ES2840056T3 - Métodos basados en espectrometría de masas para la detección de histonas circulantes H3 y H2B en plasma a partir de pacientes con septicemia o choque séptico (SS) - Google Patents

Abstract

Método basado en espectrometría de masas para diagnosticar o detectar septicemia o choque séptico en un sujeto humano que comprende las etapas de: medir el nivel o la concentración al menos de histona circulante H3 en una o más muestras biológicas que consisten en sangre, suero o plasma aisladas a partir del sujeto usando un espectrómetro de masas; y comparar el nivel o la concentración de dicha histona circulante a partir de la una o más muestras biológicas del sujeto que se sospecha que padece septicemia o choque séptico con un valor de referencia o con el nivel o la concentración de dicha histona circulante a partir de una muestra biológica que consiste en sangre, suero o plasma de un sujeto normal, en el que el sujeto normal es un sujeto sano que no padece septicemia o choque séptico, en el que el nivel o la concentración de histona circulante H3 es equivalente a la cantidad de péptido de SEQ ID NO 1 (STELLIR) presente en la muestra biológica tras digestión o tratamiento con tripsina, y en el que para medir el nivel o la concentración de histona circulante H3 en la muestra biológica se obtiene la razón promedio de SEQ ID NO 1, y en el que un aumento en el nivel o la concentración al menos de histona circulante H3 es indicativo de septicemia o choque séptico.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos basados en espectrometría de masas para la detección de histonas circulantes H3 y H2B en plasma a partir de pacientes con septicemia o choque séptico (SS)

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo médico, en particular al campo del diagnóstico/pronóstico de enfermedad basándose en la detección de biomarcadores de plasma usando métodos basados en espectrometría de masas. Más particularmente, la presente invención se refiere a métodos basados en espectrometría de masas para la detección de histonas circulantes H3 y H2B en plasma de pacientes que se sospecha que padecen septicemia o choque séptico para el diagnóstico/pronóstico de septicemia o choque séptico en esos pacientes.

Antecedentes de la invención

La septicemia se define como la respuesta inflamatoria sistémica del huésped frente a infección grave, potencialmente mortal, con la presencia de anomalías bioquímicas y disfunción orgánica. Es un principal problema de atención sanitaria, que afecta a millones de personas en todo el mundo cada año. Su incidencia está amentando debido al envejecimiento de la población, la inmunosenescencia y la inmunidad afectada resultante. Además, es la causa más frecuente de mortalidad en la mayoría de las unidades de cuidados intensivos (UCI), especialmente si no se reconoce y se trata rápidamente. A pesar de su importancia a nivel mundial y de considerarse una preocupación de salud pública, que representa más de 20 mil millones de $ (5,2%) de los costes hospitalarios totales en EE.UU. en 2011, la concienciación pública sobre la septicemia es escasa.

El choque séptico debe definirse como un subconjunto de septicemia en el que anomalías circulatorias, celulares y metabólicas particularmente profundas están asociadas con un riesgo de mortalidad mayor que con la septicemia sola. Los pacientes con choque séptico pueden identificarse clínicamente mediante un requisito de vasopresores para mantener una tensión arterial media de 65 mm de Hg o mayor y un nivel de lactato en suero mayor de 2 mmol/l (>18 mg/dl) a pesar de una reposición de la volemia adecuada.

La mortalidad a corto plazo de la septicemia oscila entre el 10-40% y se ha notificado que es de hasta el 30-60% en el choque séptico. La terapia dirigida a objetivos temprana y el tratamiento con antibióticos apropiado administrado al paciente lo antes posible han demostrado ser ambos eficaces en la reducción de la mortalidad, pero, a pesar de las mejoras en el tratamiento, la mortalidad a corto plazo todavía es muy alta.

Anteriormente se ha estudiado la presencia de histonas circulantes en relación con procesos sépticos y varios trabajos muestran una correlación directa entre la presencia de histonas específicas en plasma y los síntomas derivados de septicemia prolongada. Las histonas circulantes se encuentran en la sangre de individuos sanos a bajas concentraciones, pero sus niveles aumentan en gran medida en pacientes que padecen traumatismo grave, inflamación sistémica, septicemia o daño tisular. De manera notable, las proteínas de histona muestran un potencial citotóxico interesante, que se ha demostrado que afecta a células bacterianas y de mamíferos, contribuyendo a empeorar la evolución de la septicemia.

Sin embargo, no se ha alcanzado ningún consenso definitivo referente a los niveles de concentración específicos para cada tipo de histona con respecto a su patogenia. Además, nunca se han esclarecido totalmente los niveles de histonas específicas y su capacidad para usarse para monitorizar la progresión de la septicemia así como la correlación con la eficacia de tratamientos. Esto se debe, en la gran mayoría de los casos, a la falta de métodos específicos y sensibles para analizar la presencia y, además, para cuantificar los niveles de histonas circulantes.

Anteriormente se han usado inmunoensayos (IA) para la detección de proteínas de histona libres que circulan en plasma, pero los resultados obtenidos mediante IA muestran una baja reproducibilidad, altos intervalos de error y baja sensibilidad. Además, los IA semicuantitativos muestran muchos defectos, tales como escasa concordancia entre ensayos, diferencia en la reproducibilidad cuando se usan diferentes kits de fabricantes que usan diferentes anticuerpos patentados (que reconocen diferentes epítopos en cada ensayo) y reactividad cruzada variable. Además, puede producirse una variedad de interferencias en los IA, incluyendo anticuerpos anti-reactivo y autoanticuerpos endógenos presentes en las muestras biológicas sometidas a ensayo, que pueden generar resultados erróneos y provocar efectos secundarios clínicos.

Por tanto, existe una necesidad de sustitución de los IA actuales por otros métodos o técnicas que aumenten la sensibilidad y especificidad de la detección de biomarcadores de septicemia de diagnóstico y pronóstico.

Breve descripción de la invención

Los autores de la presente invención han llegado a la conclusión de que, sustituyendo los métodos de IA actuales por métodos basados en espectrometría de masas, hay una mejora significativa en la sensibilidad y especificidad de la detección de biomarcadores ligados al diagnóstico y pronóstico de la septicemia. Con respecto a esto, en el presente documento se muestra que la espectrometría de masas (EM) dirigida usando péptidos en adiciones conocidas, fuertemente marcados, específicos, es un enfoque eficiente y sensible para la identificación y cuantificación de histonas circulantes de la sangre. Por tanto, usando dichos métodos basados en espectrometría de masas, la monitorización de septicemia y/o choque séptico se beneficiará en gran medida de nuevos biomarcadores asequibles con alta sensibilidad y especificidad.

En este sentido, en la presente invención, se propone un nuevo método para la detección de histonas circulantes H3 y H2B en plasma a partir de pacientes con septicemia o choque séptico (SS), basándose en métodos basados en espectrometría de masas, en particular basándose en espectrometría de masas dirigida a monitorización de reacciones múltiples (MRM-EM) y en enfoque de monitorización de reacciones múltiples. Tales métodos permiten la cuantificación de histonas usando un patrón interno y muestran fuertes valores de especificidad y sensibilidad. Usando muestras biológicas a partir de pacientes, en comparación con controles sanos, se ha validado adicionalmente el presente método y, además, se ha podido establecer un umbral para los niveles de histona en plasma que se correlacionan con un desenlace mortal para pacientes con choque séptico. Por tanto, el método puede establecer la norma para la implantación de cuantificación basada en espectrometría de masas de los niveles de histonas H3 y H2B en patologías con presencia de estas histonas circulantes, proporcionando una herramienta muy valiosa para monitorizar la progresión de la enfermedad e intervenciones clínicas.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Resumen de cuantificación de proteínas seleccionadas como diana de histonas H2B y H3 mediante MRM-EM. Cromatogramas para los péptidos LLLPGELAK y STELLIR que muestran las áreas de picos integradas a partir de la señal correspondiente a transiciones (pesada, 300 fmol y endógena). Se comparan las áreas de picos para péptidos seleccionados como diana con las de péptidos en adiciones conocidas estables usados como patrones. También se muestran transiciones específicas de secuencia derivadas a partir del espectro de EM/EM.

