CN112724182A - G418发酵液的精制纯化工艺 - Google Patents

G418发酵液的精制纯化工艺 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种G418发酵液的精制纯化工艺，用草酸调节G418发酵液pH至2.0‑3.0，然后加入助滤剂，充分搅拌，再经板框过滤、得到G418溶液；然后将G418溶液依次经陶瓷膜过滤、阳离子交换树脂吸附、阴离子交换树脂脱色、大孔吸附树脂吸附、真空浓缩、活性炭脱色和干燥即得G418纯品。本工艺操作步骤简单，产品纯度高，可实现G418稳定、安全高效地生产。

Description

G418发酵液的精制纯化工艺
技术领域
本发明涉及生物化工领域，具体地说，涉及G418发酵液的精制纯化工艺。
背景技术
G418(Geneticin，遗传霉素)是由棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)、绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)或红橙小单孢菌(Micromonosporarhodorangea)发酵产生的一种氨基糖苷类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，在分子遗传试验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。它通过抑制转座子Tn601，Tn5的基因而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。当Neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动Neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得到广泛应用。G418有杀菌作用，本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。
棘孢小单孢菌、绛红色小单孢菌或红橙小单孢菌发酵液中主要产物是G418，但还含有多种氨基糖苷类杂质成分，包括庆大霉素B、西索米星、小诺霉素和庆大霉素C等系列组分。这些杂质的理化性质与G418近似，都是水溶性很强的氨基糖苷类抗生素，因此制备高纯度G418极其困难，US3997403中采用两步阴阳离子树脂交换，得到G418产品，但纯度仅90％左右。WO/2012/079039中采用硅胶层析，得到G418纯度达到95％以上的产品，生产成本较高。随着对氨基糖苷类产品提纯方法的不断研究，涌现出许多新的纯化技术，如泡沫分离法、反胶束萃取法、沉淀法和膜分离法等，但上述方法目前仅限于实验室研究，难以实现对G418发酵液的大规模纯化制备。此外，由于缺少G418成品的质量标准，国内厂家生产的成品中G418有效含量较低，一般在90-92％；杂质含量较高，严重影响了G418产品的质量。因此，亟需提供一种新的G418发酵液的精制纯化工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种G418发酵液的精制纯化工艺。
为了实现本发明目的，本发明提供的G418发酵液的精制纯化工艺包括：用草酸调节G418发酵液pH至2.0-3.0，然后加入助滤剂，充分搅拌，再经板框过滤、得到G418溶液；然后将G418溶液依次经陶瓷膜过滤、阳离子交换树脂吸附、阴离子交换树脂脱色、大孔吸附树脂吸附、真空浓缩和活性炭脱色。
前述的方法，用草酸调节G418发酵液pH至2.0-3.0，搅拌2-3h后加入助滤剂。加入草酸使菌体破壁，同时使发酵液中的金属离子和一些蛋白沉淀，增加上清液产品质量。
前述的方法，加入助滤剂搅拌20-40min后再经板框过滤。加入助滤剂有利于增加滤液流速。
所述助滤剂可以是硅藻土或珍珠岩，目数为40-100目，助滤剂的用量为G418发酵液体积的2-4％。
前述的方法，陶瓷膜过滤中选用多通道陶瓷膜，通道数控制在10-12。
优选地，膜材质为玻璃膜，孔径为0.20μm。
陶瓷膜过滤时，将流速控制在5-10m/s，压力控制在0.1-0.2MPa，滤液温度控制在40-50℃。陶瓷膜能够进一步去除滤液中的不溶物，使上清液更加清澈透明。
前述的方法，阳离子交换树脂可以去除绝大部分的蛋白、无机盐、糖类和脂类等成分，阳离子交换树脂吸附的方法如下：
