CN115927049A

CN115927049A - 一株长双歧杆菌婴儿亚种b2-01及其应用

Info

Publication number: CN115927049A
Application number: CN202210850462.7A
Authority: CN
Inventors: 刘冬梅; 钟舒莹; 徐仪倩; 许喜林; 彭芸燕; 张馨月
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2022-07-20
Filing date: 2022-07-20
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明公开了一株长双歧杆菌婴儿亚种B2‑01及其应用，长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.infantis)B2‑01从广州健康3月龄婴儿粪便中分离筛选获得，已于2021年9月1日，在广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC No:61911。经较为系统的安全性评价，证明该菌株安全无毒。本发明菌株具有良好的胃肠液耐受能力，且具有一定的耐胆盐能力和耐氧能力，同时该菌株具有良好的肠道黏附能力、抑菌活性、拮抗致病菌黏附能力、抗氧化活性、护肝活性、降血糖活性及降胆固醇活性，可在发酵乳等食品及药品中应用。

Description

一株长双歧杆菌婴儿亚种B2-01及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一株婴儿肠道源的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01及其在食品、功能性食品、饲料添加剂及药品生产中的应用。

背景技术

2001年，世界粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)对益生菌的定义：益生菌是活的微生物，当摄入充足的数量时，对宿主产生健康益处。近年来，人们越来越注重健康饮食，益生菌与健康成为研究热点。双歧杆菌(Bifidobacterium)是人和许多哺乳类动物肠道内重要的益生菌，其具有调节肠道菌群、增强免疫力、改善血脂代谢、血糖代谢、抗氧化、护肝等益生功能。

虽然双歧杆菌是传统益生菌，具有较长的安全食用历史。但不同的菌株之间存在差异性，以及其它因素的影响，安全性评价仍然需放在首位。益生菌的安全性研究应基于菌株水平已形成当前科学共识。

黏附是菌株在肠道中定殖的首要条件之一，是益生菌在肠道内发挥益生功能的一个必要条件，因此菌株的黏附性能也成为开发新型益生菌的重要指标之一。益生菌对肠道上皮细胞的特异性黏附作用有利于其在肠道定殖，增强其与肠道细胞之间的信号交流，有利于维持肠道菌群稳态，维持肠黏膜形态与功能的完整性。益生菌为了能够在肠道中定殖并发挥益生功能，需要在消化过程中保持一定的活力，因此需要考虑益生菌的胃肠液耐受性、胆盐耐受性。

目前双歧杆菌已被广泛应用于医学、饲料、食品等领域，较为出名的双歧杆菌有动物双歧杆菌Bb-12、乳双歧杆菌HN019等，但我国拥有自主知识产权的长双歧杆菌婴儿亚种较少。人源益生菌更具有亲和性，不易被人体免疫系统所排斥，有利于其在肠道定殖，发挥益生功能，因此，从广州本土健康婴儿肠道中分离筛选到一株长双歧杆菌婴儿亚种，研究其安全性和益生性对长双歧杆菌婴儿亚种的开发利用更具有潜力和价值。

发明内容

本发明的目的是提供一株新的分离自广州市健康3月龄婴儿粪便的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01及其应用。

在本发明的第一方面，提供一株长双歧杆菌婴儿亚种B2-01。

在本发明的第二方面，提供所述的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的安全性评价，其中包括菌株的硝基还原酶实验、氨基脱羧酶实验、吲哚实验、溶血性实验、抗生素敏感性实验、动物急性经口毒理实验，实验证明长双歧杆菌婴儿亚种B2-01硝基还原酶实验阴性、氨基脱羧酶实验阴性、吲哚实验阴性、不溶血。根据EFSA相关标准判断，该菌株对氨苄西林(ampicillin)、万古霉素(vancomycin)、庆大霉素(gentamicin)、链霉素(streptomycin)、红霉素(erythromycin)、克林霉素(clindamycin)、四环素(tetracycline)、氯霉素(chloramphenicol)敏感。对小鼠无急性毒性作用，该菌株安全无毒。

在本发明的第三方面，提供所述的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株在人工模拟胃肠液环境下的耐受能力及胆盐耐受能力。长双歧杆菌婴儿亚种B2-01在不同pH下的人工模拟胃液中(pH＝2、2.5、3)暴露2h后存活率大于60％。在人工模拟肠液中暴露4h后存活率大于100％。本发明菌株对胃肠液有良好的耐受能力。将该菌株二次活化的种子液按10％的接种量接种于含有0.1％、0.3％、0.5％牛胆盐的MRS肉汤培养基中，37℃培养4h后存活率为40％～80％。

在本发明的第四方面，提供所述的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株的疏水性、自凝聚能力以及对Caco-2细胞的黏附能力。静置30min时，B2-01的疏水性为4.43％(二甲苯)，静置24h时，自凝聚力达到85.17％。在最高浓度(5×10⁷CFU/mL)下，平均每个Caco-2细胞黏附的B2-01活菌数为18.39CFU。

在本发明的第五方面，提供所述的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01发酵上清液对致病菌的抑制作用以及该菌株拮抗致病菌黏附能力，该菌株上清液对大肠杆菌ATCC25922的抑菌圈直径(mm)为25.77，对沙门氏菌ATCC14028的抑菌圈直径(mm)为23.17，对铜绿假单胞菌ATCC27853的抑菌圈直径(mm)为33.50，对单增李斯特菌CMCC54002的抑菌圈直径(mm)为27.93，对金黄色葡萄球菌ATCC12592的抑菌圈直径(mm)为24.10。B2-01菌株可以通过排斥、竞争、取代这三种方式来拮抗金黄色葡萄球菌ATCC12592、大肠杆菌ATCC25922、沙门氏菌ATCC14028黏附于Caco-2细胞。

在本发明的第六方面，提供所述的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01不同菌体浓度的上清液或其裂解液或其菌悬液或其灭活菌体的抗氧化能力，B2-01上清液、裂解液、菌悬液和灭活菌体对DPPH自由基的清除率分别为56.31％～93.93％、52.72％～98.16％、11.98％～91.61％、1.22％～90.02％，对羟自由基的清除率分别为34.47％～98.87％、38.31％～98.12％、20.09％～63.83％、15.97％～68.73％。

在本发明的第七方面，提供所述的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的护肝活性，在最高浓度(5×10⁷CFU/mL)下，上清液组和灭活菌体组的存活率分别为91.38％、90.68％，对酒精损伤的L02细胞具有较强的保护作用。

在本发明的第八方面，提供所述的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的降血糖活性，在最高浓度(5×10⁸CFU/mL)下，裂解液对α-淀粉酶的抑制率为89.91％，上清液对α-葡萄糖苷酶的抑制率为12.69％。其上清液和灭活菌体能够有效缓解胰岛素抵抗，促进胰岛素抵抗HepG2细胞消耗葡萄糖，降低血糖水平，起到降血糖作用。

