JPS58134990A - 新規な細菌アルカリプロテア−ゼ及びその製造方法 - Google Patents
新規な細菌アルカリプロテア−ゼ及びその製造方法Info
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- JPS58134990A JPS58134990A JP57017596A JP1759682A JPS58134990A JP S58134990 A JPS58134990 A JP S58134990A JP 57017596 A JP57017596 A JP 57017596A JP 1759682 A JP1759682 A JP 1759682A JP S58134990 A JPS58134990 A JP S58134990A
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- enzyme
- glothiase
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- api
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- Granted
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本実９１１は８新規なアルカリグロチアーゼＡＰＩ−２
１及びその製造方法に関し、更に詳しくはアルカリ性の
条件下、比横的低温度（１！ｎｉｌ〜約４０１′Ｃ）に
ても＃素活性ｔＶする細菌アルカリグロテアーゼＡＰＩ
−２１並びに新■種パテルヌ属ＮＫＳ−２１Ｖｒ培養す
ることによりて生産される鋏アルカリグロチアーゼＡＰ
Ｉ−２１０８造方法に関する＠アルカリグロチアーゼは
一般に熱に対して中性プ四テアーゼよりも安定であるた
め、その用途も皮革加工用１食品工業用、繊細１槃用あ
るい鉱医薬としての応用等、広範囲にわたりている。１
１た。
１及びその製造方法に関し、更に詳しくはアルカリ性の
条件下、比横的低温度（１！ｎｉｌ〜約４０１′Ｃ）に
ても＃素活性ｔＶする細菌アルカリグロテアーゼＡＰＩ
−２１並びに新■種パテルヌ属ＮＫＳ−２１Ｖｒ培養す
ることによりて生産される鋏アルカリグロチアーゼＡＰ
Ｉ−２１０８造方法に関する＠アルカリグロチアーゼは
一般に熱に対して中性プ四テアーゼよりも安定であるた
め、その用途も皮革加工用１食品工業用、繊細１槃用あ
るい鉱医薬としての応用等、広範囲にわたりている。１
１た。
近年では洗剤添加用ｒｓｘｏ督用が増大している◇この
ような洗剤添加用酵素として実用に供されているもの鉱
石んどバチルス属細１のアルカリグロチアーゼであり、
高温度高活性型の酵素である〇すなわち、該酵素はｄ９
〜１Ｇ附近に至適作用条件ｔ″有し、高温度特に６ Ｇ
”付近に最高活性ｔＶし、低ｍ度ｌｆ＃に型温付近では
酵素活性を失りてし１うものが多い・我国に訃ける如く
型温で洗濯１行なう習慣のある国で蝶、十分に上記―嵩
の特性線発揮嘔れていない０又、康近における熱に比駿
的弱い化学繊維の増加、あるいは省エネルギーの観点か
らもより低いＩＩ［でも高い活性が保持される酵素の開
発が畳求されている０ 本発明者ＩＩｉ、かかる状況に鏝みより１１１１度で最
高活性値を有する細菌アルカリグロチアーゼ【得ること
ｔ＠的に９％樵土鳴中よりアルカリグロチアーゼ生、ｍ
