JP7295513B2 - 質量分析用標識組成物、代謝物の定量分析法、及び代謝物の動態解析法 - Google Patents
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Description
本発明は、質量分析用標識組成物、代謝物の定量分析法、及び代謝物の動態解析法に関する。
核酸、補酵素、糖リン酸、リン脂質、リン酸化タンパク質等の生体内のリン酸化合物は生命活動において重要な役割を担っている。そのため、代謝物の網羅的解析等、リン酸化合物の測定技術や解析技術は、生命現象の解明のためだけでなく、医学、薬学、農学等の様々な分野で求められている。
リン酸化合物の観測方法としては、３１Ｐ－ＮＭＲを用いる方法がある。この方法では、３１Ｐを直接観測することによって、リン酸化、脱リン酸化等の詳細な反応機序を理解することが可能である。しかし、この方法は、生体抽出試料に適用した場合、生体内に含まれる膨大な種類のリン酸化合物に由来する多数のＮＭＲシグナルが観測され、帰属が困難であるため、代謝物の網羅的な解析には不向きである。
タンパク質のリン酸化の解析として、放射性同位体である３２Ｐで標識したリン酸化タンパク質を、放射能測定やオートラジオグラフィ等で分析する方法がある。しかし、この方法は、ＲＩ実験設備が必要であり、実験者の被爆の問題もある。また、放射性同位体を用いる方法は、放射線によって分析対象物が損傷を受けることがあることから、生体内とは異なる状態を解析している可能性がある。
２Ｈ、１３Ｃ、１８Ｏ等の安定同位体で標識したリン酸化合物を用い、３１Ｐ－ＮＭＲ等で反応機構等を解析する方法も知られている（例えば、非特許文献１、２）。標識に安定同位体を用いれば、放射線によって分析対象物が損傷を受けることを防止できる。
２Ｈ、１３Ｃ、１８Ｏ等の安定同位体で標識したリン酸化合物を用い、３１Ｐ－ＮＭＲ等で反応機構等を解析する方法も知られている（例えば、非特許文献１、２）。標識に安定同位体を用いれば、放射線によって分析対象物が損傷を受けることを防止できる。
代謝物の網羅的解析においては、生体内での代謝物組成を維持した状態で試料を調製して分析することが、分析結果の信頼性を確保する上で極めて重要である。そのため、例えば生体試料からリン酸化合物を抽出する場合、抽出液中の酸やアルカリ、あるいは残存する代謝酵素等によって抽出後のリン酸化合物に分解や拡散が起きないように、これらの反応を停止させる必要がある。これまでに様々な検討が重ねられおり（非特許文献３、４）、生体試料から抽出したリン酸化合物の定量分析も行われている（非特許文献５）。しかし、分析試料の調製工程での対象化合物の分解や拡散を評価する方法は無く、従来の方法では、分析試料内での代謝物組成が生体内の組成と一致しているか否かを知ることはできず、代謝変換の状況も把握できない。
Blattler, W. et. al. Stereochemical Course of Phosphokinases. The Use of Adenosine [Gamma-(S)- 16O,17O,18O]triphosphate and the Mechanistic Consequences for the Reactions Catalyzed by Glycerol Kinase, Hexokinase, Pyruvate Kinase, and Acetate Kinase. Biochemistry 1979, 18 (18), 3927-3933.