在本发明的第九方面，提供所述的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的降胆固醇活性，其胆固醇清除率高达46.67％，即培养基中466.7μg/mL胆固醇被降解。

长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株在食品、功能性食品、饲料添加剂及药品生产中应用。

优选地，长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株在制备益生菌发酵乳中的应用，所述益生菌发酵乳的制备方法，包括如下步骤：

(1)发酵剂的制备：将嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)DMST-H2、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)DMLD-H1和长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌粉混合，使其活菌数的比例为3:3:(3～15)；

(2)发酵乳的制备：取牛奶预热，加入白砂糖，搅拌溶解，巴氏杀菌后，冷却，接种发酵剂，发酵至pH＝4.5±0.5，再经后熟，制得发酵乳。

优选地，步骤(1)所述活菌数的比例为3:3:10。

优选地，步骤(2)所述发酵剂总活菌数为2×10⁷CFU/mL以上；发酵温度为37-45℃。

优选地，步骤(2)所述巴氏杀菌条件：65℃，0.5h，后熟条件：4℃后熟12h。

优选地，长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株在制备抑制肠道致病菌药物、治疗或预防肠道疾病药物中的应用。

优选地，长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株在制备功能性食品或解酒护肝药物中的应用。

优选地，长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株在制备降血糖或降胆固醇药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株来源于广州市3月龄健康婴儿的粪便，经过一系列安全性实验证明该菌株安全无毒。将其接种于MRS肉汤培养基，置于普通生化培养箱静置培养，活菌数高达5×10⁸CFU/mL。本发明菌株具有一定的耐胆盐能力、耐氧能力，同时具有良好的胃肠液耐受能力、肠道黏附能力、抑菌活性、拮抗致病菌黏附能力、抗氧化活性、护肝活性、降血糖活性及降胆固醇活性，可以为功能性食品的研发提供新的优良菌株，此外，该菌株在医学、饲料、食品等领域具有较大的应用前景，尤其是在制备益生菌发酵乳、乳酸菌饮料中的应用。

保藏说明

菌种名称：长双歧杆菌婴儿亚种

拉丁名：Bifidobacteriumlongum subsp.infantis

菌株编号：B2-01。

保藏机构：广东省微生物菌种保藏中心。

地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所。

保藏日期：2021年9月1日。

保藏中心登记入册编号：GDMCC No:61911。

附图说明

图1实施例1长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株在BL固体培养基上的菌落形态图。

图2实施例1长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株革兰氏染色镜检图。

图3实施例2长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株硝基还原酶实验结果图。

图4实施例2长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株氨基酸脱羧酶实验结果图，A):精氨酸；B):酪氨酸；C)：组氨酸；D)赖氨酸。

图5实施例2长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株吲哚实验结果图。

图6实施例2长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株溶血实验结果图。

图7实施例3长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株拮抗致病菌黏附Caco-2细胞，(A)对金黄色葡萄球菌的抑制黏附率；(B)对沙门氏菌的抑制黏附率；(C)对大肠杆菌的抑制黏附率，其中**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图8实施例3长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株对DPPH自由基的清除率。

图9实施例3长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株对羟自由基的清除率。

图10实施例3长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株上清液和灭活菌体对酒精损伤的L02细胞存活率的影响，其中，正常组与模型组相比，####P<0.0001；样品组与模型组相比，**P<0.01，****P<0.0001。

图11实施例3长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株对α-淀粉酶的抑制率。

图12实施例3长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株对α-葡萄糖苷酶的抑制率。

图13实施例3长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株上清液和灭活菌体对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响，其中，正常组与模型组相比，####P<0.0001；样品组与模型组相比，***P<0.001，****P<0.0001。

图14实施例3长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株的总胆固醇清除能力，其中，**P<0.01，***P<0.001。

图15实施例5发酵乳的发酵曲线。

图16实施例5发酵乳的表观黏度。

图17实施例5发酵乳频率扫描曲线，(a)储能模量(G')；(b)损耗模量(G")。

具体实施方式

本发明提供一株安全无毒、具有益生活性的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01，具体而言，本发明涉及一株一株婴儿肠道源的安全无毒的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01，该菌株具有一定的耐胆盐能力、耐氧能力，同时具有良好的胃肠液耐受能力、肠道黏附能力、抑菌活性、拮抗致病菌黏附能力、抗氧化活性、护肝活性、降血糖活性及降胆固醇活性。为了更好的理解本发明，下面结合具体的实施例，对本发明进行详细的阐述和说明，但本发明要求保护范围并不局限于以下具体实施例所示范围。

以下实施例所使用的培养基配方为：

MRS肉汤培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司)：

取酪蛋白酶消化物10g、牛肉膏粉10g、酵母膏粉4g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、硫酸镁(Mg SO₄·7H₂O)0.2g、硫酸锰(Mn SO₄·4H₂O)0.05g、磷酸氢二钾2g、葡萄糖20g、吐温801.08g，加蒸馏水1000mL，溶解后，调pH至5.7±0.2。121℃灭菌15min。

MRS固体培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司)：

取蛋白胨10g、牛肉膏粉5g、酵母膏粉4g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、柠檬酸三铵2g、硫酸镁(Mg SO₄·7H₂O)0.2g、硫酸锰(Mn SO₄·4H₂O)0.05g、琼脂15g，加蒸馏水1000mL，溶解后，调pH至6.2±0.2，121℃灭菌15min。

BL琼脂培养基(购自青岛高科园海博生物技术有限公司)：

肝浸粉4.0g、蛋白胨5.0g、牛肉浸粉3.0g、酵母浸粉2.0g、胰酪蛋白胨5.0g、可溶性淀粉0.5g、L-半胱氨酸0.5g、葡萄糖10.0g、磷酸二氢钾1.0g、磷酸氢二钾1.0g、大豆胨3.0g、硫酸镁0.2g、硫酸亚铁0.01g、氯化钠0.01g、琼脂20.0g、硫酸锰0.0067g、吐温80 1.0g，加蒸馏水1000mL，溶解后，调pH至7.2±0.1，121℃灭菌15min。

硝基还原酶检测培养基：

取细菌学蛋白胨1g，硝酸钾0.1g，加蒸馏水100mL，溶解后，调节培养基pH值至7.4，分装，121℃高压灭菌15min。

氨基脱羧酶诱导培养基：

向100mL MRS肉汤培养基中加入0.005％质量分数的5-磷酸吡哆醛，混合均匀，分装，分别加入0.1％质量分数的赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸，121℃高压灭菌15min。

