CN115786518A - 嗅素结构域家族蛋白4（olfm4）在结肠癌检测产品中的应用 - Google Patents
嗅素结构域家族蛋白4（olfm4）在结肠癌检测产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种检测/诊断结肠癌的方法，具体为通过PAL‑SEQ技术检测患者结肠癌干细胞中OLFM4基因Poly(A)‑tail的具体长度与序列，实现对结肠癌患者的早期诊断，具有极高的精准性，可广泛用于临床使用。
Description
技术领域
本发明涉及医学诊断领域，更为具体的，本发明涉及一种嗅素结构域家族蛋白4(OLFM4)在结肠癌检测产品中的应用。
背景技术
肿瘤的早期筛查在控制与治疗肿瘤上起着极为重要的作用，通过早期的发现，早期治疗与预防疾病的进展的方式，可显著提高患者的存活率与生活质量。Poly(A)-tail在20世纪70年代首次在RNA上被发现，推测与翻译、RNA形成和转运相关。几乎所有新合成的mRNA都含有一个多聚腺苷酸化信号(polyadenylation signal，PAS)，通过招募多蛋白体参与Poly(A)-tail的合成。在聚(A)聚合酶(poly(A)polymerase，PAP)的作用下，PAS的下游形成11-14腺苷的Poly(A)-tail。随后核聚(A)结合蛋白(nuclear poly(A)binding protein，PABPN)对新形成的短Poly(A)-tail进行延长至200-250个腺苷。随着研究深入，越来越多的证据证明Poly(A)-tail在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。
结直肠癌(CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，每年新发病例1,096,601例，死亡病例551,269例，是全球癌症相关性死亡的第二大原因。结直肠癌的治疗方式主要以手术和化疗为主，同时结合免疫或靶向治疗的不同治疗方案。但这些治疗方式都有不同的缺点和局限性。CRC患者的预后与分期密切相关，1期和2期的5年生存率可达到70％，而4期5年生存率不到10％。因此，迫切需要确定新的生物标志物以早期诊断结直肠癌，提高结直肠癌的治疗效果以提高结直肠癌患者的生存率。
发明内容
为了填补现有技术的空白，本发明提供一种嗅素结构域家族蛋白4(OLFM4)在结肠癌诊断产品中的应用。
本发明的第一个方面，提供一种嗅素结构域家族蛋白4(OLFM4)在制备结肠癌检测产品中的应用。
在一种实施方式中，所述产品可通过检测患者嗅素结构域家族蛋白4(OLFM4)mRNA的Poly(A)-tails的长度从而诊断患者是否患有结肠癌。
在一种实施方式中，所述产品为试剂盒或基因芯片。
本发明的第二个方面，提供一种结肠癌检测产品，所述产品可通过检测患者嗅素结构域家族蛋白4(OLFM4)mRNA的Poly(A)-tails的长度从而诊断患者是否患有结肠癌。
在一种实施方式中，所述产品为试剂盒。
相对于现有技术，本发明具有如下突出的进步：
本技术方案与现有的三代测序技术相比，可通过PAL-seq专利技术，实现了对结肠癌Poly(A)-tails全长转录本的测序，可从RNA整体水平上研究Poly(A)-tails与isoform及非编码区的关系，获得某一基因的不同转录本亚型(isoform)和Poly(A)-tails的具体长度。
本技术方案可通过PAL-SEQ技术检测结肠癌干细胞中OLFM4基因Poly(A)-tail的具体长度与序列，实现对结肠癌患者的早期诊断。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明实施例1中的实验流程图。
图2A显示细胞干性相关基因LGR5、SOX9、MYC和SALL4在结肠癌组织中表达显著高于癌旁组织；图2B显示OLFM4在结肠癌和癌旁组织的表达情况(Tumor：结肠癌组织；Adjacent：癌旁组织)；图2C显示OLFM4在各种结肠癌组织类型和不同分期的表达情况(Adjacent：癌旁组织；LG：低分化癌；HG：高分化癌；TIS：原位癌；StageⅠ：一期；StageⅡ：二期；StageⅢ：三期；StageⅣ：四期)，观察到OLFM4在高分化癌中表达要高于低分化癌，在癌症早期(Ⅰ和Ⅱ期)要高于癌症晚期(Ⅲ和Ⅳ期)；图2D显示OLFM4表达水平与结肠癌患者预后的关系，观察到低表达组的预后明显好于高表达组。
图3A显示OLFM4的mRNA水平在结肠癌和癌旁组织的表达情况(Tumor：结肠癌组织；Adjacent：癌旁组织)，观察到OLFM4的mRNA水平在结肠癌和癌旁组织无明显差异；图3B显示OLFM4在结肠癌组织中的不同类型细胞的表达情况，观察到OLFM4主要表达于干细胞中；图3C显示OLFM4和CD133在结肠癌组织中的定位情况(Stroma：间质；Cancer Nest：癌巢)，观察到OLFM4和CD133在结肠癌组织中共定位。