A1、阳离子交换树脂上样：将阳离子树脂装入阳性柱内，G418溶液由上至下进入树脂柱内，流速控制在2.0-4.0BV/h；
A2、阳离子交换树脂淋洗：先用纯化水自上而下洗涤2.0-4.0个柱体积，流速控制在2.0BV/h，漂洗至洗出液无粉色；然后用0.2mol/L盐酸自上而下淋洗6-8个柱体积，流速控制在2.0-4.0BV/h，最后用纯化水淋洗至洗出液的pH4.0-5.0。
A3、阳离子交换树脂洗脱：淋洗结束后，用0.5mol/L氨水由上至下进入树脂柱内，流速控制在2.0-4.0BV/h，收集氨水解析液，至流出的氨水解析液中G418效价低于5.0mg/L时，停止洗脱。
前述的方法，阴离子交换树脂脱色包括：将氨水解析液进入阴离子交换树脂，流速控制在1.5-3.0BV/h，进行脱色，收集脱色液；脱色液颜色为清澈透明或淡黄色，若颜色深，呈现棕色或深黄色，则需重复阴离子交换树脂脱色。
所述阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，其树脂材料的母体结构可以是苯乙烯-二乙烯苯共聚物，其中二乙烯苯在共聚物中的摩尔百分含量为4％-7％。
优选地，树脂材料的用量为G418质量的30-50倍，树脂柱的径高比为1:8-10。
前述的方法，大孔吸附树脂主要是除去残留在解析液中的小分子蛋白、粘性多糖、脂类和G418的类似物等杂质，大孔吸附树脂吸附的方法如下：
B1、大孔吸附树脂上样：将阴离子交换树脂脱色液以2.0-4.0BV/h的流速由上至下进入到大孔树脂柱中，直至树脂柱饱和，停止吸附，静置4.0-6.0h；
B2、大孔吸附树脂淋洗：先用纯化水自上而下洗涤2.0-4.0个柱体积，流速控制在2.0-4.0BV/h；
B3、大孔吸附树脂洗脱：淋洗结束后，用10％甲醇水溶液由上至下进入树脂柱内，流速控制在2.0-4.0BV/h，洗脱5.0-6.0个柱体积，收集含有G418的甲醇液，然后用0.03mol/L硫酸溶液洗脱，洗脱2.0-4.0个柱体积，收集硫酸解析液，至流出的硫酸解析液中G418效价低于5.0mg/L时，停止洗脱。
所述大孔吸附树脂，其树脂材料的母体结构可以是聚苯乙烯，如Amberlite公司生产的XAD-16。
优选地，树脂材料的用量为G418质量含量的10-20倍，树脂柱的径高比为1:8-10。
前述的方法，真空浓缩的条件为：50-70℃，真空度-0.06～-0.09MPa，浓缩至原收集液体积的1/8-1/10。
前述的方法，经真空浓缩后，向浓缩液中加入活性炭搅拌0.5-1h；静置0.5-1h，整个过程温度控制在55-60℃。
优选地，活性炭的目数为80-200目，用量为G418质量含量的1/50-1/20。
经活性炭脱色后，进行冷冻干燥，即得G418纯品。
冷冻干燥方法为：采用冷冻干燥机，干燥条件为-45～-5℃。真空度20～25Pa，掺入空气条件：1～3s/1min，干燥时间72～84h。
本发明中，所述G418发酵液可以是棘孢小单孢菌、绛红色小单孢菌或红橙小单孢菌发酵液。
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
(一)本发明通过阴阳离子交换树脂，有效而准确地去除发酵液中无机盐，绝大部分蛋白、多糖、脂类和色素等，再通过大孔吸附树脂吸附，进一步除去残余的小分子蛋白、多糖、脂类、色素和G418的类似物。
(二)采用本发明的精制纯化工艺生产的成品中G418有效含量高，达到98.5％以上，远高于国内水平。
(三)本发明避免了常规提纯工艺中有机溶媒的污染问题。
(四)操作步骤简单，可控性高，提纯工艺总成本低，可实现对G418发酵液的大规模纯化制备。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
以下实施例中使用的陶瓷膜(多通道陶瓷膜)购自三达膜科技(厦门)有限公司，通道数控制在10-12，其膜材质为玻璃膜，孔径为0.2微米。阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和大孔吸附树脂由Amberlite公司提供，树脂型号分别为IR-120、IRA-402和XAD-16型。
真空浓缩采用的双效蒸发器购自常州市华天药化设备有限公司，商品型号为FWZ2-2000。