氨基脱羧酶鉴定培养基(BASM)：

取胰蛋白胨5g、酵母膏5g、牛肉膏5g、NaCl 2.5g、葡萄糖0.5g、吐温80 1g、碳酸钙0.1g、硫酸亚铁0.04g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.2g、柠檬酸铵2g、硫胺素0.01g、磷酸氢二钾2g、5-磷酸吡哆醛0.05g、溴甲酚紫0.06g、琼脂20g，加蒸馏水1000mL，溶解后，调PH为5.3，121℃灭菌10min，待稍微冷却后分装，分别加入1％赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸，摇匀。

蛋白胨水培养基：

取细菌学蛋白胨1g、氯化钠0.5g，添加蒸馏水100mL，溶解后，调pH至7.8，121℃灭菌15min。

LB液体培养基：

取蛋白胨10g、氯化钠5g、葡萄糖1g、酵母膏粉5g，加蒸馏水1000mL，溶解后，调pH至7.0±0.2，121℃灭菌15min。

LB琼脂培养基：

取蛋白胨10g、氯化钠5g、葡萄糖1g、酵母膏粉5g、琼脂15g，加蒸馏水1000mL，溶解后，调pH至7.0±0.2，121℃灭菌15min。

10％脱脂乳：

取脱脂乳粉10g，加蒸馏水90mL，121℃灭菌15min。

实施例1：菌株的筛选与鉴定

用无菌的一次性粪便采集杯收集广州市3月龄健康婴儿的粪便，样品于3h内在生理盐水中梯度稀释10³～10⁷倍，将样品稀释液涂布于BL琼脂培养基中，37℃厌氧培养48h。根据菌落大小、形态等特征选取单菌落在BL琼脂培养基上划线培养3次以上，获得一株分离纯化的菌株，将该菌株命名为B2-01。该菌株的菌落形态图见图1，菌落形态特征为中间凸起，呈乳白色且不透明，表面光滑有光泽，边缘整齐。

为鉴定菌株，先用显微镜观察革兰氏染色后的菌体形态，结果如图2所示，通过16SrDNA测序进行分子生物学鉴定，16S rDNA测序结果表明，该菌株与Bifidobacteriumlongumsubsp.infantis ATCC15697同源性高达99.78％，确定菌株B2-01为长双歧杆菌婴儿亚种。该菌株16S rDNA序列参见SEQ NO.1，将分离纯化后的B2-01菌株保存至10％脱脂乳中，-20℃下冻存。

实施例2：长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的安全性评价

长双歧杆菌婴儿亚种B2-01(B.infantisB2-01)、Bifidobacteriumlongumsubsp.infantisATCC15697(B.infantisATCC15697)菌株的活化：将-20℃冰箱中冻存的菌株，按1％(v/v)的接种量，接种于MRS肉汤培养基中，37℃培养16～22h，进行一次活化，再按3％(v/v)的接种量，将一次活化的种子发酵液接种于MRS肉汤培养基中，37℃培养16～22h，得到二次活化的菌株发酵液。

金黄色葡萄球菌ATCC12592、单增李斯特菌CMCC54002、革兰氏阴性菌(大肠杆菌ATCC25922(E.coliATCC25922)、沙门氏菌ATCC14028、铜绿假单胞菌ATCC27853菌株的活化：将-20℃冰箱中冻存的菌株，按1％(v/v)的接种量，接种于LB液体培养基中，37℃培养12～16h，连续活化2次。

2.1硝基还原酶活性检测

将二次活化的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01、阳性对照菌株大肠杆菌ATCC25922以及阴性性对照菌株Bifidobacteriumlongum subsp.infantisATCC15697按3％(v/v)的接种量分别接种于硝基还原酶检测培养基中，以未接种菌株的硝基还原酶检测培养基为空白对照，37℃恒温培养48～96h，依次向培养基中加入α-萘胺和对氨基苯磺酸溶液，混匀，观察培养基颜色的变化。培养基变为红色则代表硝基还原酶检测结果为阳性，否则为阴性。结果如图3所示，长双歧杆菌婴儿亚种B2-01硝基还原酶结果为阴性。

2.2氨基脱羧酶活性检测

将二次活化的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01发酵液按1％(v/v)的接种量分别接种于诱导培养基，同时以大肠杆菌ATCC25922作为阳性对照菌株，以Bifidobacteriumlongumsubsp.infantis ATCC15697作为阴性对照菌株，37℃培养20～24h，按照同样的方法转接6次后，将过夜培养的菌株发酵液混匀，分别吸取100μL菌液均匀涂布于BASM培养基上，37℃培养4天，观察培养基颜色。BASM培养基呈黄色为阴性，呈紫色为阳性。结果如图4所示，长双歧杆菌婴儿亚种B2-01氨基脱羧酶结果为阴性，即该菌株不产生氨基脱羧酶。

2.3吲哚实验

将二次活化的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01、阳性对照菌株大肠杆菌ATCC25922以及阴性性对照菌株Bifidobacteriumlongum subsp.infantis ATCC15697按3％(v/v)接种量接种于蛋白胨水培养基中，同时设置空白对照，37℃恒温培养72h，加入吲哚试剂8～10滴，观察液面颜色变化。结果如图5所示，Escherichia coli ATCC25922培养基的液面为玫瑰红色，结果为阳性，而Bifidobacteriumlongum subsp.infantis ATCC15697和长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的培养基液面均为黄色，结果为阴性，说明B2-01在增殖过程中不产生色氨酸酶。

2.4溶血实验

挑取长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌落，在哥伦比亚血琼脂平板上划线，37℃厌氧培养48h，观察菌落周围有无明显的溶血圈。结果如图6所示，该菌株菌落周围无明显溶血圈形成，即该菌株不会对人体造成溶血伤害。

2.5抗生素敏感性实验

用无菌的MRS肉汤培养基稀释二次活化的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌液，使菌体浓度约为10⁵CFU/mL。用无菌水配制抗生素母液，采用二倍稀释法进行稀释，配制成1.25～1280mg/L的氨苄西林(ampicillin)、1.25～1280mg/L的万古霉素(vancomycin)、5～5120mg/L的庆大霉素(gentamicin)、10～10240mg/L的链霉素(streptomycin)、0.625～640mg/L的红霉素(erythromycin)、0.625～640mg/L的克林霉素(clindamycin)、5～5120mg/L的四环素(tetracycline)、1.25～1280mg/L的氯霉素(chloramphenicol)，向无菌的96孔板加入20μL不同浓度的抗生素溶液和180μL B2-01菌液(10⁵CFU/mL)，用无菌水替代抗生素溶液作为阴性对照，以无菌MRS肉汤培养基作为空白对照，37℃厌氧培养18h，测定各孔OD600。抑制菌体生长的最小稀释浓度为最小抑菌浓度(MIC)。

双歧杆菌对各抗生素的敏感性根据欧洲食品安全局(European Food SafetyAuthority，EFSA)制定的相关标准(见表1)判断。抗生素敏感性实验的结果如表2所示，该菌株对氨苄西林(ampicillin)、万古霉素(vancomycin)、庆大霉素(gentamicin)、链霉素(streptomycin)、红霉素(erythromycin)、克林霉素(clindamycin)、四环素(tetracycline)、氯霉素(chloramphenicol)均为敏感。