图4显示OLFM4 mRNA的Poly(A)-tails与结肠癌和癌旁组织的关系：结果显示OLFM4mRNA的Poly(A)-tails在结肠癌和癌旁组织的表达情况，观察到OLFM4 mRNA的Poly(A)-tails仅在结肠癌组织中检测到且长度在50-60nt之间，而癌旁组织中未检测到。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1OLFM4在结肠癌干细胞中高表达且与结肠癌分期和预后的研究
我们收集了16例临床结肠癌和癌旁组织样本(病人样本来自广东医科大学附属医院，为结肠癌Ⅱ期或Ⅲ期的患者，均已取得患者知情同意书)进行RNA二代测序以及质谱和免疫组化检测，具体操作步骤如下(流程如图1所示)：
1.RNA提取
使用TroZol法提取组织总RNA。取适量质量合格的洁净冻存组织样本，在液氮中研磨至粉末状；加入1ml TroZol室温静置5min，后加入200μl氯仿，充分振荡混匀，室温静置5min；4℃10000×g离心15min，取上清转移到新管中；加入200μl异丙醇，室温静置10min，4℃10000×g离心10min；去上清，加入500μl 75％乙醇，4℃10000×g离心5min，移去上清，重复该步骤一次；室温放置5-10min，待75％乙醇完全挥发后，加入适量DEPC水溶解。
2.RNA二代测序
2.1样品检测
使用Agilent 2100Bioanalyzer检测total RNA的浓度、RIN值、28S/18S和片段大小。
2.2文库构建
2.2.1mRNA的纯化
取一定量total RNA样品，适温变性打开其二级结构，使用oligo-dT磁珠进行纯化。
2.2.2片段化处理
在上一步得到的mRNA中加入打断试剂，适温反应一定时间，将mRNA片段化。
2.2.3cDNA合成
向打断后的mRNA中加入提前配制的一链合成反应体系，在PCR仪上按相应程序合成一链cDNA，配制二链合成反应体系，适温反应一定时间，合成二链cDNA。
2.2.4末端修复和接头连接
配制反应体系，适温反应一定时间，修复双链cDNA末端，并在3’末端加上A碱基，配制接头连接反应体系，适温反应一定时间，使接头与cDNA连接。
2.2.5PCR反应及产物回收
配制PCR反应体系，并设置反应程序，对连接产物进行扩增。
2.3文库检测
使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent DNA 1000Reagents)检测文库的插入片段范围，同时使用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System(TaqMan Probe)对文库进行浓度的定量。
2.4测序
将检测合格的文库，加入NaOH变性成单链，按照预期上机数据量，稀释至一定的浓度。并将变性稀释后的文库加入FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交，然后在簇生成平台cBot上完成桥式PCR扩增。最后将制备好的FlowCell采用Illumina测序系统SBS试剂进行上机测序。
3.液相色谱质谱联用分析
检测系统为热电公司的Easy-nLC 1200(Thermo Scientic,P/N LC140)与Orbitrap Exploris 480(Thermo Scientic,P/N BRE725533)联用。样品使用7微升流动相A(0.1％甲酸水溶液)溶解上样3微升，肽段在10微升/分钟流速下被捕集柱(PepMap C18,100μm x2cm)捕集3分钟，随后肽段在纳升级分析柱(PepMap C18,75μmx 25cm)上进行梯度洗脱色谱分离。分离梯度为70分钟内流动相B(0.1％甲酸的乙腈溶液)从5％上升至30％。色谱流速为200纳升/分钟，色谱柱柱温为55摄氏度。离子源喷雾电压为2.3kV，质谱仪加热毛细管设定为320℃，采用数据依赖模式自动在MS和MS/MS间切换采集。全扫描MS使用Orbitrap进行一级扫描，扫描范围为m/z 350-1600，分辨率设定为120,000(m/z 200处)。离子最大引入时间为50ms，自动增益控制(Automatic gain control,AGC)设定为5x105，随后使用高能碰撞解离(Higher energy C-trap dissociation,HCD)对符合串级(MS/MS)碎裂条件的强度前20名母离子进行碎裂并用orbitrap进行扫描，扫描分辨率设定为17,500。扫描范围根据母离子质荷比自动控制，最低扫描范围固定为m/z＝110处。MS/MS时离子最大引入时间为50ms，AGC控制设定为2.0x105，母离子选择窗口设定为1.6道尔顿。对于2、3、4电荷数的离子进行MS/MS采集，动态排除设定为每个母离子在10秒内进行1次MS/MS，之后排除40秒，30％的碰撞能量。