Figura 2. Diagramas de cajas que muestran el nivel de histonas H2B y H3 detectadas en plasma. A) Diagrama de cajas que representa niveles de H2B y H3 en sujetos sanos frente a pacientes con choque séptico con bacteriemia; B) diagramas de cajas que representan niveles de H2B y H3 a partir de pacientes con s S supervivientes y no supervivientes. Las cajas designan intervalos de intercuartiles, las líneas designan la mediana, y los bigotes designan los percentiles 10 y 90. Los niveles se expresan como ng/ml de H2B o H3 en plasma.

Figura 3. Curva de rendimiento diagnóstico (ROC) para histona H2B (3A) y H3 (3B) para la distinción entre pacientes con SS supervivientes y no supervivientes. Curva de ROC basada en la cuantificación mediante MRM-EM de los niveles de H2B y H3.

Figura 4. Señales de monitorización de reacciones múltiples (MRM) endógenas no específicas observadas en cromatogramas totales para A) LLLPGELAK y B) STELLIR. Las flechas indican los picos asignados al péptido de interés. No se encontró ningún pico interferente en el tiempo de elución de ambos péptidos.

Figura 5. Niveles de histona circulante H2B en plasma a partir de pacientes de UCI (unidad de cuidados intensivos) sin septicemia, de control, y población general sana, pacientes sépticos y con choque séptico. Los diagramas de cajas y bigotes representan los niveles de H2B en los cuatro grupos. Las cajas designan intervalos de intercuartiles, las líneas horizontales designan las medianas, y los bigotes designan los percentiles 10 y 90. Los niveles se expresan como ng/ml de H2B.

Figura 6. Intensidad en los cromatogramas de nano-CL-MRM-EM para STLLIR en proteína de patrón pura H3.1.

Figura 7. Intensidad en los cromatogramas de nano-CL-MRM-EM para LLLPGELAK en proteína de patrón pura H2B.

Figura 8. Curvas de respuesta para péptido LLLPGELAK para histona H2B. Se hizo variar la concentración de péptido ligero entre 0,012 ug/ml y 60 ug/ml y se midió con respecto a la señal de péptido pesado. Los gráficos muestran la regresión lineal entre el área a partir del espectro de e M y la concentración de péptido para diferentes transiciones.

Figura 9. Curvas de respuesta para péptido STELLIR para H3. Se hizo variar la concentración de péptido ligero entre 0,012 ug/ml y 60 ug/ml y se midió con respecto a la señal de péptido pesado. Los gráficos muestran la regresión lineal entre el área a partir del espectro de EM y la concentración de péptido para diferentes transiciones.

Descripción detallada de la invención

El diagnóstico temprano y la estratificación rápida de pacientes de septicemia y SS pueden mejorar el desenlace de pacientes redefiniendo el tratamiento específico de una manera oportuna y apropiada. Esto supone un desafío para los profesionales de las UCI que requieren nuevos biomarcadores para reconocer a pacientes propensos a presentar progresión hacia un estado patológico más crítico. Las complejidades de la fisiopatología de septicemia y SS y sus muchas amenazas nosológicas, son motivos por los cuales ni los biomarcadores clínicos ni los biológicos han demostrado ser altamente precisos como para predecir desenlaces adversos.

MRM-EM ofrece una posible metodología tanto para descubrimiento de biomarcadores como para validación de biomarcadores. Además, este método proporciona la sensibilidad, precisión y alto rendimiento necesarios para la validación clínica de biomarcadores, eliminando por tanto la necesidad de realizar métodos de descubrimiento y validación diferentes. El plasma es una fuente de biomarcadores para ensayos de diagnóstico, pero también es una matriz biológica compleja para estudios proteómicos debido a la amplia gama dinámica de proteínas presentes en este líquido (1010). Se ha propuesto que la monitorización de una única transición por péptido es suficientemente específica para la cuantificación de péptidos en mezclas complejas tales como plasma. Por otro lado, los biomarcadores clásicos no añaden más información que puntuaciones genéricas en la predicción del desenlace de pacientes sépticos. A pesar de tener CRP y PCT para complementar el diagnóstico de septicemia, y la utilidad de la PCT como biomarcador de pronóstico, el conocimiento futuro de septicemia requiere hallar nuevos biomarcadores que puedan ser sensibles, específicos y económicamente asequibles.

La abrumadora respuesta inmunitaria frente a infección puede liberar histonas en la sangre no sólo para luchar contra la infección mediante un proceso denominado generación de NET, sino también como consecuencia de daño endotelial y apoptosis de neutrófilos y otras células inmunitarias. Se ha descrito la toxicidad para todos los tipos de histona, pero algunos datos resultan controvertidos con respecto a esto, incluyendo el tipo de histona y la concentración en plasma. Abrams y colaboradores obtuvieron resultados de citotoxicidad similares tanto para histona de unión H1 como para histonas núcleo H2A, H2B, H3 y H4, mientras que otros autores encontraron una citotoxicidad superior para H3, H4 y en algunos casos H2B, en vez de H2A. Además, las histonas median en la apoptosis de células en el compartimento linfoide incluyendo el timo, bazo y sangre. Particularmente, se ha propuesto H4 como la principal histona que impulsa la apoptosis de linfocitos. Otros estudios han identificado la histona H3 y nucleosomas en plasma a partir de pacientes sépticos.

Además del tipo de histona, los IA han proporcionado diferentes niveles de histonas circulantes en septicemia, pero estudios anteriores nunca fueron capaces de proporcionar un intervalo estrecho de concentraciones que puedan considerarse citotóxicas. Con el fin de identificar un método sensible y específico para cuantificar histonas circulantes en muestras de plasma, se desarrolló un método basado en MRM-EM que usa péptidos en adiciones conocidas LLLPGELAK y s Te LLIR para detectar histonas H2B y H3, respectivamente.

El presente método permite la identificación de pacientes con coeficientes de correlación significativos tanto en supervivientes como no supervivientes con respecto al episodio séptico dentro de las primeras 24 horas en la UCI. La presencia de ambas histonas puede usarse con propósitos clínicos, estableciendo por primera vez un intervalo de concentración específico de histonas H2B y H3 en plasma que va a usarse como criterio de primera clasificación cuando llegan pacientes a la UCI y también pasan a ser un biomarcador de pronóstico valioso de desenlace mortal de choque séptico.

Con el fin de proporcionar tal metodología y seleccionar los mejores péptidos que tienen coeficientes de correlación significativos tanto en supervivientes como en no supervivientes frente al episodio séptico dentro de las primeras 24 horas en la UCI, se realizó un análisis mediante nano-CL-EM-EM-DIA usando un espectrómetro de masas 5600 TripleTOF (SCIEX) de proteínas H2B humana y H3 humana, patrones puros. Tal análisis permitió identificar mediante BLAST un total de 29 péptidos trípticos para H2B humana con una confianza estadística del 95% o superior. En el caso de H3 humana, este ensayo permitió asignar 18 péptidos, con una confianza estadística del 95% o superior.

Además, usando los programas bioinformáticos MRM Pilot (Sciex) y Skiline (Macoss Lab, Department of Genome Sciences, UW, EE.UU.) y descartando los péptidos que tenían escisiones omitidas y aminoácidos propensos a modificación (M / W / Q / N), la lista de candidatos adecuados para su uso en experimentos de MRM posteriores se redujo a:

En el procedimiento de realizar un ajuste fino de los parámetros de adquisición tales como “potencial de desolvatación” y “energía de colisión” y durante el análisis de las proteínas de patrón en matrices complejas, se determinó que los péptidos más intensos eran STELLIR para H3.1 y LLLPGELAK para H2B, por tanto se eligieron como candidatos para experimentos de MRM-EM para la cuantificación de histonas circulantes H3 y H2B. La diferencia de intensidad se ilustra en los cromatogramas de nano-CL-MRM-EM mostrados en las figuras 6 y 7 para cada proteína de patrón pura.

