CN105132513B - 全水相直通制备阿莫西林或氨苄西林的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全水相直通制备阿莫西林或氨苄西林的方法。该方法以高浓度青霉素GK或青霉素VK提取液为原料，固定化青霉素G酰化酶或青霉素V酰化酶作为酶催化剂，经催化裂解、分离、酸化、过滤、层析、纳滤浓缩等全水相操作，得到高浓度6‑APA溶液或晶体，再与对羟基苯甘氨酸甲酯或苯甘氨酸甲酯在固定化青霉素合成酶催化下，合成阿莫西林或氨苄西林；该方法全过程为水相反应，不使用任何有机溶媒，减少环境的污染；且利用特殊的固定化青霉素G酰化酶和青霉素V酰化酶裂解高浓度青霉素GK或VK提取液以及采用了特殊的大孔吸附树脂分离裂解产物，大大简化了工艺步骤、降低生产成本，提高产品收率，满足工业化生产要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种全水相直通制备阿莫西林或氨苄西林的方法，属于生物医药领域。
背景技术
阿莫西林和氨苄西林是一种β-内酰胺类抗生素，其中阿莫西林是目前用量最大的口服抗生素品种。
目前阿莫西林合成有化学法和酶法两种工艺，化学法为老工艺，目前仍有少量的使用，流程为对羟基苯甘氨酸邓钾盐与特戊酰氯混合后经混酐、缩合、水解、结晶等工序合成阿莫西林，该工艺复杂，、用到大量的有毒物质。
酶法是目前的主流工艺，中国专利(申请号CN200410012464.0)中提到青霉素裂解液酸化后按体积的25％～50％加入甲基异丁基酮，萃取分离，6-APA水相按结晶液体积加入50％～60％的丙酮，调等电点结晶，抽滤，洗涤和干燥。结晶粉配制用于制备阿莫西林；中国专利(申请号CN 201410208804.0)中提到青霉素裂解液酸化后，加入超高交联树脂或大孔吸附树脂，吸附6-APA溶液中的苯乙酸，苯乙酸的截留率为80％，固液分离后，6-APA溶液氨水回调结晶，抽滤，洗涤和干燥。中国专利(申请号CN201410348904.3)中提到将6％～10％浓度的青霉素裂解液，纳滤浓缩到6-APA浓度为7％～12％，酸化，按6-APA溶液体积加入60％的丁醇或丁酯萃取苯乙酸，分离所得水相进苯乙烯类大孔树脂层析，收集苯乙酸浓度≤100PPM的6-APA，直接制备阿莫西林。总摩尔收率79.2％，6-APA溶液终浓度中含苯乙酸25PPM。
现有工艺上游青霉素GK裂解后的6-APA溶液中大量的苯乙酸和少量的乙酸丁酯，通过萃取或树脂纯化不能完全去除苯乙酸和乙酸丁酯，导致6-APA必须结晶纯化，同时结晶母液不能经济的利用，也增加结晶、抽滤、洗涤和干燥等步骤，降低收率和增加了劳动强度。6-APA结晶粉中仍有少量苯乙酸残留，苯乙酸抑制阿莫西林的合成反应，导致固定化青霉素合成酶转化效率降低。
发明内容
针对现有的合成阿莫西林或氨苄西林的方法中，存在青霉素GK裂解浓度低，6-APA中苯乙酸用化学方法或树脂去除不干净，苯乙酸抑制阿莫西林的合成反应，过程中使用大量的有机溶媒，导致产能低，生产成本高，对环境污染以严重等一系列问题，本发明的目的是在于提供一种青霉素GK(VK)在高浓度下裂解，且可以实现裂解产物中6-APA完全分离，高产率制备高纯度阿莫西林或氨苄西林的方法，该方法全程不使用有机溶媒，对环境污染小，成本低，满足工业生产要求。
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种全水相直通制备阿莫西林或氨苄西林的方法，该方法包括以下步骤：
a、通过固定化青霉素G酰化酶或固定化青霉素V酰化酶裂解青霉素GK提取液或青霉素VK提取液，得到6-APA和苯乙酸混合液或6-APA和苯氧乙酸混合液；所述的固定化青霉素G酰化酶的氨基酸序列如SEQ NO.1所示；
