CN113881583A - 菌株安-15、其选育方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种菌株安‑15、其选育方法及其应用。该菌株安‑15，拉丁名Saccharomyces cerevisiae，保藏编号为CCTCC NO：M 2019643。本发明提供的菌株安‑15属于布拉氏酵母菌株，其具有更好的耐酸、耐胆盐、耐人工胃液及人工肠液能力。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种菌株安-15、其选育方法及其应用。
背景技术
布拉氏酵母于20世纪20年代由法国微生物学家Henri Boulard首次发现并分离，后被确认为酿酒酵母的一个亚种，其没有病原性，并具有特殊的生物活性。布拉氏酵母能有效的治疗人和动物的各种腹泻，且未发现不良反应。布拉氏酵母菌进入人和动物肠道后，不仅可以降解致病菌产生的毒素，还能刺激肠道黏膜增强免疫功能，同时调节肠道微生态平衡，阻止病原菌的侵袭。
布拉酵母发挥作用主要环境在人和动物的胃肠环境。在进入胃中要耐受pH2.0～2.5的低pH环境及胃液胃蛋白酶的影响，进入肠道要耐受胆盐及肠液中胰蛋白酶的影响。
公开号为CN104388325A的中国专利中公开了一株饲用布拉氏酵母菌株SH94及其应用，从该专利的布拉氏酵母耐人工胃液实验结果表明，该布拉氏酵母SH94在pH2.0的人工胃液停留2小时后，活菌数有90％，该布拉氏菌株在pH6.8人工肠液停留2小时后活菌数几乎不变。然而，从其实施例看，菌株SH94的耐人工胃液及人工肠液是分别进行的，实际应该连续检测其耐受能力，并针对其连续消化耐受性进行性状改良。且该专利中没有提及菌株SH94的耐人及动物胆盐的能力，仅提及了耐NaCl的能力，此外该菌株在耐酸能力及耐酸时间上也需要进一步提升。
基于上述原因，有必要提供一种耐酸、耐胆盐、耐人工胃液及人工肠液能力更强的布拉氏酵母菌株。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种菌株安-15、其选育方法及其应用，以解决现有技术中布拉氏酵母菌株耐酸、耐胆盐、耐人工胃液及人工肠液能力不足的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种菌株安-15，拉丁名Saccharomyces cerevisiae，保藏编号为CCTCC NO：M 2019643。
根据本发明的另一方面，还提供了上述菌株安-15的选育方法，其包括以下步骤：将布拉氏酵母进行连续进化培养，得到进化培养菌株；对进化培养菌株进行常压室温等离子体(ARTP)诱变选育，得到突变株；依次对突变株进行高通量筛选和多次迭代诱变，得到菌株安-15。
进一步地，布拉氏酵母的保藏编号为CCTCC NO：M 2012116。
进一步地，连续进化培养过程中，将布拉酵母接入pH为2.0～3.0的液体培养基，每16～24h转接一次，连续转接进化培养3～6个月，得到进化培养菌株。
进一步地，按重量份计，液体培养基包括葡萄糖3～8％，蛋白胨0.5～2％，磷酸二氢钾0.1～0.3％，硫酸镁0.05～0.2％，其余为水。
进一步地，等离子体诱变选育过程中，处理温度为20～37℃，处理压力为0.8～1.2KPa；优选地，等离子体诱变选育过程中，诱变功率100～140W，进气量10～12SLM，诱变时间为30～60S。
进一步地，高通量筛选及多次迭代的步骤包括：将突变株置于装有选择性液体培养基的高通量孔板中；恒温摇动培养，18～24小时后，用酶标仪测定600nm下的吸光值OD，比较吸光值OD相对较高的菌株进行多次迭代诱变，得到菌株安-15。
进一步地，多次迭代诱变的迭代次数为4～8次。
根据本发明的另一方面，提供了一种上述菌株安-15在制备食品中的应用。
根据本发明的另一方面，提供了一种上述菌株安-15在制备抗腹泻药物中的应用。
根据本发明的另一方面，提供了一种上述菌株安-15在饲料级酵母中的应用。
本发明提供的菌株安-15属于布拉氏酵母菌株，其具有更好的耐酸、耐胆盐、耐人工胃液及人工肠液能力。
本发明菌株的保藏信息