Para lograr una cuantificación relativa fiable de péptidos en matrices complejas, debe caracterizarse analíticamente el ensayo proteómico dirigido con respecto a su especificidad, intervalo lineal, precisión y repetibilidad. Para la cuantificación de histonas circulantes en sangre, la especificidad, intervalo lineal, precisión y repetibilidad son requisitos obligatorios, por tanto se comprobó en la condición experimental la linealidad del péptido LLLPGELAK para histona H2B y del péptido STELLIR para H3. En la figura 8 y la figura 9 se muestra la linealidad del péptido LLLPGELAK para histona H2B y del péptido STELLIR para H3, respectivamente, teniendo en cuenta diferentes transiciones para cada concentración de péptido sometida a prueba.

Por tanto, los resultados demuestran que la concentración detectada de cada péptido está por encima del límite de cuantificación del ensayo y dentro del intervalo lineal del ensayo. De hecho, el péptido LLLPGELAK para histona H2B y el péptido STELLIR para H3 mostraron un buen intervalo lineal, buena sensibilidad y especificidad. Se indica que, en el contexto de la presente invención, “límite de cuantificación” se entiende como el límite inferior de cuantificación y se refiere a la concentración más baja del analito a la que pueden realizarse mediciones cuantitativas. El límite superior de cuantificación describe la concentración más alta de analito por encima de la cual la señal se aleja de la linealidad. Estos dos límites de cuantificación definen el intervalo lineal del ensayo.

Además, y tal como se muestra en los ejemplos, se analizó a un total de diecisiete pacientes con diagnóstico clínico de SS en el ingreso en una UCI médica. La tabla 1 muestra las características clínicas de pacientes. Se extrajeron muestras de sangre de dichos pacientes de la UCI y de sujetos sanos en tubos de EDTA. Se centrifugó cada muestra a 2.500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA) para separar el plasma y después se almacenaron alícuotas a -80°C hasta su uso en experimentos de MRM-EM. Se realizaron experimentos de MRM tal como se describe en los ejemplos incluidos en el presente documento. Se estimaron los niveles de histonas H2B y H3 basándose en la razón promedio obtenida para los péptidos LLPGELAK y STELLIR. Se dedujo la concentración final de H2B y H3 en ng/ml a partir de los valores de masa molecular relativa (Mr) de las proteínas seleccionadas como objetivo (Mr de 13,906 Da y 15,404 Da para H2B y H3, respectivamente).

Para la histona H2B el nivel medio encontrado en controles, sujetos sanos, fue de 204,48 ng/ml (IC del 95% de 25,31­ 283,66), y en pacientes aumentó hasta 1.736,91 ng/ml (IC del 95% de 555,34-2918,47). Las diferencias observadas fueron estadísticamente significativas (p=0,014), siendo superiores para histona H3 en la que los niveles medios eran de 23,50 ng/ml (IC del 95% de -3,97-50,98) para controles y 2.040,79 ng/ml (IC del 95% de 756,58-3325,01) para pacientes (p=0,004) (figura 2A).

Los niveles de histonas se correlacionaron de manera positiva con coeficientes de correlación significativos en ambos grupos (coeficiente de Spearman r= 0,848, p=0,002 para controles y r=0,827, p<0,0001 para pacientes).

Para los pacientes que sobrevivieron, el nivel medio de ambas histonas dentro de las primeras 24 horas en la UCI fue significativamente bajo en comparación con los no supervivientes (figura 2B), siendo los valores hasta cinco veces inferiores en comparación con los niveles detectados en los no supervivientes. Para la histona H2B, el nivel medio fue de 607,00 ng/ml (IC del 95% de 204,20-1.009,82) en supervivientes y 3.008,05 ng/ml (IC del 95% de 603,94-5.412,15) en no supervivientes (p=0,046), y se observaron las mismas diferencias proporcionales con respecto a los niveles de histona H3, siendo los valores medios observados de 740,70 ng/ml (IC del 95% de 311,16-1170,23) para supervivientes y 3.503,41 ng/ml (IC del 95% de 955,95-6.050,86) para no supervivientes (p=0,036).

Además y tal como se muestra en los ejemplos, un análisis de curva de ROC realizado para evaluar el poder de diagnóstico de los niveles de histonas H2B y H3 reveló que ambas podían servir como biomarcadores valiosos para distinguir casos de choque séptico de controles sanos. En la tabla 2 se muestran las AUC (área bajo las curvas de ROC), error estándar, intervalo de confianza (IC), valor de corte de concentración óptimo, sensibilidad y especificidad para cada histona.

Aunque las AUC para ambas histonas son similares y los niveles de ambos biomarcadores eran significativamente diferentes entre controles sanos y pacientes, la histona H3 mostró valores superiores para sensibilidad y especificidad con respecto al diagnóstico. Para este biomarcador, con una concentración de 86,36 ng/ml como valor de corte óptimo, los valores de sensibilidad y especificidad del método fueron del 94,1% y el 90,0%, respectivamente.

Además, para examinar el posible uso de histonas en plasma como biomarcadores para el pronóstico de choque séptico, se construyó la curva de ROC correspondiente para cada histona. Se seleccionaron únicamente los casos y se calcularon los parámetros de biomarcador: valor de corte óptimo, sensibilidad y especificidad para distinguir entre supervivientes y no supervivientes (figura 3). De nuevo, la histona H3 se clasificó mejor que la histona H2B para el pronóstico. El valor de sensibilidad fue superior para la histona H3 (sensibilidad = 75,0%, especificidad = 88,9%, valor de corte = 1348,13 ng/ml) que para histona H2B (sensibilidad = 62,5%, especificidad = 88,9%, valor de corte = 1426,38 ng/ml), con valores de corte similares. Por tanto, queda claro entonces a partir de los resultados en el presente documento que los niveles de histonas tanto H2B como H3 en sangre, suero o plasma, pueden servir como biomarcadores valiosos para distinguir casos de choque séptico de controles sanos y distinguir entre supervivientes y no supervivientes.

Por consiguiente, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método basado en espectrometría de masas para diagnosticar o detectar septicemia o choque séptico en un sujeto humano que comprende las etapas de: medir el nivel o la concentración al menos de histonas circulantes H3 y/o H2B en una o más muestras biológicas que consisten en sangre, suero o plasma aisladas a partir del sujeto usando un espectrómetro de masas; y comparar el nivel o la concentración de dichas histonas circulantes a partir de la una o más muestras biológicas del sujeto que se sospecha que padece septicemia o choque séptico con un valor de referencia o con el nivel o la concentración de dichas histonas circulantes a partir de una muestra biológica que consiste en sangre, suero o plasma de un sujeto normal, en el que el sujeto normal es un sujeto sano que no padece septicemia o choque séptico, y en el que un aumento en el nivel o la concentración al menos de histonas circulantes H3 y/o H2B es indicativo de septicemia o choque séptico.

Preferiblemente, el intervalo de concentración específico de histonas H2B y/o H3 en plasma que va a usarse como criterio de primera clasificación cuando llegan pacientes a la UCI, y también pasa a ser un biomarcador de diagnóstico valioso de septicemia o choque séptico, es un intervalo en el que los niveles de concentración de histona circulante H2B en plasma están por encima de 212,03 ng/ml y/o los niveles de concentración de histona circulante H3 en plasma están por encima de 86,36 ng/ml. Si los niveles de concentración de H2B o H3 en plasma están más allá de cualquiera de dichos valores, esto es indicativo de septicemia o choque séptico.

Preferiblemente, el espectrómetro de masas es un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo/trampa de iones lineal, preferiblemente equipado con un sistema cromatográfico, más preferiblemente equipado con un sistema cromatográfico de nano-CL. Preferiblemente, el método basado en espectrometría de masas para diagnosticar o detectar septicemia o choque séptico en un sujeto humano según el primer aspecto de la invención o cualquiera de sus realizaciones preferidas, el nivel o la concentración de histona circulante H3 es equivalente a la cantidad de péptido de SEQ ID NO 1 (STELLIR). En este sentido, para medir el nivel o la concentración de histona circulante H3 en la muestra biológica, se obtiene la razón promedio, entendida como la razón de péptido señal de interés/péptido señal en adiciones conocidas, de SEQ ID NO 1. Por los mismos motivos, para medir el nivel o la concentración de histona circulante H2B en la muestra biológica, se obtiene la razón promedio de SEQ ID NO 2 (LLLPGELAK). Más preferiblemente, pueden prepararse preferiblemente secuencias de péptidos seleccionados (STELLIR para H3; LLLPGELAK para H2B) como SpikeTidesTM_TQ (marcado con isótopos pesados tal como Arg: 13C6, 15N4; Lys: Arg: 13C6, 15N2) (JPT Peptide Technologies, Berlín, Alemania) para la cuantificación absoluta de histona circulante H3 y/o H2B en el método según el primer aspecto de la invención o cualquiera de sus realizaciones preferidas.