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本発明は、分析に用いる複数の標識化合物が試料内で代謝変換されたとしても、それらを区別して評価できる質量分析用標識組成物、代謝物の定量分析法、及び代謝物の動態解析法を提供することを目的とする。
本発明は、以下の構成を有する。
［１］２種以上の標識化合物を含む質量分析用標識組成物であって、
前記の２種以上の標識化合物は、生体内の代謝変換の一連の経路の中の２種以上のリン酸化合物が、１８Ｏを含む１種以上の安定同位体により標識された２種以上の標識化合物であり、
前記の２種以上の標識化合物は、前記の２種以上の標識化合物と、前記の２種以上の標識化合物の代謝変換によって生じる標識化合物とが、多重反応モニタリングのトランジションで互いに区別できるように標識されている、質量分析用標識組成物。
［２］前記安定同位体が、１８Ｏと、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ及び１７Ｏからなる群から選ばれる１種以上との組み合わせである、［１］に記載の質量分析用標識組成物。
［３］前記の２種以上の標識化合物が、ヌクレオシド、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、及びヌクレオシド三リン酸からなる群から選ばれる２種以上が標識された標識化合物である、［１］又は［２］に記載の質量分析用標識組成物。
［４］前記の２種以上の標識化合物が、ヌクレオシド二リン酸が標識された標識化合物と、ヌクレオシド三リン酸が標識された標識化合物とを含む、［１］又は［２］に記載の質量分析用標識組成物。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載の質量分析用標識組成物を用い、前記の２種以上の標識化合物を内部標準物質として対象の代謝物を絶対定量する、代謝物の定量分析法。
［６］［１］～［４］のいずれかに記載の質量分析用標識組成物を用いて対象の代謝物の動態を解析する、代謝物の動態解析法。
［１］２種以上の標識化合物を含む質量分析用標識組成物であって、
前記の２種以上の標識化合物は、生体内の代謝変換の一連の経路の中の２種以上のリン酸化合物が、１８Ｏを含む１種以上の安定同位体により標識された２種以上の標識化合物であり、
前記の２種以上の標識化合物は、前記の２種以上の標識化合物と、前記の２種以上の標識化合物の代謝変換によって生じる標識化合物とが、多重反応モニタリングのトランジションで互いに区別できるように標識されている、質量分析用標識組成物。
［２］前記安定同位体が、１８Ｏと、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ及び１７Ｏからなる群から選ばれる１種以上との組み合わせである、［１］に記載の質量分析用標識組成物。
［３］前記の２種以上の標識化合物が、ヌクレオシド、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、及びヌクレオシド三リン酸からなる群から選ばれる２種以上が標識された標識化合物である、［１］又は［２］に記載の質量分析用標識組成物。
［４］前記の２種以上の標識化合物が、ヌクレオシド二リン酸が標識された標識化合物と、ヌクレオシド三リン酸が標識された標識化合物とを含む、［１］又は［２］に記載の質量分析用標識組成物。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載の質量分析用標識組成物を用い、前記の２種以上の標識化合物を内部標準物質として対象の代謝物を絶対定量する、代謝物の定量分析法。
［６］［１］～［４］のいずれかに記載の質量分析用標識組成物を用いて対象の代謝物の動態を解析する、代謝物の動態解析法。
本発明によれば、分析に用いる複数の標識化合物が試料内で代謝変換されたとしても、それらを区別して評価できる質量分析用標識組成物、代謝物の定量分析法、及び代謝物の動態解析法を提供できる。
［質量分析用標識組成物］
本発明の質量分析用標識組成物（以下、「本標識組成物」とも記す。）は、２種以上の標識化合物を含む。
本標識組成物中の２種以上の標識化合物は、生体内の代謝変換の一連の経路の中の２種以上のリン酸化合物が、１８Ｏを含む１種以上の安定同位体によって標識されたものである。また、本標識組成物中の２種以上の標識化合物は、それら２種以上の標識化合物と、それら２種以上の標識化合物の代謝変換によって生じる標識化合物とが、多重反応モニタリング（ＭＲＭ：Multiple Reaction Monitoring）のトランジションで互いに区別できるように標識されている。すなわち、２種以上の標識化合物は、それら２種以上の標識化合物と、それら２種以上の標識化合物から一連の代謝の分解及び再合成によって生じる標識化合物とがＭＲＭトランジションで互いに区別できるように標識されている。