b、所得6-APA和苯乙酸混合液或6-APA和苯氧乙酸混合液经过酸化后，分离析出的苯乙酸晶体或苯氧乙酸晶体；分离晶体所得余液通过大孔吸附树脂层析分离，收集6-APA溶液；所述6-APA溶液通过pH调节可进一步获得6-APA晶体；
c、向所述6-APA溶液或6-APA晶体中加入对羟基苯甘氨酸甲酯或苯甘氨酸甲酯，在固定化青霉素合成酶的催化作用下反应，得到阿莫西林或氨苄西林。
本发明的技术方案中首次应用一种全新的固定化青霉素G酰化酶(PGA-6)或固定化青霉素V酰化酶(PVA-4)来实现青霉素GK提取液或青霉素VK提取液的裂解制取6-APA，再进一步得到阿莫西林或氨苄西林；该方法全部操作过程都避免了有机溶媒的介入，达到简化工艺步骤，节约成本、满足环保的要求。
本发明的全水相直通制备阿莫西林或氨苄西林的方法还包括以下优选方案：
优选的方案中，青霉素GK提取液或青霉素VK提取液浓度为8wt％～30wt％，最优选为18wt％～25wt％。该优选方案中由于采用特殊的固定化青霉素G酰化酶或固定化青霉素V酰化酶，其具有更高的活力系数及耐环境的能力，更适应于高浓度底物反应。大大简化了现有工艺对裂解产物进行纳膜过滤，浓缩等操作步骤。在现有的固定化青霉素酰化酶一般适应的底物浓度在8wt％以下，经过酶裂解后得到的6-APA溶液一般浓度都较低，需大量的操作实现浓缩、提纯等步骤。
优选的方案中，固定化青霉素G酰化酶(PGA-6)活力为400U/g～500U/g，耐受最低pH值为4.0，耐受最高底物浓度为30wt％。
优选的方案中，固定化青霉素V酰化酶(PVA-4)活力为450U/g～500U/g，耐受最低pH值为2.0，耐受最高底物浓度为30wt％。
优选的固定化青霉素G酰化酶(PGA-6)和固定化青霉素V酰化酶(PVA-4)的活力系数高，对环境适应性强，适应更高浓度的底物反应，有利于简化后续的裂解产物的浓缩、提纯过程。
优选的方案中，裂解是在温度为25～37℃，pH值为7.0～8.5的条件下进行。在该优选的条件下进行固定化青霉素G酰化酶(PGA-6)和固定化青霉素V酰化酶(PVA-4)对青霉素GK提取液或青霉素VK提取液的催化裂解反应，能在较短时间内获得较高6-APA收率。一般在反应时间达到1～3h，青霉素GK或青霉素VK的转化率大于98％。
优选的方案中，固定化青霉素G酰化酶(PGA-6)与青霉素GK的质量比为0.45～0.60。
优选的方案中，固定化青霉素V酰化酶(PVA-4)与青霉素VK的质量比为0.45～0.49。
该优选的方案提供最佳的反应底物与催化酶的比例，主要基于选择的固定化青霉素G酰化酶(PGA-6)和固定化青霉素V酰化酶(PVA-4)活力系数高，可以降低酶的使用量，且达到更佳的反应效果。
优选的方案中，大孔吸附树脂为F-Z-001、PDA600、HP20或SP207(F-Z-001可购买于湖南宝利士生物技术有限公司，HP20或SP207可购买于日本三菱公司，PDA600可购买于purolite公司)中至少一种；最优选为F-Z-001。
优选的大孔树脂对苯乙酸和苯氧乙酸具有特殊的选择性吸附功能，可以实现6-APA与苯乙酸和苯氧乙酸完全分离。而现有的分离6-APA与苯乙酸和苯氧乙酸的方法一般采用大孔吸附树脂吸附分离或采用萃取分离，或者将两者结合，但是这些方法分离6-APA的效果都比较差，导致苯乙酸和苯氧乙酸残留，对后续阿莫西林或氨苄西林的合成具有抑制作用。如中国专利(申请号201410348904.3)中大孔吸收树脂吸附前需要采用丁醇或丁酯或丁醇与丁酯混合物进行萃取分离水相，再进大孔树脂层析分离，但分离后得到的6-APA溶液仍有100PPM以下的苯乙酸残留。又如，中国专利(申请号201410208804.0)中树脂吸附苯乙酸的截留率在80％以上，层析液仍有苯乙酸残留，需要结晶除杂，加入大量的酸碱，结晶粉要抽滤、洗涤和干燥等步骤，工序繁多，并且有大量的6-APA结晶母液废弃。而本发明采用的大孔吸附树脂直接对6-APA和苯乙酸混合液或6-APA和苯氧乙酸混合液进行层析分离后，得到的6-APA溶液测不出苯乙酸、苯氧乙酸和乙酸丁酯等。