表1各抗生素对双歧杆菌的MIC要求及抗药性判断标准

注：S为抗生素敏感；R为抗生素不敏感。

表2抗生素敏感实验结果

抗生素素名称	MIC(mg/L)	抗生素敏感程度
			氨苄西林	0.25	S
万古霉素	≤0.125	S
			庆大霉素	64	S
链霉素	8	S
			红霉素	≤0.0625	S
克林霉素	0.125	S
			四环素	≤0.5	S
氯霉素	0.5	S

2.6小鼠急性经口毒性试验

取SPF级KM小鼠20只，雌雄各半，体重为18g～22g。实验前动物禁食过夜，不限制饮水。取对数生长期的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01发酵液离心(6000rpm，5min，4℃)，取菌泥，重悬于无菌生理盐水，并用无菌生理盐水调菌浓度为4×10⁸CFU/mL，空腹灌胃1次，灌胃容量为20.0mL/kg体重，灌胃后继续禁食1h～2h，立即观察并记录动物的中毒表现、死亡数和死亡时间，观察期为14天。

实验结果表明：含有长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的口服液(受试物)对雌雄性KM小鼠急性经口毒性LD₅₀＞10.0g/kg体重，属于实际无毒级，对小鼠不具备急性毒性作用。

表3受试物对小鼠急性经口毒性试验结果

实施例3：长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的益生活性研究

将-20℃冰箱中冻存的菌株，接种于MRS肉汤培养基中，连续2次活化，得到种子发酵液。以体积比为3:100的比例，将种子发酵液接入MRS液体培养基中，37℃过夜培养得到菌株发酵液。

3.1人工模拟胃肠道耐受性实验

取过夜培养的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的发酵液离心(6000rpm，5min，4℃)，取菌泥，并用无菌生理盐水重悬。将菌悬液按照10％(v/v)的接种量接种于不同pH的人工模拟胃液中，37℃恒温培养2h后取样，计活菌数。将菌悬液按照10％(v/v)的接种量接种于人工模拟肠液中，37℃恒温培养4h后取样，计活菌数。存活率＝[logCFU(N_t)/logCFU(N₀)]×100％，其中，N₀为暴露在人工模拟胃液、人工模拟肠液0min时的活菌数，N_t为菌株暴露在人工模拟胃液中2h、暴露在人工模拟肠液中4h时的活菌数。其中，人工模拟胃液的配制为：称取0.88g氯化钠，用少量蒸馏水溶解，用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调节溶液pH为3，按照5g/L浓度加入胃蛋白酶，用蒸馏水定容至30mL，溶解后，过0.22μm滤膜除菌备用。人工模拟肠液的制备为：称取0.27g磷酸二氢钾，量取少量蒸馏水溶解，用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调节溶液pH为6.8，按照0.1g/L的比例加入胰蛋白酶，用蒸馏水定容至30mL，过0.22μm滤膜除菌备用。

长双歧杆菌婴儿亚种B2-01在人工模拟胃液中的存活率结果如表4所示，暴露在pH＝3.0的人工模拟胃液2h后，存活率可达80.35％。暴露在人工模拟肠液液4h后，存活率可达(104.90±3.65)％。说明本发明的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01对人工胃肠液具有较好的耐受性。

表4长双歧杆菌婴儿亚种B2-01在人工模拟胃液中的存活率(％)

	人工胃液(pH＝2.0)	人工胃液(pH＝2.5)	人工胃液(pH＝3.0)
				存活率(％)	<![CDATA[60.61±0.78<sup>c</sup>]]>	<![CDATA[76.37±0.55<sup>b</sup>]]>	<![CDATA[80.35±1.07<sup>a</sup>]]>

注：不同字母代表差异显著(p＜0.05)

3.2长双歧杆菌婴儿亚种B2-01胆盐耐受性实验

将二次活化的种子液按10％的接种量接种于含有0.1％、0.3％、0.5％牛胆盐的MRS肉汤培养基中，37℃培养4h后平板计数。存活率＝[logCFU(N_t)/logCFU(N₀)]×100％，其中，N₀为接种于含胆盐MRS肉汤基0h时的活菌数，N_t为接种于含胆盐MRS肉汤基t h时的活菌数。胆盐耐受性实验结果如表5所示，在0.3％、0.5％的胆盐培养基中培养4h后存活率不足60％，生存率较低，但在0.1％胆盐MRS培养基中仍有较高的存活率，可达80.20％。人的肠道中含有胆盐，不利于益生菌在肠道中存活并发挥益生功能。B2-01菌株能够耐受低浓度胆盐且具有良好的胃肠液耐受能力，有利于菌株在胃肠道内以较高的活菌数到达其作用靶点，发挥其益生功能。

表5长双歧杆菌婴儿亚种B2-01在含胆盐培养基中的存活率(％)

胆盐浓度	存活率(％)
		0.1％	<![CDATA[80.20±1.13<sup>a</sup>]]>
0.3％	<![CDATA[52.60±2.08<sup>b</sup>]]>
		0.5％	<![CDATA[40.64±1.95<sup>c</sup>]]>

注：不同字母代表差异显著(p＜0.05)

3.3长双歧杆菌婴儿亚种B2-01疏水性能与自凝聚能力测试

取过夜培养的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01发酵液进行离心(6000rpm，5min，4℃)，用无菌PBS缓冲溶液(pH 7.4)洗涤2次，取菌泥用PBS溶液重悬，调菌悬液OD600值为0.5±0.02。取3mL菌悬液与2mL二甲苯或乙酸乙酯混合，旋涡震荡2min，室温下静置，分别静置0h、0.5h后取水相测定OD600值，A₀为混合前的OD600值。疏水性＝[(A₀-A_t)/A₀]×100％。其中，A_t为放置t h后的OD600值，A₀为静置0h时的OD600值。疏水性实验结果如表6所示。

表6长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的疏水性实验结果

有机试剂	二甲苯	乙酸乙酯
			疏水性(％)	<![CDATA[4.43±0.31<sup>b</sup>]]>	<![CDATA[11.90±0.59<sup>a</sup>]]>

注：不同字母代表差异显著(p＜0.05)

取过夜培养的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01发酵液进行离心(6000rpm，5min，4℃)，用无菌PBS缓冲溶液洗涤2次，取菌泥用PBS溶液重悬，旋涡震荡，室温下静置，分别静置0、12h、24h后吸取上层清液液测定OD600值，自凝聚能力＝[(A₀-A_t)/A₀]×100％。其中，A_t为放置t h后的OD600值，A₀为静置0h的OD600值。结果如表7所示，静置24h时，长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的自凝聚力可达85.17％，具有良好的自凝聚能力。

