CN110463508B - 一种人工形成干巴菌菌塘的方法 - Google Patents

Abstract

一种人工形成干巴菌菌塘的方法，通过选取适合的林地和幼松，人工方法开掘菌塘，并在菌塘的土壤中添加高度分散的树脂微粒和干巴菌腐败提取的胺类、酰胺类物质，人工监测养护，促进干巴菌繁殖体对土壤的适应和加快形成真菌与植物共生体系的生长，形成能够使干巴菌营养体正常生长、菌丝活力旺盛的菌塘；此种方法具有操作简单、接种成活概率高、形成共生体系速度快和形成菌塘周期短的优点；利用树脂溶胶与土壤作用形成有机质和矿物质、无机盐分布的面积，提高了松树与干巴菌的信息传递速率，依靠土壤的吸附，催生更多有益于物质循环的林下微生物，增强土壤保水能力，实际加快了林地内物质和能量循环速度。

Description

一种人工形成干巴菌菌塘的方法

技术领域

本发明涉及野生真菌资源利用和野生菌繁殖技术领域，具体涉及一种人工形成干巴菌菌塘的方法。

背景技术

干巴菌,又称绣球菌、马牙菌，是与云南松共生真菌的子实体。近几年来干巴菌促繁技术快速发展，现研究结果表明，干巴菌的营养菌丝体与松树形成共生关系是一个复杂的过程，有很重要和独特的生理生化过程；因共生关系的存在，使得真菌与松树间的物质交换是持续的、稳定的、长时间、高效的模式。最新的研究结果表明，干巴菌相对于松树而言是一种固氮菌，其固氮功能主要通过将铵态氮，硝态氮转为有机胺类供给松树，从单独培养情况看，干巴菌菌丝代谢物的积累会导致其从营养体进入孢子期中止发育进程，且干巴菌具有转化土壤磷元素的生物转化功能，这使得工厂化袋料栽培成为不可能。现有技术中通过幼苗侵染造林、侵染松树幼根虽然可以使得土壤保留真菌繁殖体，将孢子、菌丝保留在土壤中，但形成共生体系的速度缓慢，存在着偶然因素，不可定点形成菌塘，从而不能有效的促进干巴菌繁育。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种人工形成干巴菌菌塘的方法，能够通过人工在土壤中添加高度分散的树脂微粒与干巴菌腐败提取的胺类、酰胺类物质，促进干巴菌繁殖体对土壤的适应和加快形成干巴菌与植物共生体系，形成能够使干巴菌营养体正常生长、菌丝活力旺盛的菌塘；具有操作简单、接种成活概率高、形成共生体系速度快和形成菌塘周期短的特点。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的。

一种人工形成干巴菌菌塘的方法，其具体步骤为：

1)在干巴菌生长季节提前选好适宜菌株，选择没有人畜影响，可以封闭生长至11月份的干巴菌作为种子，并做标记，自然条件下使其在菌塘内自然干燥，然后采集，研碎成粉，过20目筛，干燥冷藏；

2)采集成熟肥厚的干巴菌子实体，去除杂草泥土，撕碎，在溶剂瓶加入撕碎干巴菌，纱布覆盖瓶口，在通风环境下，置于接种箱内，20℃-29℃保温存放10-15天，每两天加一次水，保证整体湿润，待干巴菌菌丝表层腐烂，固液分层，液体颜色由金黄色转为黑色时，往液体中加入与干巴菌质量比为1:1的质量分数50％-95％的乙醇溶液，80℃-90℃温水浴15分钟-30分钟；

3)提取步骤2)所制得的乙醇溶液200ml-400ml过粗滤网，再用细菌膜过滤，将滤液移入玻璃缸中，往玻璃缸中加入500ml-800ml蒸馏水稀释，然后取出400ml-600ml稀释后溶液加入圆底烧瓶加热减压0.2atm-0.5atm蒸馏除去乙醇，得到胺类、酰胺类物质混合物；

4)将松香与无水乙醇按松香质量：无水乙醇质量＝120～180：900～1000提前浸提，得到棕黄色的松香乙醇溶液，过滤去除松香乙醇溶液中的不溶性长链树脂和松针杂草后与无菌水按照1:4的体积比加入到溶剂置换釜中，采用离心喷雾法分散到无菌水中，减压至0.2atm-0.5atm抽提乙醇制成质量分数15％-25％浓缩松香溶胶；

5)按质量分数：首先将1％-5％的木糖、1％-5％的硝酸铵溶于74.5％-92.95％的无菌水中，再加入0.05％-0.5％步骤3)制得的胺类、酰胺类物质混合物，然后将步骤4)所制得的浓缩松香溶胶按5％-15％混入溶解，得到稀释的松香溶胶；

6)将步骤5)制得的稀释的松香溶胶用灌装机分装于1000ml棕色玻璃瓶内，避光储存于19℃-25℃的保藏室备用；

7)选择人工形成菌塘的地点及幼龄松树；

8)在选好的幼松树下，以树桩为中心开设深度为4cm-15cm，宽度为1cm-3cm，长度为10cm-30cm的放射状沟槽4-6条；

9)在11月干燥9-14天的情况下，测定土壤水分，当表层土壤水分低于15％，菌种播种土层土壤水分低于15％-25％的环境条件下，在开设好的每条沟槽内，用毛刷清理沟槽，使表层土疏松，松树幼根暴露，然后分别均匀注入1000ml-3000ml步骤6)制得的溶胶，然后将5-10g步骤1)制得的干巴菌粉均匀撒入沟槽内，以松针覆盖，不可覆盖土壤；

10)在步骤9)完成5天后，测定槽内土壤水分及透光情况，当测得槽内土壤水分湿度低于25％-30％时，使用喷雾器增加覆盖层湿度，增加湿度至60％-70％，通过增加覆盖松针或减少覆盖松针促使槽内保持光照强度在0-15lux；至14-16天若没有菌苔出现，适当揭开松针通风，使土壤水分保持在30％-45％；若因水分含量低于25％-30％而没有形成菌苔，即需进行干巴菌补种：在该条槽内均匀注入1000ml-3000ml步骤6)所得的溶胶，并将步骤1)所得的干巴菌菌粉5g-10g，用步骤6)所得的溶胶按水分含量10％-15％润湿后，在17℃-24℃避光培养箱内培养12小时-24小时，取出后均匀撒入沟槽内，以松针覆盖；待白色苔状干巴菌菌落在槽内形成直径2mm-7mm菌苔，则停止喷雾器增湿管理，使其上层营养体随自然气候进入休眠，形成孢子繁殖体；14-16天后，仍无干巴菌苔出现，则需再次进行干巴菌补种：再次揭开松针通风，然后在该条槽内均匀注入1000ml-3000ml步骤6)所得的溶胶，并将步骤1)所得的干巴菌菌粉5g-10g，用步骤6)所得的溶胶按水分含量10％-15％润湿后，在17℃-24℃培养箱内避光培养12小时-24小时，取出后均匀撒入沟槽内，以松针覆盖；