优选的方案中，通过大孔吸附树脂层析分离过程中采用的浓度为2wt％～5wt％的碱溶液，或酒精作为洗脱剂。优选为采用碱溶液作为洗脱剂。本发明采用的大孔吸附树脂吸附后，通过低浓度的碱溶液就能实现再生，有利于大孔吸附树脂的重复使用以及苯乙酸和苯氧乙酸的回收利用。回收苯乙酸经处理后用于青霉素发酵。
优选的方案中，层析分离过程控制温度在10℃以下，收集到的6-APA溶液，pH控制在4.0～4.3时，得到6-APA晶体，pH控制在7.0～7.5时为6-APA溶液。其中，当收集的6-APA层析液调节pH值至4.0～4.3时，结晶收集6-APA，结晶母液纳滤浓缩2～3倍，6-APA结晶粉和对羟基苯甘氨酸甲酯或苯甘氨酸甲酯按一定比例加入浓缩母液中，在固定化青霉素合成酶的催化下制备阿莫西林或氨苄西林。其中，当收集的6-APA层析液调节pH值至7.0～7.5时，经纳滤浓缩或稀释到8.0wt％，按一定比例加入对羟基苯甘氨酸甲酯或苯甘氨酸甲酯溶解液，固定化青霉素合成酶制备阿莫西林或氨苄西林。
优选的方案中，酸化是在温度为4～10℃的条件下进行，优选在4～10℃条件下，酸化使6-APA和苯乙酸混合液或6-APA和苯氧乙酸混合液的pH不大于1，优选为pH为0.5～0.8。
优选的方案中，层析分离过程中，6-APA和苯乙酸混合液或6-APA和苯氧乙酸混合液中6-APA的浓度为3wt％～15wt％，优选在5wt％～10wt％，上柱6-APA和苯乙酸混合液或6-APA和苯氧乙酸混合液总体积为2BV～8BV，上柱的速度为1～6BV/h。
与现有技术的相比，本发明的技术方案具有如下优势：
1、本发明的技术方案中采用了一种特殊的固定化青霉素G酰化酶或固定化青霉素V酰化酶，其具有活力系数高、适应环境强的特点，可以适应高浓度青霉素GK提取液或青霉素VK提取液的裂解，能获得高浓度的6-APA溶液，有利于后续阿莫西林或氨苄西林的合成；大大简化了现有工艺需要对裂解产物进行纳膜过滤，浓缩等操作步骤。且固定化青霉素G酰化酶或固定化青霉素V酰化酶能在较短时间内获得较高6-APA收率，一般在反应时间达到1～3h，青霉素GK或青霉素VK的转化率大于98％。
2、本发明的优选的技术方案中采用了特殊的大孔吸附树脂，可在全水相的条件下一步实现6-APA与苯乙酸或苯氧乙酸的完全分离，获得高纯度的6-APA溶液，有利于后续高纯度阿莫西林或氨苄西林的合成。
3、本发明的技术方案步骤简单，成本低，不产生环境污染物，获得的目标产物纯度高，不低于98.5％，总摩尔收率为81～83％，高于现有直通工艺生产阿莫西林的纯度和收率。
附图说明
【图1】为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求的保护范围。
实施例1
1、将1000mL 8％、15％、20％、25％和30％的青霉素GK提取液，按180U/g底物、200U/g底物、220U/g底物、240U/g底物和270U/g底物投入固定化青霉素G酰化酶(PGA-6)，用3N氨水控制pH值8.0～8.3，温度30℃，裂解时间1～2h，裂解后固液分离，体积1040mL～1200mL。