En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el valor de referencia para histona H3 es de 86,36 ng/ml, en el que un aumento de al menos 1,5 veces, preferiblemente de al menos 2, de al menos 3, de al menos 4, de al menos 5, de al menos 6, de al menos 7, de al menos 8, de al menos 9, de al menos 10, de al menos 15, de al menos 20, de al menos 30, de al menos 40, de al menos 50, de al menos 60, de al menos 70, de al menos 80, de al menos 90 o de al menos 100 es indicativo de septicemia o choque séptico.

En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el valor de referencia para histona H2B es de 212,03 ng/ml, en el que un aumento de al menos 1,5, de al menos 2, de al menos 3, de al menos 4, de al menos 5, de al menos 6, de al menos 7, de al menos 8, de al menos 9, de al menos 10, de al menos 15, de al menos 20, de al menos 30, de al menos 40, de al menos 50, de al menos 60, de al menos 70, de al menos 80, de al menos 90 o de al menos 100 es indicativo de choque séptico.

En otra realización preferida del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, el método comprende las etapas de: medir el nivel o la concentración al menos de histonas circulantes H3 y H2B en una o más muestras biológicas que consisten en sangre, suero o plasma aisladas a partir del sujeto usando un espectrómetro de masas; y comparar el nivel o la concentración de dichas histonas circulantes a partir de la una o más muestras biológicas del sujeto que se sospecha que padece choque séptico con un valor de referencia o con el nivel o la concentración de dichas histonas circulantes a partir de una muestra biológica que consiste en sangre, suero o plasma de un sujeto normal, en el que el sujeto normal es un sujeto sano que no padece choque séptico, y en el que un aumento en el nivel o la concentración al menos de histonas circulantes H3 y h 2b es indicativo de choque séptico.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método basado en espectrometría de masas para predecir (pronosticar) la evolución clínica de septicemia o choque séptico en un sujeto humano que padece septicemia o choque séptico, que comprende las etapas de: medir el nivel o la concentración al menos de histonas circulantes H3 y/o H2B en una o más muestras biológicas que consisten en sangre, suero o plasma aisladas a partir del sujeto usando un espectrómetro de masas; y comparar el nivel o la concentración de dichas histonas circulantes a partir de la una o más muestras biológicas del sujeto que padece septicemia o choque séptico con un valor de referencia, en el que un aumento en el nivel o la concentración al menos de histonas circulantes H3 y/o H2B es indicativo de una evolución clínica negativa, y en el que la evolución clínica se refiere a la supervivencia global del paciente.

En el contexto de la presente invención la “supervivencia global” (OS) se entiende como la duración de tiempo o bien desde la fecha de diagnóstico o bien desde el inicio del tratamiento para una enfermedad en la que los pacientes en los que se diagnostica la enfermedad todavía están vivos.

En el contexto de la presente invención, “evolución clínica negativa” se entiende como progresión diaria negativa del estado clínico con respecto a la primera semana de septicemia o choque séptico con una respuesta mala o sin respuesta al tratamiento con desenlace de mortalidad.

Preferiblemente, el intervalo de concentración específico de histonas H2B y/o H3 en plasma que va a usarse como criterio de primera clasificación cuando llegan pacientes a la UCI, y también pasa a ser un biomarcador de pronóstico valioso de septicemia o choque séptico, es un intervalo en el que los niveles de concentración de histona circulante H2B en plasma están por encima de 1426,38 ng/ml y/o los niveles de concentración de histona circulante H3 en plasma están por encima de 1348,13 ng/ml. Si los niveles de concentración de H2B o H3 en plasma están más allá de cualquiera de dichos valores, esto es indicativo de una evolución clínica negativa, en el que la evolución clínica se refiere a la supervivencia global del paciente.

Preferiblemente, el espectrómetro de masas es un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo/trampa de iones lineal equipado con un sistema cromatográfico, más preferiblemente equipado con un sistema cromatográfico de nano-CL. Preferiblemente, el método basado en espectrometría de masas para predecir (pronosticar) la evolución clínica de choque séptico en un sujeto humano que padece choque séptico según el segundo aspecto de la invención o cualquiera de sus realizaciones preferidas, el nivel o la concentración de histona circulante H3 es equivalente a la cantidad de péptido de SEQ ID NO 1 (STELLIR). En este sentido, para medir el nivel o la concentración de histona circulante h 3 en la muestra biológica, se obtiene la razón promedio de SEQ ID NO 1. Por los mismos motivos, para medir el nivel o la concentración de histona circulante H2B en la muestra biológica, se obtiene la razón promedio de SEQ ID NO 2. Más preferiblemente, pueden prepararse preferiblemente secuencias de péptidos seleccionados (STELLIR para H3; LLLPGELAK para H2B) como SpikeTidesTM_TQ (marcado con isótopos pesados tal como Arg: 13C6, 15N4; Lys: Arg: 13C6, 15N2) (JPT Peptide Technologies, Berlín, Alemania) para la cuantificación absoluta de histona circulante H3 y/o H2B en el método según el primer aspecto de la invención o cualquiera de sus realizaciones preferidas.

En otra realización preferida del segundo aspecto de la invención, el valor de referencia para histona H3 es de 1.348,13 ng/ml, en el que un aumento de al menos 1,5 veces, preferiblemente de al menos 2, de al menos 3, de al menos 4, de al menos 5, de al menos 6, de al menos 7, de al menos 8, de al menos 9, de al menos 10, de al menos 15, de al menos 20, de al menos 30, de al menos 40, de al menos 50, de al menos 60, de al menos 70, de al menos 80, de al menos 90 o de al menos 100 es indicativo de una evolución clínica negativa.

En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el valor de referencia para histona H2B es de 1.426,38 ng/ml, en el que un aumento de al menos 1,5 veces, preferiblemente de al menos 2, de al menos 3, de al menos 4, de al menos 5, de al menos 6, de al menos 7, de al menos 8, de al menos 9, de al menos 10, de al menos 15, de al menos 20, de al menos 30, de al menos 40, de al menos 50, de al menos 60, de al menos 70, de al menos 80, de al menos 90 o de al menos 100 es indicativo de una evolución clínica negativa.

En otra realización preferida del segundo aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, el método comprende las etapas de: medir el nivel o la concentración al menos de histonas circulantes H3 y H2B en una o más muestras biológicas que consisten en sangre, suero o plasma aisladas a partir del sujeto usando un espectrómetro de masas; y comparar el nivel o la concentración de dichas histonas circulantes a partir de la una o más muestras biológicas del sujeto que padece choque séptico con un valor de control, en el que un aumento en el nivel o la concentración al menos de histonas circulantes H3 y H2B es indicativo de una evolución clínica negativa.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo adecuado para diagnosticar o detectar septicemia o choque séptico en un sujeto humano y/o para predecir (pronosticar) la evolución clínica de septicemia o choque séptico en un sujeto humano, que comprende: un péptido de SEQ ID NO 1 y/o un péptido de SEQ ID NO 2, en el que estos péptidos se sintetizan preferiblemente con al menos uno o más aminoácidos pesados y en el que dichos péptidos están preferiblemente marcados en el residuo de aminoácido C-terminal con una etiqueta.

En el contexto de la presente invención, el término “etiqueta” se entiende como aminoácidos marcados con isótopos estables que comparten las mismas propiedades fisicoquímicas y la misma actividad química con sus homólogos de aminoácidos no marcados. Las etiquetas también pueden ser una pequeña modificación química que se escinde durante el tratamiento con tripsina u otras proteasas antes de experimentos de EM. Se usan etiquetas unidas a péptidos proteotípicos para la cuantificación de péptidos en experimentos de EM dirigida.

