CN111487332A - 一种单一聚合度低聚果糖益生元作用评价方法及应用 - Google Patents
一种单一聚合度低聚果糖益生元作用评价方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种单一聚合度低聚果糖益生元作用评价方法，步骤如下：以合成型低聚果糖和酶切型低聚果糖为原料，应用聚丙烯酰胺型凝胶将低聚果糖分离纯化为单一聚合度低聚果糖，采用薄层色谱法、高效液相色谱法、质谱法以及核磁共振鉴定法检测分离样品纯度，以纯度大于90％的单一聚合度低聚果糖为碳源，双歧杆菌以及乳酸杆菌为益生活性作用标的，通过益生菌生长曲线的测定以及培养上清液成分的分析，建立单一聚合度低聚果糖益生元作用的评价体系。本方法精准、高效，可快速建立、鉴别与调控不同寡糖成分添加与其益生元作用的关联，对于科学指导功能食品设计以及食品加工过程，提升食品品质与营养价值具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，尤其是一种单一聚合度低聚果糖益生元作用评价方法和应用。
背景技术
低聚果糖是以果糖为组成单元，通过β(2-1)糖苷键连接组成的聚合度在2-9之间，且具有丰富生理活性的一系列寡糖。低聚果糖作为重要的益生元，广泛应用于各种食品中，其中包括婴幼儿配方奶粉、乳制品以及功能性食品。目前，低聚果糖的生产方式主要有两种，一种是以菊粉为原料，经菊粉内切酶水解生产；另一种是以蔗糖为原料，经果糖基转移酶合成制备。生产方式的不同决定了其产品的组成成分。合成方法生产的低聚果糖由具有葡萄糖端基的一组低聚糖组成，而水解方法制备的低聚果糖由具有葡萄糖端基以及果糖端基的低聚糖混合组成。
低聚果糖的益生活性与其自身的化学信息密切相关，即组成、结构、分子量、手性以及多分散性。作为功能性添加成分，低聚果糖通常以多分散性的混合物形式添加与应用。该应用方式忽视了不同发酵方法产生产品的结构多样性以及活性差异性。为了精确有效地调控、应用低聚果糖的益生元作用，通过单一聚合度低聚果糖评价其益生元作用至关重要。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种单一聚合度低聚果糖益生元作用评价方法及应用，该方法精准、高效，可快速建立、鉴别与调控不同寡糖成分添加及其益生元作用的关联，对于科学指导功能食品设计以及食品加工过程，提升食品品质与营养价值具有重要的意义。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种单一聚合度低聚果糖益生元作用评价方法，步骤如下：
以市售的合成型低聚果糖(以蔗糖为底物制备的低聚果糖)以及酶切型低聚果糖(以菊粉为底物制备的低聚果糖)为原料，根据低聚果糖的结构特点及化学特性，基于分子筛原理应用聚丙烯酰胺凝胶分离低聚果糖为单一聚合度低聚果糖，并采用薄层色谱法、高效液相色谱法、质谱法以及核磁共振鉴定法检测分离样品纯度，并且，以分离所得纯度达到大于90％的单一聚合度低聚果糖为碳源，双歧杆菌以及乳酸杆菌为益生活性作用标的，建立单一聚合度低聚果糖益生元作用的评价体系。
而且，具体步骤如下：
以合成型低聚果糖以及酶切型低聚果糖为原料，应用聚丙烯酰胺型凝胶对低聚果糖进行分离纯化；经薄层色谱法、高效液相色谱法、质谱法以及核磁共振法鉴定检测分离样品纯度，以分离纯化的单一聚合度低聚果糖为碳源，进行益生菌的厌氧培养以及生长曲线的测定，并通过益生菌培养上清液成分的分析，建立单一聚合度低聚果糖结构与其益生菌利用之间的关系。
而且，所述合成型低聚果糖纯度大于90％。
而且，所述酶切型低聚果糖纯度大于90％。
而且，所述聚丙烯酰胺型凝胶规格为Bio Rad P2极细，45μm-90μm。
而且，所述薄层色谱规格为20cm×20cm。
而且，所述高效液相色谱法采用高效液相色谱仪岛津LC-20AT。
而且，所述质谱法采用质谱仪德国布鲁克MALDI-TOF-MS ultrafleXtreme。