以下实施例1和2中使用的G418发酵液，使用编号为ATCC27932的棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)进行G418发酵生产。菌株ATCC27932参见Wagman GH,etal.Antibiotic G-418,a new Micromonospora-produced aminoglycoside withactivity against protozoa and helminths:Fermentation,isolation,andpreliminary characterization.Antimicrob.Agents Chemother.6:144-149,1974。
具体地，采用三级发酵模式生产G418，各级配方和工艺控制条件如下：
一级种子配方：可溶性淀粉1.0％，葡萄糖0.15％，中温黄豆饼粉1.5％，硝酸铵0.15％，硫酸镁0.05％，碳酸钙0.3％。培养条件：34℃，培养周期：48hrs。向二级种子罐移种条件：镜检网枝无杂菌，菌体浓度：10％-12％。移种量：1.0％。
二级种子配方：玉米淀粉2.0％，麦芽糖1.0％，中温黄豆饼粉2.0％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.02％，碳酸钙0.5％。培养条件：34℃，培养周期：36hrs。向三级发酵罐移种条件：镜检网枝无杂菌，菌体浓度：15％-20％。移种量：5.0％。
三级发酵配方：玉米淀粉6.0％，麦芽糖0.5％，中温黄豆饼粉2.0％，豆粕粉1.5％硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.02％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸锌0.01％，碳酸钙0.6％。培养条件：30℃，培养周期：7-9天，20吨发酵罐检测发酵单位不低于900mg/L。
实施例1 G418发酵液的精制纯化工艺
1、发酵液预处理：G418发酵液5000L，发酵单位为910mg/L。
加入草酸调节G418发酵液pH至2.0，草酸用量为20kg，搅拌2h。加入助滤剂珍珠岩，用量为100kg，目数40目，搅拌20min。经板框过滤，得到G418溶液3600L。经检测，发酵单位是1245mg/L。发酵液预处理的收率为98.5％。
2、陶瓷膜过滤
采用循环式过滤，流速控制在5m/s，压力控制0.1-0.2MPa，滤液温度控制在40℃。过滤结束，G418水溶液3400L，发酵单位是1299mg/L，收率为98.6％。
3、树脂吸附
树脂吸附是指依次用阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和大孔吸附树脂得到G418溶液。具体如下：
阳离子交换树脂上样：将阳离子树脂装入阳性柱内，G418溶液由上至下进入树脂柱内，流速控制在2.0BV/h，吸附材料的母体结构为苯乙烯-二乙烯苯共聚物(其中二乙烯苯在共聚物中的摩尔百分含量为7％)，其用量为150KG。
阳离子交换树脂淋洗：先用纯化水自上而下洗涤2个柱体积，流速控制在2BV/h，漂洗至洗出液无粉色。然后用配置0.2mol/L的盐酸溶液，自上而下淋洗7个柱体积，流速控制在3BV/h，最后用纯化水淋洗至洗出液的pH4.5。
阳离子交换树脂洗脱：淋洗结束，使用0.5mol/L的氨水溶液由上至下进入树脂柱内，流速控制在2BV/h，至流出的溶液中G418效价低于5mg/L时，停止洗脱。收集G418洗脱液约1050L，发酵单位3995mg/L，收率为95.0％。
阴离子交换树脂：将氨水解析液进入阴离子交换树脂，进行脱色，流速为2.0BV/h，吸附材料的母体结构为苯乙烯-二乙烯苯共聚物，用量为150KG。收集G418洗脱液约1100L，发酵单位3776mg/L，收率为99.0％。
大孔吸附树脂上样：将阴离子交换树脂脱色液以2.0BV/h流速由上至下进入到大孔树脂柱中，吸附结束静止6h。大孔树脂其母体结构聚苯乙烯，其用量为83KG。
大孔吸附树脂淋洗：先用纯化水自上而下洗涤2个柱体积，流速控制在2BV/h。
大孔吸附树脂洗脱：淋洗结束，使用10％的甲醇水溶液由上至下进入树脂柱内，流速控制在2BV/h，收集含有G418的甲醇液，然后使用0.03mol/L硫酸溶液洗脱，至流出的溶液中G418效价低于5mg/L时，停止洗脱。
收集G418甲醇硫酸解析液约640L，发酵单位6152mg/L，收率为94.8％。
