
图8是多糖对TNF-α表达的影响效果图。
图9是多糖的吸湿性曲线。
图10是多糖的保湿性曲线。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中，覆盆子多糖R2的单糖组成分析由杭州研趣信息技术有限公司进行，报告编号为YY220127002。
实施例1
覆盆子多糖R2的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)覆盆子粗多糖的制备
称取掌叶覆盆子干果120g，粉碎，先后过60目、80目筛，称量100g粉末加入2000mL去离子水，在80℃温度下水浴，以200rpm速率搅拌浸提6h。提取两次，合并滤液，在60℃减压浓缩，至400mL。冷却至室温后，往水提浓缩液中边搅拌边缓慢加入1600mL 95％乙醇，多糖醇沉后形成棕色絮状沉淀，于4℃冰箱中静置12h后抽滤，得粗多糖沉淀。
(2)覆盆子粗多糖的脱蛋白
将粗多糖沉淀利用200mL超纯水溶解，冰浴条件下缓慢加入200mL的10％三氯乙酸溶液，充分震荡，在4℃冰箱中静置2h。用5％的NaOH中和滤液，调pH至7。在8000r/min速度下离心5min，去除胶状蛋白沉淀，得多糖滤液，在60℃减压浓缩至200mL。往多糖溶液中缓慢加入800mL的95％乙醇，同时用玻璃棒不断搅拌使多糖均匀沉淀，随后于4℃条件下静置12h。然后取出，真空抽滤得沉淀，得到脱蛋白后的覆盆子多糖。
(3)覆盆子多糖的分离纯化
称取2.5g脱蛋白的覆盆子多糖溶解于50mL去离子水中，经0.45μm微孔滤膜抽滤后上DEAE琼脂糖凝胶柱，先用去离子水以0.5mL/min流速洗脱三个柱床体积，然后用浓度为0.3mol/L的NaCl溶液以0.5mL/min流速进行洗脱3-5个柱体积，再用浓度为0.4mol/L的NaCl溶液以0.5mL/min流速进行洗脱，每50mL收集1瓶，苯酚硫酸法逐瓶测定多糖含量。合并0.4mol/L氯化钠洗脱的多糖溶液，60℃减压浓缩，再转入透析袋(3000Da)中于4℃透析72h，去除小分子杂质。透析袋内保留液在50℃下减压浓缩后进行冷冻干燥，得到覆盆子多糖的纯化组分R2。
苯酚-硫酸法检测多糖含量具体操作：精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品0.1g，置于100ml容量瓶中加蒸馏水溶解并定容，摇匀，配成1mg/ml的标准品溶液备用。取该溶液分别稀释成0、20、40、60、80、100μg/ml不同浓度的标准溶液。分别吸取上述溶液各1ml置于试管中，加入6％苯酚溶液1ml并混匀，再加入5ml浓硫酸混匀，室温静置20min，以蒸馏水为空白对照，于490nm处测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。未知样品用标准曲线法测定多糖含量。
实施例2
对实施例1得到的覆盆子多糖R2进行单糖组成分析，具体实验方法如下：
采用离子色谱系统，利用电化学检测器对单糖组分进行分析检测。取干净的色谱瓶，精确称量多糖样品5mg(±0.05mg)，加入1mL 2M TFA酸溶液，121℃加热2小时。通氮气，吹干。加入甲醇清洗，再吹干，重复甲醇清洗2-3次。加入无菌水溶解，转入色谱瓶中待测。
采用DionexTM CarboPacTM PA20(150*3.0mm，10um)液相色谱柱；进样量为5uL。流动相A(0.1M NaOH)，流动相B(0.1M NaOH，0.2M NaAc)，流速0.5mL/min；柱温为30℃；洗脱梯度：0min A相/B相(95：5V/V)，30min A相/B相(80：20V/V)，30.1min A相/B相(60：40 V/V)，45min A相/B相(60：40 V/V)，45.1min A相/B相(95：5 V/V)，60min A相/B相(95：5 V/V)。