11)4月松树开始生长，在距沟槽表面深度1cm-2cm厘米内开始新生松树根系，激活休眠播种干巴菌所形成的孢子，并逐渐形成稳定共生体系；于降雨后或人工喷洒水使得土壤湿度达到60％-85％，再次施加步骤6)制得的溶胶500ml-3000ml，使松树根系生长，进行自然条件下的松树根系被干巴菌菌丝侵染的过程；

12)步骤1)至步骤11)形成的槽内第一年即可有小和散的干巴菌出现，但不会长大和形成固定生长点，第二年才会形成多个散布生长点，形成菌塘；在第三年将该沟槽扩大为直径为10-20cm塘穴，测定并保持光照强度在0.5lux-100000lux日夜光照强度变化刺激20-30天，发育形成子实体。

所述步骤3)中的胺类物质为三-(二甲胺基甲基)苯酚。

所述步骤3)中的酰胺类物质为：9-18碳烯酰胺和对羟基苯甲酰胺。

所述步骤7)中的人工形成菌塘的地点及幼龄松树的条件为：杂木树种5-20株/100m²的松林，树龄4-8年幼松，腐殖质厚度不超过5-8cm，土壤PH值5.0-6.0。

所述步骤9)至步骤10)中的测定土壤水分的方法为：通过HWS-430型土壤水分测定仪测定土壤水分。

所述步骤10)中透光情况使用型号TES-1330A便携式光亮度计测试。

本发明利用树脂溶胶与土壤作用形成有机质和矿物质、无机盐分布的面积，依靠土壤的吸附，树脂可催生更多有益于物质循环的林下微生物，增强土壤保水能力，溶胶进入土壤后水分挥发，树脂的化学特性保持，结合胺类及酰胺类物质从干巴菌生长的外界环境中建立干巴菌与松树共生关系，能够高效的获得活力旺盛，侵染力强的初级菌落，实际加快了林地内物质和能量循环速度，提高了干巴菌与树脂的接触面积和真菌酶系的催化速率以及松树与干巴菌的信息传递速率，具有操作简单、接种成活概率高、形成共生体系速度快和与自然孢子传播形成菌塘相比形成菌塘周期短的优点，对干巴菌资源的开发利用和其他共生菌的研究有一定的意义。

附图说明

图1为本发明所形成菌塘情况效果图。

图2为本发明步骤4)所制得浓缩松香溶胶实物图。

图3为本发明步骤5)添加胺类、酰胺类物质的稀释的松香溶胶实物图。

图4为本发明干巴菌与松树根形成共生体系效果图，其中图(a)为实物效果图，图(b)为显微镜下效果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步说明。

一种人工形成干巴菌菌塘的方法，其具体步骤为：

1)在干巴菌生长季节提前选好适宜菌株，选择没有人畜影响，可以封闭生长至11月份的干巴菌作为种子，并做标记，自然条件下使其在菌塘内自然干燥，然后采集，研碎成粉，过20目筛，干燥冷藏；

2)采集成熟肥厚的干巴菌子实体，去除杂草泥土，撕碎，在溶剂瓶加入撕碎干巴菌，纱布覆盖瓶口，在通风环境下，置于接种箱内，20℃-29℃保温存放10-15天，每两天加一次水，保证整体湿润，待干巴菌菌丝表层腐烂，固液分层，液体颜色由金黄色转为黑色时，往液体中加入与干巴菌质量比为1:1的质量分数50％-95％的乙醇溶液，80℃-90℃温水浴15分钟-30分钟；

3)提取步骤2)所制得的乙醇溶液200ml-400ml过粗滤网，再用细菌膜过滤，将滤液移入玻璃缸中，往玻璃缸中加入500ml-800ml蒸馏水稀释，然后取出400ml-600ml稀释后溶液加入圆底烧瓶加热减压0.2atm-0.5atm蒸馏除去乙醇，得到胺类、酰胺类物质混合物；

4)将松香与无水乙醇按松香质量：无水乙醇质量＝120～180：900～1000提前浸提，得到棕黄色的松香乙醇溶液，过滤去除松香乙醇溶液中的不溶性长链树脂和松针杂草后与无菌水按照1:4的体积比加入到溶剂置换釜中，采用离心喷雾法分散到无菌水中，减压至0.2atm-0.5atm抽提乙醇制成质量分数15％-25％浓缩松香溶胶；

5)按质量分数：首先将1％-5％的木糖、1％-5％的硝酸铵溶于74.5％-92.95％的无菌水中，再加入0.05％-0.5％步骤3)制得的胺类、酰胺类物质混合物，然后将步骤4)所制得的浓缩松香溶胶按5％-15％混入溶解，得到稀释的松香溶胶；

6)将步骤5)制得的稀释的松香溶胶用灌装机分装于1000ml棕色玻璃瓶内，避光储存于19℃-25℃的保藏室备用；

7)选择人工形成菌塘的地点及幼龄松树；

8)在选好的幼松树下，以树桩为中心开设深度为4cm-15cm，宽度为1cm-3cm，长度为10cm-30cm的放射状沟槽4-6条；

9)在11月干燥9-14天的情况下，测定土壤水分，当表层土壤水分低于15％，菌种播种土层土壤水分低于15％-25％的环境条件下，在开设好的每条沟槽内，用毛刷清理沟槽，使表层土疏松，松树幼根暴露，然后分别均匀注入1000ml-3000ml步骤6)制得的溶胶，然后将5-10g步骤1)制得的干巴菌粉均匀撒入沟槽内，以松针覆盖，不可覆盖土壤；