表7长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的自凝聚力

时间(h)	自凝聚力(％)
		12	<![CDATA[80.29±0.65<sup>b</sup>]]>
24	<![CDATA[85.17±0.83<sup>a</sup>]]>

注：不同字母代表差异显著(p＜0.05)

3.4长双歧杆菌婴儿亚种B2-01对Caco-2细胞的黏附作用

菌悬液的制备：将过夜培养的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株发酵液离心(6000rpm，5min，4℃)，收集菌体沉淀，用PBS洗涤1次，用DMEM基础培养基(不含血清和双抗)重悬，调整菌体浓度为5×10⁷、2×10⁷、1×10⁷CFU/mL，进行黏附实验。

细胞培养：使用含20％胎牛血清和1％双抗(青霉素+链霉素)的DMEM高糖培养基培养(简称DMEM完全培养基)培养Caco-2细胞，当细胞生长状态良好并且贴壁面积达70％～80％时，在细胞培养瓶中加入0.25％胰酶1.5mL，于37℃培养箱中消化2min后，加入1.5mLDMEM完全培养基，离心(1000r/min，4min)，弃上清，加入DMEM完全培养基，调整细胞浓度，以每孔1.5×10⁵个细胞，均匀地接种至24孔板中，置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养，待细胞贴壁面积达80％时，吸去培养基，并用无菌PBS清洗2次，分别取500μL的浓度为5×10⁷、2×10⁷、1×10⁷CFU/mL的B2-01菌悬液加入孔中，在37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养2h进行黏附。黏附完成后，无菌PBS洗涤3次，除去未黏附的菌体，再加入1mL1％Triton X-100将Caco-2细胞裂解20min，将每孔中剩余的菌体吸出计活菌数。向未进行黏附实验的孔加入0.5mL0.25％胰酶进行消化2min，再加入0.5mLDMEM完全培养基，吹打均匀，用血球计数板计数细胞浓度，计算每孔细胞数。计算平均每个细胞黏附的B2-01活菌数(黏附数)。

表8长双歧杆菌婴儿亚种B2-01对Caco-2细胞的黏附能力

B2-01菌悬液浓度(CFU/mL)	黏附数(CFU/Caco-2细胞)
		<![CDATA[5×10<sup>7</sup>]]>	<![CDATA[18.39±0.84<sup>a</sup>]]>
<![CDATA[2×10<sup>7</sup>]]>	<![CDATA[11.37±0.51<sup>b</sup>]]>
		<![CDATA[1×10<sup>7</sup>]]>	<![CDATA[6.70±0.20<sup>c</sup>]]>

注：不同字母代表差异显著(p＜0.05)

乳酸菌在肠道内的黏附机制主要包括非特异性黏附和特异性黏附，菌株特异性黏附是通过菌株与细胞之间的黏附素－黏附位点的特异性结合，乳酸菌的黏附素主要有表层蛋白、肽聚糖、脂磷壁酸等物质。非特异性黏附主要是通过细菌表面的物理化学性质如疏水相互作用、静电等表面特性而起作用。

乳酸菌的疏水性和自凝聚能力是乳酸菌对肠道非特异性黏附的重要指标。目前，常采用结肠癌细胞系Caco-2和HT-29细胞系作为体外细胞模型来评价乳酸菌的黏附特性。B2-01菌株对Caco-2细胞黏附作用的结果如表8所示，不同浓度的菌悬液作用于Caco-2细胞，其黏附强度不同，在最高浓度(5×10⁷CFU/mL)下，平均每个Caco-2细胞黏附的B2-01活菌数为18.39CFU。结合B2-01菌株疏水性和自凝聚能力的结果，表明B2-01菌株具有较高的黏附能力，有利于其在肠道定殖，更好地发挥益生功能。该菌株良好的黏附能力使其益生活性的研究更具有意义。

3.5抑制致病菌实验

革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌ATCC12592、单增李斯特菌CMCC54002)、革兰氏阴性菌(大肠杆菌ATCC25922、沙门氏菌ATCC14028、铜绿假单胞菌ATCC27853)作为指示菌株。取适量二次活化的指示菌加入LB琼脂培养基中，使菌的终浓度约为10⁶CFU/mL，摇匀，倾注平板，培养基凝固后，打孔(孔直径7mm)，分别注入长双歧杆菌婴儿亚种B2-01上清液100μL，风干孔内液体，37℃培养18～24h，测量抑菌圈的直径。上述上清液为过夜培养的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的发酵液离心(6000rpm，5min，4℃)取上清液，经0.22μm滤膜过滤。结果如表9所示，长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的发酵上清液具有良好的抑菌效果，抑菌物质包括有机酸等。

表9长双歧杆菌婴儿亚种B2-01对五种指示菌的抑制能力

指示菌	抑菌圈直径(mm)
		金黄色葡萄球菌	<![CDATA[24.10±0.53<sup>d</sup>]]>
单增李斯特菌	<![CDATA[27.93±0.31<sup>b</sup>]]>
		大肠杆菌	<![CDATA[25.77±0.68<sup>c</sup>]]>
沙门氏菌	<![CDATA[23.17±1.04<sup>d</sup>]]>
		铜绿假单胞菌	<![CDATA[33.50±0.87<sup>a</sup>]]>

注：不同字母代表差异显著(p＜0.05)

3.6拮抗致病菌黏附Caco-2细胞作用

采用排斥试验、竞争实验、取代试验研究长双歧杆菌婴儿亚种B2-01抑制致病菌对Caco-2细胞的黏附作用。

菌悬液的制备：取二次活化的金黄色葡萄球菌ATCC12592、大肠杆菌ATCC25922、沙门氏菌ATCC14028、过夜培养的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株发酵液离心(6000rpm，5min，4℃)，用无菌PBS洗涤1次，并用DMEM基础培养基(不含血清和双抗)重悬，调整菌体浓度为4×10⁷CFU/mL。

调整消化后的Caco-2细胞浓度，以每孔1×10⁵个细胞，均匀地接种至24孔板中，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养，待细胞贴壁面积达80％时，进行实验。

(1)排斥实验-长双歧杆菌婴儿亚种B2-01对致病菌在Caco-2细胞上的排斥黏附实验

将24孔培养板中的单层细胞用PBS清洗2次后，每孔加入500μLB2-01菌悬液，在CO₂培养箱中37℃培养2h。然后用无菌PBS洗涤3次，除去未黏附的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01，分别加入500μL金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌菌悬液，培养2h。

(2)竞争实验-长双歧杆菌婴儿亚种B2-01和致病菌在Caco-2细胞上的竞争黏附实验

将24孔培养板中的单层细胞用PBS清洗2次后，每孔同时加入500μLB2-01菌悬液和500μL致病菌菌悬液，在CO₂培养箱中37℃培养2h。

(3)置换实验-长双歧杆菌婴儿亚种B2-01替换致病菌在Caco-2细胞上的黏附实验

将24孔培养板中的单层细胞用PBS清洗2次后，向孔中分别加入500μL金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌菌悬液，在CO₂培养箱中37℃培养2h。然后用无菌PBS洗涤3次，除去未黏附的致病菌，再每孔加入500μLB2-01菌悬液，在CO₂培养箱中37℃培养2h。

