CN108070664B - 检测溶酪大球菌的Taqman实时荧光定量PCR方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种TaqMan实时荧光定量PCR检测溶酪大球菌的方法。选取溶酪大球菌的一段特异基因序列(序列号MCCL_RS01590)，基于该特异基因序列，设计PCR引物与TaqMan探针，并建立了检测溶酪大球菌核酸的实时荧光探针定量PCR方法。该方法具有很好的特异性和稳定性，能够满足一般临床样品要求，不会出现假阳性反应。所设计的探针具有极高的敏感性，最低检测限量可达到每个PCR反应检出10个拷贝的目的基因。本发明使用特异基因引物和Taqman探针，在优化的反应条件下检测溶酪大球菌时，具有更高的稳定性、特异性和灵敏性，是一种快速、准确的检测溶酪大球菌的方法。

Description

检测溶酪大球菌的Taqman实时荧光定量PCR方法
技术领域
本发明涉及一种Taqman探针荧光定量PCR方法，属于PCR技术领域，尤其涉及一种TaqMan实时荧光定量PCR检测溶酪大球菌的方法。
背景技术
早在1916年，微生物学家伊万斯就发现了溶酪大球菌，不过在当时的技术条件下还无法与葡萄球菌区别，所以就命名为溶酪葡萄球菌。直到1998年，微生物学家Kloos等人，才将其更正命名为溶酪大球菌(Macrococcus Caseolyticus)。该菌属于葡萄球菌科，大球菌属，是革兰氏阳性菌，缺乏磷壁酸，无运动性，无芽孢，具有凝固酶阴性、过氧化氢酶阳性及细胞色素C氧化酶反应阳性等生化特性，其直径是金黄色葡萄球菌的2–4倍。通常溶酪大球菌主要分离自动物皮肤和动物产品，但该菌的进化与人类病原菌金黄色葡萄球菌和炭疽芽胞杆菌密切相关，在适宜的条件下，也会引起机体疾病。同时，研究表明低温肉制品中的溶酪大球菌往往是导致食品腐败变质的主要菌种之一，严重威胁食品安全。
目前，对该菌的检测方法主要是分离培养、常规PCR检测和变性梯度凝胶电泳(DGGE)指纹图谱相结合的方法进行检测。在传统分离鉴定方法中，首先对样品进行平板培养，挑取不同菌落纯化，对各单菌落进行菌落形态和菌体形态观察，并进行生理生化反应等鉴定菌株，判断结果时只靠肉眼观察，没有足够可靠依据，降低实验的准确性。常规PCR及变性梯度凝胶电泳(DGGE)指纹图谱虽然避免了上述方法的缺陷，但存在实验室污染和临床样品中存在PCR抑制物造成假阴性等问题，限制了在快速检测诊断上的推广应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明公开了一种检测溶酪大球菌的Taqman实时荧光定量PCR方法，探针法实时荧光PCR技术依据序列特异性探针区别物种，增加了实验特异性和敏感性，提高了结果的准确率，能够很好地解决上述问题，在细菌病原体检测上应用广泛。因此，本发明利用TaqMan探针技术建立了一种灵敏度高、特异性强和稳定性好的快速检测溶酪大球菌的实时荧光定量PCR方法。
本发明的目的是提供一种检测溶酪大球菌的TaqMan实时荧光定量PCR方法。为了实现本发明的目的，本发明选取溶酪大球菌特有的一段基因(序列号MCCL_RS01590)为目标序列，设计特异性PCR引物和探针，利用TaqMan探针技术建立检测该菌的实时荧光定量PCR方法。
本发明提供用于检测溶酪大球菌的TaqMan实时荧光定量PCR引物及探针，所述引物包括：
上游引物Mc1590F：5′-TCCAGGAACATATCGTTA-3′
下游引物Mc1590R：5′-CGCTCTAGATAAGGCTTA-3′
所述探针为：
探针Mc1590T：5′-F-AGGACCCATTCGTCATTATCTGTCT-Q-3′
其中，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ。
扩增序列为：
TCCAGGAACATATCGTTATTTCTAAGGACCCATTCGTCATTATCTGTCTTCACATAGTCCAGATCTAAGTCCAGATACGTGATATTACCATCTCTATCGCGTTCACATGGAGAAGAGATATTACAGAATATCTTAATGGGTTGATAAGCCTTATCTAGAGCG
其中上游引物序列位置为TCCAGGAACATATCGTTA，下游引物序列位置为TAAGCCTTATCTAGAGCG，AGGACCCATTCGTCATTATCTGTCT为探针序列。
本发明还提供含有上述引物及探针的用于检测溶酪大球菌的TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒。所述试剂盒还包括商品化的2×AceQ qPCR Probe Master Mix、ROXReference Dye、灭菌双蒸水等。
优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板和阴性模板，阳性模板为构建的标准品阳性质粒，阴性模板为灭菌双蒸水。
本发明还提供检测溶酪大球菌的TaqMan实时荧光定量PCR方法，利用引物Mc1590F和Mc1590R及探针Mc1590T，或所述试剂盒对溶酪大球菌进行TaqMan实时荧光定量PCR检测。
前述方法包括以下步骤：
1.提取样品组织中细菌的总DNA(参照商品化的细菌DNA Mini Kit说明书)
2.以步骤1中的总DNA为模板，Mc1590F和Mc1590R为引物，Mc1590T为探针，进行PCR扩增反应。