ａｒ検索した結果、土壌よｐ分層し次バチルス（Ｂａｅ
ｉｌ１％Ｊ）属に属する新■種、バチルス１４ＮＫｓ
−２１（Ｂａｅｉｌｌｗ ｔｐ、 ｓｏｗ、 ＮＫＳ−
２１−以下単ＷＣＮＫＳ−２１号厘というンが上記目的
に合歓した＃規アルカリグロチアーゼを培地中に生産す
ることを見出し、この知見に基づき本発明を完成したも
のである◎ すなわち１本発明に）ｔ’ｊるアルカリグロチアーゼＡ
ＰＩ −２１ｌ生産する菌株はその１字的性質より好気
性有胞子Ｊ１１でありバチルス属に属する新１種である
ことが４ｉ１１明した・以下、これについて詳しく述べ
る９尚、同定にあたっての薗学的緒性質の試１１２よび
分一方法は［パージニーズ マ二島アル オプ ブタ−
ζネイティブ パクテリオロジーＪｊｌＳ版（１９７４
年）の記歌に基づいて行なり危・ 本発明にかける菌株ＮＭＳ −２１４１は、前述の如く
好気ｔ！！有胞子細■でＴｏｐバチルス属に属すること
が明らかである０而しで鋏■株の極めて轡異的性状とし
て中性の培地でもアルカリ性の培地でも生育するが、特
にナルカリ性の培地に：おいて非常に良く生育し、最適
生育条件としてのｆＩ［が８〜１０である点があげられ
るＯこのような性質に近似した会知の１株とじでバチル
ス パスツリー （Ｂａａｉｌｌｓａ ｐａａｔｔｗｒ
ｉｉ ） ａおよびバチルス アルｌｙ ａ ７４ ル
＊ （Ｂａａｉｌｌｓａ ａｌｅａｌｉｉｌｓａ ）ｅ
ｆｉ挙ｔ／’ｆ ６れる０しかるに、不発明における
菌株ＮＫ＆ −２１号薗は、上記の薗□−とそのＭ’！
−的性質に訃いて一部一欽する点もめるが異なる４１性
管も有し、それらと別異の１株であり文献未記載の新菌
種であるＯｔなわち、バチルス パスツリーとパテルス
アルカロフイルスはともにアルカリ！！１躍域で生育す
る麿であり、特にバチルス□ アルカロフイルスはｐＨ
７では生育できない４１性を有するＯ−万。
ような洗剤添加用酵素として実用に供されているもの鉱
石んどバチルス属細１のアルカリグロチアーゼであり、
高温度高活性型の酵素である〇すなわち、該酵素はｄ９
〜１Ｇ附近に至適作用条件ｔ″有し、高温度特に６ Ｇ
”付近に最高活性ｔＶし、低ｍ度ｌｆ＃に型温付近では
酵素活性を失りてし１うものが多い・我国に訃ける如く
型温で洗濯１行なう習慣のある国で蝶、十分に上記―嵩
の特性線発揮嘔れていない０又、康近における熱に比駿
的弱い化学繊維の増加、あるいは省エネルギーの観点か
らもより低いＩＩ［でも高い活性が保持される酵素の開
発が畳求されている０ 本発明者ＩＩｉ、かかる状況に鏝みより１１１１度で最
高活性値を有する細菌アルカリグロチアーゼ【得ること
ｔ＠的に９％樵土鳴中よりアルカリグロチアーゼ生、ｍ
ａｒ検索した結果、土壌よｐ分層し次バチルス（Ｂａｅ
ｉｌ１％Ｊ）属に属する新■種、バチルス１４ＮＫｓ
−２１（Ｂａｅｉｌｌｗ ｔｐ、 ｓｏｗ、 ＮＫＳ−
２１−以下単ＷＣＮＫＳ−２１号厘というンが上記目的
に合歓した＃規アルカリグロチアーゼを培地中に生産す
ることを見出し、この知見に基づき本発明を完成したも
のである◎ すなわち１本発明に）ｔ’ｊるアルカリグロチアーゼＡ
ＰＩ −２１ｌ生産する菌株はその１字的性質より好気
性有胞子Ｊ１１でありバチルス属に属する新１種である
ことが４ｉ１１明した・以下、これについて詳しく述べ
る９尚、同定にあたっての薗学的緒性質の試１１２よび