对照组不经过长双歧杆菌婴儿亚种B2-01处理，只在Caco-2细胞中加入500μL致病菌菌悬液，进行黏附实验。

实验结束后，每孔用无菌PBS清洗3次，除去未粘附的菌体，再加入1mL1％TritonX-100将Caco-2细胞裂解20min，吹打混匀，梯度稀释，将稀释液均匀涂布于平板中，在37℃、有氧条件下培养24～48h(注：B2-01菌株用该方法计活菌数，结果为0CFU/mL)。大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌分别采用伊红美蓝琼脂(EMB)、亚硫酸铋琼脂(BS)和LB琼脂培养基进行平板计数。抑制黏附率计算公式如下：抑制黏附率＝[(对照组黏附致病菌数-实验组黏附致病菌数)/对照组黏附致病菌数)]×100％。

乳酸菌抑制致病菌黏附机制主要包括：对黏附位点与营养的竞争；产生抑菌物质，抑制致病菌的生长和繁殖；形成空间排阻作用，阻碍致病菌的黏附和定殖。

B2-01菌株可以通过排斥、竞争、取代这三种方式来拮抗金黄色葡萄球菌ATCC12592、大肠杆菌ATCC25922、沙门氏菌ATCC14028黏附于Caco-2细胞。结果如图7所示，B2-01菌株对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌黏附的抑制以排斥方式为主，在排斥实验中，抑制黏附率分别为51.77％、61.57％。B2-01菌株与大肠杆菌在Caco-2细胞上的竞争黏附效果最好，对大肠杆菌黏附作用的抑制率为84.9％。

黏附是致病菌破坏肠道黏膜、产生毒素以及侵袭细胞的基础。B2-01菌株能够较好的抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌黏附于Caco-2细胞，有利于其调节肠道菌群、保护肠道上皮细胞、维持肠黏膜形态与功能的完整性，进而维护肠道健康。同时，B2-01菌株的代谢产物具有较强的抑菌活性。因此，B2-01菌株可应用于抑制肠道致病菌药物的制备，辅助治疗或预防肠道疾病。

3.7长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的抗氧化活性

(1)DPPH自由基清除率的测定

用无菌生理盐水把过夜培养的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01发酵液分别稀释至5×10⁸、5×10⁷、5×10⁶CFU/mL，分别测定这3个稀释度的上清液、菌悬液、细胞裂解液、灭活菌体的DPPH自由基清除能力。取2mL待测样品和2mL DPPH乙醇溶液，混匀，暗反应40min，同时设置对照组(用无水乙醇代替样品溶液)和空白组(用无水乙醇代替DPPH溶液)，测定517nm波长处的吸光值。自由基清除率＝[1-(A_样-A_空/A_对)]×100％。上述DPPH为0.2mmol/L的DPPH，取0.0078gDPPH用无水乙醇定容至100mL。上述上清液为该浓度下的发酵液离心(6000rpm，5min，4℃)取上清液，经0.22μm滤膜过滤。上述菌悬液为该浓度下的发酵液离心(6000rpm，5min，4℃)，取菌体重悬于无菌生理盐水中。上述细胞裂解液是该浓度下的菌液经细胞超声破碎仪处理10min(500W，1.5s，1.5s)后，离心(6000rpm，5min，4℃)取上清液，经0.22μm滤膜过滤。上述灭活菌体是该浓度下的菌液经121℃高温处理15min，离心(6000rpm，5min，4℃)，用无菌PBS重悬制得。结果如图8所示，B2-01上清液、裂解液、菌悬液和灭活菌体对DPPH自由基的清除率分别为56.31％～93.93％、52.72％～98.16％、11.98％～91.61％、1.22％～90.02％，在最高浓度(5×10⁸CFU/mL)下，B2-01裂解液对DPPH自由基的清除率高达98.16％。

(2)羟自由基清除率的测定

用无菌生理盐水把过夜培养的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01发酵液分别稀释至5×10⁸、5×10⁷、5×10⁶CFU/mL，分别测定这3个稀释度的上清液、菌悬液、细胞裂解液、灭活菌体的羟自由基清除能力。依次向试管加入1mL 9mmol/L FeSO₄、3mL 9mmol/L水杨酸-乙醇溶液、1mL样品溶液，最后加入1mL 8.8mmol/L H₂O₂溶液启动反应，置于37℃水浴锅中加热反应15min，测定OD510。空白对照用蒸馏水替代样品溶液，样品空白用蒸馏水替代H₂O₂溶液。羟自由基清除率计算公式如下：

结果如图9所示，B2-01上清液、裂解液、菌悬液和灭活菌体对羟自由基的清除率分别为34.47％～98.87％、38.31％～98.12％、20.09％～63.83％、15.97％～68.73％，在最高浓度(5×10⁸CFU/mL)下，B2-01上清液对羟自由基的清除率高达98.87％。

3.8长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的护肝活性

使用含10％胎牛血清和1％双抗(青霉素+链霉素)的DMEM高糖培养基培养(简称DMEM完全培养基)对人正常肝细胞L02进行复苏和传代。样品溶液的制备：取2份5×10⁸CFU/mL的B2-01发酵液，一份置于121℃下高温处理15min，离心(6000rpm，5min，4℃)，用无菌PBS重悬制得灭活菌体；一份离心(6000rpm，5min，4℃)取上清液用0.22μm滤膜过滤制得上清液(该上清液的浓度为5×10⁸CFU/mL)。

将L02细胞密度调整为8×10⁴个/mL后，按100μL/孔加入96孔板，5％CO₂、37℃条件下培养24h，用注射器吸弃各孔培养上清液后加入100μL PBS润洗两次，实验组加入100μL同时含有6％(体积分数)酒精和不同浓度样品(5×10⁷、2×10⁷、1×10⁷CFU/mL)的DMEM完全培养基作用24h，即将样品与6％酒精同时作用于细胞，模型组加入100μL含有6％酒精的DMEM完全培养基作用24h，正常组加入100μLDMEM完全培养基作用24h。培养结束后，采用MTT法检测细胞存活率，细胞存活率＝(A_处理组/A_空白组)×100％。

由图10可见，与正常组相比，模型组L02细胞存活率仅为58.33％，说明在6％酒精的损伤作用下，L02细胞的存活率显著降低，酒精性肝细胞损伤模型建立成功。但在不同浓度的上清液和灭活菌体处理24h之后，样品组细胞存活率显著高于模型组，且存活率提高程度呈浓度依赖性。在最高浓度(5×10⁷CFU/mL)下，上清液组和灭活菌体组的存活率分别为91.38％、90.68％，对酒精损伤的L02细胞具有较强的保护作用，可应用于具有解酒护肝功效的功能性食品或药品的制备。