PCR反应体系为25μl：模板DNA，1μl；10μM上游引物，0.5μl；10μM下游引物，0.5μl；10μM探针，0.25μl；50×ROX Reference Dye 1，0.5μl；2×AceQ qPCR Probe Master Mix，12.5μl；不含RNase的ddH2O，补足至25μl。
PCR反应条件为：37℃污染消化2分钟；95℃预变性10分钟，单个循环(95℃10秒，55℃30秒)，共40个循环。
本发明选取溶酪大球菌特异的一段基因序列，基于该特异基因序列，设计引物与TaqMan探针。应用目标基因克隆质粒作为标准品，检测敏感性、扩增效率等指标，应用溶酪大球菌和其它种属的细菌共计33株菌作为阴性对照进一步验证本方法的特异性，建立了溶酪大球菌的实时荧光探针定量PCR检测方法。除目标菌外，其它种属细菌的基因组DNA均无扩增信号，表明该方法具有很好的特异性，能够满足一般样品检测要求。所设计的探针具有极高的敏感性，最低检测限可达到每个PCR反应检出10个拷贝的目的基因。十倍倍比稀释标准品，3次重复实验均具有很好的重复性，表明该方法稳定，数据可靠。因而，本发明建立的实时荧光探针定量PCR方法是一种快速、准确的检测溶酪大球菌的方法。
附图说明
图1：实施例中利用分析软件自动生成标准曲线图，其中A为不同浓度梯度质粒标准品的循环扩增曲线；B为由不同浓度梯度质粒标准品的Ct值与质粒标准品拷贝数的对数所构成的标准曲线图。
图2：实施例中的实时荧光定量PCR方法的特异性检测结果对照图。
具体实施方式
1.设计、合成引物和Taqman探针
从GenBank中获取溶酪大球菌的MCCL_RS01590基因序列，应用Primer 5软件分析基因序列，根据引物和探针设计原则，在这些序列的保守区域筛选到能扩增目标片段长度为162bp的一对引物，并在该引物的扩增区域内设计1条荧光探针。探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ，由宝生物工程技术服务有限公司合成。
扩增引物包括：
上游引物Mc1590F：5′-TCCAGGAACATATCGTTA-3′
下游引物Mc1590R：5′-CGCTCTAGATAAGGCTTA-3′
探针为：
探针Mc1590T：5′-F-AGGACCCATTCGTCATTATCTGTCT-Q-3′
其中，F为荧光报告基团FAM，Q为荧光淬灭基团BHQ。
2.主要仪器设备与试剂
安捷伦Mx3005P荧光定量PCR仪、台式高速离心机Eppendorf centrifuge5804R、核酸浓度测定仪NanoDrop-2000，细菌DNA Mini Kit(天根)，pMD-18T Cloning Kit购自宝生物公司、2×AceQ qPCR Probe Master Mix购自诺唯赞公司；质粒提取试剂盒购自宝生物工程技术有限公司。
3.标准品的制备
以Mc1590F和Mc1590R为引物，溶酪大球菌的DNA为模板，扩增得到大小为162bp的目的片段；PCR产物切胶回收纯化后连接到pMD-18T载体上；将连接后载体导入JM109感受态细胞，筛选阳性克隆子，用PCR测序方法验证后提取质粒，测定浓度，经测序鉴定正确后可作为绘制定量PCR标准曲线的标准品。用于后续研究的质粒和含有重组子的阳性菌分别保存于-20℃和-70℃。
4.质粒浓度换算拷贝数
用NanoDrop-2000测定阳性质粒浓度为102.9ng/μL，pMD-18T载体的碱基数为2692bp，每个碱基的平均分子量为660道尔顿/bp，扩增产物大小为162bp，每μL样品中检测基因拷贝数按照公式估算：样品copies/μL＝阿伏伽德罗常数(6.02×1023)×质粒浓度ng/μL×10-9/(660×重组质粒碱基数)，其中，重组质粒碱基数＝载体序列碱基数+插入序列碱基数。计算得出拷贝数为3.29×1010copies/μL。
5.反应体系及反应参数
PCR反应体系为25μl：模板DNA，1μl；10μM上游引物，0.5μl；10μM下游引物，0.5μl；10μM探针，0.25μl；50×ROX Reference Dye 1，0.5μl；2×AceQ qPCR Probe Master Mix，12.5μl；不含RNase的ddH2O，补足至25μl。
PCR反应条件为：37℃污染消化2分钟；95℃预变性10分钟，单个循环(95℃10秒，55℃30秒)，共40个循环。
6.标准曲线的绘制
用Easy Dilution将质粒依次稀释成3.29×108copies/μL～3.29×101copies/μL，共制得8个浓度梯度的模板。以此为模板，按照上述PCR反应体系和扩增程序进行实时荧光定量PCR。
反应结束后，利用分析软件自动生成标准曲线，结果如图1所示，其中A为不同浓度梯度质粒标准品的循环扩增曲线；B为由不同浓度梯度质粒标准品的Ct值与质粒标准品拷贝数的对数所构成的标准曲线。结果显示当质粒浓度在3.29×108拷贝/μl～3.29×103拷贝/μl范围内时，质粒拷贝数的对数值与CT值具有非常好的线性相关性，相关系数R2达0.999。标准曲线的回归方程为：Y＝-3.417*LOG(X)+41.32，Eff.＝96.2％，其中，Y为Ct值，x为质粒标准品的拷贝数。
7.特异性实验