13种单糖标准品(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、古罗糖醛酸)按照相同步骤进行实验，按照相同的检测程度，将处理后的标准品单糖进行气相色谱分析。
测得R2单糖组成为，阿拉伯糖(Ara)：半乳糖醛酸(Gal-UA)：半乳糖(Gal)：鼠李糖(Rha)：木糖(Xyl)：葡萄糖醛酸(Glc-UA)：葡萄糖(Glc)：甘露糖(Man)：岩藻糖(Fuc)：古罗糖醛酸(Gul-UA)：核糖(Rib)＝33.74：24.53：19.03：11.96：4.09：3.14：1.40：0.87：0.71：0.41：0.12(质量百分比)。R2的糖骨架主要由阿拉伯糖构成。
实施例3
对实施例1得到的覆盆子多糖进行细胞毒性测定，具体实验方法如下：
通过覆盆子多糖对RAW264.7细胞存活率的影响测试多糖细胞毒性。
1.细胞培养
将处于对数生长期的RAW264.7细胞吹打成单细胞悬液，离心收集沉淀，加入适量新鲜的完全培养基(10％FBS+DMEM)重悬细胞，取样计数；在96孔板中接种细胞(1.5×104cells/100μL/孔)，细胞培养箱中至少培养24h。
2.多糖处理
(1)铺板培养24h后，观察记录细胞的融合度及形态；
(2)以完全培养基(10％FBS+DMEM)为基础，配制不同R2浓度的加样培养基(1、5、10、50、100、200、400、600μg/mL)，对照为含10％无菌水的培养基。
(3)弃去原孔中的培养基，按分组每孔加入100μL的加样培养基，细胞培养箱继续培养24h。
3.活性检测
(1)加药培养24h后，观察记录不同样品浓度下细胞的融合度及形态变化；
(2)将96孔板中的培养基甩掉，每孔中加入50μL亚甲基蓝染液，在细胞培养箱孵育1h。
(3)孵育1h后取出，用水洗去多余的染液，拍干孔板，每孔加入100μL洗脱液，另选3个空白孔加入100μL洗脱液作为空白对照(调零孔)；
(4)孔板震荡15min，再放入酶标仪继续震荡1min，测定OD595。
(5)分析数据(调零后)，需要先得出对照组的平均值，各组(实验数据/对照平均值×100)得出细胞存活率，之后算出各个数值之间的偏差(即每三孔之间的偏差)，作图，分析药物对细胞的毒性。
图2是多糖的细胞毒性结果图。数据显示，R2处理后的细胞存活率均略高于100％，说明覆盆子多糖在0-400μg/mL的浓度范围内对RAW264.7细胞无毒性作用。
实施例4
对实施例1得到的覆盆子多糖R2进行抗肿瘤活性测定，具体实验方法如下：
通过CCK-8法检测多糖抗肿瘤活性。
1.细胞培养
将处于对数生长期的3株癌细胞(Hela、HCT116、HepG2)消化离心后，加入适量新鲜的完全培养基重悬细胞(Hela：10％FBS+MEM；HepG2：10％FBS+DMEM；HCT116：10％FBS+McCoy’s 5A)，取样计数；在96孔板中按3000cells/100μL/孔接种细胞，细胞培养箱中(37℃，5％CO2)培养24h。
2.多糖处理
铺板培养24h后，观察记录细胞的融合度及形态；以对应的完全培养基为基础，配制不同R2浓度的加样培养基(0.2、0.4、0.6、0.8、1mg/mL)，对照为含10％无菌水的培养基。弃去原孔中的培养基，按分组每孔加入100μL的加样培养基，细胞培养箱继续培养24h。
3.结果测定
加药培养24h后，每孔加入10μL CCK8，混匀，培养箱避光孵育1h，然后用酶标仪测定OD450。
实验结果表明R2具有抑制癌细胞增殖的能力，呈浓度依赖性。图3是多糖对人宫颈癌细胞Hela细胞的抑制效果图，图中数据表明，覆盆子多糖对HeLa细胞的增殖具有较明显抑制作用，1mg/mL的R2处理后的Hela细胞存活率为63.43％。图4是多糖对人肝癌细胞HepG2细胞的抑制效果图，当多糖R2浓度达到1mg/mL时，处理后的HepG2细胞存活率为76.28％。图5是多糖对结肠癌细胞HCT116细胞的抑制效果图。当R2浓度达到1mg/mL时，HCT116细胞存活率为79.89％。覆盆子多糖R2对Hela细胞抑制效果最强，其次是HepG2细胞，最弱是HCT116。
实施例5