本発明の質量分析用標識組成物（以下、「本標識組成物」とも記す。）は、２種以上の標識化合物を含む。
本標識組成物中の２種以上の標識化合物は、生体内の代謝変換の一連の経路の中の２種以上のリン酸化合物が、１８Ｏを含む１種以上の安定同位体によって標識されたものである。また、本標識組成物中の２種以上の標識化合物は、それら２種以上の標識化合物と、それら２種以上の標識化合物の代謝変換によって生じる標識化合物とが、多重反応モニタリング（ＭＲＭ：Multiple Reaction Monitoring）のトランジションで互いに区別できるように標識されている。すなわち、２種以上の標識化合物は、それら２種以上の標識化合物と、それら２種以上の標識化合物から一連の代謝の分解及び再合成によって生じる標識化合物とがＭＲＭトランジションで互いに区別できるように標識されている。
ＭＲＭは、例えば、２つの四重極質量分析計（Ｑ）が衝突室（ｑ）を挟んで直列に連結（Ｑ－ｑ－Ｑ）された三連四重極型質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）を用いることで行える。ＭＲＭに用いる質量分析計は、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）を連結したＧＣ－ＭＳ／ＭＳであってもよく、液体クロマトグラフ（ＬＣ）を連結したＬＣ－ＭＳ／ＭＳであってもよい。
２種以上の標識化合物と、それら２種以上の標識化合物の代謝変換によって生じる標識化合物をＭＲＭトランジションで互いに区別できるように標識するとは、それらをＭＲＭにおけるプリカーサイオン及びプロダクトイオンのいずれか一方又は両方が異なるように標識することを意味する。
標識化合物における標識は、プリカーサイオンのｍ／ｚ値のみが異なるように標識されていてもよく、プロダクトイオンのｍ／ｚ値のみが異なるように標識されていてもよく、プリカーサイオンのｍ／ｚ値とプロダクトイオンのｍ／ｚ値の両方が異なるように標識されていてもよい。
標識対象であるリン酸化合物としては、例えば、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を例示できる。標識対象であるリン酸化合物は、核酸、補酵素、糖リン酸、リン脂質、リン酸化タンパク質等であってもよい。
ヌクレオシドとしては、アデノシン、グアノシン、ウリジン、５－メチルウリジン、シチジン等のリボヌクレオシド、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン等のデオキシヌクレオシドを例示できる。
ＮＭＰとしては、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、５－メチルウリジン一リン酸（ｍ５ＵＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）を例示できる。
ＮＤＰとしては、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、５－メチルウリジン二リン酸（ｍ５ＵＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）を例示できる。
ＮＴＰとしては、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、５－メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）を例示できる。
標識対象である代謝変換の一連の経路の中の２種以上のリン酸化合物としては、ヌクレオシド、ＮＭＰ、ＮＤＰ及びＮＴＰからなる群から選ばれる２種以上が好ましい。
ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ及びアデノシンの組み合わせは、代謝変換の一連の経路の中のリン酸化合物である。同様に、ＧＴＰ、ＧＤＰ、ＧＭＰ及びグアノシンの組み合わせ、ＵＴＰ、ＵＤＰ、ＵＭＰ及びウリジンの組み合わせ、ｍ５ＵＴＰ、ｍ５ＵＤＰ、ｍ５ＵＭＰ及び５－メチルウリジンの組み合わせ、ＣＴＰ、ＣＤＰ、ＣＭＰ及びシチジンの組み合わせ、ｄＡＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＡＭＰ及びデオキシアデノシンの組み合わせ、ｄＧＴＰ、ｄＧＤＰ、ｄＧＭＰ及びデオキシグアノシンの組み合わせ、ｄＵＴＰ、ｄＵＤＰ、ｄＵＭＰ及びデオキシウリジンの組み合わせ、ｄＴＴＰ、ｄＴＤＰ、ｄＴＭＰ及びデオキシチミジンの組み合わせ、ｄＣＴＰ、ｄＣＤＰ、ｄＣＭＰ及びデオキシシチジンの組み合わせは、代謝変換の一連の経路の中のリン酸化合物である。
ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ及びアデノシンの組み合わせは、代謝変換の一連の経路の中のリン酸化合物である。同様に、ＧＴＰ、ＧＤＰ、ＧＭＰ及びグアノシンの組み合わせ、ＵＴＰ、ＵＤＰ、ＵＭＰ及びウリジンの組み合わせ、ｍ５ＵＴＰ、ｍ５ＵＤＰ、ｍ５ＵＭＰ及び５－メチルウリジンの組み合わせ、ＣＴＰ、ＣＤＰ、ＣＭＰ及びシチジンの組み合わせ、ｄＡＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＡＭＰ及びデオキシアデノシンの組み合わせ、ｄＧＴＰ、ｄＧＤＰ、ｄＧＭＰ及びデオキシグアノシンの組み合わせ、ｄＵＴＰ、ｄＵＤＰ、ｄＵＭＰ及びデオキシウリジンの組み合わせ、ｄＴＴＰ、ｄＴＤＰ、ｄＴＭＰ及びデオキシチミジンの組み合わせ、ｄＣＴＰ、ｄＣＤＰ、ｄＣＭＰ及びデオキシシチジンの組み合わせは、代謝変換の一連の経路の中のリン酸化合物である。
本標識組成物中の２種以上の標識化合物としては、細胞内の代謝や制御に重要な役割を担っている点から、ＮＤＰを標識した標識化合物と、ＮＴＰを標識した標識化合物とを含むことが好ましい。また、２種以上の標識化合物は、ＡＤＰを標識した標識化合物と、ＡＴＰを標識した標識化合物とを含むことがより好ましい。これにより、ＡＴＰのＡＤＰへ分解速度や、ＡＴＰの再合成速度を解析したり、共役する他の反応速度を解析したりすることが可能となる。
リン酸化合物を標識する安定同位体は、１８Ｏを含んでいればよく、１８Ｏのみであってもよく、１８Ｏと１８Ｏ以外の安定同位体の組み合わせであってもよい。１８Ｏ以外の安定同位体としては、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏを例示できる。
１８Ｏ以外の安定同位体を用いる場合、生体化合物中における存在確率が多い点から、リン酸化合物を標識する安定同位体は、１８Ｏと、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ及び１７Ｏからなる群から選ばれる１種以上との組み合わせが好ましく、１８Ｏと、１３Ｃ及び１５Ｎのいずれか一方又は両方との組み合わせがより好ましい。
１８Ｏ以外の安定同位体を用いる場合、生体化合物中における存在確率が多い点から、リン酸化合物を標識する安定同位体は、１８Ｏと、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ及び１７Ｏからなる群から選ばれる１種以上との組み合わせが好ましく、１８Ｏと、１３Ｃ及び１５Ｎのいずれか一方又は両方との組み合わせがより好ましい。
本標識組成物中の標識化合物としては、分析試料中で１６Ｏと１８Ｏの交換反応が起きにくい点から、リン酸化合物のリン酸部分が１８Ｏで標識されていることが好ましい。
また、一般に、生体中に含まれるリン酸化合物の炭素骨格部分は、複雑な糖や脂質等の化学合成法では合成が困難なものが多い。そのため、より安価かつ簡便に得られる点では、本標識組成物における標識化合物は、リン酸化合物の炭素骨格部分を非標識体とし、リン酸部分を１８Ｏで標識した標識化合物が好ましい。
また、一般に、生体中に含まれるリン酸化合物の炭素骨格部分は、複雑な糖や脂質等の化学合成法では合成が困難なものが多い。そのため、より安価かつ簡便に得られる点では、本標識組成物における標識化合物は、リン酸化合物の炭素骨格部分を非標識体とし、リン酸部分を１８Ｏで標識した標識化合物が好ましい。
本標識組成物における、代謝変換の一連の経路の中の２種以上のリン酸化合物が標識された標識化合物の種類は、２～２０種が好ましく、２～５種がより好ましい。
本標識組成物中の２種以上の標識化合物の具体例としては、例えば、下記式（Ａ－１）で表される標識化合物（以下、「標識化合物（Ａ－１）」と記す。他の式で表される標識化合物、及び非標識の化合物も同様に記す。）、標識化合物（Ａ－２）、標識化合物（Ａ－３）及び標識化合物（Ａ－４）からなる群から選ばれる２種以上を例示できる。
標識化合物（Ａ－１）の一連の代謝変換では、標識化合物（Ａ－１１）、標識化合物（Ａ－１２）、標識化合物（Ａ－１３）、標識化合物（Ａ－１４）、化合物（Ａ－１５）が生じる。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで汎用的に使われているエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）では、標識化合物（Ａ－１）（ｍ／ｚ＝５２８→４２４、１３６）、標識化合物（Ａ－１１）（ｍ／ｚ＝４４２→１３６、１１９）、標識化合物（Ａ－１２）（ｍ／ｚ＝３５６→１３６、７１）のプリカーサーイオンは負イオン検出モードで脱プロトン分子が生じ、標識化合物（Ａ－１３）（ｍ／ｚ＝２７０→１３６）、標識化合物（Ａ－１４）、化合物（Ａ－１５）のプリカーサーイオンは正イオン検出モードでプロトン化分子が生じる。ただし、括弧内のｍ／ｚ値は、プリカーサイオンとプロダクトイオンのｍ／ｚ値であり、以下も同様である。