10)在步骤9)完成5天后，测定槽内土壤水分及透光情况，当测得槽内土壤水分湿度低于25％-30％时，使用喷雾器增加覆盖层湿度，增加湿度至60％-70％，通过增加覆盖松针或减少覆盖松针促使槽内保持光照强度在0-15lux；至14-16天若没有菌苔出现，适当揭开松针通风，使土壤水分保持在30％-45％；若因水分含量低于25％-30％而没有形成菌苔，即需进行干巴菌补种：在该条槽内均匀注入1000ml-3000ml步骤6)所得的溶胶，并将步骤1)所得的干巴菌菌粉5g-10g，用步骤6)所得的溶胶按水分含量10％-15％润湿后，在17℃-24℃避光培养箱内培养12小时-24小时，取出后均匀撒入沟槽内，以松针覆盖；待白色苔状干巴菌菌落在槽内形成直径2mm-7mm菌苔，则停止喷雾器增湿管理，使其上层营养体随自然气候进入休眠，形成孢子繁殖体；14-16天后，仍无干巴菌苔出现，则需再次进行干巴菌补种：再次揭开松针通风，然后在该条槽内均匀注入1000ml-3000ml步骤6)所得的溶胶，并将步骤1)所得的干巴菌菌粉5g-10g，用步骤6)所得的溶胶按水分含量10％-15％润湿后，在17℃-24℃培养箱内避光培养12小时-24小时，取出后均匀撒入沟槽内，以松针覆盖；

11)4月松树开始生长，在距沟槽表面深度1cm-2cm厘米内开始新生松树根系，激活休眠播种干巴菌所形成的孢子，并逐渐形成稳定共生体系；于降雨后或人工喷洒水使得土壤湿度达到60％-85％，再次施加步骤6)制得的溶胶500ml-3000ml，使松树根系生长，进行自然条件下的松树根系被干巴菌菌丝侵染的过程；

12)步骤1)至步骤11)形成的槽内第一年即可有小和散的干巴菌出现，但不会长大和形成固定生长点，第二年才会形成多个散布生长点，形成菌塘；在第三年将该沟槽扩大为直径为10-20cm塘穴，测定并保持光照强度在0.5lux-100000lux日夜光照强度变化刺激20-30天，发育形成子实体。

所述步骤3)中的胺类物质为三-(二甲胺基甲基)苯酚。

所述步骤3)中的酰胺类物质为9-18碳烯酰胺和对羟基苯甲酰胺。

所述步骤1)至步骤6)中的溶胶制备数量，根据实际使用情况制取。

所述步骤7)中的人工形成菌塘的地点及幼龄松树的条件为：杂木树种5-20株/100m²的松林，树龄4-8年幼松，腐殖质厚度不超过5-8cm，土壤PH值5.0-6.0。

所述步骤9)至步骤10)中的测定土壤水分的方法为：通过HWS-430型土壤水分测定仪测定土壤水分。

所述步骤10)中透光情况使用型号TES-1330A便携式光亮度计测试。

实施例1：

一种人工形成干巴菌菌塘的方法，其具体步骤为：

1)在干巴菌生长季节提前选好适宜菌株，选择没有人畜影响，可以封闭生长至11月份的干巴菌作为种子，并做标记，自然条件下使其在菌塘内自然干燥，然后采集，研碎成粉，过20目筛，干燥冷藏；

2)采集成熟肥厚的干巴菌子实体，去除杂草泥土，撕碎，在溶剂瓶加入撕碎的干巴菌，纱布覆盖瓶口，在通风环境下，置于接种箱内，20℃保温存放15天，每两天加一次水，保证整体湿润，待干巴菌菌丝表层腐烂，固液分层；液体颜色由金黄色转为黑色时，往液体中加入与干巴菌质量比为1:1的质量分数50％的乙醇溶液，90℃温水浴30分钟；

3)提取步骤2)所制得的乙醇溶液400ml过粗滤网，再用细菌膜过滤，将滤液移入玻璃缸中，往玻璃缸中加入500ml蒸馏水稀释，然后取出600ml稀释后溶液加入圆底烧瓶，加热减压0.2atm蒸馏除去乙醇，得到三-(二甲胺基甲基)苯酚、9-18碳烯酰胺和对羟基苯甲酰胺混合物；

4)将松香与无水乙醇按松香质量：无水乙醇质量＝120：900提前浸提，得到棕黄色的松香乙醇溶液，过滤去除松香乙醇溶液中的不溶性长链树脂和松针杂草后与无菌水按照1:4的体积比加入到溶剂置换釜中，采用离心喷雾法分散到无菌水中，减压至0.2atm抽提乙醇，制成质量分数21％浓缩松香溶胶；

5)按质量分数：首先将1％的木糖、1％的硝酸铵溶于92.95％的无菌水中，再加入0.05％的步骤3)制得的三-(二甲胺基甲基)苯酚、9-18碳烯酰胺和对羟基苯甲酰胺混合物，最后将步骤4)所制得的浓缩松香溶胶按5％混入溶解，得到稀释的松香溶胶；

6)将步骤5)制得的稀释的松香溶胶用灌装机分装于1000ml棕色玻璃瓶内，避光储存于19℃的保藏室备用；

7)选择杂木树种5-20株/100m²的松林，树龄4年幼松，腐殖质厚度不超过5cm，土壤PH值5.0，作为人工形成菌塘的地点；

8)在选好幼松树下以树桩为中心开设深度为4cm，宽度为3cm，长度为30cm的放射状沟槽4条；

9)在11月干燥9天的情况下，测定土壤水分，当表层土壤水分低于15％，菌种播种土层土壤水分低于15％的环境条件下，在开设好的每条沟槽内，用毛刷清理沟槽，使表层土疏松，松树幼根暴露，然后分别均匀注入3000ml步骤6)制得的溶胶，将5g步骤1)制得的干巴菌粉均匀撒入沟槽内，以松针覆盖，不可覆盖土壤；

10)在步骤9)完成5天后，测定播种槽内水分情况及透光情况；当测得槽内土壤水分低于25％时，使用喷雾器增加覆盖层湿度至70％，通过增加覆盖松针或减少覆盖松针促使槽内保持光照强度在0lux；至14天若没有菌苔出现，适当揭开松针通风，使土壤水分保持在30％；若因水分含量低于25％而没有形成菌苔，即需进行干巴菌补种：在该条槽内均匀注入1000ml步骤6)制得的溶胶，并将步骤1)所得的干巴菌菌粉10g，用步骤6)所制得的溶胶按水分含量10％润湿后，17℃避光培养箱内培养12小时，均匀撒入沟槽内，以松针覆盖；待白色苔状干巴菌菌落在槽内形成直径2mm菌苔，则停止喷雾器增湿管理，使其上层营养体随自然气候进入休眠，形成孢子繁殖体；14天后，仍无干巴菌苔出现，则需再次进行干巴菌补种：再次揭开松针通风，然后在该条槽内均匀注入1000ml步骤6)制得的溶胶，并将步骤1)所得的干巴菌菌粉10g，用步骤6)所制得的溶胶按水分含量10％润湿后，在24℃避光培养箱内培养12小时，取出后均匀撒入沟槽内，以松针覆盖，即可补救因干燥造成的接种失败造成的损失；