3.9长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的降血糖活性

(1)对α-淀粉酶的抑制作用

用无菌生理盐水把过夜培养的长双歧杆菌婴儿亚种B2-01发酵液分别稀释至5×10⁸、2×10⁸、1×10⁸CFU/mL。上清液为该浓度下的发酵液离心(6000rpm，5min，4℃)，取上清液，经0.22μm滤膜过滤；菌悬液为该浓度下的发酵液离心(6000rpm，5min，4℃)，取菌体重悬于无菌生理盐水中；细胞裂解液为该浓度下的菌液经细胞超声破碎仪处理10min(500W，1.5s，1.5s)后，离心(6000rpm，5min，4℃)取上清液，经0.22μm滤膜过滤。

表10B2-01对α-淀粉酶的抑制实验的加样表

	样品	a-淀粉酶(1mg/mL)	PBS(pH＝6.8)
				A-样品	0.5mL	0.1mL	0.9mL
B-样品空白	0.5mL	0mL	1.0mL
				C-对照	0mL	0.1mL	1.4mL
D-空白	0mL	0mL	1.5mL

按表10加入试剂，37℃水浴10min，各组分别加入0.5mL 1％可溶性淀粉，37℃水浴5min，再加入DNS试剂1mL，沸水浴5min，加入蒸馏水10mL，混匀，静置30min，测定各组的OD540。α-淀粉酶抑制率的公式如下：

α-淀粉酶是一种重要的淀粉水解酶，它能够切断淀粉内部的糖苷键，产生糊精、低聚糖和葡萄糖等，生成的葡萄糖被小肠吸收，从而提高了血糖水平。因此，抑制α-淀粉酶的活性有助于减少葡萄糖的吸收，降低血糖水平。结果如图11所示，上清液、裂解液对α-淀粉酶的抑制作用强于菌悬液。在最高浓度(5×108CFU/mL)下，裂解液对α-淀粉酶的抑制率为89.91％。

(2)对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

α-葡萄糖苷酶(0.5U/mL)预先置于37℃活化，2.5mmol/L的PNPG溶液由PBS(PH＝6.8)配制而成，实验体系在96孔板内反应。设置以下4个组别：样品组(60μLPBS+20μL-α葡萄糖苷酶(0.5U/mL)+30μL样品)、样品空白组(80μLPBS+30μL样品)、空白组(110μLPBS)、对照组(90μL PBS+20μLα-葡萄糖苷酶(0.5U/mL))，按上述分组加样后，置于37℃恒温箱避光孵育10min，再加入50μL PNPG溶液，37℃避光反应30min后立即加入100μL浓度为1mol/L的Na2CO3溶液，终止反应，用酶标仪测定各孔的OD405。α-葡萄糖苷酶抑制率的公式如下：

食物中的多糖经过淀粉酶消化后，生成的低聚糖进入小肠，位于小肠上皮的α-葡萄糖苷酶从非还原末端切开低聚糖的α-1,4糖苷键，生成可被小肠吸收的葡萄糖，葡萄糖进入血液循环，从而促进血糖水平的提高，因此，通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性，延缓葡萄糖的吸收，控制餐后血糖的升高。结果如图12所示，上清液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用强于裂解液、菌悬液。在最高浓度(5×10⁸CFU/mL)下，上清液对α-葡萄糖苷酶的抑制率为12.69％。

(3)基于胰岛素抵抗HepG2细胞模型评价降血糖活性

使用含10％胎牛血清和1％双抗(青霉素+链霉素)的DMEM高糖培养基培养(简称DMEM完全培养基)对肝癌细胞HepG2进行复苏和传代。样品溶液的制备：取2份5×10⁸CFU/mL的B2-01发酵液，一份置于121℃下高温处理15min，离心(6000rpm，5min，4℃)，用无菌PBS洗涤2次并重悬制得灭活菌体；一份离心(6000rpm，5min，4℃)取上清液用0.22μm滤膜过滤制得上清液(该上清液的浓度为5×10⁸CFU/mL)。

将HepG2细胞密度调整为8×10⁴个/mL后，按100μL/孔加入96孔板，5％CO₂、37℃条件下培养24h，用注射器吸弃各孔培养上清液后加入100μL PBS洗涤两次，正常组加入100μLDMEM完全培养基，样品组、阳性药物组、模型组避光加入100μL含10^-7mol/L胰岛素的DMEM高糖培养基，培养48h，吸弃培养上清液，各孔加入100μL PBS洗涤两次，正常组和模型组加入100μL DMEM完全培养基，样品组加入100μL含不同浓度灭活菌体或上清液(5×10⁷、2×10⁷、1×10⁷CFU/mL)的DMEM完全培养基，阳性药物组加入100μL含300μg/mL二甲双胍的DMEM完全培养基，继续培养24h，收集各组的细胞培养上清液，检测葡萄糖含量，并计算各组的葡萄糖消耗量。葡萄糖消耗量＝A-B，其中A为空白DMEM完全培养基的葡萄糖含量，B为各实验组培养上清液的葡萄糖含量。按照葡萄糖(GLU)测试盒(购自南京建成生物工程研究所)说明书测定各组培养上清液中的葡萄糖含量。

结果如图13所示，模型组的葡萄糖消耗量显著低于正常组，说明胰岛素抵抗细胞模型建立成功，5×10⁷CFU/mL的上清液和灭活菌体组和二甲双胍组的葡萄糖消耗量显著高于模型组，甚至能够高于正常组，这表明上清液和灭活菌体在缓解胰岛素抵抗的同时，可能也通过某些机制促进细胞消耗葡萄糖。而且，5×10⁷CFU/mL的上清液和灭活菌体组的葡萄糖消耗量与阳性药物(二甲双胍)组相当，说明上清液和灭活菌体能够有效缓解胰岛素抵抗，促进胰岛素抵抗HepG2细胞消耗葡萄糖，降低血糖水平，起到降血糖作用。可以将B2-01菌株应用于辅助治疗Ⅱ型糖尿病，减少二甲双胍药物的使用，减轻该药物对人体的不良影响。

人体进食后，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶协同促进血糖的升高。B2-01菌株可以通过2种途径起到降血糖作用，一是抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，延缓机体对碳水化合物的消化与吸收，而是增加胰岛素敏感性，缓解胰岛素抵抗。B2-01菌株可应用于具有降血糖作用的功能性食品的研发。为辅助治疗糖尿病、减缓肥胖的药品研发提供新的优良菌株。