標識化合物（Ａ－２）の一連の代謝変換では、標識化合物（Ａ－２１）、標識化合物（Ａ－２２）、標識化合物（Ａ－２３）、標識化合物（Ａ－２４）、化合物（Ａ－２５）が生じる。ＥＳＩ法では標識化合物（Ａ－２）（ｍ／ｚ＝４３１→１３６、１１９）、標識化合物（Ａ－２１）（ｍ／ｚ＝５１１→４０８、１３６）、標識化合物（Ａ－２２）（ｍ／ｚ＝３５３→１３６、７０）のプリカーサーイオンは負イオン検出モードで脱プロトン分子が生じ、標識化合物（Ａ－２３）（ｍ／ｚ＝２６７→１３６）、標識化合物（Ａ－２４）、化合物（Ａ－２５）は正イオン検出モードでプロトン化分子が生じる。
標識化合物（Ａ－３）の一連の代謝変換では、標識化合物（Ａ－３１）、標識化合物（Ａ－３２）、標識化合物（Ａ－３３）、標識化合物（Ａ－２４）、化合物（Ａ－３５）が生じる。ＥＳＩ法では標識化合物（Ａ－３）（ｍ／ｚ＝３５５→１３６、７３）、標識化合物（Ａ－３１）（ｍ／ｚ＝４３５→１３６、１２５）、標識化合物（Ａ－３２）（ｍ／ｚ＝５１５→４１７、１３６）、のプリカーサーイオンは負イオン検出モードで脱プロトン分子が生じ、標識化合物（Ａ－３３）（ｍ／ｚ＝２７５→１３６、７２）、標識化合物（Ａ－２４）、化合物（Ａ－３５）は正イオン検出モードでプロトン化分子が生じる。
標識化合物（Ａ－４）の一連の代謝変換では、標識化合物（Ａ－４１）、標識化合物（Ａ－４２）、標識化合物（Ａ－４３）、標識化合物（Ａ－４４）、化合物（Ａ－４５）が生じる。ＥＳＩ法では標識化合物（Ａ－４１）（ｍ／ｚ＝３６１→７３、１４６）、標識化合物（Ａ－４２）（ｍ／ｚ＝４４１→１２７、１４６）、標識化合物（Ａ－４３）（ｍ／ｚ＝５２１→４２３、１４６）のプリカーサーイオンは負イオン検出モードで脱プロトン分子が生じ、標識化合物（Ａ－４）（ｍ／ｚ＝２８１→１４６）、標識化合物（Ａ－４４）、化合物（Ａ－４５）は正イオン検出モードでプロトン化分子が生じる。
このように、標識化合物（Ａ－１）～（Ａ－４）は、標識化合物（Ａ－１）～（Ａ－４）と、標識化合物（Ａ－１）～（Ａ－４）の一連の代謝変換によって生じる各標識化合物とがＭＲＭトランジションで互いに区別できるように、１８Ｏ、１３Ｃ及び１５Ｎで標識されている。
具体的には、標識ＡＴＰである標識化合物（Ａ－１）、標識化合物（Ａ－２）から生じた標識化合物（Ａ－２１）、標識化合物（Ａ－３）から生じた標識化合物（Ａ－３２）、及び標識化合物（Ａ－４）から生じた標識化合物（Ａ－４３）は、ＭＲＭトランジションで互いに区別できる。
標識ＡＤＰである標識化合物（Ａ－２）、標識化合物（Ａ－１）から生じた標識化合物（Ａ－１１）、標識化合物（Ａ－３）から生じた標識化合物（Ａ－３１）、及び標識化合物（Ａ－４）から生じた標識化合物（Ａ－４２）は、ＭＲＭトランジションで互いに区別できる。
標識ＡＭＰである標識化合物（Ａ－３）、標識化合物（Ａ－１）から生じた標識化合物（Ａ－１２）、標識化合物（Ａ－２）から生じた標識化合物（Ａ－２２）、及び標識化合物（Ａ－４）から生じた標識化合物（Ａ－４１）は、ＭＲＭトランジションで互いに区別できる。
標識アデノシンである標識化合物（Ａ－４）、標識化合物（Ａ－１）から生じた標識化合物（Ａ－１３）、標識化合物（Ａ－２）から生じた標識化合物（Ａ－２３）、及び標識化合物（Ａ－３）から生じた標識化合物（Ａ－３３）は、ＭＲＭトランジションで互いに区別できる。
標識化合物（Ａ－１）～（Ａ－４）は、これらのうちの任意の２つを選択して用いてもよく、任意の３つを選択して用いてもよく、すべてを用いてもよい。
１８Ｏのみで標識した２種以上の標識化合物の具体例としては、例えば、標識化合物（Ｂ－１）、標識化合物（Ｂ－２）及び標識化合物（Ｂ－３）からなる群から選ばれる２種以上を例示できる。
標識化合物（Ｂ－１）（ｍ／ｚ＝３５０→１３６、７１）の一連の代謝変換では、標識化合物（Ｂ－１１）（ｍ／ｚ＝４３０→１１９、１３６）、標識化合物（Ｂ－１２）（ｍ／ｚ＝５１０→４００、１３６）が生じる。ＥＳＩ法では標識化合物（Ｂ－１）、標識化合物（Ｂ－１１）、標識化合物（Ｂ－１２）のプリカーサーイオンは負イオン検出モードで脱プロトン分子が生じる。
標識化合物（Ｂ－２）（ｍ／ｚ＝４３２→１１９、１３６）の一連の代謝変換では、標識化合物（Ｂ－２１）（ｍ／ｚ＝３５２→６９、１３６）、標識化合物（Ｂ－２２）（ｍ／ｚ＝５１２→４０４、１３６）が生じる。ＥＳＩ法では標識化合物（Ｂ－２）、標識化合物（Ｂ－２１）、標識化合物（Ｂ－２２）のプリカーサーイオンは負イオン検出モードで脱プロトン分子が生じる。