而且，所述核磁共振法采用核磁共振波谱仪AVANCEIII 400MHz。
而且，所述分离纯化的单一聚合度低聚果糖纯度大于90％。
而且，所述益生菌为双歧杆菌B.lactis BB12，B.lactis FN019和B.lactis B420以及乳酸杆菌L.acidophilus NCFM，L.acidophilus LA-5和L.acidophilus HN001。
而且，所述应用聚丙烯酰胺型凝胶对低聚果糖进行分离纯化的条件为：分离纯化前装柱准备，在室温下，称取55g Bio Rad P-2聚丙烯酰胺型凝胶于500ml干净的烧杯中，用5倍体积去离子水溶胀24h，倾倒出上层细小颗粒，再加去离子水、静置、倾倒、如此反复数次，直到无悬浮的细小颗粒为止。将烧杯口覆盖保鲜膜并扎孔超声排气泡1小时，再静置1小时，倒去上层浮胶。将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入分离柱内，使其自动沉降装柱到规定高度，倾倒过程中避免产生气泡。上样前，接恒流泵在特定流速下用去离子水平衡凝胶柱两个柱体积。分离层析柱为1.6cm×100cm，有效柱高为1.6cm×80cm。聚丙烯酰胺型凝胶分离纯化低聚果糖的过程条件，根据低聚果糖的溶解性调整低聚果糖的上样浓度分别为200mg/mL、130mg/mL、150mg/mL、300mg/mL、250mg/mL以及400mg/mL浓度的水溶液，分别用一次性塑料滴管缓慢沿壁滴加至胶体上层进行分离；调整上样量体积分别为0.5mL，1mL以及2mL；调整分离过程泵压分别为：540μL/min、400μL/min、300μL/min、200μL/min、100μL/min、80μL/min、60μL/min以及20μL/min；调整层析分离柱出口端连接电脑全自动收集器控制每管的接样量，接样时间设定分别为7min/管、10min/管、15min/管、20min/管以及30min/管。磷钼酸试剂显色法确定含糖收集液的起始点和终止点。利用薄层色谱法和高效液相色谱法对收集液组分进行分析，合并含相同组分的收集液，最后将收集液进行浓缩和冷冻干燥得到单一聚合度低聚果糖。
而且，所述应用薄层色谱法对分离纯化低聚果糖进行分离样品纯度检测鉴定的条件为：在薄层色谱展开前，首先将10cm×10cm的展缸放于通风橱中，并保证其干燥无污染；将20cm×20cm硅胶板裁剪成10cm×3cm，用铅笔在距离宽短边边缘1cm处划上起始线与展开剂前沿线，并在起始线上距离长边边缘1cm处，左右各标注出低聚果糖的样品点样处，用0.5mm毛细管点样，每个点均点样三次。样点之间相隔5mm。点样后用加热枪将点吹干。按照展开剂的比例进行配比，混合均匀后取2mL的展开剂溶液加入到展缸中，待展开剂混匀后将硅胶板点样端浸入展开剂中，盖上展缸盖，待展开剂延展到展开剂前沿距离边缘1cm处时，展开过程结束，取出薄板，用加热枪吹干后，用显色剂浸湿层析板显色，3秒后立即取出，再次用加热枪吹干烘烤至出现明显样点后，观察样品分离情况。展开过程展开剂的选择包括：乙醇∶水∶氨水∶乙酸乙酯＝2∶4∶0.3∶5；正丁醇∶水∶氨水＝6∶3∶1；乙酸乙酯∶乙醇∶水∶氨水＝5∶5∶4∶0.3；正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2；正丙醇∶乙酸乙酯∶水＝45∶35∶20；正丁醇∶醋酸∶乙酸乙酯∶水＝9∶6∶2∶1以及正丁醇∶醋酸∶乙酸乙酯∶水＝9∶6∶3∶1；显色剂的选择包括：5％硫酸/乙醇溶液；5％磷钼酸/乙醇溶液；苯胺-二苯胺-磷酸显色剂以及茴香醛(对甲氧基苯甲醛)显色剂。