一种菌株安-15，属于布拉氏酵母菌株，拉丁学名为Saccharomyces cerevisiae，保存于中国武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2019年8月19日，保藏编号为CCTCC NO：M 2019643。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
正如背景技术部分所描述的，现有技术中布拉氏酵母菌株耐酸、耐胆盐、耐人工胃液及人工肠液能力不足。为了解决这一问题，本发明提供了一种菌株安-15，拉丁名Saccharomyces cerevisiae，保藏编号为CCTCC M 2019643。该菌株安-15属于布拉氏酵母菌株，其具有更好的耐酸、耐胆盐、耐人工胃液及人工肠液能力。
根据本发明的另一方面，还提供了上述菌株安-15的选育方法，其包括以下步骤：将布拉氏酵母进行连续进化培养，得到进化培养菌株；对进化培养菌株进行常压室温等离子体(ARTP)诱变选育，得到突变株；依次对突变株进行高通量筛选和多次迭代诱变，得到菌株安-15。多次迭代是指在诱变后筛选好的再次重复进行同样条件的ARTP诱变，如此重复就是多次迭代。高通量筛选是指各突变株在微孔板中培养16-24h后测OD600，优选数值大的菌株。
等离子体诱变选育能够通过丰富的活性粒子(激发态He、O、OH等粒子)穿透细胞壁细胞膜作用到胞内，活性粒子可以对DNA产生明显的破坏作用，DNA受破坏启动SOS修复机制从而产生突变株。本发明先后通过对布拉酵母进行适应性定向进化和等离子体诱变选育，再结合高通量筛选和多次迭代诱变，最终得到了具有更高耐酸、耐胆盐、耐人工胃液及人工肠液能力的菌株安-15。
多次迭代诱变是指经过一次常压室温等离子体诱变后选生长好OD相对高的菌株再重复进行新一次的ARTP诱变，这样重复多次(优选4-8次)即可以。
在一种优选的实施方式中，布拉氏酵母的保藏编号为CCTCC NO：M 2012116(安琪1.27，详见已公开专利CN103374531A)。该布拉氏是来自于安琪菌种库中的一株布拉氏酵母，该菌株通过上述适应性定向进化和常压室温等离子体诱变选育，得到的布拉氏酵母安-15的耐酸性、耐胆盐能力都有较大提高，在人工胃、肠液的持续消化后的存活率也明显提升。
为了进一步提高适应性定向进化效果，以进一步改善最终菌种的性能，在一种优选的实施方式中，上述连续进化培养过程中，将布拉氏酵母接入pH为2.0～3.0的液体培养基(pH2.0～2.5十分接近胃液环境。)，每16～24h转接一次，连续转接进化培养3～6个月，得到进化培养菌株。
更优选地，按重量份计，液体培养基包括葡萄糖3～8％，蛋白胨0.5～2％，磷酸二氢钾0.1～0.3％，硫酸镁0.05～0.2％，其余为水。
在一种优选的实施方式中，等离子体诱变选育过程中，处理温度为20～37℃，处理压力为0.8～1.2KPa；优选地，等离子体诱变选育过程中，诱变功率100～140W，进气量10～12SLM(Standard Liter per Minute)，诱变时间为30～60S。该常压室温等离子体诱变选育条件下更有利于提高最终菌种的性能。
在一种优选的实施方式中，高通量筛选及多次迭代的步骤包括：将突变株置于装有选择培养基的高通量孔板中；恒温振荡培养，18～24小时后，用酶标仪测定600nm下的吸光值OD，比较所述吸光值OD相对较高的菌株进行所述多次迭代诱变，得到所述菌株安-15。
优选地，多次迭代诱变的迭代次数为4～8次。
根据本发明的另一方面，还提供了上述菌株安-15在制备抗腹泻药物中的应用。该菌株安-15属于布拉氏酵母菌株，其具有更好的耐酸、耐胆盐、耐人工胃液及人工肠液能力，因此更适合在制备抗腹泻药物中应用。
根据本发明的另一方面，还提供了上述菌株安-15在饲料酵母中的应用。比如在饲料级反刍专用酵母中的应用。
根据本发明另一方面，还提供了上述菌株安-15在制备食品中的应用。
以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例1
出发菌为安琪菌种库中的一株布拉酵母安琪1.27，将其接入pH2.5的液体培养基连续进化培养，液体培养基包括葡萄糖5％，蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.1％，pH2.5。每24h转接一次，这样连续转接进化培养3个月，再对进化培养后的菌株。
将进化培养菌株进行常压室温等离子体诱变选育，条件如下：功率120W，进气量10SLM,诱变时间30～45秒，得到突变菌。