4、真空浓缩和活性炭脱色
采用双效蒸发器，操作条件：温度60℃，真空度为-0.09MPa，G418浓缩液约71.0L，然后加入200g，80目的活性炭后搅拌1h；静止1h，温度60℃。
过滤得到G418滤液71.0L，发酵单位53236mg/L，收率为96.0％。
5、干燥
使用冷冻燥机器干燥，每个托盘装量约1.5L，干燥条件：温度-45～-5℃；真空度：20～25Pa；掺入空气条件：1～3s/1min，干燥时间72h。
所得成品重量为3.77kg，G418含量为98.8％，总收率为82.8％。
实施例2 G418发酵液的精制纯化工艺
1、发酵液预处理：G418发酵液15m3，发酵单位为915mg/L。
加入草酸调节G418发酵液pH至3.0，草酸用量为60kg，搅拌3h。加入助滤剂硅藻土，用量为600kg，目数100目，搅拌40min。经板框过滤，得到G418溶液11.0m3。经检测，发酵单位是1226mg/L，发酵液预处理的收率为98.3％。
2、陶瓷膜过滤
采用循环式过滤，流速控制在10m/s，压力控制0.1-0.2MPa，滤液温度控制在50℃。过滤结束，G418水溶液10.4m3，发酵单位是1277mg/L，收率为98.5％。
3、树脂吸附
树脂吸附是指依次用阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和大孔吸附树脂得到G418溶液。具体如下：
阳离子交换树脂上样：将阳离子树脂装入阳性柱内，G418溶液由上至下进入树脂柱内，流速控制在4.0BV/h，吸附材料的母体结构为苯乙烯-二乙烯苯共聚物(其中二乙烯苯在共聚物中的摩尔百分含量为7％)，其用量为665KG。
阳离子交换树脂淋洗：先用纯化水自上而下洗涤2个柱体积，流速控制在4.0BV/h，漂洗至洗出液无粉色。然后用配置0.2mol/L的盐酸溶液，自上而下淋洗7个柱体积，流速控制在3.0BV/h，最后用纯化水淋洗至洗出液的pH4.5。
阳离子交换树脂洗脱：淋洗结束，使用0.5mol/L的氨水溶液由上至下进入树脂柱内，流速控制在4.0BV/h，至流出的溶液中G418效价低于5mg/L时，停止洗脱。收集G418洗脱液约5320L，发酵单位2354mg/L，收率为94.3％。
阴离子交换树脂：将氨水解析液进入阴离子交换树脂，进行脱色，流速为2.0BV/h，吸附材料的母体结构为苯乙烯-二乙烯苯共聚物，用量为665KG。收集G418洗脱液约5500L，发酵单位2247mg/L，收率为98.7％。
大孔吸附树脂上样：将阴离子交换树脂脱色液以2.0BV/h流速由上至下进入到大孔树脂柱中，其母体结构聚苯乙烯，其用量为247KG，静止6h。
大孔吸附树脂淋洗：先用纯化水自上而下洗涤2个柱体积，流速控制在2.0BV/h。
大孔吸附树脂洗脱：淋洗结束，使用10％的甲醇溶液由上至下进入树脂柱内，流速控制在4.0BV/h，收集含有G418甲醇液，然后使用0.03mol/L硫酸溶液洗脱，至流出的溶液中G418效价低于5.0mg/L时，停止洗脱。收集G418甲醇硫酸解析液约2500L，发酵单位4661mg/L，收率为94.3％。
4、真空浓缩和活性炭脱色
采用双效蒸发器，操作条件：温度60℃，真空度为-0.09MPa，G418浓缩液约250.0L，然后加入580g，200目的活性炭后搅拌1h；静止1h，温度60℃。过滤得到G418滤液249.0L，发酵单位44784mg/L，收率为95.7％。
5、干燥
使用冷冻燥机器干燥，每个托盘装量约2.0L，干燥条件：温度-45～-5℃；真空度：20～25Pa；掺入空气条件：1～3s/1min，干燥时间72h。
所得成品重量为11.0kg，G418含量为98.6％，总收率为80.1％。
实施例3 G418发酵液的精制纯化工艺(绛红色小单孢菌)
使用编号为ATCC15835的绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)进行G418发酵生产。菌株ATCC15835参见Testa RT,Tilley BC.Biotransformation,a new approachto aminoglycoside biosynthesis:Ⅱgentamicin,J Antibiot(Tokyo),1976,29(2):140-146。
具体地，采用三级发酵模式生产G418，各级配方和工艺控制条件如下：