而且，所述应用高效液相色谱法对分离纯化低聚果糖进行分离样品纯度检测鉴定的条件为：称取低聚果糖样品溶于超纯水中，配置成2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL以及20mg/mL水溶液后用0.22μm针头式EPS滤膜过滤。然后利用高效液相色谱法分析柱进行样品成分含量分析。色谱分析柱采用phenomenex Luna NH2 100A柱、C18柱以及Ca2+柱。以示差折光检测器检测结果为依据，选出适合低聚果糖分离的色谱柱；选择流动相的比例分别为乙腈∶水＝55∶45、乙腈∶水＝60∶40、乙腈∶水＝65∶35、乙腈∶水＝75∶25、乙腈∶水＝85∶15以及乙腈∶水＝70∶30；样品浓度分别为0.5mg/mL、2mg/mL、10mg/mL以及20mg/mL；流动相流速分别为0.4mL/min、0.6mL/min以及0.7mL/min；柱温分别为25℃、30℃以及35℃。
而且，所述应用质谱法对分离纯化低聚果糖进行分离样品纯度检测鉴定的条件为：在室温下，分别称取合成型低聚果糖以及酶切型低聚果糖溶于去离子水中，配置成1mg/mL、10mg/mL和100mg/mL的水溶液，置于EP管中用超声波清洗器超声3min，放置室温条件下，直至测定分析。采用德国Bruker ultrafleXtreme MALDI-TOF-MS质谱仪进行分析。点样前，保证点样周围无杂物，避免样品被污染。实验前，首先取出擦拭纸铺于平面，将靶板放于纸上，用移液枪吸取1μL样品溶液于点样位置，待样点溶液在室内气流中干燥后，再吸取1μL2，5-二羟基苯甲酸作为电离基质覆盖在干燥后的样点溶液位置上，静置30min。待基质与样品的混合点在室内气流中再次干燥后，将带有检测样品的靶板按箭头指向放入质谱仪中，采用正离子模式(RP700-3500)进行测定，扫描范围为0-2000m/z。所得数据采用flexAnalysis软件(Bruker Daltonics)进行分析。
而且，所述应用核磁共振法对分离纯化低聚果糖进行分离样品纯度检测鉴定的条件为：分离纯化的单一聚合度低聚果糖冷冻干燥后，分别称取25mg样品于EP管中，加入0.5mLD2O充分溶解且用超声波处理3min，用移液枪将样品溶液移入洁净的核磁管中，采用Bruker 400MHz NMR谱仪在293k时分别记录1H-NMR和13C-NMR核磁共振谱。
而且，所述以分离纯化的单一聚合度低聚果糖为碳源，进行益生菌的厌氧培养以及生长曲线测定的条件为：单一聚合度低聚果糖对双歧杆菌以及乳酸杆菌的增殖在YQX-II厌氧培养箱内进行。厌氧培养箱采用混合气10％H2、5％CO2以及85％N2保证培养箱内的厌氧环境。活化培养基mMRS组成为牛肉膏10g、酵母膏5g、蛋白胨10g、吐温80 1g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g以及柠檬酸三胺2g，将上述组分溶于1L超纯水中；发酵培养基组成为，在mMRS成分不变的情况下，用10g/L的不同碳源代替20g/L的葡萄糖。发酵前，将上述培养基pH调整为6.2±0.2，然后在121℃下高压湿热灭菌30min备用。每次试验均在无菌操作条件下，分别称取0.2g冻干菌粉移入盛有20mL灭菌培养基的三角锥形瓶中，充分振荡使菌体混合均匀，37℃厌氧培养48h，传代2次，重新接种发酵18h后得菌种母液。采用96孔V形培养板(NEST Biotech Co.)进行益生菌厌氧培养。按所加培养基溶液4％的接菌量分别将菌种母液接种于各培养基中。以无糖培养基为阴性对照，添加葡萄糖、果糖的培养基为阳性对照，37℃厌氧培养24h，且每两小时用Multiskan FC型酶标仪在OD595nm处检测菌株生长情况。以培养时间为横坐标，吸光度(OD值)为纵坐标，绘制生长曲线。
而且，所述以分离纯化的单一聚合度低聚果糖为碳源，益生菌培养上清液成分分析的条件为：培养过程中分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h采集样品150μL于EP管中，-80℃保存至检测。检测分析前，先将样品在95℃水浴5min后，用高速离心机以5000rpm的转速离心15min，用1mL一次性注射器吸取上清液以0.22μm针头式EPS滤膜过滤。将过滤后的样品置于-20℃直至进样分析。采用高效液相色谱法进行碳水化合物消耗及发酵期间中间产物的分析。高效液相色谱法的检测分析，应用高效液相色谱法对分离纯化低聚果糖进行分离样品纯度检测鉴定的具体方法。
