CN103451123A - 溶酪大球菌及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了溶酪大球菌及其筛选方法和应用，该溶酪大球菌为溶酪大球菌T17，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7623。溶酪大球菌T17能在含有鸟氨酸的普通营养肉汤培养基中发酵产生大量的腐胺，并因此可以利用该菌发酵后从发酵液上清中分离纯化得到腐胺。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株溶酪大球菌，以及溶酪大球菌的制备方法和应用技术。
背景技术
腐胺（putrescine）是一种有机化合物，常温下为无色晶体或无色至微黄色液体。腐胺的分子式为NH2(CH2)4NH2，也被命名为1，4-丁二胺、1，4-二氨基丁烷、四亚甲基二胺或腐肉碱。腐胺是工业上生产尼龙-46、尼龙-6及尼龙-66的原料，尤其是尼龙-46广泛用于汽车、摩托的零部件材料，而尼龙-66是电子产品的生产原料，酸性气体吸收剂。目前腐胺的制备方法主要有（1）由氰化氢与丙烯腈反应生成的丁二腈氢化而进行规模化生产；（2）在碳酸钠的作用下，由吡咯与盐酸羟胺反应得到丁二肟，再在钠汞齐作用下，经无水乙醇加热还原制备；（3）由2，5-二氨基戊酸加热催化脱羧制备；（4）以精氨酸脱羧、脱胍制备。由此可见，目前腐胺的生产方式主要以化学合成为主，能量消耗大，对环境也有污染。我国腐胺需求量较大，但国内企业生产能力和产品质量有限，从国外进口价格也很高，因此需要寻求高纯度腐胺的制备方法，以降低生产成本，减少对环境的污染。
发明内容
本发明的目的是提供溶酪大球菌，并通过该菌的代谢特性发酵生产腐胺，获得高浓度的腐胺发酵液。
本发明溶酪大球T17菌于2013年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：CGMCC No.7623，分类命名：溶酪大球菌 Macrococcus caseolyticus。
本发明另一目的是提供以上溶酪大球T17的筛选方法。
本发明采用普通营养肉汤琼脂从市售制熟的盐水鸭产品中分离得到。
在普通营养琼脂培养基37℃中菌落是乳白色，隆起，革兰氏染色阳性，普通显微镜下是球状。
本发明容易分离提取，可以降低生产成本，减少化学合成造成的环境污染，使用该微生物发酵生产腐胺，发酵液中腐胺含量较高。
本发明再一目的是提出以上溶酪大球T17在生产高浓度腐胺方面的应用。
本发明是以溶酪大球菌T17为生产菌株，接种保存好的纯菌接种至普通营养肉汤液体培养基中，待菌株生长到对数生长期（OD值为0.6左右）；将该活化好的菌液按照1%的接种量接种到改良的普通营养肉汤培养基中，37℃220rpm振荡培养4-6天；将培养后的菌体发酵液10000rpm离心5min，此时的上清液即含有高浓度的腐胺，腐胺的含量在每升发酵液500mg以上。
本发明直接以鸟氨酸为前体，通过一些特定的具有鸟氨酸脱羧酶活性的微生物的作用，可以获得高浓度的腐胺，然后从发酵液上清中分离腐胺，可以减少化学合成的污染，降低生产成本。由于本发明溶酪大球菌是从食品中分离获得，并且也是传统发酵肉制品中的一种菌，因此从该类菌中筛选到能产腐胺的菌株T17，该类菌不携带致病基因，发酵后的菌体也容易灭菌处理，使用该菌来发酵生产腐胺会比别的微生物发酵更为安全，不会造成有毒微生物和致病基因危害。
本发明所述的改良普通营养肉汤培养基的成分是在普通营养肉汤培养基中添加质量百分比分别占1%和0.005%的L-鸟氨酸、磷酸吡哆醛。
附图说明
图1为七种生物胺标样的分离效果图
图2为以鸟氨酸为底物时，溶酪大球菌T17（CGMCC No.7623）的发酵上清液的高效液相图。
图3为溶酪大球菌T17的鸟氨酸脱羧酶基因序列和氨基酸序列。
具体实施方式
