CN114891694B - 一种印度不动杆菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种印度不动杆菌及其用途，本发明的印度不动杆菌Acinetobacter indicusSCT‑B2，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为：CGMCC NO.23679。本发明的菌株在生长过程中可以分解利用烟叶并产生多种风味物质。将该菌株的发酵液或菌体按照烟叶重量的1～5％，加入到含水量为20～40％的雪茄烟草中，发酵15～30天可以明显提升雪茄烟叶的豆香香韵，明显减少烟叶刺激性，减少杂气，烟气柔和，烟香增加，感官质量明显改善。
Description
技术领域
本发明涉及烟草加工技术领域，尤其涉及一种印度不动杆菌及其用途。
背景技术
烟叶发酵是烟草加工过程中的重要环节之一，发酵的主要目的是促进烟叶化学成分及物理性能的变化，从而改善烟叶的内在品质，提高烟叶的使用价值。通过发酵处理，可使烟叶的青杂气减少，刺激性降低，烟叶特征香气显露，香气质变好、香气量增加，烟气由粗糙变得细腻，吃味变得醇和，可用性提高。烟叶发酵过程主要是主要由烟叶中的微生物群落驱动。然而，这些过程漫长且不受控制。现代人工发酵一直试图通过调整发酵条件或在自然发酵群落中添加特殊配方的发酵剂来控制过程。采用外接微生物发酵技术，可以缩短烟叶发酵时间，提高有效作业率，可以赋予烟叶自然、醇和芳香，除去苦涩、青杂气味，谐调因含氮过高而引起的辛辣味，对提高烟叶品质有重要作用。外加微生物可能并不总是产生积极的结果，因为接种的微生物无法驱动群落向有利于产品发酵的方向进化。主要原因是接种微生物(外在)和天然微生物(内在)之间的微生物相互作用导致微生物群落的结构和功能不完整。微生物相互作用，如共生、协同、捕食、寄生和竞争，可以极大地影响微生物群落的代谢活动。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种印度不动杆菌及其用途，本发明通过前期筛选的产香微生物，添加至雪茄烟叶中进行强化发酵，烟叶可用性明显提高。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明的第一个方面是提供一种印度不动杆菌Acinetobacter indicus SCT-B2，所述印度不动杆菌Acinetobacter indicus SCT-B2，已于2021年10月28日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.23679保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。
所述印度不动杆菌为所述菌株为革兰阴性杆菌，专性需氧，多为球杆状、常呈双排列，可单个存在，有时形成丝状和链状，黏液型菌株有荚膜，无芽孢，无鞭毛，最适生长温度为35℃。
本发明另一方面还提供了所述的印度不动杆菌在微生物培养、烟叶发酵中的用途。
本发明又一方面还提供了所述的一种印度不动杆菌的获取方法，包括以下步骤：
(1)振荡洗脱烟叶上的微生物，离心收集微生物；
(2)将收集的微生物复溶后加入荧光染料cy5-hydrazide，在暗处染色；
(3)差速离心分离微生物和未结合的染料，先通过荧光显微镜检测菌株的染色情况，然后通过流式细胞仪将被荧光标记的菌株分选至装有YH培养基的96深孔板中进行培养；
(4)通过2，4-硝基苯肼测定培养基中醛酮化合物的含量，再使用GC-MS鉴定产物的种类，所得的菌株即为印度不动杆菌Acinetobacter indicus SCT-B2。
通过上述方法得到的菌株的培养步骤为：
平板培养：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，将冷冻保存的甘油悬液接种到平板上，37℃恒温培养24h；或
摇瓶培养摇瓶培养：葡萄糖30g，蛋白胨20g，酵母粉15g，K2HPO4.1.5g NaH2PO4 3g，加蒸馏水1000mL，调pH值为7.0，高压蒸汽灭菌；摇瓶装液量为10～20％(v/v)，接种量为2～5％(v/v)，培养温度为30～35℃，摇床转速为150～220rpm，摇瓶培养1～3天。
本发明再一方面还提供了上述的方法获取的菌株在微生物培养、烟叶发酵中的用途。
最后，本发明还提供了一种烟叶的发酵方法，包括以下步骤：
A、提供一种印度不动杆菌Acinetobacter indicus SCT-B2，其保藏编号为：CGMCCNO.23679；
B、将印度不动杆菌Acinetobacter indicus SCT-B2进行发酵培养，获得发酵液及菌体；
C、将步骤B所得的发酵液及菌体用水、生理盐水或者其它缓冲液进行稀释，稀释后菌液浓度达到106～1012个菌/mL，将菌液按照烟叶重量的1～5％，加入到含水量为20～50％的烟叶中进行发酵，发酵温度为30～50℃，发酵时间15～30天。
本发明的有益效果在于：
采用本发明来改善雪茄烟叶原料，工艺过程简单，反应条件温和；经过处理后，烟叶豆香香韵显著增加，降低杂气，提升醇和度、流畅度、缠绵感、甜润度、改善刺激性、干净度、回味感，烟叶可用性明显提高。该方法具有简单实用，成本低廉等特点，可望在工业上推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要实用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明菌株的菌落图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1、微生物的培高通量分选及培养