而且，所述分析还经过如下处理：采用excel软件进行数据统计与分析，origin软件进行绘图。
如上所述的单一聚合度低聚果糖益生元作用在功能食品设计、加工中品质提升方面的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、益生元是一种被广泛应用的高多分散性功能性添加剂。单一聚合度低聚果糖益生元作用评价方法与应用有助于提高益生元添加成分的分子利用度，降低其他低效或无效成分对身体吸收代谢造成的负担，进而提高益生元应用的安全性与有效性。
2、目前，关于低聚果糖的研究主要在它的生理活性和高效制备方面。在这些过程中，低聚果糖以混合物形式呈现，对其组成成分单一聚合度低聚果糖的益生功能以及被益生菌利用的方式所知甚少。然而，低聚果糖的聚合度和确切的分子结构在其被益生菌摄取和代谢途径中发挥着重要的作用。单一聚合度低聚果糖益生元作用评价方法可直接用于揭示益生元和益生菌之间构效关系，更准确有效地调控其益生效果。
附图说明
图1为分离纯化后单一聚合度低聚果糖各组分的薄层色谱检测图；其中：图1a为合成型低聚果糖分离纯化后单一聚合度低聚果糖；图1b为酶切型低聚果糖分离纯化后单一聚合度低聚果糖；
图2为分离纯化后单一聚合度低聚果糖各组分的高效液相色谱检测图；其中：图2a为合成型低聚果糖分离纯化后单一聚合度低聚果糖；图2b为酶切型低聚果糖分离纯化后单一聚合度低聚果糖；
图3为分离纯化后单一聚合度低聚果糖GF2和GF2&F3的质谱图；其中，图3a为GF2的质谱图；图3b为GF2&F3的质谱图；
图4为分离纯化后单一聚合度低聚果糖GF2和GF2&F3的核磁共振谱图；其中，图4a为GF2的核磁共振谱图；图4b为GF2&F3的核磁共振谱图；
图5为分离纯化后单一聚合度低聚果糖GF2和GF2&F3的双歧杆菌B.lactis BB12厌氧培养生长曲线图；
图6为分离纯化后单一聚合度低聚果糖GF2和GF2&F3的双歧杆菌B.lactis BB12培养上清液成分的分析图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
实施例1合成型低聚果糖GF2的双歧杆菌B.lactis BB12作用评价方法：
分离纯化前装柱准备：在室温下，称取55g Bio Rad P2聚丙烯酰胺型凝胶于500mL干净的烧杯中，用5倍体积去离子水溶胀24h，倾倒出上层细小颗粒，再加去离子水、静置、倾倒、如此反复数次，直到无悬浮的细小颗粒为止。将烧杯口覆盖保鲜膜并扎孔超声排气泡1小时，再静置1小时，倒去上层浮胶。将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入分离柱内，使其自动沉降装柱到规定高度，倾倒过程中避免产生气泡。上样前，接恒流泵在特定流速下用去离子水平衡凝胶柱两个柱体积。分离层析柱为1.6cm×100cm，有效柱高为1.6cm×80cm。
聚丙烯酰胺型凝胶分离纯化合成型低聚果糖GF2的粗分离过程为：称取400mg的合成型低聚果糖溶于去离子水中，配成浓度为400mg/mL的水溶液，上样量1mL，接上恒流泵，恒定洗脱速度60μL/min，去离子水室温下洗脱，每30min收集一管。磷钼酸试剂显色法确定含糖收集液的起始点和终止点。聚丙烯酰胺型凝胶分离纯化合成型低聚果糖GF2的精细分离过程为：称取粗分离样品100mg溶于去离子水中，配成浓度为200mg/mL的水溶液，上样量0.5mL，接上恒流泵，恒定洗脱速度20μL/min，去离子水室温下洗脱，每10min收集一管。磷钼酸试剂显色法确定含糖收集液的起始点和终止点。
