CN118048282B - 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用，所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）保藏于中国典藏微生物保护中心，保藏编号为：CCTCC NO:M20231613。所述解淀粉芽孢杆菌可用于雪茄烟发酵防霉和发酵增香。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体的说，涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。
背景技术
雪茄烟叶经过采摘、调制后会被送入发酵房进行发酵。雪茄烟发酵的核心是原烟所含基础物质在催化因子的作用下，通过特定的转化途径，发生一系列生物化学变化，使烟叶内各种化学成分更加协调，从而提高烟叶质量。如发酵过程会对大分子物质进行降解，分解为香气前体物质以及单糖，进而提高烟叶香气质和香气量。没有经过发酵的烟叶不仅含有青杂气、土杂气、木质气，而且烟气粗糙，刺激性大。而经过发酵的烟叶含青少，青杂气和土杂气基本消失，刺激性小，烟气细腻，烟叶弹性增强，燃烧性增强，因此，发酵是提升雪茄烟叶品质的关键环节。然而，雪茄烟在发酵过程中经常受到霉菌孢子的污染，严重制约着雪茄烟的品质。引起雪茄烟腐烂的微生物种类较多，主要有青霉属、曲霉属、根霉属、毛壳属、枝孢霉属和交链孢霉属真菌，以及不动杆菌、芽孢杆菌、乳杆菌和果胶杆菌属细菌等。
申请号为202211130724.9，主题名称为：一株解淀粉芽孢杆菌及其应用的发明专利公开了一株解淀粉芽孢杆菌在抑制卷烟烟草和/或雪茄烟烟草霉菌方面的应用。并具体公开了相应有抑制效果的霉菌，但是雪茄烟发酵过程还是一个去杂气和增香的过程，前述专利公开的解淀粉芽孢杆菌仅能抑制霉菌不能增加香气，功能上还有一定的缺陷。
发明内容
为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。
为实现上述目的，本发明第一方面提供一株解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）保藏于中国典藏微生物保护中心，保藏编号为：CCTCCNO:M20231613。
本发明第二方面提供上述的解淀粉芽孢杆菌在雪茄烟发酵防霉和发酵增香中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明提供的解淀粉芽抱杆菌CCTCC NO:M20231613具有广谱抑菌能力，已证实能够抑制的雪茄烟发酵霉变病原菌有黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、米根霉、谢瓦曲霉、聚多曲霉、产黄青霉、橘青霉等。在雪茄烟发酵过程中喷洒该菌株时，不仅能够有效降低雪茄烟发酵霉变率，还能在发酵结束后提高雪茄烟香气总含量。此外，该菌株还能具有，可在发酵过程中有效降解雪茄烟中蛋白质、纤维素、淀粉及果胶等大分子物质，形成香气前提物，改善雪茄烟中大分子含量多的苦涩、酸涩和味苦，易于形成雪茄烟特有风味。
2、本发明提供的解淀粉芽抱杆菌JDF-1是一株从发酵完成的多米尼加烟叶上分离的菌株，相比于其他环境和样本中分离的菌株及现有技术中许多基因工程改造或诱导突变等方式人工培育的菌株相比， 解淀粉芽抱杆菌JDF-1对于雪茄烟叶具有更好的定殖能力，利于其在施用后持续发挥作用。同时雪茄烟作为一种吸食商品，原生菌更兼具绿色安全性。
3、本发明提供的解淀粉芽抱杆菌能有效降低雪茄烟发酵霉变病原菌的侵染，改善烟叶质量，有助于雪茄烟提高发酵程度，促进物质转化，从而提高雪茄烟质量，形成风味。经过进一步研究发现，该菌株不仅在发酵过程中具有较好的防霉效果，对于雪茄烟晾晒阶段仍然具有较强的防霉能力，在实际发酵房中可降低70%以上的霉变率。
4、本发明提供的解淀粉芽孢杆菌以营养肉汤为培养基进行扩繁后离心，离心后的菌体用纯水稀释即可用于喷洒，纯水与发酵上清液比率为1:1，具有原料来源广、成本低、绿色环保并且制备方法简单的特点。同时，该种添加菌株的方法除了菌株本身不会带入其他物质影响发酵过程，雪茄烟发酵过程是比较复杂的过程，多添加任何一种物质都容易影响其风味和烟叶品质。因此，该方法有助于促进雪茄烟叶质量提升，对于雪茄烟总产值提高和农民增收具有积极意义。