一级种子配方：葡萄糖0.5％，玉米淀粉1.5％，中温黄豆饼粉1.5％，蛋白胨0.2，硫酸铵0.2％，碳酸钙0.2％。培养条件：37℃，培养周期：48-56hrs。向二级种子罐移种条件：镜检网枝无杂菌，菌体浓度：10％-12％。移种量：0.5％。
二级种子配方：玉米淀粉2.0％，玉米粉0.5％，中温黄豆饼粉2.0％，氯化钾0.05％，磷酸氢二钾0.02％，碳酸钙0.3％。培养条件：37℃，培养周期：36-48hrs。向三级发酵罐移种条件：镜检网枝无杂菌，菌体浓度15％-20％。移种量：10.0％。
三级发酵配方：玉米淀粉4.5％，玉米粉1.0％，中温黄豆饼粉4.0％，鱼粉0.5％，磷酸二氢钾0.1％，氯化钴0.0001％，大豆油0.5％，碳酸钙0.5％。此外，在发酵第3天和第6天分别补入3％左右的玉米淀粉。培养条件：34℃，培养周期：9-12天，60吨发酵罐检测发酵单位不低于750mg/L。
1、发酵液预处理：G418发酵液45m3，发酵单位为790mg/L。
加入草酸调节G418发酵液pH至2.5，草酸用量为190kg，搅拌3h。加入助滤剂珍珠岩，用量为1350kg，目数100目，搅拌30min。经板框过滤，得到G418溶液32.0m3。经检测，发酵单位是1088mg/L，发酵液预处理的收率为98.0％。
2、陶瓷膜过滤
采用循环式过滤，流速控制在10m/s，压力控制0.1-0.2MPa，滤液温度控制在50℃。过滤结束，G418水溶液30.3m3，发酵单位是1133mg/L，收率为98.6％。
3、树脂吸附
树脂吸附是指依次用阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和大孔吸附树脂得到G418溶液。具体如下：
阳离子交换树脂上样：将阳离子树脂装入阳性柱内，G418溶液由上至下进入树脂柱内，流速控制在4.0BV/h，吸附材料的母体结构为苯乙烯-二乙烯苯共聚物(其中二乙烯苯在共聚物中的摩尔百分含量为7％)，其用量为1650KG。
阳离子交换树脂淋洗：先用纯化水自上而下洗涤2个柱体积，流速控制在4.0BV/h，漂洗至洗出液无粉色。然后用配置0.2mol/L的盐酸溶液，自上而下淋洗7个柱体积，流速控制在3.0BV/h，最后用纯化水淋洗至洗出液的pH4.5。
阳离子交换树脂洗脱：淋洗结束，使用0.5mol/L的氨水溶液由上至下进入树脂柱内，流速控制在4.0BV/h，至流出的溶液中G418效价低于5mg/L时，停止洗脱。收集G418洗脱液约14.8m3，发酵单位2178mg/L，收率为93.9％。
阴离子交换树脂：将氨水解析液进入阴离子交换树脂，进行脱色，流速为2.0BV/h，吸附材料的母体结构为苯乙烯-二乙烯苯共聚物，用量为1650KG。收集G418洗脱液约15.5m3，发酵单位2056mg/L，收率为98.9％。
大孔吸附树脂上样：将阴离子交换树脂脱色液以2.0BV/h流速由上至下进入到大孔树脂柱中，其母体结构聚苯乙烯，其用量为550KG，静止6h。
大孔吸附树脂淋洗：先用纯化水自上而下洗涤2个柱体积，流速控制在2.0BV/h。
大孔吸附树脂洗脱：淋洗结束，使用10％的甲醇溶液由上至下进入树脂柱内，流速控制在4.0BV/h，收集含有G418甲醇液，然后使用0.03mol/L硫酸溶液洗脱，至流出的溶液中G418效价低于5.0mg/L时，停止洗脱。收集G418甲醇硫酸解析液约5.5m3，发酵单位5452mg/L，收率为94.1％。
4、真空浓缩和活性炭脱色
采用双效蒸发器，操作条件：温度60℃，真空度为-0.09MPa，G418浓缩液约680.0L，然后加入1.0Kg，200目的活性炭后搅拌1h；静止1h，温度60℃。过滤得到G418滤液678.0L，发酵单位42192mg/L，收率为95.4％。
5、干燥
使用冷冻燥机器干燥，每个托盘装量约2.0L，干燥条件：温度-45～-5℃；真空度：20～25Pa；掺入空气条件：1～3s/1min，干燥时间72h。
所得成品重量为28.6kg，G418含量为98.5％，总收率为80.4％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.G418发酵液的精制纯化工艺，其特征在于，包括：用草酸调节G418发酵液pH至2.0-3.0，然后加入助滤剂，充分搅拌，再经板框过滤、得到G418溶液；然后将G418溶液依次经陶瓷膜过滤、阳离子交换树脂吸附、阴离子交换树脂脱色、大孔吸附树脂吸附、真空浓缩和活性炭脱色。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，用草酸调节G418发酵液pH至2.0-3.0，搅拌2-3h后加入助滤剂。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，加入助滤剂搅拌20-40min后再经板框过滤；