11)4月松树开始生长，在距沟槽表面深度1cm-2cm厘米内开始新生松树根系，激活休眠播种干巴菌所形成的孢子，并逐渐形成稳定共生体系；于降雨后或人工喷洒水，使得土壤湿度达到60％，再次施加步骤6)制得的溶胶500ml，使松树根系生长，进行自然条件下的松树根系干巴菌菌丝侵染；

12)步骤1)至步骤11)形成的槽内第一年即可有小和散的干巴菌出现，但不会长大和形成固定生长点，经过一年后才会形成多个散布生长点，形成菌塘；在第三年将该沟槽扩大为直径为10塘穴，测定并保持光照强度在0.5lux-100000lux日夜光照强度变化刺激20天，发育形成子实体。

实施例2

一种人工形成干巴菌菌塘的方法，其具体步骤为：

1)在干巴菌生长季节提前选好适宜菌株，选择没有人畜影响，可以封闭生长至11月份的干巴菌作为种子，并做标记，自然条件下使其在菌塘内自然干燥，然后采集，研碎成粉，过20目筛，干燥冷藏；

2)采集成熟肥厚的干巴菌子实体，去除杂草泥土，撕碎，在溶剂瓶加入撕碎干巴菌，纱布覆盖瓶口，在通风环境下，置于接种箱内，29℃保温存放10天，每两天加一次水，保证整体湿润，待干巴菌菌丝表层腐烂，固液分层，液体颜色由金黄色转为黑色时，往液体中加入与干巴菌质量比为1:1的质量分数95％的乙醇溶液，80℃温水浴15分钟；

3)提取步骤2)所制得的乙醇溶液200ml过粗滤网，再用细菌膜过滤，将滤液移入玻璃缸中，往玻璃缸中加入800ml蒸馏水稀释，然后取出400ml稀释后溶液加入圆底烧瓶加热减压0.3atm蒸馏除去乙醇，得到三-(二甲胺基甲基)苯酚、9-18碳烯酰胺和对羟基苯甲酰胺混合物；

4)将松香与无水乙醇按松香质量：无水乙醇质量＝180：1000提前浸提，得到棕黄色的松香乙醇溶液，过滤去除松香乙醇溶液中的不溶性长链树脂和松针杂草后与无菌水按照1:4的体积比加入到溶剂置换釜中，采用离心喷雾法分散到无菌水中，减压至0.3atm抽提乙醇，制成质量分数23％浓缩松香溶胶；

5)按质量分数：首先将5％的木糖、5％的硝酸铵溶于74.5％的无菌水中，再加入0.5％步骤3)制得的三-(二甲胺基甲基)苯酚、9-18碳烯酰胺和对羟基苯甲酰胺混合物，最后将步骤4)所制得的浓缩松香溶胶按15％混入溶解，得到稀释的松香溶胶；

6)将步骤5)制得的稀释的松香溶胶用灌装机分装于1000ml棕色玻璃瓶内，避光储存于25℃的保藏室备用；

7)选择杂木树种5-20株/100m²的松林，树龄7年幼松，腐殖质厚度不超过8cm，土壤PH值5.5，作为人工形成菌塘的地点；

8)在选好幼松树下以树桩为中心开设深度为15cm，宽度为1cm，长度为10cm的放射状沟槽8条；

9)在11月干燥14天的情况下，测定土壤水分，当表层土壤水分低于15％，菌种播种土层土壤水分低于25％的环境条件下，在开设好的每条沟槽内，用毛刷清理沟槽，使表层土疏松，松树幼根暴露，然后分别均匀注入1000ml步骤6)所得的溶胶，然后将10g步骤1)制得的干巴菌粉均匀撒入沟槽内，以松针覆盖，不可覆盖土壤；

10)在步骤9)完成5天后，测定播种槽内水分及透光情况；当测得槽内土壤水分低于30％时，使用喷雾器增加覆盖层湿度至70％，测定并通过增加覆盖松针或减少覆盖松针促使槽内保持光照强度在15lux；至16天若没有菌苔出现，适当揭开松针通风，使土壤水分保持在45％；若因水分含量低于30％而没有形成菌苔，即需进行干巴菌补种：在该条槽内均匀注入1000ml步骤6)所得的溶胶，并将步骤1)所得的干巴菌菌粉5g，用步骤6)所得的溶胶按水分含量15％润湿后，24℃避光培养箱内培养24小时，均匀撒入沟槽内，以松针覆盖；待白色苔状干巴菌菌落在槽内形成直径7mm菌苔，则停止喷雾器增湿管理，使其上层营养体随自然气候进入休眠，形成孢子繁殖体；16天后，仍无干巴菌苔出现，则需再次进行干巴菌补种：再次揭开松针通风，然后在该条槽内均匀注入1000ml步骤6)所得的溶胶，并将步骤1)所得的干巴菌菌粉6g，用步骤6)所制得的溶胶按水分含量10％润湿后，在17℃避光培养箱内培养24小时，取出后均匀撒入沟槽内，以松针覆盖，即可补救因干燥造成的接种失败造成的损失；

11)4月松树开始生长，在距沟槽表面深度1cm-2cm厘米内开始新生松树根系，激活休眠播种干巴菌所形成的孢子，并逐渐形成稳定共生体系；于降雨后或人工喷洒水，使得土壤湿度达到75％，再次施加步骤6)所得的溶胶3000ml，使松树根系生长，进行自然条件下的松树根系干巴菌菌丝侵染；

12)步骤1)至步骤11)形成的槽内第一年即可有小和散的干巴菌出现，但不会长大和形成固定生长点，经过一年后才会形成多个散布生长点，形成菌塘；在第三年将该沟槽扩大为直径为20cm塘穴，测定并保持光照强度在0.5lux-100000lux日夜光照强度变化刺激25天，发育形成子实体。

实施例3

一种人工形成干巴菌菌塘的方法，其具体步骤为：

1)在干巴菌生长季节提前选好适宜菌株，选择没有人畜影响，可以封闭生长至11月份的干巴菌作为种子，并做标记，自然条件下使其在菌塘内自然干燥，然后采集，研碎成粉，过20目筛，干燥冷藏；