一、溶酪大球菌T17的筛选和鉴定：
1、准确称取色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺的标准品各50mg，用0.4mol/L的高氯酸（HClO4）定容到50mL，配成1mg/mL储备液备用。
分别取以上标准品储备液，用0.4mol/L HClO4配制成质量浓度分别为2.5μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的混合标准溶液，铝箔避光、4℃冰箱保存备用。
2、无菌条件下从每只制熟的盐水鸭中分别取5g鸭脖和鸭翅肉、15g鸭胸肉、10g鸭腿肉及10g鸭背肉，共40克混合捣碎，每只盐水鸭的鸭肉作为一个试验样品。
无菌条件下取25g各样品分别加入225mL灭菌生理盐水（含1g/L蛋白胨、9g/LNaCl）摇床振摇30min。然后取1mL上清液依次进行10倍梯度稀释，选择合适的稀释度涂布于普通营养肉汤培养基中，于37℃下培养48h，挑选特征性菌落进一步地进行划线分离，然后将纯化好的菌落接种到普通营养肉汤液体培养中，37 ℃ 220rpm振荡培养12h。
3、称取0.1gL-鸟氨酸盐酸盐，加入到100mL 普通营养肉汤培养基中灭菌。将上述培养好的菌株发酵液按照1%接种量接种到含有氨基酸的普通营养肉汤培养基液体培养基中，220rpm振荡培养4～6天。
4、将步骤3获得的发酵液低温下10000rpm离心5min，取上清500μL（不能带菌体）以及混合后的生物胺标准品加入到10mL离心管中，依次加入500μL 0.25mol/L的Na2HPO4，50μL 4mol/L 的NaOH，1mL 2.5mg/L的丹磺酰氯溶液，在离心管外边包上锡箔纸避光，放入到55℃水浴锅中避光衍生1h，然后将样品置于4℃避光保存。
5. 先将G60硅胶板（5cm*10cm）在105℃下活化1h。
展开剂由体积比为8︰1︰2的氯仿、乙醚和三乙胺组成。
将25mL展开剂倒入展开缸中预饱和0.5h。使用自动点样台点样，上样量为2μL，间隔1.5cm，待样点干燥后，置入展开槽内，待展开剂扩展到距样点17cm处取出，通风厨内干燥，在366nm紫外灯下观察，然后使用自动凝胶成像分析拍照。通过和生物胺标准品进行比对，确定各分离菌株是否产生腐胺，从而筛选到能够产生腐胺的菌株T17。
6、将T17菌株在普通营养肉汤固体培养基中，连续传代培养，获得纯的单菌落，菌落是乳白色，隆起，革兰氏染色阳性，普通显微镜下是小球状。然后将该纯菌落接种到灭菌后的5mL普通营养肉汤液体培养基中，37 ℃ 220rpm振荡培养12h，利用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，通过PCR扩增获得该菌株的16S rRNA基因片段，测序序列见表1，将测序后获得的序列信息通过GENEBANK数据库进行序列分析发现该菌为溶酪大球菌。
将该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.7623。
7、将培养12小时候的菌体培养液加入终浓度10%的灭菌甘油，-80℃保存。
表1溶酪大球菌T17的16SrRNA基因序列
二、以溶酪大球菌T17制备高浓度腐胺溶液：
1、以溶酪大球菌（T17）为生产菌株，将保存好的纯菌接种至普通营养肉汤液体培养基中，待菌株生长到对数生长期（OD值为0.6左右）。
2、将该活化好的菌液按照1%的接种量接种到灭菌好的改良的普通营养肉汤培养基（普通营养肉汤培养基的基础上额外添加1%L-鸟氨酸和0.005%磷酸吡哆醛，即：每升培养基中含有蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，L-鸟氨酸10 g，磷酸吡哆醛0.05g）中，37℃ 220rpm振荡培养4-6天。