附图说明
图1是本发明中菌株JDF-1的系统发育树；
图2是本发明中菌株产酶能力研究实验的实物图；
图3是本发明中烟叶霉变率测定结果柱状图；
图4是使用本发明中解淀粉芽抱杆菌JDF-1和常规发酵雪茄烟后30d，烟叶中致香成分含量对比图，柱状图中自上直下依次为：叶绿素降解产物、类胡萝卜素降解产物、西柏烷类降解产物、美拉德反应产物。
生物保藏
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌株编号JDF-1，分类命名为：解淀粉芽孢杆菌 JDF-1Bacillus amyloliquefaciensJDF-1已于2023年9月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M20231613。
具体实施方式
本发明中，解淀粉芽孢杆菌JDF-1和解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M20231613是同一菌株，其二者意义相同，其名称（编号）可以互换使用。
本发明的发明人在研究时发现，解淀粉芽孢杆菌JDF-1在雪茄烟发酵过程中能够抑制的雪茄烟发酵霉变病原菌黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、米根霉、谢瓦曲霉、聚多曲霉、产黄青霉和橘青霉的同时还能增加雪茄烟发酵后的香气。而且在雪茄烟晾晒阶段仍然具有较强的防霉能力，在实际发酵房中可降低70%以上的霉变率。
基于上述发现，本发明一方面提供一株解淀粉芽孢杆菌所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）保藏于中国典藏微生物保护中心，保藏编号为：CCTCC NO:M20231613。
本发明第二方面提供上述的解淀粉芽孢杆菌在雪茄烟发酵防霉和发酵增香中的应用。
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
实施例一
本实施例用于说明本发明提供的解淀粉芽孢杆菌JDF-1的分离、鉴定以及保藏。
（一）菌株分离和纯化
发明人在研究过程中，采用稀释涂布平板法从云南省烟草公司玉溪市公司提供的发酵结束的多米尼加雪茄烟叶上分离获得一株编号为JDF-1的菌株。
（二）菌株鉴定
参照《伯杰氏系统分类手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株JDF-1进行菌株形态学及生理生化特征鉴定。结果如下：解淀粉芽孢杆菌JDF-1整体呈白色，不产生色素，菌落偏大，边缘不规则，呈皱裙状，菌落表面微微凸起。其革兰氏染色、淀粉水解试验、明胶液化试验、葡萄糖发酵试验、过氧化氢酶试验、甲基红试验及V-P试验等测定结果为阳性；菌株D-甘露醇试验、柠檬酸分解试验、硫化氢试验、吲哚试验及乳糖发酵试验等测定结果为阴性，如表1所示，根据其测定结果初步判断菌株为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。
表1菌株JDF-1生理生化试验结果
Table 1 Physiological and biochemical characteristics of bacteriumJDF-1
注：+：阳性，-：阴性，以标准菌株为对照；
Note: +: positive; −: negative;the standard strain was used ascontrol。
将解淀粉芽孢杆菌JDF-1接种至纯化液体培养基中，28℃恒温摇床中180 r/min振荡培养过夜，无菌条件下取样于紫外分光光度计下读取培养菌液OD600值，当OD600值近似于1(约1*109cfu/L)时停止培养。使用通用引物27F-1492R通过PCR扩增生防菌的16S rDNA基因，扩增的前向引物为27F（序列：TACGGYTACCTTGTTACGACTT），反向引物为1492R（序列：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG），扩增长度为1.5K左右，扩增的PCR产物在上海荣序生物技术有限公司进行测序，测序结果如SEQ ID NO.1所示。