将突变株置于装有固体发酵培养基的高通量孔板中；向高通量孔板中添加酒精，离心后取上清液，用酶标仪测定600nm下的吸光值OD，比较吸光值OD相对较高的菌株进行4次迭代诱变，得到菌株安-15。
性能评价：
耐酸能力情况：分别将实施例1中选育得到的菌株安-15、出发菌安琪1.27和现有菌株SH94(见已公开专利CN104388325A)在不同pH值37℃摇床培养48小时，平皿活菌计数，各菌株存活率结果见表1：
表1不同pH值下培养各菌株存活率
| pH | 安-15 | 安琪1.27 | 菌株SH94 |
| 1 | 0 | 0 | 0 |
| 2.0 | 0.61％ | 0.54％ | 0.48％ |
| 2.5 | 83.74％ | 41.37％ | 40.52％ |
| 3.0 | 89.97％ | 63.69％ | 63.27％ |
| 自然 | 100.00％ | 100.00％ | 100.00％ |
由此可见，在耐酸性方面，诱变菌株安-15比原菌株均有提高，从数据可以看出，在耐酸pH2.5情况下提高超过20％以上。
耐胆盐能力情况：在不同胆盐中情况，37℃摇床培养48小时，平皿活菌计数，各菌株存活率结果见表2：
表2不同胆盐浓度下培养各菌株存活率
从上面数据看，安-15耐胆盐有提高，提高9％左右。
耐人工胃液能力情况：在人工胃液中，活菌数计数(×106)，结果见表3：
表3人工胃液不同时间处理后各菌株存活率
由此可见，在低pH胃液的情况下，诱变菌株安-15均较出发菌株安1.27和SH94有提高，提高3.5％左右，达到95％以上。
耐人工肠液能力情况：将各菌株经过人工胃液4小时后直接接种到人工肠液中，37℃恒温震荡培养，每2小时取样进行活菌计数，其存活率结果见表4：
表4人工肠液不同时间处理后各菌株存活率
由此可以看出在连续经过4小时胃液和6小时肠液，安-15菌保持很好的耐受性。在胃液4小时还有略微增长(表3中pH2.5条件下的数据可知)，在肠液继续消化6小时活菌数还能达到90％以上，其连续耐受能力很强。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种菌株安-15，拉丁名Saccharomyces cerevisiae，保藏编号为CCTCC NO：M2019643。
2.一种权利要求1所述的菌株安-15的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
将布拉氏酵母进行连续进化培养，得到进化培养菌株；
对所述进化培养菌株进行等离子体诱变选育，得到突变株；
依次对所述突变株进行高通量筛选和多次迭代诱变，得到所述菌株安-15。
3.根据权利要求2所述的选育方法，其特征在于，所述布拉氏酵母的保藏编号为CCTCCNO：M 2012116。
4.根据权利要求2或3所述的选育方法，其特征在于，所述连续进化培养过程中，将所述布拉氏酵母接入pH为2.0～3.0的液体培养基，每16～24h转接一次，连续转接进化培养3～6个月，得到所述进化培养菌株。
5.根据权利要求4所述的选育方法，其特征在于，按重量份计，所述液体培养基包括葡萄糖3～8％，蛋白胨0.5～2％，磷酸二氢钾0.1～0.3％，硫酸镁0.05～0.2％，其余为水。
6.根据权利要求2或3所述的选育方法，其特征在于，所述常压室温等离子体诱变选育过程中，处理温度为20～37℃，处理压力为0.8～1.2KPa；优选地，所述等离子体诱变选育过程中，诱变功率100～140W，进气量10～12SLM，诱变时间为30～60S。
7.根据权利要求2或3所述的选育方法，其特征在于，所述高通量筛选及所述多次迭代的步骤包括：
将所述突变株置于装有选择性液体培养基的高通量孔板中；恒温振荡培养，18～24小时后，用酶标仪测定600nm下的吸光值OD，比较所述吸光值OD相对较高的菌株进行所述多次迭代诱变，得到所述菌株安-15。
8.根据权利要求7所述的选育方法，其特征在于，所述多次迭代诱变的迭代次数为4～8次。
9.一种权利要求1所述的菌株安-15在制备食品中的应用。
10.一种权利要求1所述的菌株安-15在制备抗腹泻药物中的应用。
11.一种权利要求1所述的菌株安-15在饲料酵母中的应用。
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