CN117452003A - 血清多肽标志物prpf19在制备黑素瘤血清诊断产品中的应用 - Google Patents
血清多肽标志物prpf19在制备黑素瘤血清诊断产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了血清多肽标志物PRPF19在制备黑素瘤血清诊断产品中的应用，属于生物医药技术领域。本发明通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI‑TOF‑MS)和酶联免疫吸附实验(ELISA)的方法测检测血清中PRPF19的表达水平，发现PRPF19在黑素瘤血清中呈现特异性高表达，此多肽可以作为诊断黑素瘤的血清多肽标记物，本发明填补了在临床诊断黑素瘤的血液指标上的空白。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及血清多肽标志物PRPF19在制备黑素瘤血清诊断产品中的应用。
背景技术
黑素瘤(Melanoma)是一种恶性肿瘤，起源于皮肤中的黑色素细胞。发病率最高的地区包括澳大利亚、新西兰和北美洲。黑素瘤的高发病率与遗传因素、环境因素(如紫外线暴露)和个体特征(如皮肤类型)等密切相关。目前对于黑素瘤的临床诊断通常是通过病史询问，皮肤检查，皮肤镜检查，皮肤活检，影像学检查等手段进行综合诊断，临床中缺少对于黑素瘤诊断的客观生物学指标，而皮肤活检的手段往往因其有创性不利于被患者所接受。因此，寻找敏感性、特异性高的黑素瘤血液诊断标志物已成为临床所关注的热点问题，以利于临床医生对患者的后续治疗和管理，对于改善患者的生存质量有着重要的临床意义。
蛋白质组学是研究生物体内所有蛋白质的组成、结构、功能和相互作用的科学。在黑素瘤研究中，蛋白质组学技术可以用于识别潜在的生物标志物，揭示黑素瘤发生和发展的分子机制，这些生物标志物可以用于早期诊断、预后评估和治疗监测。通过蛋白质组学的研究方法，可以全面了解黑素瘤标志物的组成、结构和功能，从而揭示肿瘤发生的复杂的生物过程和疾病机制。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix Assisted LaserDesorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)在蛋白质组学研究中可以提供快速、高通量的蛋白质分析方法，帮助揭示蛋白质的组成、结构和功能，从而深入理解生物过程和疾病机制。在蛋白质鉴定方面，MALDI-TOF-MS可以用于快速鉴定复杂混合物中的蛋白质。通过将样品与基质混合并加以激光解吸电离，得到蛋白质的质谱图谱。然后，将质谱图谱与已知的蛋白质数据库进行比对，从而确定样品中的蛋白质身份。在蛋白质表达差异分析方面，MALDI-TOF-MS可以用于比较不同条件下蛋白质表达的差异。通过将样品进行蛋白质提取和质谱分析，可以获得蛋白质表达谱。然后，通过比较不同样品的蛋白质表达谱，可以发现与特定条件或疾病相关的蛋白质差异表达，从而揭示生物过程和疾病机制。
PRPF19(Pre-mRNA Processing Factor 19)是体内一种具有重要功能的蛋白质/多肽，参与了前mRNA的剪接过程。PRPF19是一个核内的剪接复合物的组成成员，对于正常的剪接和mRNA的成熟起着关键的调控作用。PRPF19被发现与多种疾病的发生和发展相关，包括白内障和神经系统疾病。PRPF19的突变或功能异常可能导致剪接错误和mRNA的异常处理，进而影响基因的表达和蛋白质功能。对PRPF19的深入研究有助于理解剪接调控的机制，以及相关疾病的发生机制和治疗策略的开发。
目前，尚未有关于PRPF19在黑素瘤诊断方面的相关报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供血清多肽标志物PRPF19在制备黑素瘤血清诊断产品中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开血清多肽标志物PRPF19在制备黑素瘤血清诊断产品中的应用。
优选地，通过MALDI-TOF-MS和ELISA对血清多肽PRPF19的表达进行检测。
优选地，所述血清多肽标志物PRPF19在黑素瘤血清中显著高表达。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血清多肽标志物PRPF19在黑素瘤血清中呈现特异性高表达。