標識化合物（Ｂ－３）（ｍ／ｚ＝５２０→４０６、１３６）の一連の代謝変換では、標識化合物（Ｂ－３１）（ｍ／ｚ＝４３４→１１９、１３６）、標識化合物（Ｂ－３２）（ｍ／ｚ＝３４８→６９、１３６）が生じる。ＥＳＩ法では標識化合物（Ｂ－３）、標識化合物（Ｂ－３１）、標識化合物（Ｂ－３２）のプリカーサーイオンは負イオン検出モードで脱プロトン分子が生じる。
このように、標識化合物（Ｂ－１）～（Ｂ－３）は、標識化合物（Ｂ－１）～（Ｂ－３）と、標識化合物（Ｂ－１）～（Ｂ－３）の一連の代謝変換によって生じる各標識化合物とがＭＲＭトランジションで互いに区別できるように１８Ｏで標識されている。
具体的には、標識ＡＭＰである標識化合物（Ｂ－１）、標識化合物（Ｂ－２）から生じた標識化合物（Ｂ－２１）、及び標識化合物（Ｂ－３）から生じた標識化合物（Ｂ－３２）は、ＭＲＭトランジションで互いに区別できる。
標識ＡＤＰである標識化合物（Ｂ－２）、標識化合物（Ｂ－１）から生じた標識化合物（Ｂ－１１）、及び標識化合物（Ｂ－３）から生じた標識化合物（Ｂ－３１）は、ＭＲＭトランジションで互いに区別できる。
標識ＡＴＰである標識化合物（Ｂ－３）、標識化合物（Ｂ－１）から生じた標識化合物（Ｂ－１２）、及び標識化合物（Ｂ－２）から生じた標識化合物（Ｂ－２２）は、ＭＲＭトランジションで互いに区別できる。
標識化合物（Ｂ－１）～（Ｂ－３）は、これらのうちの任意の２つを選択して用いてもよく、すべてを用いてもよい。
なお、本標識組成物中の標識化合物は、前記した標識化合物（Ａ－１）～（Ａ－４）、標識化合物（Ｂ－１）～（Ｂ－３）には限定されない。例えば、本標識組成物中の標識化合物は、標識化合物（Ｄ－１）と標識化合物（Ｄ－２）の組み合わせであってもよい。
標識化合物の合成方法は、特に限定されず、公知の方法を採用できる。
標識化合物の合成方法は、特に限定されず、公知の方法を採用できる。
従来の方法では、分析試料中で標識化合物が代謝変換されているか否かを判断できない。また、従来の標識化合物を２種以上用いると、分析試料中で標識化合物が代謝変換された場合に、添加した標識化合物と、添加した標識化合物の代謝変換によって生じた標識化合物とを区別できないため、複数の代謝物を網羅的に解析することができない。
これに対して、本標識組成物中の２種以上の標識化合物は、それら２種以上の標識化合物と、それら２種以上の標識化合物の代謝変換によって生じる標識化合物とが、ＭＲＭトランジションで互いに区別できるように、１８Ｏを含む安定同位体で標識されている。そのため、分析試料中で標識化合物が代謝変換されても、分析試料中の代謝変換で生じた標識化合物が、分析試料に添加したどの標識化合物が代謝変換されたものであるかを識別することができる。これにより、分析試料中での標識化合物の代謝変換の有無を認識できるうえ、例えば分析試料中でＡＤＰとＡＴＰの相互変換が生じている場合であっても、それを加味した正確な絶対定量や動態解析を行うことができる。
［代謝物の定量分析法］
本発明の代謝物の定量分析法は、本標識組成物を用い、２種以上の標識化合物を内部標準物質として、対象の代謝物を絶対定量する方法である。具体的には、本標識組成物中の２種以上の標識化合物を内部標準物質とし、ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ等でＭＲＭ測定を行い、対象の代謝物を絶対定量する。
本標識組成物中の２種以上の標識化合物を内部標準物質として用いる以外のＭＲＭ測定の測定条件は、適宜設定できる。
本発明の代謝物の定量分析法は、本標識組成物を用い、２種以上の標識化合物を内部標準物質として、対象の代謝物を絶対定量する方法である。具体的には、本標識組成物中の２種以上の標識化合物を内部標準物質とし、ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ等でＭＲＭ測定を行い、対象の代謝物を絶対定量する。
本標識組成物中の２種以上の標識化合物を内部標準物質として用いる以外のＭＲＭ測定の測定条件は、適宜設定できる。
本標識組成物中の２種以上の標識化合物を内部標準物質としたＭＲＭ測定により、分析試料中で標識化合物が代謝変換されても、それを加味して対象の代謝物を網羅的に絶対定量することができる。
［代謝物の動態解析法］
本発明の代謝物の動態解析法は、本標識組成物を用いて対象の代謝物の動態を解析する方法である。具体的には、本標識組成物中の２種以上の標識化合物を分析試料に添加し、所定の条件で保持した後に、ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ等でＭＲＭ測定を行い、対象の代謝物の動態を解析する。