应用薄层色谱法对分离纯化合成型低聚果糖GF2进行分离样品纯度检测的鉴定，具体方法为：在薄层色谱展开前，首先将10cm×10cm的展缸放于通风橱中，并保证其干燥无污染；将20cm×20cm硅胶板裁剪成10cm×10cm，用铅笔在距离宽短边边缘1cm处划上起始线与展开剂前沿线，并在起始线上距离长边边缘1cm处，注出合成型低聚果糖GF2样品点样处，用0.5mm毛细管点样，每个点均点样三次。样点之间相隔5mm。点样后用加热枪将点吹干。按照展开剂正丁醇∶醋酸∶乙酸乙酯∶水＝9∶6∶3∶1的比例进行配比，混合均匀后取2mL的展开剂溶液加入到展缸中，待展开剂混匀后将硅胶板点样端浸入展开剂中，盖上展缸盖，待展开剂延展到展开剂前沿距离边缘1cm处时，展开过程结束，取出薄板，用加热枪吹干后，用磷钼酸显色剂浸湿层析板显色，3秒后立即取出，再次用加热枪吹干烘烤至出现明显样点后，观察样品分离情况。应用薄层色谱法对分离纯化合成型低聚果糖GF2样品纯度检测的效果图如图1所示。
应用高效液相色谱法对分离纯化合成型低聚果糖GF2进行纯度的检测鉴定，具体方法为：称取低聚果糖样品溶于超纯水中，配置成10mg/mL水溶液后用0.22μm针头式EPS滤膜过滤。然后利用高效液相色谱法分析柱进行样品成分含量分析。色谱分析柱采用Phenomenex Luna NH2 100A柱。以示差折光检测器检测结果为依据，选择流动相的比例为乙腈∶水＝60∶40；样品浓度为10mg/mL；流动相流速为0.6mL/min；柱温为30℃。应用高效液相色谱法，对分离纯化合成型低聚果糖GF2进行纯度检测鉴定的效果图，如图2所示。
应用质谱法对分离纯化合成型低聚果糖GF2进行纯度的检测鉴定，具体方法为：在室温下，分别称取合成型低聚果糖GF2溶于去离子水中，配置成1mg/mL的水溶液，置于EP管中用超声波清洗器超声3min，放置室温条件下，直至测定分析。采用德国BrukerultrafleXtreme MALDI-TOF-MS质谱仪进行分析。点样前，保证点样周围无杂物，避免样品被污染。实验前，首先取出擦拭纸铺于平面，将靶板放于纸上，用移液枪吸取1μL样品溶液于点样位置，待样点溶液在室内气流中干燥后，再吸取1μL 2，5-二羟基苯甲酸作为电离基质覆盖在干燥后的样点溶液位置上，静置30min。待基质与样品的混合点在室内气流中再次干燥后，将带有检测样品的靶板按箭头指向放入质谱仪中，采用正离子模式(RP700-3500)进行测定，扫描范围为0-2000m/z。所得数据采用flexAnalysis软件(Bruker Daltonics)进行分析。应用质谱法对分离纯化合成型低聚果糖GF2进行纯度检测鉴定的效果图如图3所示。
应用核磁共振法对分离纯化合成型低聚果糖GF2进行纯度的检测鉴定，具体方法为：合成型低聚果糖GF2冷冻干燥后，称取25mg样品于EP管中，加入0.5mL D2O充分溶解且用超声波处理3min，用移液枪将样品溶液移入洁净的核磁管中，采用Bruker 400MHz NMR谱仪在293k时分别记录1H NMR和13C NMR核磁共振谱。应用核磁共振法对分离纯化合成型低聚果糖GF2进行纯度检测鉴定的效果图如图4所示。
以合成型低聚果糖GF2为碳源，进行双歧杆菌B.lactis BB12的厌氧培养以及生长曲线的测定，具体方法为：低聚果糖GF2对双歧杆菌B.lactis BB12的厌氧培养在YQX-II厌氧培养箱内进行。厌氧培养箱采用混合气10％H2、5％CO2以及85％N2保证培养箱内的厌氧环境。mMRS培养基组成为牛肉膏10g、酵母膏5g、蛋白胨10g、吐温80 1g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g以及柠檬酸三胺2g，将上述组分溶于1L超纯水中；发酵培养基组成为，在mMRS成分不变的情况下，用10g/L的不同碳源代替20g/L的葡萄糖。发酵前，将上述培养基pH值调整为6.2±0.2，然后在121℃下高压湿热灭菌30min备用。