优选地，所述产品为诊断试剂或诊断试剂盒。
本发明还公开了检测血清多肽标志物PRPF19的试剂在制备用于黑素瘤血清诊断产品中的应用。
优选地，所述血清多肽标志物PRPF19在黑素瘤血清中显著高表达。
优选地，所述血清多肽标志物PRPF19在黑素瘤血清中呈现特异性高表达。
优选地，所述产品为诊断试剂或诊断试剂盒。
本发明还公开了一种黑素瘤血清诊断试剂盒，该试剂盒中包括用于检测待测血清样品中多肽标志物PRPF19的试剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明应用MALDI-TOF-MS技术筛选出黑素瘤组vs健康对照组差异表达多肽即PRPF19，并首次揭示了黑素瘤血清多肽标志物PRPF19在制备黑素瘤诊断产品中的新用途，通过MALDI-TOF-MS和ELISA技术对黑素瘤血清样本进行了检测和验证，结果显示PRPF19在黑素瘤人群中显著高表达(P＜0.01)。ROC曲线分析显示PRPF19的AUC值为0.813，最大约登指数为0.656，95％可信区间为(0.701,0.925)，最佳临界值为244.346，灵敏度为100.00％，特异度为65.60％，说明PRPF19在黑素瘤血清中呈现特异性高表达，基于以上分析，血清多肽标志物PRPF19可以作为诊断黑素瘤的血清标记物在临床中予以应用，本发明填补了在诊断黑素瘤的临床血液指标上的空白。
附图说明
图1为本发明的蛋白多肽峰m/z：3605.04在黑素瘤患者(红色)和正常健康人群组(绿色)中的蛋白多肽表达差异图；
图2为本发明的黑素瘤患者血清蛋白多肽混合物的凝胶色谱分离图；其中，色谱图中横坐标表示样本流出时间，纵坐标代表多肽相对丰度；
图3为本发明的PRPF19的MS/MS质谱鉴定图谱；其中，m/z：3605.04；
图4为本发明的黑素瘤患者组和正常健康人群组血清中PRPF19蛋白的表达水平；其中，黑素瘤组N＝32，正常健康人群N＝32，***代表P＜0.001。
图5为ROC曲线分析PRPF19在黑素瘤中的诊断价值。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
1.血清样本的采集和分组
样本采集自延安大学咸阳医院皮肤科(2020年10月至2022年10月)的64例(男性30例；女性34例)黑素瘤患者，64例正常健康人群(男性33例；女性31例)，按照1∶1的比例随机分为训练组(黑素瘤患者32例，健康对照32例)和验证组(黑素瘤患者32例，健康对照32例)，训练组用于MALDI-TOF-MS分析，验证组用于ELISA血清验证。样本考虑年龄、性别、采集时间、储存条件是否一致以及有无基础疾病等因素。被采集者晨起空腹采血，用真空采血管(黄帽、有隔离胶)采集全血5mL，室温静置30min；室温离心5min(3000g)，将上层血清分装成100μL/管，立即保存于-80℃，避免反复冻融。
血清蛋白的提取采用中国普睿迈格生物科技公司IMAC-Cu磁珠，以及光谱纯(HPLC级)乙腈、三氟乙酸(德国Merck公司)和α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)(美国Sigma公司)。
实验所用仪器包括磁珠分离器、600/384AnchorChip靶板和AutoFlexIII基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time ofFlight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS)(德国Bruker Daltonics公司)。
2.血清蛋白样本的制备
运用IMAC-Cu磁珠试剂盒捕获血清蛋白多肽，具体操作步骤如下：
①用混匀器完全混匀磁珠悬浮液1min；
②加10μL磁珠结合液以及10μL IMAC-Cu磁珠至PCR管，混匀后加5uL血清，混匀至少5次，静置5min；
③将PCR管放入磁柱分离器，使磁珠贴壁1min，液体清澈后弃上清液；
④加100μL磁珠冲洗液，在磁柱分离器上前后移动10次PCR管，磁珠贴壁后弃上清液，重复步骤③、④两次；
⑤加5μL磁珠洗脱液洗涤贴壁的磁珠,并反复吹打10次,磁珠贴壁2min，将上清液移入干净的离心管；
⑥加5μL磁珠稳定液至离心管并混匀，提取的蛋白多肽可以用于直接MALDI-TOF-MS检测或者冻存于-20℃冰箱24h之内质谱分析。