以溶酪大球菌的DNA为阳性对照，以大肠杆菌、沙门氏菌、腐生葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌的DNA为阴性对照，设双蒸水为空白对照，反应体系及程序同上，进行实时荧光定量PCR对上述几种细菌DNA进行检测。从图2可以看出，利用建立的实时荧光定量PCR方法对溶酪大球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、腐生葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌进行检测，并设立阴性对照，结果只有溶酪大球菌反应管中检测到特异性扩增信号，其它反应管均无荧光信号积累，表明该方法具有良好的特异性。
8.重复性实验
按探针引物浓度分别为10μM配制荧光定量PCR检测反应体系，以构建的标准阳性质粒(3.29×103copies/μL～3.29×108copies/μL)为模板进行稳定性检测。在同一次定量PCR反应中，每个稀释度标准质粒做3个重复孔，以分析组内差异；用上述相同条件分别进行3次独立重复实验，分析组间差异，计算其变异系数，变异系数(CV)＝标准偏差(SD)/平均数(X)。并采用SPSS19.0软件进行统计学分析，方差分析用于比较不同样本之间的差异，P＜0.05有统计学意义。组内各孔之间CV值在0.79％～0.96％之间，组间重复测定CV值在0.79％～0.93％之间，均小于1％(表1)。
表1
Figure BDA0001294298020000051
9.溶酪大球菌实时荧光定量PCR检测方法与细菌传统分离鉴定方法的对比
利用建立的溶酪大球菌实时荧光定量PCR检测方法和细菌传统分离培养鉴定方法对26份腊肉及31份咸水鸭进行检测。
具体操作步骤：
(1)细菌的传统分离培养鉴定方法
①无菌条件下取10g盐水鸭肉和腊肉，捣碎后，每份作为一个试验样品。无菌条件下取各样品分别加入225mL灭菌生理盐水(含1g/L蛋白胨、9g/L NaCl)摇床震荡培养30min。然后取1mL上清液依次进行10倍梯度稀释，选择合适的稀释度涂布于胰蛋白胨大豆琼脂培养基中，于37℃下培养24h，挑选特征性菌落进一步地进行划线分离，然后将纯化好的菌落接种到胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，37℃220rpm振荡培养12h。同时，对各单菌落进行菌落形态和菌体形态观察。②对疑似溶酪大球菌通过普通PCR扩增以获得16S rDNA序列。PCR按照以下反应体系及反应程序进行：采用16S rDNA通用引物(上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物1492R：5’-TACGGY TACCTTGTTACGACTT-3’)，PCR反应体系：2×PCR TaqMix 25μL，灭菌去离子水21μL，引物16s-27F 1μL，16s-149 2R 1μL，DNA 2μL，反应总体积50μL。反应程序：94℃预变性5min；94℃30s、60℃30s、72℃2min，重复30个循环，最后72℃延伸10min。③将获得的16S rDNA序列进行测序比对，确定是否是溶酪大球菌。
(2)实时荧光定量PCR检测方法
利用组织样品细菌DNA试剂盒提取26份腊肉及31份咸水鸭样品的基因组DNA。测定样品DNA浓度，控制DNA浓度为1μg，以此浓度为模板进行实时荧光定量PCR检测。
检测结果如表2所示。
表2实时荧光定量PCR与细菌传统培养鉴定方法的结果对比
Figure BDA0001294298020000061
表2结果显示，本发明建立的溶酪大球菌实时荧光定量PCR检测方法的检出率为21.05％，而细菌传统培养鉴定方法的检出率仅为7.01％，表明溶酪大球菌实时荧光定量PCR检测方法较传统检测方法具有更高的检出率，且快速、方便。
上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的修改、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种Taqman 实时荧光定量PCR探针和引物，其特征在于，
所述探针为：
探针Mc1590T：5′-F- AGGACCCATTCGTCATTATCTGTCT-Q-3′；其中，F 为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团，所述荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ；
所述引物包括：
上游引物Mc1590F：5′-TCCAGGAACATATCGTTA-3′；
下游引物Mc1590R：5′-CGCTCTAGATAAGGCTTA-3′。
2.一种TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的探针和引物及商品化的2×AceQ qPCR Probe Master Mix 、ROX Reference Dye、灭菌双蒸水、标准阳性模板和标准阴性模板，阳性模板为构建的标准品阳性质粒，阴性模板为灭菌双蒸水。
3.如权利要求2所述的TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒在溶酪大球菌非诊断目的检测中的应用。
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