3、将培养后的菌体发酵液10000rpm离心5min，此时的发酵上清液经高相液相色谱检测发现有一个腐胺的峰出现，见图2所示，证实该发酵上清液含有高浓度的腐胺。
图1为七种生物胺标样的分离效果图。
三、腐胺的含量的检测方法：
1、将发酵液低温10000rpm离心5min，取上清500μL（不能带菌体）加入到10mL离心管中，依次加入500μL 0.25mol/L的Na2HPO4，50μL 4 mol/L的NaOH，1mL 2.5mg/L的丹磺酰氯溶液，然后在离心管外边包上锡箔纸避光，放入到55℃水浴锅中避光衍生1h。然后将样品置于4℃保存，使用高效液相色谱进行检测。
2、色谱检测方法如下：使用Waters Alliance 2695液相色谱系统，色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4.6×250 mm，2.5 μm)，流速为1 ml/mL，UV-2487紫外检测器，检测波长254 nm，进样量20 μL，柱温30℃，流动相A为水，B为乙腈，采用梯度洗脱程序。
经以上方法检测，采用本发明方法制成的腐胺溶液中，腐胺的含量在每升发酵上清液中500mg以上。可见，本发明方法达到了预期的效果。
四、溶酪大球菌T17鸟氨酸脱氢酶基因的检测和鉴定：
1、首先利用细菌基因组提取试剂盒提取溶酪大球菌T17的基因组DNA后作为PCR反应的模板，使用引物PUTI-F（5'-TWYMAYGCNGAYAARACNTAYYYTGT- 3'）和PUT1-R （5'-ACRCANAGNACNCCNGGNGGRTANGG - 3'）扩增出溶酪大球菌T17的鸟氨酸脱羧酶基因（odc）部分片段。其中50μL 的PCR体系包括10 ng 基因组DNA，稀释到50 μM的引物各1 μl, 1 U的 Taq DNA聚合酶，4 μl的2.5 mM浓度的dNTP，5 μl 10×PCR Buffer (Mg2+ plus) ，最后用超纯水补足50μL。
PCR反应条件为：首先94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，50 ℃退火1 min，72℃延伸1 min，以上为30个循环；最后72 ℃处理5 min。使用1% (m/v) 的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物的纯度和片段长度进行检测。最后将扩增出的目的片段测序。
2、以获得的部分odc基因序列为靶向片段，通过基因组步移试剂盒获得odc的全基因序列。以上方法按照试剂盒的说明进行。将获得的全基因序列进行测序，测序结果见图3。测序发现克隆到的基因序列与GENEBANK数据上已公布的鸟氨酸脱羧酶基因序列相似，证实溶酪大球菌T17存在着鸟氨酸脱羧酶基因。
Claims (4)
1.溶酪大球菌T17，其特征在于：其保藏号为：CGMCC No.7623。
2.如权利要求1所述溶酪大球菌的筛选方法，其特征在于：从制熟的盐水鸭中分离得到，使用普通营养琼脂进行培养。
3.一种如权利要求1所述的溶酪大球菌在生产高浓度腐胺的应用，其特征在于：以所述的溶酪大球菌T17为生产菌株，接种保存好的纯菌接种至普通营养肉汤液体培养基中，待菌株生长到对数生长期后；将该活化好的菌液按照1%的接种量接种到改良的普通营养肉汤培养基中，37℃ 220rpm振荡培养4～6天；将培养后的菌体发酵液10000rpm离心5min，取上清液，即为腐胺的含量在每升发酵液500mg以上的高浓度的腐胺。
4.根据权利要求3所述的溶酪大球菌在生产高浓度腐胺的应用，其特征在于：所述的改良普通营养肉汤培养基的成分是在普通营养肉汤培养基中添加质量百分比分别占1%和0.005%的L-鸟氨酸、磷酸吡哆醛。
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