3.MALDI-TOF-MS质谱分析
将分离收集得到的蛋白样本1μL与10μL的基质α-氰基-4-羟基肉桂酸混匀，取1μL混匀物点在Anchorchip靶板(德国Bruker公司)上，每个样本分别点三个靶点以作三次重复。待室温干燥后将靶板放入质谱仪进行飞行时间质谱分析，采用FlexControl 2.0软件进行标准品校正后开始样本检测，每个样本要经过总共300次激光打靶(5次点靶，每次打靶2X30次)之后生成质谱图，获得由不同质核比(m/z)组成的蛋白多肽谱图。采用ClinProTools2.1软件结合遗传算法等生物统计学和生物信息学方法分析两组血清样本的蛋白多肽图谱。进行归一化平滑处理总离子流图，消除化学及电物理噪声；分析组间差异蛋白并计算差异大小，按差异大小由大到小排列，找出组间表达具有显著差异的蛋白多肽峰值(P＜0.01)。
将黑素瘤患者和正常健康人群血清样本采用磁珠分离系统处理后，经过MALDI-TOF-MS分析后，对黑素瘤患者和正常健康人群的每个样本进行蛋白多肽图谱绘制，在分子量范围800Da-10000Da共检测到56个蛋白多肽峰图，且每个样本的三次重复稳定性较高。
采用ClinProTools 2.1软件对质谱捕获的黑素瘤患者和正常健康人群的血清蛋白多肽图谱进行分析，将黑素瘤患者血清多肽谱图与正常健康人群进行比较分析，检测到具有极显著差异的蛋白多肽峰图(P＜0.01)，对在黑素瘤患者中显著高表达的蛋白多肽进行分析，具体如表1所示。
表1.质谱捕获的黑素瘤患者和正常健康人群的血清蛋白多肽图谱分析结果
对表1中的黑素瘤患者血清中特异高表达蛋白多肽进行Flex analysis软件分析，结果如图1所示，经过m/z：3605.04在黑素瘤患者(红色)和正常健康人群(绿色)中的表达比较，发现m/z：3605.04的蛋白多肽峰图在黑素瘤患者血清中均显著高表达，因此对其进行序列鉴定并作为标志物的首选进一步鉴定。
4.黑素瘤血清潜在标志物的序列鉴定
具体采用液相色谱分离与质谱联用(MS/MS)的技术对黑素瘤患者血清多肽标志物m/z：3605.04进行鉴定，采用Thermo Scientific公司的纳升流速HPLC液相系统Easy nLC1200对经磁珠分离收集的质谱上样剩余的血清蛋白多肽进行二维凝胶色谱分离,再联用Thermo Sceientific的Orbitrap Fusion质谱仪对黑素瘤患者血清中表达上调的蛋白多肽m/z：3605.04进行序列鉴定。
具体的操作步骤为：
4.1样本前处理
将100μL样本与800μL 5％乙腈、0.5％甲酸溶液混合后加入1.5ml、小于10kDa的超滤管中，在低温离心机中设置20℃，7000转离心40min，浓缩至500μL，脱盐，最后用70％甲醇、0.5％甲酸洗脱多肽，收集浓缩至100μL，Zip-tip柱处理浓缩。
4.2色谱分离
每份样品采用纳升流速HPLC液相系统Easy nLC 1200进行分离。缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈溶液。色谱柱以95％的A液平衡。样品由自动进样器上样到质谱预柱C18 trap column(C18 3μm0.10X20mm)，再经分析柱C18 column(C18 1.9μm 0.15X120mm)分离，流速为600nL/min。相关液相梯度如表2所示，凝胶色谱分离结果如图2所示。
表2.相关液相梯度
4.3质谱鉴定
每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用Orbitrap Fusion质谱仪(ThermoSceientific)进行质谱分析。主要参数设置如表3所示，质谱鉴定结果如图3所示。
表3.质谱分析的主要参数设置
4.4数据分析
质谱分析原始数据为RAW文件，用软件Sequest和Proteome Discoverer2.5.0(Thermo Scientific)在数据库"uniprot-human"中进行搜库鉴定，搜库时将RAW文件通过Proteome Discoverer提交至Sequest服务器，选择已经建立好的数据库，然后进行数据库搜索，相关参数如表4所示：
表4.进行数据库搜索的相关参数
结果过滤参数为:Peptide FDR≤0.01。
检索结果如表5所示：
表5.数据库搜索的检索结果