菌种培养在无菌操作条件下，称取0.2g冻干菌粉移入盛有20mL灭菌培养基的三角锥形瓶中，充分振荡使菌体混合均匀，37℃厌氧培养48h，传代2次，重新接种发酵18h后得菌种母液。采用96孔V形培养板(NEST Biotech Co.)进行益生菌厌氧培养试验。按所加培养基溶液4％的接菌量分别将菌种母液接种于各培养基中。以无糖培养基为阴性对照，添加葡萄糖、果糖的培养基为阳性对照，37℃厌氧培养24h，且每两小时用Multiskan FC型酶标仪在OD595nm处检测菌株生长情况。以培养时间为横坐标，吸光度(OD值)为纵坐标，绘制生长曲线，如图5所示。
以合成型低聚果糖GF2为碳源，进行双歧杆菌B.lactis BB12培养上清液的成分分析，具体方法为：培养过程中分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h采集样品150μL于EP管中，-80℃保存至检测。检测分析前，先将样品在95℃水浴5min后，用高速离心机以5000rpm的转速离心15min，用1mL一次性注射器吸取上清液，以0.22μm针头式EPS滤膜过滤。将过滤后的样品置于-20℃直至进样分析。采用高效液相色谱法进行碳水化合物消耗及发酵期间中间产物的分析。高效液相色谱法的检测分析，应用高效液相色谱法对分离纯化低聚果糖进行分离样品纯度检测鉴定的具体方法，分析结果如图6所示。
实施例2酶切型低聚果糖GF2&F3的双歧杆菌B.lactis BB12作用评价方法：
分离纯化前装柱准备：在室温下，称取55g Bio Rad P2聚丙烯酰胺型凝胶于500ml干净的烧杯中，用5倍体积去离子水溶胀24h，倾倒出上层细小颗粒，再加去离子水、静置、倾倒，如此反复数次，直到无悬浮的细小颗粒为止。将烧杯口覆盖保鲜膜并扎孔超声排气泡1小时，再静置1小时，倒去上层浮胶。将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入分离柱内，使其自动沉降装柱到规定高度，倾倒过程中避免产生气泡。上样前，接恒流泵在特定流速下用去离子水平衡凝胶柱两个柱体积。分离层析柱为1.6cm×100cm，有效柱高为1.6cm×80cm。
聚丙烯酰胺型凝胶分离纯化酶切型低聚果糖GF2&F3的粗分离过程为：称取400mg的酶切型低聚果糖溶于去离子水中，配成浓度为400mg/mL的水溶液，上样量1mL，接上恒流泵，恒定洗脱速度60μL/min，去离子水室温下洗脱，每30min收集一管。磷钼酸试剂显色法确定含糖收集液的起始点和终止点。聚丙烯酰胺型凝胶分离纯化酶切型低聚果糖GF2&F3的精细分离过程为：称取粗分离样品100mg溶于去离子水中，配成浓度为200mg/mL的水溶液，上样量0.5mL，接上恒流泵，恒定洗脱速度20μL/min，去离子水室温下洗脱，每10min收集一管。磷钼酸试剂显色法确定含糖收集液的起始点和终止点。
应用薄层色谱法对分离纯化酶切型低聚果糖GF2&F3进行分离样品纯度检测的鉴定，具体方法为：在薄层色谱展开前，首先将10cm×10cm的展缸放于通风橱中，并保证其干燥无污染；将20cm×20cm硅胶板裁剪成10cm×3cm，用铅笔在距离短边边缘1cm处划上起始线与展开剂前沿线，并在起始线上距离长边边缘1cm处，标注出酶切型低聚果糖GF2&F3样品点样处，用0.5mm毛细管点样，每个点均点样三次。样点之间相隔5mm。点样后用加热枪将点吹干。按照展开剂正丁醇∶醋酸∶乙酸乙酯∶水＝9∶6∶3∶1的比例进行配比，混合均匀后取2mL的展开剂溶液加入到展缸中，待展开剂混匀后将硅胶板点样端浸入展开剂中，盖上展缸盖，待展开剂延展到展开剂前沿距离边缘1cm处时，展开过程结束，取出薄板，用加热枪吹干后，用磷钼酸显色剂浸湿层析板显色，3秒后立即取出，再次用加热枪吹干烘烤至出现明显样点后，观察样品分离情况。应用薄层色谱法对分离纯化酶切型低聚果糖GF2&F3进行纯度检测鉴定的效果图如图1所示。