本標識組成物中の２種以上の標識化合物を用いる以外のＭＲＭ測定の測定条件は、適宜設定できる。
本発明の代謝物の動態解析法は、本標識組成物を用いて対象の代謝物の動態を解析する方法である。具体的には、本標識組成物中の２種以上の標識化合物を分析試料に添加し、所定の条件で保持した後に、ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ等でＭＲＭ測定を行い、対象の代謝物の動態を解析する。
本標識組成物中の２種以上の標識化合物を用いる以外のＭＲＭ測定の測定条件は、適宜設定できる。
本標識組成物中の２種以上の標識化合物を用いたＭＲＭ測定により、それら標識化合物と、それら標識化合物が代謝変換されて生じる標識化合物を互いに区別できるため、対象の代謝物の動態を網羅的に解析できる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載によっては限定されない。
［例１］細胞抽出液中のＡＴＰの酸化分解状況の評価実験
１０ｃｍディッシュで培養したＨｅＬａ細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、冷メタノール（１ｍＬ）で代謝をクエンチした後に、スクレーピング処理により細胞縣濁抽出液を回収した。前記細胞抽出液に、内部標準物質として標識化合物（Ｃ－１）１０ｎｍｏｌを添加し、さらに、クロロホルム及び水を添加することで２相分画を行った。親水性代謝物画分として上相の水メタノール抽出液を回収し、分析試料を得た。前記分析試料中の標識化合物（Ｃ－１）について、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳとしてＮｅｘｅｒａ ＵＨＰＬＣ－ＬＣＭＳ－８０６０（株式会社津製作所）によるＭＲＭ測定を行った。
標識化合物（Ｃ－１）のＭＲＭトランジションは、ｍ／ｚ＝５２６→４２２、１３６である。標識化合物（Ｃ－１）の分解物である標識化合物（Ｃ－１１）のＭＲＭトランジションは、ｍ／ｚ＝４４０→１３６、１１９である。標識化合物（Ｃ－１１）の分解物である標識化合物（Ｃ－１２）のＭＲＭトランジションは、ｍ／ｚ＝３５４→６９、１３６である。
標識化合物（Ｃ－１）を添加した分析試料のＭＲＭ測定は２回（ｎ＝２）行った。また、細胞抽出液に含まれている、１８Ｏで標識されていないＡＴＰ（非標識ＡＴＰ）についてもＭＲＭ測定を行った。結果を図１に示す。
［例１］細胞抽出液中のＡＴＰの酸化分解状況の評価実験
１０ｃｍディッシュで培養したＨｅＬａ細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、冷メタノール（１ｍＬ）で代謝をクエンチした後に、スクレーピング処理により細胞縣濁抽出液を回収した。前記細胞抽出液に、内部標準物質として標識化合物（Ｃ－１）１０ｎｍｏｌを添加し、さらに、クロロホルム及び水を添加することで２相分画を行った。親水性代謝物画分として上相の水メタノール抽出液を回収し、分析試料を得た。前記分析試料中の標識化合物（Ｃ－１）について、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳとしてＮｅｘｅｒａ ＵＨＰＬＣ－ＬＣＭＳ－８０６０（株式会社津製作所）によるＭＲＭ測定を行った。
標識化合物（Ｃ－１）のＭＲＭトランジションは、ｍ／ｚ＝５２６→４２２、１３６である。標識化合物（Ｃ－１）の分解物である標識化合物（Ｃ－１１）のＭＲＭトランジションは、ｍ／ｚ＝４４０→１３６、１１９である。標識化合物（Ｃ－１１）の分解物である標識化合物（Ｃ－１２）のＭＲＭトランジションは、ｍ／ｚ＝３５４→６９、１３６である。
標識化合物（Ｃ－１）を添加した分析試料のＭＲＭ測定は２回（ｎ＝２）行った。また、細胞抽出液に含まれている、１８Ｏで標識されていないＡＴＰ（非標識ＡＴＰ）についてもＭＲＭ測定を行った。結果を図１に示す。
図１に示すように、添加した標識化合物（Ｃ－１）の分解の度合いは、非標識のＡＴＰの分解の度合いと同程度であった。この結果から、標識化合物（Ｃ－１）を用いることで、ＨｅＬａ細胞からの細胞抽出液中のＡＴＰの分解の度合いを評価できることが分かった。
［例２］標識化合物の溶液安定性試験
水、及び、濃度０．１質量％、１質量％、５質量％のギ酸水溶液のそれぞれに、標識化合物（Ｄ－１）を２００質量ｐｐｍとなるように添加し、４℃、室温（２５℃）、及び４０℃で保存した。調製直後、５日後、及び２０日後の各溶液について、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳとしてＡＣＱＵＩＴＹ Ｈ ｃｌａｓｓ（ｗａｔｅｒｓ製）及びＸＥＶＯ－Ｇ２ＸＳＱＴＯＦ（ｗａｔｅｒｓ製）を用いて以下の条件で質量分析を行い、１８Ｏ濃縮度を算出した。結果を図２に示す。