2)采集成熟肥厚的干巴菌子实体，去除杂草泥土，撕碎，在溶剂瓶加入撕碎干巴菌，纱布覆盖瓶口，在通风环境下，置于接种箱内，24℃保温存放7天，每两天加一次水，保证整体湿润，待干巴菌菌丝表层腐烂，固液分层，液体颜色由金黄色转为黑色时，往液体中加入与干巴菌质量比为1:1的质量分数75％的乙醇溶液，85℃温水浴24分钟；

3)提取步骤2)所制得的乙醇溶液300ml过粗滤网，再用细菌膜过滤，将滤液移入玻璃缸中，往玻璃缸中加入700ml蒸馏水稀释，然后取出500ml稀释后溶液加入圆底烧瓶加热减压0.5atm蒸馏除去乙醇，得到三-(二甲胺基甲基)苯酚、9-18碳烯酰胺和对羟基苯甲酰胺混合物；

4)将松香与无水乙醇按松香质量：无水乙醇质量＝150：1000提前浸提，得到棕黄色的松香乙醇溶液，过滤去除松香乙醇溶液中的不溶性长链树脂和松针杂草后与无菌水按照1:4的体积比加入到溶剂置换釜中，采用离心喷雾法分散到无菌水中，减压至0.5atm抽提乙醇，制成质量分数23％浓缩松香溶胶；

5)按质量分数：首先将3％的木糖、3％的硝酸铵溶于83.75％的无菌水中，再加入0.25％的步骤3)制得的三-(二甲胺基甲基)苯酚、9-18碳烯酰胺和对羟基苯甲酰胺混合物，最后将步骤4)所制得的浓缩松香溶胶按10％混入溶解，得到稀释的松香溶胶；

6)将步骤5)制得的稀释的松香溶胶用灌装机分装于1000ml棕色玻璃瓶内，避光储存于22℃的保藏室备用；

7)选择杂木树种5-20株/100m²的松林，树龄8年幼松，腐殖质厚度不超过8cm，土壤PH值6.0，作为人工形成菌塘的地点；

8)在选好幼松树下以树桩为中心开设深度为9cm，宽度为2cm，长度为20cm的放射状沟槽4-6条；

9)在11月干燥11天的情况下，测定土壤水分，当表层土壤水分低于15％，菌种播种土层土壤水分低于20％的环境条件下，在开设好的每条沟槽内，用毛刷清理沟槽，使表层土疏松，松树幼根暴露，然后分别均匀注入2000ml步骤6)所得的溶胶，将8g步骤1)所制得的干巴菌粉均匀撒入沟槽内，以松针覆盖，不可覆盖土壤；

10)在步骤9)完成5天后，测定播种槽内水分及透光情况；当测得槽内土壤水分低于27％时，使用喷雾器增加覆盖层湿度，增加至70％；测定并通过增加覆盖松针或减少覆盖松针促使槽内保持光照强度在5lux；至15天若没有菌苔出现，适当揭开松针通风，使土壤水分保持在38％；若因水分含量低于27％而没有形成菌苔，即需进行干巴菌补种：在该条槽内均匀注入2000ml步骤6)所得的溶胶，并将步骤1)所得的干巴菌菌粉8g，用步骤6)所得的溶胶按水分含量13％润湿后，20℃避光培养箱内培养17小时，均匀撒入沟槽内，以松针覆盖；待白色苔状干巴菌菌落在槽内形成直径5mm菌苔，则停止喷雾器增湿管理，使其上层营养体随自然气候进入休眠，形成孢子繁殖体；15天后，仍无干巴菌苔出现，则需再次进行干巴菌补种：再次揭开松针通风，然后在该条槽内均匀注入1000ml步骤6)所得的溶胶，并将步骤1)所得的干巴菌菌粉8g，用步骤6)所得的溶胶按水分含量13％润湿后，在20℃避光培养箱内培养17小时，取出后均匀撒入沟槽内，以松针覆盖，即可补救因干燥造成的接种失败造成的损失；

11)4月松树开始生长，在距沟槽表面深度1cm-2cm内开始新生松树根系，激活休眠播种干巴菌所形成的孢子，并逐渐形成稳定共生体系；于降雨后或人工喷洒水使得土壤湿度达到85％再次施加步骤6)所得的溶胶2000ml，使松树根系生长，进行自然条件下的松树根系干巴菌菌丝侵染；

12)步骤1)至步骤11)形成的槽内第一年即可有小和散的干巴菌出现，但不会长大和形成固定生长点，经过一年后才会形成多个散布生长点，形成菌塘；在第三年将该沟槽扩大为直径为15cm塘穴，测定并保持光照强度在0.5lux-100000lux日夜光照强度变化刺激30天，发育形成子实体。

Claims (9)

1.一种人工形成干巴菌菌塘的方法，其特征在于：包括以下具体步骤：

1)在干巴菌生长季节提前选好适宜菌株，选择没有人畜影响，可以封闭生长至11月份的干巴菌作为种子，并做标记，自然条件下使其在菌塘内自然干燥，然后采集，研碎成粉，过20目筛，干燥冷藏；

2)采集成熟肥厚的干巴菌子实体，去除杂草泥土，撕碎，在溶剂瓶加入撕碎干巴菌，纱布覆盖瓶口，在通风环境下，置于接种箱内，20℃-29℃保温存放10-15天，每两天加一次水，保证整体湿润，待干巴菌菌丝表层腐烂，固液分层，液体颜色由金黄色转为黑色时，往液体中加入与干巴菌质量比为1:1的质量分数50％-95％的乙醇溶液，80℃-90℃温水浴15分钟-30分钟；

3)提取步骤2)所制得的乙醇溶液200ml-400ml过粗滤网，再用细菌膜过滤，将滤液移入玻璃缸中，往玻璃缸中加入500ml-800ml蒸馏水稀释，然后取出400ml-600ml稀释后溶液加入圆底烧瓶加热减压0.2atm-0.5atm蒸馏除去乙醇，得到胺类、酰胺类物质混合物；

4)将松香与无水乙醇按松香质量：无水乙醇质量＝120～180：900～1000提前浸提，得到棕黄色的松香乙醇溶液，过滤去除松香乙醇溶液中的不溶性长链树脂和松针杂草后与无菌水按照1:4的体积比加入到溶剂置换釜中，采用离心喷雾法分散到无菌水中，减压至0.2atm-0.5atm抽提乙醇制成质量分数15％-25％浓缩松香溶胶；

5)按质量分数：首先将1％-5％的木糖、1％-5％的硝酸铵溶于74.5％-92.95％的无菌水中，再加入0.05％-0.5％步骤3)制得的胺类、酰胺类物质混合物，然后将步骤4)所制得的浓缩松香溶胶按5％-15％混入溶解，得到稀释的松香溶胶；