分一方法は［パージニーズ マ二島アル オプ ブタ−
ζネイティブ パクテリオロジーＪｊｌＳ版（１９７４
年）の記歌に基づいて行なり危・ 本発明にかける菌株ＮＭＳ −２１４１は、前述の如く
好気ｔ！！有胞子細■でＴｏｐバチルス属に属すること
が明らかである０而しで鋏■株の極めて轡異的性状とし
て中性の培地でもアルカリ性の培地でも生育するが、特
にナルカリ性の培地に：おいて非常に良く生育し、最適
生育条件としてのｆＩ［が８〜１０である点があげられ
るＯこのような性質に近似した会知の１株とじでバチル
ス パスツリー （Ｂａａｉｌｌｓａ ｐａａｔｔｗｒ
ｉｉ ） ａおよびバチルス アルｌｙ ａ ７４ ル
＊ （Ｂａａｉｌｌｓａ ａｌｅａｌｉｉｌｓａ ）ｅ
ｆｉ挙ｔ／’ｆ ６れる０しかるに、不発明における
菌株ＮＫ＆ −２１号薗は、上記の薗□−とそのＭ’！
−的性質に訃いて一部一欽する点もめるが異なる４１性
管も有し、それらと別異の１株であり文献未記載の新菌
種であるＯｔなわち、バチルス パスツリーとパテルス
アルカロフイルスはともにアルカリ！！１躍域で生育す
る麿であり、特にバチルス□ アルカロフイルスはｐＨ
７では生育できない４１性を有するＯ−万。
ＮＫＳ−２１号■はアルカリ注解でよく生育するが、中
性ｐＨにおいてもよく生育し、この点においてバチルス
アルカロフイルスと異なる。Ｘ、／（テルスパスツリー
はデンプンｔｍ水分解しないがＮＫＳ−２１勺■はデン
プンｔ２１ａ水分解するＯ更に。
性ｐＨにおいてもよく生育し、この点においてバチルス
アルカロフイルスと異なる。Ｘ、／（テルスパスツリー
はデンプンｔｍ水分解しないがＮＫＳ−２１勺■はデン
プンｔ２１ａ水分解するＯ更に。
バチルスパスツリーは硝酸塩ＶＥＲ元するが、 ＮＫＳ
−２１号ＭＢ還元しないＯ又、その形ｍにお−てはバチ
ルスバスツリー蝶９円生胞子が球形か中辛楕円形である
が、ＮＫＳ−２１号■の内生胞子は卵形テする０又、バ
チルスパスツリー扛尿素を分解するが、ＮＫＳ−２１＊
−扛これ七分解しない０以上の１学的性質の差異によＩ
ｆ）、ＮＫＳ−２１号＊ｔｉバチルスパスツリーとは明
らかに別異の種であるＯ バチルスアルカ四７４ルスＯ厘株につ−ての詳細な分類
学的記述Ｋｌｌしては、ＩＩ記「パージニーズ マ二１
アル オブ ブタ−建ネイティブ ノ（クテリオｐジー
」には見轟たらず、不備である０また。パテルヌアルカ
ａフィルスの標準株扛存しない・従って同書記載のオリ
ジナル株であるＩ（チルスアルカロフイルスＮＣｌＢ１
０４３６株＞！び同ＭＣｌ８１０４３８株とについて比
軟した。ＭＣｌＢ１０４３６株νよびＮ０１８１０４３
８株の両−株ともグラム染色性は陽性であるが僅かで６
１．脱色され易い性質【有する０向榔ｆｌｃＮＫｓ−２
１４９■ｔグラム染色性は陽性であって脱色され島い０
貰た。栄養細胞の形層に関してはＭＣｌ８１０４８６株
は０．７ Ｘ ２．ＯＰｖｍ Ｏ短棒■とＯ０畠Ｘ４．
ｌＩ調の長痒画とが電子馴黴鯛下で観察され、−７ＪＮ
ｃＩＢ株の栄養細胞の大きさは０．７ Ｘ １．５ ＃
Ｉである０しかるにｌ１ＫＳ −２１号１の栄養ａｍの
大きさは０．７ ｘ ３．Ｏｐ鋼 （電子顕”黴鏡観−
）でＴｏＬ胞子の形状は卵形でその大きさ＃２０．８
Ｘ １．２μ鯛である。また、運動性に関しＭＣｌ８１
０４３６株及び同１０４３８株はそれが観察されないの
に対し。
−２１号ＭＢ還元しないＯ又、その形ｍにお−てはバチ