2、降温到10℃以下，用6N盐酸下调pH值到0.5，过滤去除苯乙酸晶体，得1200mL～1400mL 6-APA和苯乙酸混合液。
3、1200mL～1400mL 6-APA和苯乙酸混合液上柱(树脂F-Z-001250mL)，控制上柱流速为1000mL/Hr，全程控制温度10℃以下，6-APA和苯乙酸混合液上柱完后，用250mL纯水顶洗层析柱，再用0.5N的氢氧化钠再生层析柱。过程中收集6-APA浓度大于5mg/mL的溶液。
4、1400mL 6-APA收集液用氨水调pH值7.5，纳滤浓缩或稀释到6-APA浓度8％。
5、按6-APA与D-HPM·HCl的重量比1.03加入D-HPM·HCl，固定化青霉素合成酶按6-APA重量1.0倍投酶，控温15℃，反应1～2hr，分离阿莫西林结晶粉。
| 底物浓度(％) | 青霉素转化率(％) | 阿莫西林摩尔总收率(％) | 备注 |
| 8％ | 98.24 | 80.12 | |
| 15％ | 98.14 | 81.89 | |
| 20％ | 98.41 | 82.24 | |
| 25％ | 98.21 | 81.01 | |
| 30％ | 97.98 | 80.46 |
实施例2
1、将1000mL 20％青霉素GK提取液，按220U/g底物投入固定化青霉素G酰化酶(PGA-6)，用3N氨水控制pH值8.0～8.3，温度30℃，裂解时间1～6hr，裂解后固液分离，体积1100mL。
2、降温到10℃以下，用6N盐酸下调pH值到0.5，过滤去除苯乙酸晶体，得1300mL 6-APA和苯乙酸混合液。
3、1300mL 6-APA和苯乙酸混合液，上柱250mL大孔吸附树脂(F-Z-001、PDA600、HP20、SP207、LXT-057)，控制上柱流速为1000mL/Hr，全程控制温度10℃以下，6-APA和苯乙酸混合液上柱完后，用250mL纯水顶洗层析柱，再用0.5N的氢氧化钠再生层析柱。过程中收集6-APA浓度大于5mg/mL的溶液。
4、6-APA收集液用氨水调pH值7.5，稀释到6-APA浓度8％。
5、按6-APA与D-HPM·HCl的重量比1.03加入D-HPM·HCl，固定化青霉素合成酶按6-APA重量1.0倍投酶，控温15℃，反应1～2hr，分离阿莫西林结晶粉。
LXT-057来自专利CN201410348904.3中；
实施例3
1、1000mL 20％青霉素GK&VK提取液，按220U/g底物分别投入固定化青霉素G酰化酶(IPA-750)(湖南福来格生物技术有限公司)、固定化青霉素G酰化酶(PGA-6)和固定化青霉素V酰化酶(PVA-4)，用3N氨水控制pH值8.0～8.3(PVA-4控制pH值7.0)，温度30℃，裂解时间1～2hr，裂解后固液分离，体积1100mL。
2、降温到10℃以下，用6N盐酸下调pH值到0.5，过滤去除苯乙酸或苯氧乙酸晶体，得1300mL 6-APA和苯乙酸混合液或6-APA和苯氧乙酸混合液。
3、1300mL 6-APA和苯乙酸混合液或6-APA和苯氧乙酸混合液分别上柱(树脂F-Z-001250mL)，分别收集6-APA浓度大于5mg/mL的溶液。
4、6-APA收集液用氨水调pH值7.5，测定6-APA的浓度，用纯水稀释到8％的浓度。
5、按6-APA与D-HPM·HCl的重量比1.03加入D-HPM·HCl溶液，固定化青霉素合成酶按6-APA重量1.0倍投酶，控温15℃，反应1～2hr，分离阿莫西林结晶粉。
| 酶种类 | 青霉素转化率(％) | 阿莫西林摩尔总收率(％) | 备注 |
| IPA-750 | 96.57 | 77.85 | |