En el contexto de la presente invención, el término “aminoácidos pesados” se refiere a átomos isotópicos que se incorporan en la etiqueta que contiene átomos pesados, por ejemplo 13C, 15N, 17O y/o 34S, que pueden distinguirse mediante EM.

En el contexto de la presente invención, el término “sintetizado con al menos uno o más aminoácidos pesados” se entiende como que la “etiqueta” contiene al menos uno o más átomos pesados 13C, 15N, 17O y/o 34S en la secuencia de aminoácidos en adiciones conocidas correspondiente a SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2.

En una realización preferida del tercer aspecto de la invención, el kit comprende un péptido de SEQ ID NO 1 y un péptido de SEQ ID NO 2, en el que estos péptidos se sintetizan preferiblemente con al menos uno o más aminoácidos pesados y en el que dichos péptidos están preferiblemente marcados en el residuo de aminoácido C-terminal con una etiqueta.

En otra realización preferida del tercer aspecto de la invención, el kit puede comprender una colección de péptidos (diluidos o liofilizados) correspondientes a SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2 que tienen una etiqueta de isótopo. El kit también puede contener instrucciones que indican cómo pueden usarse los materiales dentro del kit.

Opcionalmente (de manera adicional), el kit puede incluir enzimas de escisión tales como tripsina, quimotripsina, pepsina, papaína-pepsina, papaína, proteasa de Staphylococcus aureus (V8), proteasa de submaxilar, bromelaína, termolisina, aspartato endopeptidasa. El kit también puede incluir un reactivo químico tal como CNBr, ácido u otros reactivos químicos para la generación química de polipéptidos derivados de proteína.

Opcionalmente, puede usarse digestión asistida por microondas durante los tratamientos con tripsina para acelerar la formación de péptidos trípticos (P Muralidhar Reddy, et al. Digestion Completeness of Microwave-Assisted and Conventional Trypsin-Catalyzed Reactions. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, volumen 21, número 3, marzo de 2010, páginas 421-424). El kit puede contener tripsina y un protocolo de digestión asistida por microondas especial para el análisis óptimo de SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso in vitro del kit tal como se definió en el tercer aspecto de la invención o en cualquiera de sus realizaciones preferidas, para diagnosticar o detectar choque séptico en un sujeto humano o para predecir (pronosticar) la evolución clínica de choque séptico en un sujeto humano.

Un quinto aspecto de la invención se refiere a un producto de programa informático que puede cargarse directamente en la memoria interna de un ordenador digital, que comprende porciones de código de software para realizar las etapas de comparar el nivel o la concentración de las histonas circulantes a partir de la una o más muestras biológicas del sujeto que padece choque séptico con un valor de control y proporcionar un riesgo de padecer SS o un riesgo de una evolución clínica negativa del sujeto, cuando se ejecuta dicho producto en un ordenador.

Además, y tal como se muestra en el ejemplo 2 de la presente memoria descriptiva, la presente invención también se refiere, en un sexto aspecto de la invención, a un método para el diagnóstico diferencial de septicemia con respecto a choque séptico en un sujeto humano que se sospecha que padece cualquiera de estas patologías, en el que el método comprende las etapas de: medir el nivel o la concentración al menos de histonas circulantes H3 y/o H2B en una o más muestras biológicas que consisten en sangre, suero o plasma aisladas a partir del sujeto usando un espectrómetro de masas; y comparar el nivel o la concentración de dichas histonas circulantes a partir de la una o más muestras biológicas del sujeto que se sospecha que padece septicemia o choque séptico con un valor de referencia, en el que un aumento en el nivel o la concentración al menos de histona circulante H2B es indicativo de choque séptico.

En una realización preferida del sexto aspecto de la invención, el nivel o la concentración de histona circulante H3 es equivalente a la cantidad de péptido de s Eq ID NO 1 (STELLIR). En este sentido, para medir el nivel o la concentración de histona circulante H3 en la muestra biológica, se obtiene la razón promedio de SEQ ID NO 1. Por los mismos motivos, para medir el nivel o la concentración de histona circulante H2B en la muestra biológica, se obtiene la razón promedio de SEQ ID NO 2. Más preferiblemente, pueden prepararse preferiblemente secuencias de péptidos seleccionados (STELLIR para H3; LLLPGELAK para H2B) como SpikeTidesTM_TQ (marcado con isótopos pesados tal como Arg: 13C6, 15N4; Lys: Arg: 13C6, 15N2) (JPT Peptide Technologies, Berlín, Alemania) para la cuantificación absoluta de histona circulante H3 y/o H2B.

En otra realización preferida del sexto aspecto de la invención, el espectrómetro de masas es un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo/trampa de iones lineal equipado con un sistema cromatográfico, más preferiblemente equipado con un sistema cromatográfico de nano-CL.

Un séptimo aspecto de la presente invención se refiere a un uso in vitro de un kit o el diagnóstico diferencial de septicemia con respecto a choque séptico en un sujeto humano que se sospecha que padece cualquiera de estas patologías, que comprende: un péptido de SEQ ID NO 1 y/o un péptido de SEQ ID NO 2, en el que estos péptidos se sintetizan preferiblemente con al menos uno o más aminoácidos pesados y en el que dichos péptidos están preferiblemente marcados en el residuo de aminoácido C-terminal con una etiqueta. En otra realización preferida del tercer aspecto de la invención, el kit puede comprender una colección de péptidos (diluidos o liofilizados) correspondientes a SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2 que tienen una etiqueta de isótopo. El kit también puede contener instrucciones que indican cómo pueden usarse los materiales dentro del kit. Opcionalmente (de manera adicional), el kit puede incluir enzimas de escisión tales como tripsina, quimotripsina, pepsina, papaína-pepsina, papaína, proteasa de Staphylococcus aureus (V8), proteasa submaxilar, bromelaína, termolisina, aspartato endopeptidasa. El kit también puede incluir un reactivo químico tal como CNBr, ácido u otros reactivos químicos para la generación química de polipéptidos derivados de proteína.

Opcionalmente, puede usarse digestión asistida por microondas durante los tratamientos con tripsina para acelerar la formación de péptidos trípticos (P Muralidhar Reddy, et al. Digestion Completeness of Microwave-Assisted and Conventional Trypsin-Catalyzed Reactions. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, volumen 21, número 3, marzo de 2010, páginas 421-424). El kit puede contener tripsina y un protocolo de digestión asistida por microondas especial para el análisis óptimo de SEQ ID NO 1 y/o SEQ ID NO 2.

Un octavo aspecto de la invención se refiere a un producto de programa informático que puede cargarse directamente en la memoria interna de un ordenador digital, que comprende porciones de código de software para realizar las etapas de comparar el nivel o la concentración de las histonas circulantes a partir de la una o más muestras biológicas del sujeto que padece choque séptico con un valor de referencia y proporcionar un diagnóstico diferencial de septicemia con respecto a choque séptico en un sujeto humano que se sospecha que padece cualquiera de estas patologías, cuando se ejecuta dicho producto en un ordenador.

Los siguientes ejemplos simplemente ilustran la presente invención, pero no limitan la misma.

Ejemplos

Material y métodos

Selección de pacientes y sujetos de control

En este estudio se incluyó un total de diecisiete pacientes con diagnóstico clínico de SS en el ingreso en una UCI médica del Hospital Clínico Universitario de Valencia (HCUV) (Valencia, España) y posteriormente bacteriemia confirmada (cultivo microbiológico en sangre positivo a las 48 horas). Los criterios de exclusión fueron: i) pacientes con una esperanza de vida inferior a 24 horas; ii) pacientes fuera del intervalo de edad de entre 18 y 85 años; iii) pacientes con un proceso neoplásico activo o tratados con antioxidantes; iv) pacientes con una estancia superior a 24 horas en la unidad del hospital o en otro hospital; v) pacientes de cirugía o aquellos pacientes en un estado tras reanimación cardiopulmonar, o infección viral sospechada, así como también se excluyeron mujeres embarazadas y pacientes que no dieron su consentimiento. Se incluyeron pacientes y controles en el estudio tras la aprobación por el Comité ético de investigación biomédica (CEIC) del HCUV y el biobanco de IBSP-CV (biobanco para la Investigación biomédica y en salud pública en la Comunidad Valenciana, España).