所述助滤剂为硅藻土或珍珠岩，目数为40-100目，助滤剂的用量为G418发酵液体积的2-4％。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，陶瓷膜过滤中选用多通道陶瓷膜，通道数控制在10-12；
膜材质为玻璃膜，孔径为0.20μm；
流速控制在5-10m/s，压力控制在0.1-0.2MPa，滤液温度控制在40-50℃。
5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，阳离子交换树脂吸附的方法如下：
A1、阳离子交换树脂上样：将阳离子树脂装入阳性柱内，G418溶液由上至下进入树脂柱内，流速控制在2.0-4.0BV/h；
A2、阳离子交换树脂淋洗：先用纯化水自上而下洗涤2.0-4.0个柱体积，流速控制在2.0BV/h，漂洗至洗出液无粉色；然后用0.2mol/L盐酸自上而下淋洗6-8个柱体积，流速控制在2.0-4.0BV/h，最后用纯化水淋洗至洗出液的pH4.0-5.0；
A3、阳离子交换树脂洗脱：淋洗结束后，用0.5mol/L氨水由上至下进入树脂柱内，流速控制在2.0-4.0BV/h，收集氨水解析液，至流出的氨水解析液中G418效价低于5.0mg/L时，停止洗脱。
6.根据权利要求5所述的工艺，其特征在于，阴离子交换树脂脱色包括：将氨水解析液进入阴离子交换树脂，流速控制在1.5-3.0BV/h，进行脱色，收集脱色液；脱色液颜色为清澈透明或淡黄色，若颜色深，呈现棕色或深黄色，则需重复阴离子交换树脂脱色；
所述阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，其树脂材料的母体结构为苯乙烯-二乙烯苯共聚物，其中二乙烯苯在共聚物中的摩尔百分含量为4％-7％，树脂材料的用量为G418质量的30-50倍；树脂柱的径高比为1:8-10。
7.根据权利要求6所述的工艺，其特征在于，大孔吸附树脂吸附的方法如下：
B1、大孔吸附树脂上样：将阴离子交换树脂脱色液以2.0-4.0BV/h的流速由上至下进入到大孔树脂柱中，直至树脂柱饱和，停止吸附，静置4.0-6.0h；
B2、大孔吸附树脂淋洗：先用纯化水自上而下洗涤2.0-4.0个柱体积，流速控制在2.0-4.0BV/h；
B3、大孔吸附树脂洗脱：淋洗结束后，用10％甲醇水溶液由上至下进入树脂柱内，流速控制在2.0-4.0BV/h，洗脱5.0-6.0个柱体积，收集含有G418的甲醇液，然后用0.03mol/L硫酸溶液洗脱，洗脱2.0-4.0个柱体积，收集硫酸解析液，至流出的硫酸解析液中G418效价低于5.0mg/L时，停止洗脱；
所述大孔吸附树脂，其树脂材料的母体结构为聚苯乙烯，树脂材料的用量为G418质量的10-20倍；树脂柱的径高比为1:8-10。
8.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，真空浓缩的条件为：50-70℃，真空度-0.06～-0.09MPa，浓缩至原收集液体积的1/8-1/10。
9.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，经真空浓缩后，向浓缩液中加入活性炭搅拌0.5-1.0h；静置0.5-1.0h，整个过程温度控制在55-60℃；
活性炭的目数为80-200目，用量为G418质量的1/50-1/20。
10.根据权利要求1-9任一项所述的工艺，其特征在于，所述G418发酵液为棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)、绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)或红橙小单孢菌(Micromonospora rhodorangea)发酵液。
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