应用高效液相色谱法对分离纯化酶切型低聚果糖GF2&F3进行纯度的检测鉴定，具体方法为：称取低聚果糖GF2&F3样品溶于超纯水中，配置成10mg/mL水溶液后用0.22μm针头式EPS滤膜过滤。然后利用高效液相色谱法分析柱进行样品成分含量分析。色谱分析柱采用phenomenex Luna NH2 100A柱。以示差折光检测器检测结果为依据，选择流动相的比例为乙腈∶水＝60∶40；样品浓度为10mg/mL；流动相流速为0.6mL/min；柱温为30℃。应用高效液相色谱法，对分离纯化酶切型低聚果糖GF2&F3进行纯度检测鉴定的效果图，如图2所示。
应用质谱法对分离纯化酶切型低聚果糖GF2&F3进行纯度的检测鉴定，具体方法为：在室温下，称取酶切型低聚果糖GF2&F3溶于去离子水中，配置成1mg/mL的水溶液，置于EP管中用超声波清洗器超声3min，放置室温条件下，直至测定分析。采用德国BrukerultrafleXtreme MALDI-TOF-MS质谱仪进行分析。点样前，保证点样周围无杂物，避免样品被污染。实验前，首先取出擦拭纸铺于平面，将靶板放于纸上，用移液枪吸取1μL样品溶液于点样位置，待样点溶液在室内气流中干燥后，再吸取1μL 2，5-二羟基苯甲酸作为电离基质覆盖在干燥后的样点溶液位置上，静置30min。待基质与样品的混合点在室内气流中再次干燥后，将带有检测样品的靶板按箭头指向放入质谱仪中，采用正离子模式(RP700-3500)进行测定，扫描范围为0-2000m/z。所得数据采用flexAnalysis软件(Bruker Daltonics)进行分析。应用质谱法对分离纯化酶切型低聚果糖GF2&F3进行纯度检测鉴定的效果图，如图3所示。
应用核磁共振法对分离纯化酶切型低聚果糖GF2&F3进行纯度的检测鉴定，具体方法为：酶切型低聚果糖GF2&F3冷冻干燥后，称取25mg样品于EP管中，加入0.5mL D2O充分溶解且用超声波处理3min，用移液枪将样品溶液移入洁净的核磁管中，采用Bruker 400MHz NMR谱仪在293k时分别记录1H NMR和13C NMR核磁共振谱。应用核磁共振法对分离纯化酶切型低聚果糖GF2&F3进行纯度检测鉴定的效果图，如图4所示。
以酶切型低聚果糖GF2&F3为碳源，进行双歧杆菌B.lactis BB12的厌氧培养以及生长曲线的测定，具体方法为：酶切型低聚果糖GF2&F3对双歧杆菌B.lactis BB12的厌氧培养在YQX-II厌氧培养箱内进行。厌氧培养箱采用混合气10％H2、5％CO2以及85％N2保证培养箱内的厌氧环境。mMRS培养基组成为牛肉膏10g、酵母膏5g、蛋白胨10g、吐温80 1g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g以及柠檬酸三胺2g，将上述组分溶于1L超纯水中；发酵培养基组成分为，在mMRS其他成分不变的情况下，用10g/L的不同碳源代替20g/L的葡萄糖。发酵前，将上述培养基pH值调整为6.2±0.2，然后在121℃下高压湿热灭菌30min备用。菌株的培养在无菌操作条件下，称取0.2g冻干菌粉移入盛有20mL灭菌培养基的三角锥形瓶中，充分振荡使菌体混合均匀，37℃厌氧培养48h，传代2次，重新接种发酵18h后得菌种母液。采用96孔V形培养板(NEST Biotech Co.)进行益生菌厌氧培养试验。按所加培养基溶液4％的接菌量将菌种母液接种于各培养基中。以无糖培养基为阴性对照，添加葡萄糖、果糖的培养基为阳性对照，37℃厌氧培养24h，且每两小时用Multiskan FC型酶标仪在OD595nm处检测菌株生长情况。以培养时间为横坐标，吸光度(OD值)为纵坐标，绘制生长曲线，如图5所示。