对实施例1得到的覆盆子多糖R2进行抗炎活性测定，具体实验方法如下：
通过ELISA双抗体夹心法试验覆盆子多糖对RAW264.7细胞IL-6、IL-1β、TNF-α炎症因子表达的影响。
1.细胞培养
(1)将处于对数生长期的RAW264.7细胞吹打重悬成单细胞悬液，离心后弃去培养基上清，加入适量新鲜的完全培养基(10％FBS+DMEM)重悬细胞，取样计数；
(2)在24孔板中接种细胞(1.25×105cells/0.5mL/孔)，细胞培养箱中培养24h。
2.多糖处理
(1)配制培养基：5％FBS+94％DMEM+1％P/S(双抗(青霉素/链霉素))
(2)铺板培养约24h，观察记录细胞的融合度及形态；
(3)以培养基(5％FBS+94％DMEM+1％P/S(双抗(青霉素/链霉素)))为基础，配制不同R2浓度的加样培养基(100、200、400μg/mL)，空白对照为含10％无菌水的培养基，阳性对照为0.1μg/mL LPS的含10％无菌水的培养基。
(4)弃去培养基，按分组每孔加入0.5mL的加样培养基，细胞培养箱继续培养24h。
(5)加药培养24h后，观察记录细胞的融合度及形态；
(6)十字晃动孔板，收集上清液至1.5mL离心管中，12000rpm 4℃离心10min，分装，立即放入-80℃冰箱保存，备用。
3.炎症因子检测
检测前准备：
(1)试剂盒与预包被的酶标板应至少提前20min取出，平衡至室温。
(2)用无菌水将20×浓缩洗涤液稀释成1×洗涤工作液。
(3)标准品及样品稀释。
按下表，在进行不同炎症因子的检测中，用ELISA检测试剂盒中的样本稀释液对各组样品进行稀释：
表格1 炎症因子稀释浓度信息
Figure BDA0003669321750000081
实验步骤
(1)空白孔(1孔)加样本和标本通用稀释液，不同浓度标准品(各1孔)，样品孔(每组3复孔)，每孔加入100μL液体，用封板胶纸封住反应孔，放37℃恒温箱孵育90min；
(2)提前20min，配制生物素化抗体工作液：用生物素化抗体稀释液将30×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作液；
(3)洗板5次；
(4)空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加生物素化抗体工作液，100μL/孔，用新的封板胶纸封住反应孔，放37℃恒温箱孵育60min；
(5)提前20min，配制酶结合物工作液：用酶结合物稀释液将30×浓缩酶结合物稀释成1×工作液，避光室温(22～25℃)放置；
(6)洗板5次；
(7)空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加酶结合物工作液，100μL/孔，用新的封板胶纸封住反应孔，放37℃恒温箱避光孵育30min；
(8)打开酶标仪，设置程序，预热机器；
(9)洗板5次；
(10)每孔加入100μL显色底物TMB，37℃恒温箱避光孵育15min；
(11)每孔加入100μL反应终止液，混匀(用酶标仪振荡混匀15sec)，立即测量OD450(3min内完成)。
R2具有较好的抗炎症因子效果。图6是多糖对IL-6表达的影响效果图。图7是多糖对IL-1β表达的影响效果图。图8是多糖对TNF-α表达的影响效果图。从图可见，与空白对照组相比，阳性对照组LPS促使RAW264.7细胞被激活释放大量炎症因子，而多糖组分可显著抑制炎症因子的产生，抑制作用与多糖浓度负相关。R2在100μg/mL时抑制作用最强，IL-6表达量为9.89pg/mL，IL-1β的释放量为2.16pg/mL，TNF-α表达量为491.91pg/mL。
实施例6
对实施例1得到的覆盆子多糖R2进行保湿性测定，具体实验方法如下：
吸湿实验：将100mL饱和硫酸铵溶液置于干燥密闭容器内,在20℃条件下,可保持容器内相对湿度为81％。准确称取一定量的多糖置于3cm直径的玻璃扁形称量皿内,再将称量皿放入高湿度的容器中。将密闭容器放入温度为(20±0.1)℃的培养箱里。每隔3h将称量皿取出称重,通过测定实验前后多糖的重量差计算吸湿率。