| PGA-6 | 98.41 | 82.24 | |
| PVA-4 | 99.14 | 82.41 |
实施例4
6-APA稳定性加速试验
实验条件：10g装玻璃瓶密闭，55℃。
由表中数据看出，层析后结晶的6-APA，与有机溶媒萃取后结晶的6-APA稳定性要更好。
Claims (8)
1.全水相直通制备阿莫西林或氨苄西林的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、通过固定化青霉素G酰化酶或固定化青霉素V酰化酶裂解青霉素GK提取液或青霉素VK提取液，得到6-APA和苯乙酸混合液或6-APA和苯氧乙酸混合液；所述的固定化青霉素G酰化酶的氨基酸序列如SEQ NO.1所示；
b、所得6-APA和苯乙酸混合液或6-APA和苯氧乙酸混合液经过酸化后，分离析出的苯乙酸晶体或苯氧乙酸晶体；分离晶体所得余液通过大孔吸附树脂层析分离，收集6-APA溶液；所述6-APA溶液通过pH调节可进一步获得6-APA晶体；所述的大孔吸附树脂为F-Z-001；
c、向所述6-APA溶液或6-APA晶体中加入对羟基苯甘氨酸甲酯或苯甘氨酸甲酯，在固定化青霉素G酰化酶或固定化青霉素V酰化酶的催化作用下反应，得到阿莫西林或氨苄西林。
2.根据权利要求1所述的全水相直通制备阿莫西林或氨苄西林的方法，其特征在于，所述的青霉素GK提取液或青霉素VK提取液浓度为8wt％～30wt％。
3.根据权利要求2所述的全水相直通制备阿莫西林或氨苄西林的方法，其特征在于，所述的青霉素GK提取液或青霉素VK提取液浓度为18wt％～25wt％。
4.根据权利要求1所述的全水相直通制备阿莫西林或氨苄西林的方法，其特征在于，所述的固定化青霉素G酰化酶活力为400U/g～500U/g，耐受最低pH值为4.0，耐受最高底物浓度为30wt％；所述的固定化青霉素V酰化酶活力为450U/g～500U/g，耐受最低pH值为2.0，耐受最高底物浓度为30wt％。
5.根据权利要求1～4任一项所述的全水相直通制备阿莫西林或氨苄西林的方法，其特征在于，所述的裂解是在温度为25～37℃，pH值为7.0～8.5的条件下进行。
6.根据权利要求1所述的全水相直通制备阿莫西林或氨苄西林的方法，其特征在于，固定化青霉素G酰化酶与青霉素GK的质量比为0.45～0.60；固定化青霉素V酰化酶与青霉素VK的质量比为0.45～0.49。
7.根据权利要求1所述的全水相直通制备阿莫西林或氨苄西林的方法，其特征在于，通过大孔吸附树脂层析分离过程中采用的浓度为2wt％～5wt％的碱溶液，或酒精作为洗脱剂。
8.根据权利要求1所述的全水相直通制备阿莫西林或氨苄西林的方法，其特征在于，所述的层析分离过程控制温度在10℃以下，收集到的6-APA溶液pH控制在4.0～4.3时，得到6-APA晶体，pH控制在7.0～7.5时为6-APA溶液。
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Denomination of invention: A method for preparing amoxicillin or ampicillin directly through the entire aqueous phase Granted publication date: 20190115 Pledgee: Changsha Bank city branch of Limited by Share Ltd. Pledgor: HUNAN FLAG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024980012003 |