Extracción de sangre

Se extrajeron muestras de sangre de pacientes de la UCI y sujetos sanos en tubos de EDTA. Se centrifugó cada muestra a 2.500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA) para separar el plasma y después se almacenaron alícuotas a -80°C hasta su uso en experimentos de MRM-EM.

Evaluación de la linealidad para péptidos en adiciones conocidas

En primer lugar, se trataron con tripsina histonas humanas H3 y H2B purificadas comerciales (EpiGex, Illkirch, Francia) y se analizaron usando CL-EM/e M_DDA en un dispositivo 560o triple TOF (ABSciex, Framingham, MA, EE.UU.) para identificar aquellos péptidos inequívocos con buena señal. A partir de los diferentes espectros de fragmentación (EM-EM) se seleccionaron precursores peptídicos y masas de iones de fragmentos para H3 y H2B para analizarse para MRM-EM. Se optimizaron los parámetros de MRM en un instrumento 5500 QTRAP (ABSciex) mediante el software MRM-PILOT (AB Sciex), determinando el potencial de desolvatación (DP) para cada péptido y el tiempo de permanencia (DT) y la energía de colisión para cada transición (CE). Después de eso, se eligieron péptidos derivados de histona con un alto número de transiciones detectables, alta sensibilidad y alto intervalo dinámico lineal para realizar experimentos de MRM-EM. Se prepararon secuencias de péptidos seleccionados (STELLIR para H3; LLLPGELAK para H2B) como SpikeTidesTM_TQ (marcado con isótopos pesados; Arg: 13C6, 15N4; Lys: Arg: 13C6, 15N2) (JPT Peptide Technologies, Berlín, Alemania) para la cuantificación absoluta.

Preparación de muestras

Se midió el contenido en proteína mediante el método de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Se diluyó 1 |il de plasma (no agotado) en 20 |il de una disolución 1:1 de bicarbonato de amonio 0,1/trifluoroetanol. Por cada 1 |ig de contenido en proteína, se añadieron 300 fmol de ambos péptidos pesados. Después, se redujeron los residuos de cisteína mediante adición de DL-ditiotreitol 10 mM a 56°C durante 30 min. Se alquilaron los grupos sulfhidrilo con yodoacetamida 14 mM en la oscuridad a TA durante 30 min. Se neutralizó el exceso con D-L-ditiotreitol 10 mM en bicarbonato de amonio 50 mM en un volumen final de 100 |il durante 30 min a TA. Se sometió la muestra a digestión con tripsina con 1 |ig de tripsina modificada de calidad para secuenciación (TCPK Trypsin-ABSciex) durante la noche a 37°C. Se detuvo la reacción con ácido trifluoroacético (TFA) a una concentración final del 1%. Se secaron las muestras usando un dispositivo Speedvac y se resuspendieron en 50 |il de TFA (0,1%). Se concentraron los péptidos y se purificaron usando puntas ZipTip C18 (Merck Millipore, Darmstadt, Alemania). Finalmente, se diluyeron las muestras en acetonitrilo (CAN) al 2%, ácido fórmico al 0,1% (FA) para inyección.

MRM-EM

Se realizaron experimentos de MRM en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo/trampa de iones lineal híbrido 5500 QTRAP (ABSciex) equipado con un sistema cromatográfico de nano-CL Eksigent 1D+plus. Se inyectó digesto con tripsina (1 |ig de proteína y 300 fmol de cada péptido en adición conocida) sobre una columna de trampa de nano-CL, 3 |i C18-CL (Eksigent, Dublin, CA, USA), y después se separaron mediante RP-HPLC en una columna de nano-CL analítica, 3 |i C18-CL, 15 cm (Eksigent). Se realizó una cromatografía con disolvente A (FA al 0,1%) y disolvente B (ACN al 100%, FA al 0,1%) como fase móvil, usando un gradiente lineal (70 minutos desde el 2% de B hasta el 50% de B) a una velocidad de flujo de 300 nl/min. Se adquirieron datos de MRM en un modo positivo con una tensión de pulverización de 2800 V, gas de cortina: 20 psi, gas de fuente de iones: 20 psi, temperatura de elemento de calentamiento de interferencia: (IHT) 150°C, d P: 80, potencial de entrada: 10, potencial de salida: (EXP) 15, y un tiempo de pausa de 3 ms. La energía de colisión (CE) era de 26 V y 23 V para LLLPGELAK - LLLPGElA[K] y STe Ll IR - STELLI[R], respectivamente. Se monitorizaron las transiciones (9 para St ELLIR y STELLI[R]; y 12 para LLLPGELAK y LLLPGELA[K]) usando una resolución unitaria en los cuadrupolos tanto Q1 como Q3, y 40 ms de tiempo de permanencia para cada uno. Se realizó un análisis de datos usando los software Analyst® 1.5.2 y MultiQuant® 2.0.2 (ABsciex). Se calculó la razón de área (ligera/pesada) para todas las transiciones y se usó la razón de área promedio para el análisis estadístico.

Para calcular los niveles de histonas H2B y H3 se usó la razón promedio obtenida para LLPGELAK y STELLIR. Se dedujo la concentración final de H2B y H3 en mg/ml a partir de los valores de masa molecular relativa (Mr) de las proteínas seleccionadas como diana (Mr de 13,906 Da y 15,404 Da para H2B y H3 respectivamente).

Análisis estadístico

Se compararon las características de nivel inicial clínicas y sociodemográficas de los participantes entre grupos usando la prueba de Student para la edad y la prueba de la chi cuadrado para el sexo. Se comparó la concentración de histonas H2B y H3 usando pruebas paramétricas y no paramétricas tales como Student, ANOVA y la U de Mann-Whitney. La correlación entre los niveles de H2B y H3, puntuaciones de evaluación de la salud crónica y fisiología aguda II (APACHE II) y evaluación de fallo orgánico secuencial (SOFA), lactato y tiempo de protrombina se evaluaron usando correlaciones de Spearman.

El valor para los niveles de histonas H2B y H3 como biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de SS se llevó a cabo mediante análisis de curvas de rendimiento diagnóstico (ROC).

Se consideró que valores de p <0,05 eran estadísticamente significativos. Todos los análisis se llevaron a cabo usando SPSS v. 20 (IBM Corporation, Armonk, NY, EE.UU.).

Ejemplo 1. Resultados

Descripción general de las cohortes

Se analizó un total de diecisiete pacientes con diagnóstico clínico de SS en el ingreso en una UCI médica. La mediana de la edad era de 67 años (37-85) y los pacientes varones representaron el 67% de los casos. La mediana de la puntuación de APACHE II era de 25 (14-44) y el valor mediano de puntuación de SOFA era de 10 (3-19).

La tabla 1 muestra las características clínicas de los pacientes.

DE = desviación estándar, APACHE = evaluación de la salud crónica y fisiología aguda, SOFA = evaluación de fallo orgánico secuencial, SSTI = infección de la piel y tejido blando, MDR = microorganismos resistentes a múltiples fármacos, RRT = terapia sustitutiva renal, UCI = unidad de cuidados intensivos, LOS = duración de la estancia, CRP = proteína C reactiva, razón de PaO²/FiO² = presión parcial de oxígeno arterial con respecto a la fracción de oxígeno inspirado

a MDR (Escherichia coli productora de betalactamasa de espectro extendido y Staphylococcus aureus resistente a meticilinaj

b No MDR (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterobacter cloacae, Streptococcus mitis y Streptococcus pneumoniae)

c Aclaramiento de lactato de más del 10% durante las primeras seis horas de reanimación hemodinámica

Hubo 9 (53%) supervivientes y 8 (47%) no supervivientes. Ambos grupos fueron similares con respecto a las características demográficas, comorbididades en el ingreso según el índice de Charlson y gravedad, aunque los no supervivientes tenían una tendencia a una puntuación de APACHE II media superior. No hubo ninguna diferencia con respecto a la fuente de infección y microorganismos identificados en muestras de sangre entre ambos grupos, ni teniendo en cuenta criterios de resistencia a múltiples fármacos y análisis de gram.