以酶切型低聚果糖GF2&F3为碳源，进行双歧杆菌B.lactis BB12培养上清液的成分分析，具体方法为：培养过程中分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h采集样品150μL于EP管中，-80℃保存至检测。检测分析前，先将样品在95℃水浴5min后，用高速离心机以5000rpm的转速离心15min，用1mL一次性注射器吸取上清液以0.22μm针头式EPS滤膜过滤。将过滤后的样品置于-20℃直至进样分析。采用高效液相色谱法进行碳水化合物消耗及发酵期间中间产物的分析。高效液相色谱法的检测分析，应用高效液相色谱法对分离纯化低聚果糖进行分离样品纯度检测鉴定的具体方法，分析结果如图6所示。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
Claims (10)
1.一种单一聚合度低聚果糖益生元作用评价方法，其特征在于：以合成型低聚果糖和酶切型低聚果糖为原料，应用聚丙烯酰胺型凝胶将低聚果糖分离纯化为单一聚合度低聚果糖，采用薄层色谱法、高效液相色谱法、质谱法以及核磁共振鉴定法检测分离样品纯度，以纯度大于90％的单一聚合度低聚果糖为碳源，双歧杆菌以及乳酸杆菌为益生活性作用标的，通过益生菌生长曲线的测定以及培养上清液成分的分析，建立单一聚合度低聚果糖益生元作用的评价体系。
2.根据权利要求1所述的单一聚合度低聚果糖益生元作用评价方法，其特征在于：所述合成型低聚果糖纯度大于90％。
3.根据权利要求1所述的单一聚合度低聚果糖益生元作用评价方法，其特征在于：所述酶切型低聚果糖纯度大于90％。
4.根据权利要求1所述的单一聚合度低聚果糖益生元作用评价方法，其特征在于：所述聚丙烯酰胺型凝胶规格为Bio RadP2极细，45μm-90μm。
5.根据权利要求1所述的单一聚合度低聚果糖益生元作用评价方法，其特征在于：所述高效液相色谱法采用高效液相色谱仪为岛津LC-20AT。
6.根据权利要求1所述的单一聚合度低聚果糖益生元作用评价方法，其特征在于：所述质谱法采用质谱仪为德国布鲁克MALDI-TOF-MS ultrafleXtreme。
7.根据权利要求1所述的单一聚合度低聚果糖益生元作用评价方法，其特征在于：所述益生菌为双歧杆菌B.lactis BB12、B.lactis FN019和B.lactis B420以及乳酸杆菌L.acidophilus NCFM、L.acidophilus LA-5和L.acidophilus HN001。
8.根据权利要求1所述的单一聚合度低聚果糖益生元作用评价方法，其特征在于：所述以分离纯化的单一聚合度低聚果糖为碳源，进行益生菌的厌氧培养以及生长曲线的测定，具体步骤如下：
采用96孔V形培养板进行益生菌厌氧培养。按所加培养基溶液4％的接菌量分别将菌种母液接种于各培养基中。以无糖培养基为阴性对照，添加葡萄糖、果糖的培养基为阳性对照，37℃厌氧培养24h，且每两小时用Multiskan FC型酶标仪在OD595nm处检测菌株生长情况。以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制生长曲线。
9.根据权利要求1所述的单一聚合度低聚果糖益生元作用评价方法，其特征在于：所述以分离纯化的单一聚合度低聚果糖为碳源，益生菌培养上清液成分的分析，具体步骤如下：
培养过程中分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h采集样品150μL于EP管中，-80℃保存至检测。检测分析前，先将样品在95℃水浴5min后，用高速离心机以5000rpm的转速离心15min，用1mL一次性注射器吸取上清液以0.22μm针头式EPS滤膜过滤。将过滤后的样品置于-20℃直至进样分析。采用高效液相色谱法进行碳水化合物消耗及发酵期间中间产物的分析。
10.如权利要求1至10任一项所述的单一聚合度低聚果糖益生元作用评价方法在功能食品设计以及食品加工过程中的应用。
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