3.10长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的降胆固醇活性

将二次活化的B2-01发酵液离心(6000rpm，5min，4℃)，弃上清，用无菌生理盐水重悬，并将浓度调整至5×10⁸、2×10⁸、1×10⁸CFU/mL，将不同浓度的菌悬液按5％(v/v)的接种量接种到1mg/mL的胆固醇培养基中，同时设置空白组(不接菌的胆固醇培养基)，37℃培养24h。离心(8000r/min，5min)取上清液，按照总胆固醇(T-CHO)测试盒(购自南京建成生物工程研究所)说明书测定各组上清液中的总胆固醇含量。计算上清液的胆固醇浓度(C)。总胆固醇清除率＝[(C_空-C_样)/C_空)]×100％。上述胆固醇培养基为：取0.05g胆固醇用少量吐温-80加热溶解，趁热加入50mL MRS液体培养基中，摇匀，配成终浓度为1mg/mL的胆固醇培养基，121℃高压灭菌15min。结果如图14所示，在最高浓度(5×10⁸CFU/mL)下，B2-01的胆固醇清除率高达46.67％，即培养基中466.7μg/mL胆固醇被降解。降低血清中的胆固醇浓度有利于预防动脉硬化和高血压等心血管疾病，本发明菌株可应用于具有降胆固醇作用的功能性食品或药品的制备。

实施例4含有长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌粉的制备

冻干保护剂的制备：取10g海藻糖和10g脱脂乳粉，加80g的蒸馏水，搅拌溶解后，于110℃灭菌15min。

将二次活化的B2-01菌株按3％(v/v)的接种量接种于MRS肉汤培养基中，37℃培养20～23h，离心，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次后，取菌体重悬于冻干保护剂，并控制冻干保护剂和菌体的质量比为2：1，得到重悬液，将重悬液-80℃预冷后立即转移至真空冷冻干燥机干燥，得到长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌粉。

实施例5含有长双歧杆菌婴儿亚种B2-01的发酵乳

德氏乳杆菌DMLD-H1，由华南理工大学食品质量与安全实验室从内蒙古自制酸奶中分离筛选得到，并于2019年4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保存的菌株编号为GDMCC 60645，已在中国专利CN110607255A中公开。

嗜热链球菌DMST-H2，由华南理工大学食品质量与安全实验室从内蒙古自制酸奶中分离筛选得到，并于2019年4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保存的菌株编号为GDMCC 60642，已在中国专利CN110607253A中公开。

发酵剂的制备：将嗜热链球菌DMST-H2、德氏乳杆菌DMLD-H1和长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌粉混合，使其活菌数的比例为3:3:10。发酵乳的制备：取德亚全脂牛奶于50℃预热，加入8.5％白砂糖，搅拌溶解，巴氏杀菌(65℃，0.5h)，冷却至42℃，接种发酵剂(发酵剂总活菌数为2×10⁷CFU/mL)，43℃发酵至pH＝4.4～4.5，4℃后熟12h。

pH的测定：取适量的发酵乳样品于烧杯中，pH计校准后，测定发酵乳样品的pH，待读数稳定后，记录读数。

酸度的测定：准确称取约10.0的发酵乳样品，记录样品质量m，添加20mL煮沸后冷却的蒸馏水，加入0.5mL的10％酚酞试剂，混匀，用NaOH标准溶液(0.1mol/L，用邻苯二甲酸氢钾溶液标定)滴定至发酵乳变粉红色，且30s内不褪色。此时记录消耗的NaOH标准溶液的体积V，重复平行实验三次，酸度(°T)＝(c(NaOH)×V×100)/(m×0.1)。

持水力的测定：取适量样品，记为m₁，进行3500r/min离心10min处理，分离出乳清，称量剩余物质的质量，记为m₂。持水力(％)＝m₂/m₁×100％。

乳酸菌活菌数的测定：采用稀释平板计数法计算发酵乳样品中的乳酸菌活菌数，每组样品设3个平行试验组。

发酵乳流变学特性的测定：

(a)表观黏度

将完成后熟的发酵乳顺时针搅拌5次，再逆时针搅拌5次，使用旋转流变仪测定其表观黏度，使用40mm锥板，间隙为1mm，控制温度恒定在(25±1)℃，剪切速率范围为0.01～200rad/s，以对数取点的方式采集数据。得到剪切速率-表观黏度曲线。

(b)频率扫描

控制温度恒定在(25±1)℃，设置应变振幅为1％(线性黏弹区内)，在0.1～100Hz下进行频率扫描，确定发酵乳的黏弹特性。

5.1发酵曲线的测定

在发酵过程中，取不同发酵时间的样品测定pH和酸度(°T)。如图15所示，在发酵过程中pH不断下降，酸度增大，在发酵6.5h时，达到发酵终点。

5.2发酵性能的测定

取完成后熟的发酵乳进行pH、酸度(°T)、持水力、乳酸菌活菌数、流变学特性的测定。并对其进行感官评价。

完成后熟的发酵乳的pH、酸度(°T)、持水力、乳酸菌活菌数的测定结果如表11所示，发酵乳的乳酸菌活菌数较高，且具有较高的持水力，不易乳清析出。流变学特性的测定结果如图16、图17所示，样品的表观黏度均随剪切速率的增加而减小，是一种具有剪切稀化现象的假塑性流体。储能模量(G')和损耗模量(G")是表征产品黏弹性特征的参数，发酵乳蛋白质网络结构良好(所测样品的G'均高于G")，分子流动性较低，产品具有较强的固体特性，该发酵乳较为粘稠。对该发酵乳进行感官评价，其色泽均匀一致，呈乳白色，组织细腻、均匀，具有发酵乳特有的滋味、气味，口感顺滑，奶味醇厚，酸甜可口。

表11发酵乳的pH、酸度、持水力、乳酸菌活菌数的测定结果

B2-01菌株具有良好的肠道黏附能力、抑菌活性、拮抗致病菌黏附能力、抗氧化活性、护肝活性、降血糖活性及降胆固醇活性。本发明菌株或其菌粉可以应用于其他食品的生产制备，提高食品的价值。

Claims

1.长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriulongum subsp.infantis)B2-01菌株，其特征在于，所述菌株于2021年9月1日，在广东省微生物菌种保藏中心保藏，简称GDMCC，保藏编号为GDMCC No:61911。

2.权利要求1所述菌株的应用，其特征在于，长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株在食品、功能性食品、饲料添加剂及药品生产中应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株在制备益生菌发酵乳中的应用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述益生菌发酵乳的制备方法，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述活菌数的比例为3:3:10。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述发酵剂总活菌数为2×10⁷CFU/mL以上；发酵温度为37-45℃。

7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述巴氏杀菌条件：65℃，0.5h，后熟条件：4℃后熟12h。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株在制备抑制肠道致病菌药物、治疗或预防肠道疾病药物中的应用。

9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株在制备功能性食品或解酒护肝药物中的应用。

10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，长双歧杆菌婴儿亚种B2-01菌株在制备降血糖或降胆固醇药物中的应用。