El tratamiento inicial fue similar en ambos grupos de pacientes con SS. Los supervivientes y los no supervivientes recibieron terapia antimicrobiana intravenosa dentro de la primera hora de reconocimiento de SS y rehidratación (administración inicial de al menos 20 ml/kg de cristaloides intravenosos para mejorar la hemodinamia en ausencia de contraindicación formal) en el mismo nivel. Posteriormente, todos los pacientes en el grupo de supervivientes recibieron terapia antimicrobiana “adecuada” basándose en resultados de cultivo de sangre definitivos, mientras que este valor era del 75% para los no supervivientes Según la terapia de apoyo de órgano, todos los pacientes necesitaron fármacos vasoactivos al comienzo (considerando los criterios de inclusión de SS) y una población de pacientes superior al 50% se trataron con corticosteroides basándose en una situación resistente al tratamiento en ambos grupos. La mortalidad de aquellos pacientes cuyos niveles de lactato disminuyeron >10% tras la rehidratación fue del 27% frente al 83% en aquellos en los que no se produjo esto, con una razón de probabilidades (OR) de mortalidad en la UCI de 0,4 (IC de 0,16-1,06) para pacientes que presentan aclaramiento de este metabolito. No se observó ninguna diferencia con respecto a la mediana de las duraciones de la estancia en UCI y hospital entre ambos grupos de pacientes.

Con respecto a los resultados de análisis de sangre de pacientes en el primer día de estancia en la UCI, hubo escasas diferencias entre ambos grupos. Los parámetros inflamatorios (niveles de recuento de glóbulos blancos, proteína C reactiva (CRP) y procalcitonina (PCT)) fueron comparable así como el primer nivel de lactato reflejando una hipoperfusión clínica homogénea. Se observaron diferencias significativas en los niveles de lactato después de seis horas de terapia, tiempo de protrombina y razón de presión parcial de oxígeno arterial con respecto a fracción de oxígeno inspirado (PaO²/FiO²) entre ambos grupos, mostrando una vez más la peor situación y la disfunción orgánica más avanzada en el grupo de no supervivientes.

Se incluyó un total de 10 controles sanos, eran más jóvenes y más probable que fueran varones que en los casos. La mediana de la edad de los controles era de 42 años (20-56) y los controles varones representaron el 70%.

Análisis de MRM de H2B y H3

En primer lugar, se sometió a ensayo una selección de péptidos de histona para elegir los mejores péptidos para preparaciones en adiciones conocidas y mediciones posteriores de MRM-EM en muestras de sangre. Se seleccionaron los péptidos LLLPGELAK y STELLIR, derivados a partir de digestión con tripsina de H2B y H3 purificadas, respectivamente, tras observaciones experimentales en experimentos de CL-EM/EM. Esto es un punto crítico con el fin de diseñar ensayos de MRM porque diferentes péptidos a partir de la misma proteína pueden variar ampliamente en cuanto a su respuesta de EM y pueden producir interferencias en muestras de plasma. Las secuencias peptídicas únicas que se eligieron mostraron buenos parámetros cromatográficos, eficiencia de ionización óptima y alta calidad de EM/EM, y mostraron una gran linealidad de concentración para la señal (datos no mostrados). Se usaron ambas secuencias para realizar adiciones conocidas en muestras de plasma de pacientes con SS y sujetos sanos.

La figura 1 muestra los cromatogramas con las señales de MRM más intensas (tal como se definió anteriormente) que siguen H2B y H3 en muestras de plasma. Usando Multiquant® (ABsciex) para analizar muestras de plasma con adiciones conocidas con 300 fmol de LLLPGELAK y STELLIR por 1 |ig de proteína, pudieron detectarse péptidos con una buena relación señal-ruido.

Se encontraron picos no interferentes en el tiempo de elución de ambos péptidos (figura 4).

Histonas circulantes H2B y H3 como posibles biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de SS

Para histona H2B, el nivel medio encontrado en los controles fue de 204,48 ng/ml (IC del 95% de 25,31-283,66), y en pacientes aumentó hasta 1.736,91 ng/ml (IC del 95% de 555,34-2.918,47). Las diferencias observadas fueron estadísticamente significativas (p = 0,014), siendo superiores para histona H3 en la que los niveles medios eran de 23,50 ng/ml (IC del 95% de -3,97-50,98) para controles y 2.040,79 ng/ml (IC del 95% de 756,58-3.325,01) para pacientes (p = 0,004) (figura 2).

Los niveles de histonas se correlacionaron de manera positiva con coeficientes de correlación significativos en ambos grupos (coeficiente de Spearman r = 0,848, p = 0,002 para controles y r = 0,827, p<0,0001 para pacientes).

Para los pacientes que sobrevivieron, el nivel medio de ambas histonas dentro de las primeras 24 horas en la UCI fue significativamente bajo en comparación con los no supervivientes (figura 2), siendo los valores hasta cinco veces inferiores en comparación con los niveles detectados en los no supervivientes. Para la histona H2B, el nivel medio fue de 607,00 ng/ml (IC del 95% de 204,20-1.009,82) en supervivientes y 3.008,50 ng/ml (IC del 95% de 603,94-5.412,15) en no supervivientes (p = 0,046), y se observaron las mismas diferencias proporcionales con respecto a los niveles de histona H3, siendo los valores medios observados de 740,70 ng/ml (IC del 95% de 311,16-1170,23) para supervivientes y 3503,41 ng/ml (IC del 95% de 955,95-6.050,86) para no supervivientes (p = 0,036).

Especificidad y sensibilidad de histonas H2B y H3 detectadas mediante el método de MRM-EM

Un análisis de curva de ROC realizado para evaluar el poder de diagnóstico de los niveles de histonas H2B y H3 reveló que ambas podían servir como biomarcadores valiosos para distinguir casos de choque séptico con respecto a controles sanos. Las AUC (área bajo las curvas de ROC), error estándar, intervalo de confianza (IC), valor de corte de concentración óptimo, sensibilidad y especificidad para cada histona se muestran en la tabla 2.

Aunque las AUC para ambas histonas son similares, y los niveles de ambos biomarcadores fueron significativamente diferentes entre controles sanos y pacientes, la histona H3 mostró valores superiores para la sensibilidad y la especificidad con respecto al diagnóstico. Para este biomarcador, con una concentración de 83,36 ng/ml como valor de corte óptimo, los valores de sensibilidad y especificidad del método fueron del 94,1% y el 90,0% respectivamente.

H2B y H3 circulantes y su potencial para el desenlace temprano del paciente.

Para examinar el posible uso de histonas en plasma como biomarcadores para el pronóstico de choque séptico, se construyó la curva de ROC correspondiente para cada histona. Se seleccionaron sólo los casos y se calcularon parámetros de biomarcador: valor de corte óptimo, sensibilidad y especificidad para distinguir entre supervivientes y no supervivientes (figura 3). De nuevo, la histona H3 se clasificó mejor que la histona H2B para el pronóstico. El valor de sensibilidad fue superior para la histona H3 (sensibilidad = 75,0%, especificidad = 88,9%, valor de corte = 1.348,13 ng/ml) en contraste con la histona H2B (sensibilidad = 62,5%, especificidad = 88,9%, valor de corte = 1.426,38 ng/ml), con valores de corte similares.

Ejemplo 2. Diagnóstico diferencial

Se analizaron un total de 40 muestras, con la siguiente distribución entre los grupos incluidos en el estudio: 11 controles seleccionados en la UCI sin patologías infecciosas (controles de pacientes de la UCI no sépticos), 11 controles seleccionados de la población general sana, 8 casos de septicemia y 10 casos de choque séptico.