4.免疫组化：
用于验证研究的一抗包括：兔抗嗅介蛋白4(Cat.#28432-1-AP，proteintech，1∶50)，兔抗β微管蛋白(Cat.#，Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz，CA；1∶200)。通过估计免疫阳性染色细胞的百分比进行定量评分∶0，<10％细胞；1，10-30％细胞；2，30-50％细胞；3，50-70％细胞；和4，>70％细胞。其次，通过评估阳性细胞的平均染色强度给染色强度评分(0，无；1，弱；2，中等；和3，强)。如上所述对免疫组化数据进行统计学分析，获得MS结果。
结果显示，在结肠癌组织中细胞干性相关基因(LGR5、SOX9、MYC和SALL4)的mRNA水平明显高于癌旁组织(图2A)，这提示肿瘤干细胞可能在结肠癌发生发中具有重要的作用。为了进一步验证我们的设想，我们使用液相色谱质谱对3对结肠癌样本进行检测，发现癌组织中OLFM4蛋白的表达显著高于癌旁组织(见图2A)，随后我们通过WB实验发现OLFM4蛋白在高分化及早期结肠癌中倾向于过度表达，但在低分化和晚期结肠癌中减少或缺失(见图2B)，且与患者预后呈正相关(见图2C)。
实施例2OLFM4在结肠癌干细胞表达的研究
单细胞测序：
1.将样本制备成单细胞悬浮液，细胞质检然后进行细胞计数和细胞活性测定，最终使细胞活性高于90％，细胞浓度为700～1200个细胞/μL。
2.取75μL Master Mix+细胞悬浮液、40μL的含有barcode信息的凝胶珠和280μL的油滴分别加入到Chromium Chip B的不同小室，经由微流体“双十字”交叉系统形成油滴包裹的凝胶珠(Gel Bead-In-EMulsions，GEMs)。
3.收集GEMs，并将其全部混合，凝胶珠在每个油滴内自动溶解释放大量Barcode引物序列，细胞裂解释放mRNA，mRNA与逆转录酶、凝胶珠上的poly dT反转录引物以及dNTP底物相接触，在逆转录酶的作用下发生逆转录反应，产生用于测序的带有Barcode和UMI信息的cDNA一链，再以SMART扩增方法完成第二链合成
4.cNDA片段化油滴破碎，磁珠纯化cDNA一链，然后以cDNA为模板进行PCR扩增。
5.cDNA扩增完成后，首先利用化学方法将cDNA打断成200-300bp左右的片段，通过末端修复、加A进行cDNA片段筛选，P7 adaptor接头连接Read2测序引物，并通过PCR扩增引入样品Index，最后进行片段筛选，从而构建含有P5和P7接头的cDNA文库。
6.在Illumina的测序仪上进行测序。测序完成之后，进行数据分析。
基于上述发现，我们进一步对二代测序(RNA-seq)数据进行深入分析，首先用bowtie2做序列比对，然后用htseq进行读数统计，最后用edgeR进行标准化和差异表达分析。发现癌与癌旁组织中OLFM4基因mRNA水平不存在显著性差异(图3A)。综合上述实验数据，OLFM4的mRNA和蛋白水平在结肠癌组织存在表达不一致，这引起了我们的兴趣。为了明确OLFM4基因的表达在癌组织中是否存在异质性，我们运用单细胞测序技术对1个结肠癌癌组织样本进行检测，发现OLFM4的mRNA主要表达于结肠癌干细胞中(图3B)。随后我们对结肠癌组织石蜡切片进行IF实验，结果显示OLFM4和CD133存在共定位(见图3C)。以上结果表明OLFM4主要表达于结肠癌干细胞中。
实施例3OLFM4的mRNA Poly(A)-tail在结肠癌中长度的研究
PALso-seq测序：
1.末端延伸：选用延伸引物，配制延伸体系，进行末端延伸。
2.USER酶消化：加入USER酶消化上步延伸产物。
3.RNA纯化：选用RNA Clean&ConcentratorTM-5对USER消化后的中间产物进行纯化。
4.反转录和模板转换：采用SuperScipt II反转录酶和寡序列TSO进行反转录和模板转换。
5.PCR扩增：将反转录后的cDNA进行PCR扩增。
6.PCR纯化：选用DNA Clean&ConcentratorTM-5或AMPure XP Product磁珠对PCR产物进行纯化，得到cDNA文库。
7.SMRT接头连接：连接SMRTbell环形接头构建SMRT文库，并进行磁珠纯化后用于后续上机测序。
8.测序：将样品于PacBio SequelII三代测序平台上进行测序。
综上所述，我们认为结肠癌干细胞中OLFM4的RNA水平与蛋白水平表达之间可能存在某种特殊的调节机制，影响了OLFM4基因RNA-蛋白的翻译效率。究其原因，可能与位于OLFM4基因mRNA 3’端Poly(A)-tail有关。因此，我们使用PALso-seq技术检测3组结肠癌样本(癌与癌旁)中OLFM4基因转录本ENST00000219022.3的Poly(A)-tail长度与序列，