吸湿率(％)＝(Mn-M0)/M0×100 (1-1)
式中M0为吸湿前多糖的质量；Mn为放置n小时后多糖的质量。
保湿实验：保持环境温度为20℃,在干燥可密封容器内放入100干燥的变色硅胶,将吸湿试验的多糖样品及称量皿置于硅胶上，再密闭容器。每隔12h将称量皿取出称重，通过公式1-2计算保湿率。
保湿率(％)＝[1-(Mn-M0)/M0]×100 (1-2)
式中M0为放置前多糖的质量；Mn为放置n小时后多糖的质量。
图9是多糖的吸湿性。在81％的高湿度环境下，9小时后R2吸湿率趋于平缓，此时吸湿率为12.5％。图10是多糖的保湿性。在干燥环境下的48h内，R2的保湿性为92.37％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.覆盆子多糖R2在制备抗肿瘤药物和抗炎制剂中的应用，其特征在于：
所述的覆盆子多糖R2由以下步骤制得：
(1)取覆盆子干果粉碎、过筛，然后加水加热浸提，将浸提液浓缩和过滤，得覆盆子粗多糖；
(2)将覆盆子粗多糖脱蛋白，然后上DEAE琼脂糖凝胶柱，先用去离子水洗脱至少三个柱体积，再用0.3mol/L的NaCl溶液洗脱3-5个柱体积，最后用0.4mol/L的NaCl溶液洗脱，直至洗脱液不再含有多糖，合并0.4mol/L的NaCl溶液洗脱液，经透析后，得到覆盆子多糖R2；
所述的肿瘤为宫颈癌、肝癌和结肠癌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述覆盆子多糖R2的单糖组成为：阿拉伯糖(Ara)：半乳糖醛酸(Gal-UA)：半乳糖(Gal)：鼠李糖(Rha)：木糖(Xyl)：葡萄糖醛酸(Glc-UA)：葡萄糖(Glc)：甘露糖(Man)：岩藻糖(Fuc)：古罗糖醛酸(Gul-UA)：核糖(Rib)＝33.74：24.53：19.03：11.96：4.09：3.14：1.40：0.87：0.71：0.41：0.12(质量百分比)。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(1)所述的过滤是在浓缩液中加入无水乙醇或乙醇溶液，使多糖醇沉后形成棕色絮状沉淀，静置后抽滤，所得沉淀为覆盆子粗多糖。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(1)所述的加热浸提是在80℃下浸提。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(2)所述的脱蛋白包括以下步骤：
将覆盆子粗多糖加入超纯水溶解，在冰浴中缓慢加入三氯乙酸溶液，充分混合后静置；接着调pH值至7；5000～10000r/min离心5～10min，去除胶状蛋白沉淀，得多糖滤液；浓缩后加入95％乙醇溶液，不断搅拌使多糖均匀沉淀，随后于4℃下静置8～24h，取出，真空抽滤得沉淀，得到脱蛋白后的覆盆子多糖。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(2)所述的透析包括以下步骤：
将NaCl溶液洗脱液浓缩后转入透析袋中于4℃透析24～96h，去除小分子杂质，透析袋内的保留液含有纯化后的覆盆子多糖R2。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述透析袋的截留分子量为3000Da。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的覆盆子为掌叶覆盆子(Rubusidaeus L.)。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的抗肿瘤药物和抗炎制剂还含有其他活性成分和辅料。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的辅料为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104829737A (zh) * 2015-04-30 2015-08-12 华南理工大学 一种覆盆子叶粗多糖及其制备方法与应用