烟叶中的微生物分离：取三个不同批次的烟叶并加入灭菌的生理盐水或中性的磷酸盐缓冲液，振荡分离烟叶和微生物，离心收集微生物；
微生物染色：将收集的微生物复溶后加入荧光染料cy5-hydrazide，在暗处染色；
微生物筛选：差速离心分离微生物和未结合的染料，先通过荧光显微镜检测菌株的染色情况，然后通过流式细胞仪对荧光标记的菌株进行分选；
分选微生物的分析：
微生物产物分析：通过2，4-硝基苯肼测定菌株产生的醛酮化合物的含量，再使用GC-MS鉴定产物的种类。
微生物菌株鉴定：基于16s rRNA鉴定筛选微生物的种类。
经过鉴定，三个批次的烟叶中均得到印度不动杆菌Acinetobacter indicus SCT-B2，于2021年10月28日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.23679；
发明人对上述菌株进行16S rRNA测序，并得到的菌株的测序结果；
如图1所示，所述印度不动杆菌为所述菌株为革兰阴性杆菌，专性需氧，多为球杆状、常呈双排列，可单个存在，有时形成丝状和链状，黏液型菌株有荚膜，无芽孢，无鞭毛，最适生长温度为35℃。
分选微生物的培养：
A、平板培养：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.0，将冷冻保存的甘油悬液接种到平板上，37℃恒温培养24h；
B、摇瓶培养：葡萄糖30g，蛋白胨20g，酵母粉15g，K2HPO4 1.5g NaH2PO4 3g，加蒸馈水1000mL，调pH值为7.0，高压蒸汽灭菌；摇瓶装液量为10～20％(v/v)，接种量为2～5％(v/v)，培养温度为30～40℃，摇床转速为150～220rpm，摇瓶培养1～2天，培养后36h菌体密度达到最高值，获得发酵液；
实施例2
取实施例1中的发酵液10mL用无菌蒸馈水稀释至109个菌/mL，将菌液按照烟叶重量的1％，喷施到含水量为30％的产自海南的雪茄烟叶B022，在35℃相对湿度75％的条件下发酵15天，经专业人员品吸，产生豆香、奶香和甜香，减少杂气，提升醇和度、流畅度、缠绵感、甜润度、改善刺激性、干净度、回味感。
实施例3
取实施例1中的发酵液10mL用无菌蒸馈水稀释至109个菌/mL，将菌液按照烟叶重量的1％，喷施到含水量为30％的产自什邡的雪茄烟叶德雪1号，在35℃相对湿度75％的条件下发酵15天，经专业人员品吸，豆香显著增加，降低杂气，提升醇和度、流畅度、缠绵感、甜润度、改善刺激性、干净度、回味感。
实施例4
取实施例1中的发酵液10mL用无菌蒸馈水稀释至109个菌/mL，将菌液按照烟叶重量的1％，喷施到含水量为30％的产自湖北的雪茄烟叶CX-14，在35℃相对湿度75％的条件下发酵15天，经专业人员品吸，降低青杂气，增加了回味，甜味显著提升，豆香和烟熏味提升。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 四川中烟工业有限责任公司
<120> 一种印度不动杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1440
<212> DNA
<213> 印度不动杆菌(Acinetobacter indicus SCT-B2)
<400> 1
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Claims (5)
1.一株印度不动杆菌(Acinetobacter indicus)SCT-B2，其特征在于，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.23679。
2.如权利要求1所述的一株印度不动杆菌SCT-B2在烟叶发酵中的用途。
3.如权利要求1所述的一株印度不动杆菌SCT-B2的培养方法，其特征在于，所述印度不动杆菌SCT-B2的培养步骤为：
平板培养：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，将冷冻保存的甘油悬液接种到平板上，37℃恒温培养24h；
摇瓶培养：葡萄糖30g，蛋白胨20g，酵母粉15g，K2HPO4 1.5g，NaH2PO43g，加蒸馏水1000mL，调pH值为7.0，高压蒸汽灭菌；摇瓶装液量为10～20％(v/v)，接种量为2～5％(v/v)，培养温度为30～35℃，摇床转速为150～220rpm，摇瓶培养1～3天。
4.如权利要求3所述的方法培养的印度不动杆菌SCT-B2在烟叶发酵中的用途。
5.一种烟叶的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、提供一种印度不动杆菌SCT-B2，其保藏编号为：CGMCC NO.23679；
B、将印度不动杆菌SCT-B2进行发酵培养，获得发酵液及菌体；
C、将步骤B所得的发酵液及菌体用水、生理盐水或者其它缓冲液进行稀释，稀释后菌液浓度达到106～1012个菌/mL，将菌液按照烟叶重量的1～5％，加入到含水量为20～50％的烟叶中进行发酵，发酵温度为30～50℃，发酵时间15～30天。
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