我们发现Poly(A)-tail仅在结肠癌组织(组织样本编号：9T和15T，T代表癌组织)中被检测到且长度在50-60nt之间，而在癌旁组织(组织样本编号：9Adj和15Adj，adj代表癌旁组织)并未发现(见图4A)，且我们进一步测得结肠癌组织中Poly(A)-tail的具体序列(见图4B)。综合以上发现，我们认为针对检测结肠癌干细胞中OLFM4基因Poly(A)-tail的长度与序列的解析，对患者的分期与预后可进行更精准的预测。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (4)
1.一种嗅素结构域家族蛋白4(OLFM4)在制备结肠癌检测产品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品可通过检测患者嗅素结构域家族蛋白4(OLFM4)mRNA的Poly(A)-tails的长度从而诊断患者是否患有结肠癌。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒或基因芯片。
4.一种结肠检测产品，所述产品可通过检测患者嗅素结构域家族蛋白4(OLFM4)mRNA的Poly(A)-tails的长度从而诊断患者是否患有结肠癌。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103502470A (zh) * | 2011-03-02 | 2014-01-08 | 西部癌症学研究所 | 嗅介蛋白-4蛋白（olfm4）在结肠直肠癌诊断中的用途 |
| CN103890587A (zh) * | 2011-08-31 | 2014-06-25 | 昂科赛特公司 | 用于治疗和诊断癌症的方法和组合物 |
| US20140342361A1 (en) * | 2012-01-09 | 2014-11-20 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer |
| CN110799841A (zh) * | 2017-06-30 | 2020-02-14 | 国立研究开发法人医药基盘·健康·营养研究所 | 用于检测大肠癌的生物标志物 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG192108A1 (en) * | 2011-01-25 | 2013-08-30 | Almac Diagnostics Ltd | Colon cancer gene expression signatures and methods of use |
| WO2012169887A2 (en) * | 2011-06-06 | 2012-12-13 | Stichting Katholieke Universiteit, More Particularly The Radboud University Nijmegen Medical Centre | Use of new markers in a diagnostic assay for determining severity of rsv infection |
| US20150148626A1 (en) * | 2012-07-24 | 2015-05-28 | Given Imaging Ltd. | Method for detecting colorectal cancer |
| US20160209415A1 (en) * | 2015-01-20 | 2016-07-21 | Poochon Scientific LLC | Method to predict or diagnose a colorectal cancer |
| JP7389980B2 (ja) * | 2018-12-06 | 2023-12-01 | 国立大学法人 琉球大学 | ヒト膵臓組織特異的幹／前駆細胞の人工作製方法 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103502470A (zh) * | 2011-03-02 | 2014-01-08 | 西部癌症学研究所 | 嗅介蛋白-4蛋白（olfm4）在结肠直肠癌诊断中的用途 |
| CN103890587A (zh) * | 2011-08-31 | 2014-06-25 | 昂科赛特公司 | 用于治疗和诊断癌症的方法和组合物 |
| US20140342361A1 (en) * | 2012-01-09 | 2014-11-20 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer |
| CN110799841A (zh) * | 2017-06-30 | 2020-02-14 | 国立研究开发法人医药基盘·健康·营养研究所 | 用于检测大肠癌的生物标志物 |
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