将序列结果输入NCBI（National Center for Biotechnology Information）网站（http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov）的生物技术信息中心数据库，并利用BLAST程序进行核酸序列比较。使用MEGA11软件基于邻接法构建系统发育树，如附图1所示。菌株JDF-1与GenBank数据库中的Bacillus amyloliquefaciens聚类在一起，且16SrDNA基因序列与解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)的同源度达99.99%。结合生理生化特性及分子生物学，菌株JDF-1属于芽孢杆菌属中的解淀粉芽孢杆菌。
（三）菌株产酶能力研究
1、菌株解蛋白能力
将纯化得到的JDF-1接种LB平板培养2 d后，用无菌接种环蘸取少量菌落分别接种于酪蛋白培养基上（产蛋白酶鉴别培养基）上培养，倒扣放置于28 ℃恒温箱中培养2~3d，观察产光圈情况并测量光圈直径和菌落直径，每一个处理设置三次重复，结果如表2所示。图2中左上的培养皿图为菌株解蛋白实物图。
其中，酪蛋白固体培养基配制：称取酪蛋白10g，磷酸二氢钾0.3g，七水硫酸镁0.5g，氯化钠1g，蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，琼脂18g，水1L，pH6.8-7之间；接下来进行搅拌，直至将全部溶质搅拌溶解到溶液中，最后使用高压灭菌锅进行温度为121℃，半小时高压灭菌。
2、菌株解淀粉能力
将保存好的菌株通过挑选，在超净台上进行接种，
将纯化得到的JDF-1接种接种在在营养肉汤培养基中进行菌株培养，将培养好后的菌株再次接种在淀粉培养基中，淀粉培养基倒扣放置于28 ℃恒温箱中培养2~3d，待菌长出后用卢戈氏碘液进行染色。淀粉培养基中含有可溶性淀粉，可溶性淀粉遇碘变成蓝色。变成蓝色之后观察菌周围是否有光圈出现，如果菌周围有透明光圈说明菌产解淀粉酶，菌产生了淀粉酶分解了周围的淀粉。观察产光圈情况并测量光圈直径和菌落直径，每一个处理设置三次重复。结果如表2所示。图2中右上的培养皿图为菌株解淀粉实物图。
淀粉培养基：10g可容性淀粉、5g蛋白胨、2.5g氯化钠、2.5g牛肉膏、7.5-10g琼脂粉、 500ml蒸馏水、pH: 7.0-7.2，灭菌温度115℃，灭菌时间20分钟。
卢戈氏碘液：0.5g碘、1.0g碘化钾、150ml蒸馏水。灭菌温度115℃，灭菌时间20分钟。
3、菌株解果胶能力
将纯化得到的JDF-1接种LB平板培养2 d后，用无菌接种环蘸取少量菌落分别接种于产果胶酶鉴别培养基上培养，倒扣放置于28 ℃恒温箱中培养2~3d，观察产光圈情况并测量光圈直径和菌落直径，每一个处理设置三次重复，结果如表2所示。图2中左下的培养皿图为菌株解果胶实物图。
果胶酶产生菌选择培养基：
果胶4.0 g、磷酸氢二钾0.1 g、硫酸镁0.5 g、硝酸钠3.0 g、七水合硫酸亚铁0. 01g、刚果红0. 1 g、琼脂粉12.0 g、水1L，pH值7.0，121℃灭菌20 min，用于筛选具有降解果胶功能的微生物。为了让果胶充分溶解，我们在配置培养基时可以先倒入200-300 ml水放入锅里加热后，再把称取的果胶粉一点一点的加到锅里，期间用玻璃棒一直搅拌，待果胶充分融化后再移到烧杯中，加水补至1000ml，然后放其他的材料，搅拌均匀。
4、菌株解纤维能力
将纯化得到的JDF-1接种LB平板培养2d后，用无菌接种环蘸取少量菌落分别接种于羧甲基纤维素钠培养基（产纤维素酶鉴别培养基）上培养，倒扣放置于28℃恒温箱中培养2~3d，观察产光圈情况并测量光圈直径和菌落直径，每一个处理设置三次重复，结果如表2所示。图2中右下的培养皿图为菌株解纤维实物图。
羧甲基纤维素钠培养基：
刚果红0.04 g、CMC-Na 8.0 g、KH2PO41.0 g、琼脂15.0 g、土豆汁100ml，蒸馏水定容至1L，pH值7.0，121℃灭菌20 min，用于筛选具有降解果胶功能的微生物。
表2菌株JDF-1产酶能力
（四）菌株JDF-1防霉能力
选取大小均匀、无机械损伤和感染的雪茄烟叶进行发酵。将霉变病原菌接种在PDA培养基上，28 ℃下生长7 d，用无菌超纯水收集孢子，通过三层无菌纱布过滤残留菌丝，用0.1%的葡萄糖溶液稀释孢子浓度至105spores/ml作为孢子悬浮液。将解淀粉芽孢杆菌JDF-1接种至150 ml的NB培养液中，28℃下，180 r/min摇动48 h，作为生防菌的种子液，将种子液离心并取离心所得的细胞颗粒溶于0.1%的葡萄糖溶液作为发酵液备用。以喷洒霉变病原菌孢子悬浮液和JDF-1发酵液作为处理组，仅喷洒病原菌孢子悬浮液作为对照组，每组发酵烟叶质量均为2 kg，置于35℃和70%相对湿度条件下发酵35 d。