CN104873532A (zh) * 2015-04-04 2015-09-02 中国科学院西北高原生物研究所 树莓多糖在抗肿瘤中的应用
CN105294879A (zh) * 2015-12-02 2016-02-03 浙江大学 一种桑枝抗肿瘤活性多糖rmpw-2的制备方法
CN105294878A (zh) * 2015-12-02 2016-02-03 浙江大学 一种桑枝抗肿瘤活性多糖rmpw-1的制备方法
CN107266603A (zh) * 2017-07-29 2017-10-20 安徽博格生物科技有限公司 一种具有清除自由基功能的覆盆子多糖类成分提取方法
CN109251253A (zh) * 2018-08-07 2019-01-22 浙江大学 一种掌叶覆盆子多糖及其制备方法和在制备肝脏细胞脂毒性损伤抑制剂中的应用
CN110128562A (zh) * 2019-05-29 2019-08-16 黄河科技学院 一种抗肿瘤补骨脂多糖及其提取分离方法和在制备抗肿瘤药物方面的应用
CN112358553A (zh) * 2020-12-09 2021-02-12 青海大学 一种多糖sm-0.2m及其制备的抗肿瘤产品
CN112521521A (zh) * 2020-12-09 2021-03-19 青海大学 一种多糖sm-w及其制备的抗肿瘤产品

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104873532A (zh) * 2015-04-04 2015-09-02 中国科学院西北高原生物研究所 树莓多糖在抗肿瘤中的应用
CN104829737A (zh) * 2015-04-30 2015-08-12 华南理工大学 一种覆盆子叶粗多糖及其制备方法与应用
CN105294879A (zh) * 2015-12-02 2016-02-03 浙江大学 一种桑枝抗肿瘤活性多糖rmpw-2的制备方法
CN105294878A (zh) * 2015-12-02 2016-02-03 浙江大学 一种桑枝抗肿瘤活性多糖rmpw-1的制备方法
CN107266603A (zh) * 2017-07-29 2017-10-20 安徽博格生物科技有限公司 一种具有清除自由基功能的覆盆子多糖类成分提取方法
CN109251253A (zh) * 2018-08-07 2019-01-22 浙江大学 一种掌叶覆盆子多糖及其制备方法和在制备肝脏细胞脂毒性损伤抑制剂中的应用
CN110128562A (zh) * 2019-05-29 2019-08-16 黄河科技学院 一种抗肿瘤补骨脂多糖及其提取分离方法和在制备抗肿瘤药物方面的应用
CN112358553A (zh) * 2020-12-09 2021-02-12 青海大学 一种多糖sm-0.2m及其制备的抗肿瘤产品
CN112521521A (zh) * 2020-12-09 2021-03-19 青海大学 一种多糖sm-w及其制备的抗肿瘤产品

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YU Z 等: "Characterization and biological activities of a novel polysaccharide isolated from raspberry (Rubus idaeus L.) fruits", vol. 132 *
朱会霞;孙金旭;孙浩;: "HPLC法分析覆盆子多糖单糖组分的研究", no. 23 *

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