（質量分析条件）
移動相Ａ：５ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液、
移動相Ｂ：５ｍＭ酢酸アンモニウム／アセトニトリル、
分離カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ ＡＤＭＥ ２μｍ ２．１×１００ｍｍ、
イオン化モード：ネガティブ、
キャピラリー電圧：２．０ｋＶ、
コーン電圧：４０Ｖ、
ソース温度：１５０℃、
脱溶媒ガス温度：３５０℃、
脱溶媒ガス流量：８００Ｌ／ｈ、
コーンガス流量５０Ｌ／ｈ。
標識化合物（Ｄ－１）の代わりに標識化合物（Ｄ－２）を用いた場合についても、同様にして１８Ｏ濃縮度を算出した。結果を図３に示す。
水、及び、濃度０．１質量％、１質量％、５質量％のギ酸水溶液のそれぞれに、標識化合物（Ｄ－１）を２００質量ｐｐｍとなるように添加し、４℃、室温（２５℃）、及び４０℃で保存した。調製直後、５日後、及び２０日後の各溶液について、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳとしてＡＣＱＵＩＴＹ Ｈ ｃｌａｓｓ（ｗａｔｅｒｓ製）及びＸＥＶＯ－Ｇ２ＸＳＱＴＯＦ（ｗａｔｅｒｓ製）を用いて以下の条件で質量分析を行い、１８Ｏ濃縮度を算出した。結果を図２に示す。
（質量分析条件）
移動相Ａ：５ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液、
移動相Ｂ：５ｍＭ酢酸アンモニウム／アセトニトリル、
分離カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ ＡＤＭＥ ２μｍ ２．１×１００ｍｍ、
イオン化モード：ネガティブ、
キャピラリー電圧：２．０ｋＶ、
コーン電圧：４０Ｖ、
ソース温度：１５０℃、
脱溶媒ガス温度：３５０℃、
脱溶媒ガス流量：８００Ｌ／ｈ、
コーンガス流量５０Ｌ／ｈ。
標識化合物（Ｄ－１）の代わりに標識化合物（Ｄ－２）を用いた場合についても、同様にして１８Ｏ濃縮度を算出した。結果を図３に示す。
標識化合物（Ｄ－１）は、１％ギ酸水溶液中で４０℃にて２０日間保存したところ、ＡＭＰ及びＡＤＰへの分解が観察されたが、図２に示すように、溶液中で１８Ｏの１６Ｏとの交換は観察されず、１８Ｏ濃縮度は低下しなかった。また、他の条件においても、溶液中で１８Ｏの１６Ｏとの交換は観察されず、１８Ｏ濃縮度はほとんど低下しなかった。
また、図３に示すように、標識化合物（Ｄ－２）においても、溶液中で１８Ｏの１６Ｏとの交換は観察されず、１８Ｏ濃縮度はほとんど低下しなかった。
また、図３に示すように、標識化合物（Ｄ－２）においても、溶液中で１８Ｏの１６Ｏとの交換は観察されず、１８Ｏ濃縮度はほとんど低下しなかった。
Claims (5)
- ２種以上の標識化合物を含む質量分析用標識組成物であって、
前記の２種以上の標識化合物は、生体内の代謝変換の一連の経路の中の２種以上のリン酸化合物が、１８Ｏを含む１種以上の安定同位体により標識された２種以上の標識化合物であり、
前記の２種以上の標識化合物は、前記の２種以上の標識化合物と、前記の２種以上の標識化合物の代謝変換によって生じる標識化合物とが、多重反応モニタリングのトランジションで互いに区別できるように標識されており、
前記の２種以上の標識化合物が、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、及びヌクレオシド三リン酸からなる群から選ばれる２種以上が標識された標識化合物である、質量分析用標識組成物。 - 前記安定同位体が、１８Ｏと、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ及び１７Ｏからなる群から選ばれる１種以上との組み合わせである、請求項１に記載の質量分析用標識組成物。
- 前記の２種以上の標識化合物が、ヌクレオシド二リン酸が標識された標識化合物と、ヌクレオシド三リン酸が標識された標識化合物とを含む、請求項１又は２に記載の質量分析用標識組成物。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載の質量分析用標識組成物を用い、前記の２種以上の標識化合物を内部標準物質として対象の代謝物を絶対定量する、代謝物の定量分析法。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載の質量分析用標識組成物を用いて対象の代謝物の動態を解析する、代謝物の動態解析法。
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