6)将步骤5)制得的稀释的松香溶胶用灌装机分装于1000ml棕色玻璃瓶内，避光储存于19℃-25℃的保藏室备用；

7)选择人工形成菌塘的地点及幼龄松树；

8)在选好的幼松树下，以树桩为中心开设深度为4cm-15cm，宽度为1cm-3cm，长度为10cm-30cm的放射状沟槽4-6条；

9)在11月干燥9-14天的情况下，测定土壤水分，当表层土壤水分低于15％，菌种播种土层土壤水分低于15％-25％的环境条件下，在开设好的每条沟槽内，用毛刷清理沟槽，使表层土疏松，松树幼根暴露，然后分别均匀注入1000ml-3000ml步骤6)制得的溶胶，然后将5-10g步骤1)制得的干巴菌粉均匀撒入沟槽内，以松针覆盖，不可覆盖土壤；

10)在步骤9)完成5天后，测定槽内土壤水分及透光情况，当测得槽内土壤水分湿度低于25％-30％时，使用喷雾器增加覆盖层湿度，增加湿度至60％-70％，通过增加覆盖松针或减少覆盖松针促使槽内保持光照强度在0-15lux；至14-16天若没有菌苔出现，适当揭开松针通风，使土壤水分保持在30％-45％；若因水分含量低于25％-30％而没有形成菌苔，即需进行干巴菌补种：在该条槽内均匀注入1000ml-3000ml步骤6)所得的溶胶，并将步骤1)所得的干巴菌菌粉5g-10g，用步骤6)所得的溶胶按水分含量10％-15％润湿后，在17℃-24℃避光培养箱内培养12小时-24小时，取出后均匀撒入沟槽内，以松针覆盖；待白色苔状干巴菌菌落在槽内形成直径2mm-7mm菌苔，则停止喷雾器增湿管理，使其上层营养体随自然气候进入休眠，形成孢子繁殖体；14-16天后，仍无干巴菌苔出现，则需再次进行干巴菌补种：再次揭开松针通风，然后在该条槽内均匀注入1000ml-3000ml步骤6)所得的溶胶，并将步骤1)所得的干巴菌菌粉5g-10g，用步骤6)所得的溶胶按水分含量10％-15％润湿后，在17℃-24℃培养箱内避光培养12小时-24小时，取出后均匀撒入沟槽内，以松针覆盖；

11)4月松树开始生长，在距沟槽表面深度1cm-2cm厘米内开始新生松树根系，激活休眠播种干巴菌所形成的孢子，并逐渐形成稳定共生体系；于降雨后或人工喷洒水使得土壤湿度达到60％-85％，再次施加步骤6)制得的溶胶500ml-3000ml，使松树根系生长，进行自然条件下的松树根系被干巴菌菌丝侵染的过程；

12)步骤1)至步骤11)形成的槽内第一年即可有小和散的干巴菌出现，但不会长大和形成固定生长点，第二年才会形成多个散布生长点，形成菌塘；在第三年将该沟槽扩大为直径为10-20cm塘穴，测定并保持光照强度在0.5lux-100000lux日夜光照强度变化刺激20-30天，发育形成子实体。

2.根据权利要求1所述的一种人工形成干巴菌菌塘的方法，其特征在于：所述步骤3)中的胺类物质为：三-(二甲胺基甲基)苯酚。

3.根据权利要求1所述的一种人工形成干巴菌菌塘的方法，其特征在于：所述步骤3)中的酰胺类物质为：9-18碳烯酰胺和对羟基苯甲酰胺。

4.根据权利要求1所述的一种人工形成干巴菌菌塘的方法，其特征在于：所述步骤7)中的人工形成菌塘的地点及幼龄松树的条件为：杂木树种5-20株/100m²的松林，树龄4-8年幼松，腐殖质厚度不超过5-8cm，土壤PH值5.0-6.0。

5.根据权利要求1所述的一种人工形成干巴菌菌塘的方法，其特征在于：所述步骤9)至步骤10)中的测定土壤水分的方法为：通过HWS-430型土壤水分测定仪测定土壤水分。

6.根据权利要求1所述的一种人工形成干巴菌菌塘的方法，其特征在于：所述步骤10)中透光情况使用型号TES-1330A便携式光亮度计测试。

7.一种人工形成干巴菌菌塘的方法，其特征在于：包括以下具体步骤：

1)在干巴菌生长季节提前选好适宜菌株，选择没有人畜影响，可以封闭生长至11月份的干巴菌作为种子，并做标记，自然条件下使其在菌塘内自然干燥，然后采集，研碎成粉，过20目筛，干燥冷藏；

2)采集成熟肥厚的干巴菌子实体，去除杂草泥土，撕碎，在溶剂瓶加入撕碎的干巴菌，纱布覆盖瓶口，在通风环境下，置于接种箱内，20℃保温存放15天，每两天加一次水，保证整体湿润，待干巴菌菌丝表层腐烂，固液分层；液体颜色由金黄色转为黑色时，往液体中加入与干巴菌质量比为1:1的质量分数50％的乙醇溶液，90℃温水浴30分钟；

3)提取步骤2)所制得的乙醇溶液400ml过粗滤网，再用细菌膜过滤，将滤液移入玻璃缸中，往玻璃缸中加入500ml蒸馏水稀释，然后取出600ml稀释后溶液加入圆底烧瓶，加热减压0.2atm蒸馏除去乙醇，得到三-(二甲胺基甲基)苯酚、9-18碳烯酰胺和对羟基苯甲酰胺混合物；

4)将松香与无水乙醇按松香质量：无水乙醇质量＝120：900提前浸提，得到棕黄色的松香乙醇溶液，过滤去除松香乙醇溶液中的不溶性长链树脂和松针杂草后与无菌水按照1:4的体积比加入到溶剂置换釜中，采用离心喷雾法分散到无菌水中，减压至0.2atm抽提乙醇，制成质量分数21％浓缩松香溶胶；

5)按质量分数：首先将1％的木糖、1％的硝酸铵溶于92.95％的无菌水中，再加入0.05％的步骤3)制得的三-(二甲胺基甲基)苯酚、9-18碳烯酰胺和对羟基苯甲酰胺混合物，最后将步骤4)所制得的浓缩松香溶胶按5％混入溶解，得到稀释的松香溶胶；