因此，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测PRPF19的表达水平，可作为黑素瘤患者检测的方法。提示PRPF19是与黑素瘤特异性相关的蛋白，可进一步通过ELISA检测来进行验证。
5.黑素瘤血清PRPF19表达的ELISA血清验证分析
5.1检测方法
采用酶联免疫法(ELISA)检测黑素瘤患者和正常健康人群的血清PRPF19的表达水平，试剂盒购自中国上海泛柯实业有限公司。本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人mRNA前体剪接因子19(PRPF19)水平。用纯化的人mRNA前体剪接因子19(PRPF19)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入mRNA前体剪接因子19(PRPF19)，再与HRP标记的mRNA前体剪接因子19(PRPF19)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的mRNA前体剪接因子19(PRPF19)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中人mRNA前体剪接因子19(PRPF19)浓度。具体实验步骤参照试剂盒说明书，阳性判定标准按照试剂盒说明书界定。
5.2统计方法
采用SPSS20.0软件进行独立样本T检验。
5.3结果分析
酶联免疫法(ELISA)分析结果表明PRPF19在不同检测组中的表达水平为黑素瘤患者＞正常健康人群，并且两组间具有显著性差异(P<0.001)，具体结果如表6、图4所示：
表6.不同组别血清中PRPF19蛋白的表达水平
5.4受试者工作曲线(ROC)相关性分析及生物标志物评价指标计算
ROC曲线分析结果显示(图5)，在独立的血清样本中，血清PRPF19的曲线下面积(AUC)值为0.813，最大约登指数为0.656，95％可信区间为(0.701,0.925)，最佳临界值为244.346，灵敏度为100.00％，特异度为65.60％，这表明以上检测血清PRPF19的相对表达量的方法，对黑素瘤表现出良好的判断能力和拟合性能。
综上，本发明通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和酶联免疫吸附实验(ELISA)的方法测检测血清中PRPF19的表达水平，发现PRPF19在黑素瘤血清中呈现特异性高表达，以PRPF19作为诊断黑素瘤的血清多肽标记物，可以为黑素瘤的早期诊断提供重要参考。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (10)
1.血清多肽标志物PRPF19在制备黑素瘤血清诊断产品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过MALDI-TOF-MS和ELISA对血清多肽PRPF19的表达进行检测。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血清多肽标志物PRPF19在黑素瘤血清中显著高表达。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血清多肽标志物PRPF19在黑素瘤血清中呈现特异性高表达。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为诊断试剂或诊断试剂盒。
6.检测血清多肽标志物PRPF19的试剂在制备用于黑素瘤血清诊断产品中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述血清多肽标志物PRPF19在黑素瘤血清中显著高表达。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述血清多肽标志物PRPF19在黑素瘤血清中呈现特异性高表达。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为诊断试剂或诊断试剂盒。
10.一种黑素瘤血清诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括用于检测待测血清样品中多肽标志物PRPF19的试剂。
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