发酵完成后测定霉变率：使用叶面积测定仪测定烟叶和霉变面积，计算霉变率。
霉变率参照以下公式评估：
GI=（S1/S）*100%
式中：GI表示霉变率，S1表示霉变面积，S表示烟叶总面积。
霉变率柱状图如附图3所示，对照组在发酵15 d和30 d 霉变率分别78.09%、70.15%，添加了本发明中的解淀粉芽抱杆菌JDF-1进行发酵，两个发酵时期霉变率均显著下降，分别为6.2%、4.65%。
（五）菌株保藏
解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌株编号JDF-1，分类命名：解淀粉芽孢杆菌 JDF-1Bacillus amyloliquefaciensJDF-1，已于2023年9月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M20231613。
实施例二
本实施例中的霉变微生物：胡椒曲霉（Aspergillus piperis）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、赭曲霉（Aspergillus ochraceus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、橘青霉（Penicillium citrinum）、聚多曲霉（Aspergillus sydowii）和谢瓦曲霉（Aspergillus chevalieri）分离自云南省烟草公司玉溪市公司提供的发酵结束的多米尼加雪茄烟叶上。
霉变微生物抑制实验：
采用平板对峙法，将直径0.5cm的霉变微生物接至PDA平板中心，并将纯化的JDF-1接种到距离霉变微生物2.5cm处的外围，呈等边三角形顶点或者正方形顶点形式点接，并以只接霉变微生物为空白对照。在28℃恒温培养箱培育，直至对照平板的菌丝到达平板边缘。观察烟草疫霉生长情况及周围是否产生抑制带，并测量抑制带宽度（mm）。
实验结果如下表3所示：
表3 菌株JDF-1的抑制谱
Table.3 Spectrum of inhibition for isolate JDF-1
注：抑制带的宽度值为3次重复的平均值±标准差。
实施例三
将解淀粉芽孢杆菌JDF-1接种至NB培养液中，28℃下，180 r/min摇动48 h，作为生防菌的种子液，将种子液离心并取离心所得的细胞颗粒溶于0.1%的葡萄糖溶液作为发酵液备用。
测定发酵30d后喷洒发酵液的雪茄烟烟叶和常规发酵（CK）的雪茄烟中致香成分：叶绿素降解产物、类胡萝卜素降解产物、西柏烷类降解产物和美拉德反应产物的含量，结果如附图4所示，结果显示添加本发明的解淀粉芽抱杆菌JDF-1进行发酵，致香成分总含量较CK提高了32.88%，为3.625mol·L-1，而CK仅为2.728 mol·L-1。
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (2)
1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌保藏于中国典藏微生物保护中心，保藏编号为：CCTCC NO.M20231613。
2.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在雪茄烟发酵增香和发酵防治胡椒曲霉(Aspergillus piperis)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、赭曲霉(Aspergillusochraceus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、橘青霉(Penicillium citrinum)、聚多曲霉(Aspergillus sydowii)和谢瓦曲霉(Aspergillus chevalieri)中的应用。
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