6)将步骤5)制得的稀释的松香溶胶用灌装机分装于1000ml棕色玻璃瓶内，避光储存于19℃的保藏室备用；

7)选择杂木树种5-20株/100m²的松林，树龄4年幼松，腐殖质厚度不超过5cm，土壤PH值5.0，作为人工形成菌塘的地点；

8)在选好幼松树下以树桩为中心开设深度为4cm，宽度为3cm，长度为30cm的放射状沟槽4条；

9)在11月干燥9天的情况下，测定土壤水分，当表层土壤水分低于15％，菌种播种土层土壤水分低于15％的环境条件下，在开设好的每条沟槽内，用毛刷清理沟槽，使表层土疏松，松树幼根暴露，然后分别均匀注入3000ml步骤6)制得的溶胶，将5g步骤1)制得的干巴菌粉均匀撒入沟槽内，以松针覆盖，不可覆盖土壤；

10)在步骤9)完成5天后，测定播种槽内水分情况及透光情况；当测得槽内土壤水分低于25％时，使用喷雾器增加覆盖层湿度至70％，通过增加覆盖松针或减少覆盖松针促使槽内保持光照强度在0lux；至14天若没有菌苔出现，适当揭开松针通风，使土壤水分保持在30％；若因水分含量低于25％而没有形成菌苔，即需进行干巴菌补种：在该条槽内均匀注入1000ml步骤6)制得的溶胶，并将步骤1)所得的干巴菌菌粉10g，用步骤6)所制得的溶胶按水分含量10％润湿后，17℃避光培养箱内培养12小时，均匀撒入沟槽内，以松针覆盖；待白色苔状干巴菌菌落在槽内形成直径2mm菌苔，则停止喷雾器增湿管理，使其上层营养体随自然气候进入休眠，形成孢子繁殖体；14天后，仍无干巴菌苔出现，则需再次进行干巴菌补种：再次揭开松针通风，然后在该条槽内均匀注入1000ml步骤6)制得的溶胶，并将步骤1)所得的干巴菌菌粉10g，用步骤6)所制得的溶胶按水分含量10％润湿后，在24℃避光培养箱内培养12小时，取出后均匀撒入沟槽内，以松针覆盖，即可补救因干燥造成的接种失败造成的损失；

11)4月松树开始生长，在距沟槽表面深度1cm-2cm厘米内开始新生松树根系，激活休眠播种干巴菌所形成的孢子，并逐渐形成稳定共生体系；于降雨后或人工喷洒水，使得土壤湿度达到60％，再次施加步骤6)制得的溶胶500ml，使松树根系生长，进行自然条件下的松树根系干巴菌菌丝侵染；

12)步骤1)至步骤11)形成的槽内第一年即可有小和散的干巴菌出现，但不会长大和形成固定生长点，经过一年后才会形成多个散布生长点，形成菌塘；在第三年将该沟槽扩大为直径为10塘穴，测定并保持光照强度在0.5lux-100000lux日夜光照强度变化刺激20天，发育形成子实体。

8.一种人工形成干巴菌菌塘的方法，其特征在于：包括以下具体步骤：

1)在干巴菌生长季节提前选好适宜菌株，选择没有人畜影响，可以封闭生长至11月份的干巴菌作为种子，并做标记，自然条件下使其在菌塘内自然干燥，然后采集，研碎成粉，过20目筛，干燥冷藏；

2)采集成熟肥厚的干巴菌子实体，去除杂草泥土，撕碎，在溶剂瓶加入撕碎干巴菌，纱布覆盖瓶口，在通风环境下，置于接种箱内，29℃保温存放10天，每两天加一次水，保证整体湿润，待干巴菌菌丝表层腐烂，固液分层，液体颜色由金黄色转为黑色时，往液体中加入与干巴菌质量比为1:1的质量分数95％的乙醇溶液，80℃温水浴15分钟；

3)提取步骤2)所制得的乙醇溶液200ml过粗滤网，再用细菌膜过滤，将滤液移入玻璃缸中，往玻璃缸中加入800ml蒸馏水稀释，然后取出400ml稀释后溶液加入圆底烧瓶加热减压0.3atm蒸馏除去乙醇，得到三-(二甲胺基甲基)苯酚、9-18碳烯酰胺和对羟基苯甲酰胺混合物；

4)将松香与无水乙醇按松香质量：无水乙醇质量＝180：1000提前浸提，得到棕黄色的松香乙醇溶液，过滤去除松香乙醇溶液中的不溶性长链树脂和松针杂草后与无菌水按照1:4的体积比加入到溶剂置换釜中，采用离心喷雾法分散到无菌水中，减压至0.3atm抽提乙醇，制成质量分数23％浓缩松香溶胶；

5)按质量分数：首先将5％的木糖、5％的硝酸铵溶于74.5％的无菌水中，再加入0.5％步骤3)制得的三-(二甲胺基甲基)苯酚、9-18碳烯酰胺和对羟基苯甲酰胺混合物，最后将步骤4)所制得的浓缩松香溶胶按15％混入溶解，得到稀释的松香溶胶；

6)将步骤5)制得的稀释的松香溶胶用灌装机分装于1000ml棕色玻璃瓶内，避光储存于25℃的保藏室备用；

7)选择杂木树种5-20株/100m²的松林，树龄7年幼松，腐殖质厚度不超过8cm，土壤PH值5.5，作为人工形成菌塘的地点；

8)在选好幼松树下以树桩为中心开设深度为15cm，宽度为1cm，长度为10cm的放射状沟槽8条；

9)在11月干燥14天的情况下，测定土壤水分，当表层土壤水分低于15％，菌种播种土层土壤水分低于25％的环境条件下，在开设好的每条沟槽内，用毛刷清理沟槽，使表层土疏松，松树幼根暴露，然后分别均匀注入1000ml步骤6)所得的溶胶，然后将10g步骤1)制得的干巴菌粉均匀撒入沟槽内，以松针覆盖，不可覆盖土壤；