Para la histona H2B, los niveles medios encontrados en los 40 plasmas fueron los siguientes (tabla 2):

Los resultados se muestran en la figura 5, en la que se muestran los niveles de histona circulante H2B en plasma a partir de pacientes de control (UCI y población general), con septicemia y con choque séptico. Los diagramas de cajas y bigotes representan los niveles de H2B en los cuatro grupos. Las cajas designan intervalos de intercuartiles, las líneas horizontales designan las medianas y los bigotes designan los percentiles 10 y 90. Los niveles se expresan como ng/ml de H2B.

Para evaluar si las diferencias observadas eran estadísticamente significativas, se realizó una prueba de ANOVA (p<0,0001). Las pruebas de comparaciones múltiples a posteriori (Scheffé) indican que estas diferencias estadísticas eran entre las muestras de choque séptico y el grupo de control de la UCI (p<0,0001), el grupo de control de población general (p<0,0001) y el grupo de septicemia (p = 0,001).

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   i. Método basado en espectrometría de masas para diagnosticar o detectar septicemia o choque séptico en un sujeto humano que comprende las etapas de: medir el nivel o la concentración al menos de histona circulante H3 en una o más muestras biológicas que consisten en sangre, suero o plasma aisladas a partir del sujeto usando un espectrómetro de masas; y comparar el nivel o la concentración de dicha histona circulante a partir de la una o más muestras biológicas del sujeto que se sospecha que padece septicemia o choque séptico con un valor de referencia o con el nivel o la concentración de dicha histona circulante a partir de una muestra biológica que consiste en sangre, suero o plasma de un sujeto normal, en el que el sujeto normal es un sujeto sano que no padece septicemia o choque séptico, en el que el nivel o la concentración de histona circulante H3 es equivalente a la cantidad de péptido de SEQ ID NO 1 (STELLIR) presente en la muestra biológica tras digestión o tratamiento con tripsina, y en el que para medir el nivel o la concentración de histona circulante H3 en la muestra biológica se obtiene la razón promedio de SEQ ID NO 1, y en el que un aumento en el nivel o la concentración al menos de histona circulante H3 es indicativo de septicemia o choque séptico.
2. 2. Método basado en espectrometría de masas según la reivindicación 1, en el que el nivel o la concentración de histona circulante H3 es equivalente a la cantidad de péptido de SEQ ID NO 1 (STELLIR) presente en la muestra biológica tras digestión asistida por microondas durante el tratamiento con tripsina.
3. 3. Método basado en espectrometría de masas según la reivindicación 1 ó 2, en el que el valor de referencia para histona H3 es de 86,36 ng/ml y en el que un aumento de al menos 1,5 veces es indicativo de septicemia o choque séptico.
4. 4. Método basado en espectrometría de masas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el método comprende además las etapas de: medir el nivel o la concentración al menos de histona circulante H2B en la una o más muestras biológicas que consisten en sangre, suero o plasma aisladas a partir del sujeto usando un espectrómetro de masas; y comparar el nivel o la concentración de dicha histona circulante a partir de la una o más muestras biológicas del sujeto que se sospecha que padece septicemia o choque séptico con un valor de referencia o con el nivel o la concentración de dicha histona circulante a partir de una muestra biológica que consiste en sangre, suero o plasma de un sujeto normal, en el que el sujeto normal es un sujeto sano que no padece septicemia o choque séptico, en el que el nivel o la concentración de histona circulante H2B es equivalente a la cantidad de péptido de SEQ ID NO 2 (LLPGELAK) presente en la muestra biológica tras digestión o tratamiento con tripsina, y en el que para medir el nivel o la concentración de histona circulante H2B en la muestra biológica se obtiene la razón promedio de SEQ ID NO 2, y en el que un aumento en el nivel o la concentración al menos de histonas circulantes H3 y H2B es indicativo de septicemia o choque séptico.
5. 5. Método basado en espectrometría de masas según la reivindicación 4, en el que el nivel o la concentración de histona circulante H2B es equivalente a la cantidad de péptido de SEQ ID NO 2 (LLPGELAK) presente en la muestra biológica tras digestión asistida por microondas durante el tratamiento con tripsina.
6. 6. Método basado en espectrometría de masas según la reivindicación 4 ó 5, en el que el valor de control para histona H2B es de 212,03 ng/ml y en el que un aumento de al menos 1,5 veces es indicativo de septicemia o choque séptico.
7. 7. Método basado en espectrometría de masas para predecir (pronosticar) la evolución clínica de septicemia o choque séptico en un sujeto humano que comprende las etapas de: medir el nivel o la concentración al menos de histona circulante H3 en una o más muestras biológicas que consisten en sangre, suero o plasma aisladas a partir del sujeto usando un espectrómetro de masas; y comparar el nivel o la concentración de dicha histona circulante a partir de la una o más muestras biológicas del sujeto que se sospecha que padece septicemia o choque séptico con un valor de referencia, en el que el nivel o la concentración de histona circulante H3 es equivalente a la cantidad de péptido de SEQ ID NO 1 (STELLIR) presente en la muestra biológica tras digestión o tratamiento con tripsina, y en el que para medir el nivel o la concentración de histona circulante H3 en la muestra biológica se obtiene la razón promedio de SEQ ID NO 1, en el que un aumento en el nivel o la concentración al menos de histona circulante H3 es indicativo de una evolución clínica negativa, y en el que la evolución clínica se refiere a la supervivencia global del paciente.
8. 8. Método basado en espectrometría de masas según la reivindicación 7, en el que el nivel o la concentración de histona circulante H3 es equivalente a la cantidad de péptido de SEQ ID NO 1 (STELLIR) presente en la muestra biológica tras digestión asistida por microondas durante el tratamiento con tripsina.
9. 9. Método basado en espectrometría de masas según la reivindicación 7, en el que el método comprende además las etapas de: medir el nivel o la concentración al menos de histona circulante H2B en la una o más muestras biológicas que consisten en sangre, suero o plasma aisladas a partir del sujeto usando un espectrómetro de masas; y comparar el nivel o la concentración de dicha histona circulante a partir de la una o más muestras biológicas del sujeto que se sospecha que padece septicemia o choque séptico con un valor de referencia, en el que el nivel o la concentración de histona circulante H2B es equivalente a la cantidad de péptido de SEQ ID NO 2 (LLPGELAK), y en el que para medir el nivel o la concentración de histona circulante H2B en la muestra biológica se obtiene la razón promedio de SEQ ID NO 2, y en el que un aumento en el nivel o la concentración al menos de histonas circulantes H3 y H2B es indicativo de una evolución clínica negativa, y en el que la evolución clínica se refiere a la supervivencia global del paciente.
10. 10. Método basado en espectrometría de masas según la reivindicación 9, en el que el nivel o la concentración de histona circulante H2B es equivalente a la cantidad de péptido de SEQ ID NO 2 (LLPGELAK) presente en la muestra biológica tras digestión asistida por microondas durante el tratamiento con tripsina.
11. 11. Método basado en espectrometría de masas de cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en el que el valor de referencia para histona H3 es de 1.348,13 ng/ml y en el que un aumento de al menos 1,5 veces es indicativo de un desenlace clínico negativo.
12. 12. Método basado en espectrometría de masas de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el valor de referencia para histona H2B es de 1.426,38 ng/ml y en el que un aumento de al menos 1,5 veces es indicativo de un desenlace clínico negativo.
13. 13. Uso in vitro de un kit que comprende: un péptido de SEQ ID NO 1, en el que estos péptidos se sintetizan preferiblemente con al menos uno o más aminoácidos pesados y en el que dichos péptidos están preferiblemente marcados en el residuo de aminoácido C-terminal con una etiqueta, en el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o 7 a 8, para diagnosticar o detectar septicemia o choque séptico en un sujeto humano.
14. 14. Uso in vitro según la reivindicación 13, en el que el kit comprende además: un péptido de SEQ ID NO 2, en el que estos péptidos se sintetizan preferiblemente con al menos uno o más aminoácidos pesados y en el que dichos péptidos están preferiblemente marcados en el residuo de aminoácido C-terminal con una etiqueta.
15. 15. Uso in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, en el que el kit comprende además la enzima de escisión tripsina.