10)在步骤9)完成5天后，测定播种槽内水分及透光情况；当测得槽内土壤水分低于30％时，使用喷雾器增加覆盖层湿度至70％，测定并通过增加覆盖松针或减少覆盖松针促使槽内保持光照强度在15lux；至16天若没有菌苔出现，适当揭开松针通风，使土壤水分保持在45％；若因水分含量低于30％而没有形成菌苔，即需进行干巴菌补种：在该条槽内均匀注入1000ml步骤6)所得的溶胶，并将步骤1)所得的干巴菌菌粉5g，用步骤6)所得的溶胶按水分含量15％润湿后，24℃避光培养箱内培养24小时，均匀撒入沟槽内，以松针覆盖；待白色苔状干巴菌菌落在槽内形成直径7mm菌苔，则停止喷雾器增湿管理，使其上层营养体随自然气候进入休眠，形成孢子繁殖体；16天后，仍无干巴菌苔出现，则需再次进行干巴菌补种：再次揭开松针通风，然后在该条槽内均匀注入1000ml步骤6)所得的溶胶，并将步骤1)所得的干巴菌菌粉6g，用步骤6)所制得的溶胶按水分含量10％润湿后，在17℃避光培养箱内培养24小时，取出后均匀撒入沟槽内，以松针覆盖，即可补救因干燥造成的接种失败造成的损失；

11)4月松树开始生长，在距沟槽表面深度1cm-2cm厘米内开始新生松树根系，激活休眠播种干巴菌所形成的孢子，并逐渐形成稳定共生体系；于降雨后或人工喷洒水，使得土壤湿度达到75％，再次施加步骤6)所得的溶胶3000ml，使松树根系生长，进行自然条件下的松树根系干巴菌菌丝侵染；

12)步骤1)至步骤11)形成的槽内第一年即可有小和散的干巴菌出现，但不会长大和形成固定生长点，经过一年后才会形成多个散布生长点，形成菌塘；在第三年将该沟槽扩大为直径为20cm塘穴，测定并保持光照强度在0.5lux-100000lux日夜光照强度变化刺激25天，发育形成子实体。

9.一种人工形成干巴菌菌塘的方法，其特征在于：包括以下具体步骤：

1)在干巴菌生长季节提前选好适宜菌株，选择没有人畜影响，可以封闭生长至11月份的干巴菌作为种子，并做标记，自然条件下使其在菌塘内自然干燥，然后采集，研碎成粉，过20目筛，干燥冷藏；

2)采集成熟肥厚的干巴菌子实体，去除杂草泥土，撕碎，在溶剂瓶加入撕碎干巴菌，纱布覆盖瓶口，在通风环境下，置于接种箱内，24℃保温存放7天，每两天加一次水，保证整体湿润，待干巴菌菌丝表层腐烂，固液分层，液体颜色由金黄色转为黑色时，往液体中加入与干巴菌质量比为1:1的质量分数75％的乙醇溶液，85℃温水浴24分钟；

3)提取步骤2)所制得的乙醇溶液300ml过粗滤网，再用细菌膜过滤，将滤液移入玻璃缸中，往玻璃缸中加入700ml蒸馏水稀释，然后取出500ml稀释后溶液加入圆底烧瓶加热减压0.5atm蒸馏除去乙醇，得到三-(二甲胺基甲基)苯酚、9-18碳烯酰胺和对羟基苯甲酰胺混合物；

4)将松香与无水乙醇按松香质量：无水乙醇质量＝150：1000提前浸提，得到棕黄色的松香乙醇溶液，过滤去除松香乙醇溶液中的不溶性长链树脂和松针杂草后与无菌水按照1:4的体积比加入到溶剂置换釜中，采用离心喷雾法分散到无菌水中，减压至0.5atm抽提乙醇，制成质量分数23％浓缩松香溶胶；

5)按质量分数：首先将3％的木糖、3％的硝酸铵溶于83.75％的无菌水中，再加入0.25％的步骤3)制得的三-(二甲胺基甲基)苯酚、9-18碳烯酰胺和对羟基苯甲酰胺混合物，最后将步骤4)所制得的浓缩松香溶胶按10％混入溶解，得到稀释的松香溶胶；

6)将步骤5)制得的稀释的松香溶胶用灌装机分装于1000ml棕色玻璃瓶内，避光储存于22℃的保藏室备用；

7)选择杂木树种5-20株/100m²的松林，树龄8年幼松，腐殖质厚度不超过8cm，土壤PH值6.0，作为人工形成菌塘的地点；

8)在选好幼松树下以树桩为中心开设深度为9cm，宽度为2cm，长度为20cm的放射状沟槽4-6条；

9)在11月干燥11天的情况下，测定土壤水分，当表层土壤水分低于15％，菌种播种土层土壤水分低于20％的环境条件下，在开设好的每条沟槽内，用毛刷清理沟槽，使表层土疏松，松树幼根暴露，然后分别均匀注入2000ml步骤6)所得的溶胶，将8g步骤1)所制得的干巴菌粉均匀撒入沟槽内，以松针覆盖，不可覆盖土壤；

10)在步骤9)完成5天后，测定播种槽内水分及透光情况；当测得槽内土壤水分低于27％时，使用喷雾器增加覆盖层湿度，增加至70％；测定并通过增加覆盖松针或减少覆盖松针促使槽内保持光照强度在5lux；至15天若没有菌苔出现，适当揭开松针通风，使土壤水分保持在38％；若因水分含量低于27％而没有形成菌苔，即需进行干巴菌补种：在该条槽内均匀注入2000ml步骤6)所得的溶胶，并将步骤1)所得的干巴菌菌粉8g，用步骤6)所得的溶胶按水分含量13％润湿后，20℃避光培养箱内培养17小时，均匀撒入沟槽内，以松针覆盖；待白色苔状干巴菌菌落在槽内形成直径5mm菌苔，则停止喷雾器增湿管理，使其上层营养体随自然气候进入休眠，形成孢子繁殖体；15天后，仍无干巴菌苔出现，则需再次进行干巴菌补种：再次揭开松针通风，然后在该条槽内均匀注入1000ml步骤6)所得的溶胶，并将步骤1)所得的干巴菌菌粉8g，用步骤6)所得的溶胶按水分含量13％润湿后，在20℃避光培养箱内培养17小时，取出后均匀撒入沟槽内，以松针覆盖，即可补救因干燥造成的接种失败造成的损失；

11)4月松树开始生长，在距沟槽表面深度1cm-2cm内开始新生松树根系，激活休眠播种干巴菌所形成的孢子，并逐渐形成稳定共生体系；于降雨后或人工喷洒水使得土壤湿度达到85％再次施加步骤6)所得的溶胶2000ml，使松树根系生长，进行自然条件下的松树根系干巴菌菌丝侵染；

12)步骤1)至步骤11)形成的槽内第一年即可有小和散的干巴菌出现，但不会长大和形成固定生长点，经过一年后才会形成多个散布生长点，形成菌塘；在第三年将该沟槽扩大为直径为15cm塘穴，测定并保持光照强度在0.5lux-100000lux日夜光照强度变化刺激30天，发育形成子实体。

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