ルスバスツリー蝶９円生胞子が球形か中辛楕円形である
が、ＮＫＳ−２１号■の内生胞子は卵形テする０又、バ
チルスパスツリー扛尿素を分解するが、ＮＫＳ−２１＊
−扛これ七分解しない０以上の１学的性質の差異によＩ
ｆ）、ＮＫＳ−２１号＊ｔｉバチルスパスツリーとは明
らかに別異の種であるＯ バチルスアルカ四７４ルスＯ厘株につ−ての詳細な分類
学的記述Ｋｌｌしては、ＩＩ記「パージニーズ マ二１
アル オブ ブタ−建ネイティブ ノ（クテリオｐジー
」には見轟たらず、不備である０また。パテルヌアルカ
ａフィルスの標準株扛存しない・従って同書記載のオリ
ジナル株であるＩ（チルスアルカロフイルスＮＣｌＢ１
０４３６株＞！び同ＭＣｌ８１０４３８株とについて比
軟した。ＭＣｌＢ１０４３６株νよびＮ０１８１０４３
８株の両−株ともグラム染色性は陽性であるが僅かで６
１．脱色され易い性質【有する０向榔ｆｌｃＮＫｓ−２
１４９■ｔグラム染色性は陽性であって脱色され島い０
貰た。栄養細胞の形層に関してはＭＣｌ８１０４８６株
は０．７ Ｘ ２．ＯＰｖｍ Ｏ短棒■とＯ０畠Ｘ４．
ｌＩ調の長痒画とが電子馴黴鯛下で観察され、−７ＪＮ
ｃＩＢ株の栄養細胞の大きさは０．７ Ｘ １．５ ＃
Ｉである０しかるにｌ１ＫＳ −２１号１の栄養ａｍの
大きさは０．７ ｘ ３．Ｏｐ鋼 （電子顕”黴鏡観−
）でＴｏＬ胞子の形状は卵形でその大きさ＃２０．８
Ｘ １．２μ鯛である。また、運動性に関しＭＣｌ８１
０４３６株及び同１０４３８株はそれが観察されないの
に対し。
ＮＫＳ −２１号ｍは這ＪＩｌｌ性がある０次に生理的
性質ニツいて、バチルスアルカロフイルスはマンニトー
ル培地に生育しないが、ＮＫＳ−２１４Ｈ１は生育する
０１次ＭＣｌ８１０４３６株は７−食塩中で生育しない
が、ＮＣｌＢ１０４８８株は生育するＯＮＭＳ−２１号
１は７−食塩水で生育する０以上の結果からＮＫ：Ｓ
−２１号ｍは、パチルスアルカロフイルスＭＣｌＢ１０
４３８株とｐ９１０４３８株とは一部その性質が近似す
るが、総体的に両者から区別する仁とができ別異の１で
ある０ 更に、ＮＫＳ−２１号−とバチルスズブチリス（Ｂａｔ
ｔｉｌにｗ ｔｍｇｉｌｉ＠ンとは、パテルスス゛ブチ
リス栄養細胞の大き名扛巾０−７− ＯＪ ＩＩＪ肩ｅ
長さ２−３μ陶であり、デンプンを分解する点に訃いて
類似する＠しかるにバチルスズブチリスはｐＨ５，５〜
８．５で生育が活発であるが、ＮＫＳ−２１号ＩＩが生
育すゐ躍９〜ｌＯでは生育できない。さらにバチルスズ
ブチリスの生育最高温度は４５〜５５１１Ｃにあるが、
ＮＫＳ−２１号■は４１．５±０．５°Ｃで明らかに異
るなどの点から、ＮＫＳ−２１号開拡明らかにバチルス
ズブチリスとは別の種である０以よ述べ次ように、ＮＫ
Ｓ−２１４１ｊ■はその■学的性質から近似の性質ｔ−
有する全知の菌株バチルスパスツリー、バチルスアルカ
ミツイリスおよびパチルスズプチルスと扛区別堪れ、上
記のバーシーズ・マ二島アルにＩｅ叡されている既知Ｏ
１１のいずれとも異なる故新一種に属することが明白で
ある０よって、亨曹を新■種バチルス＠ＮＫＳ−２１号
−と同定し九〇 皺新一種バテルス属ＮＫＳ−２１９■は、４１許手続上
の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に
基づ１１＠和５７年２月３日附工業技術院微生物工業技
術研＊ｆｆｒへＪＩ際寄託され、受託番号は、黴工研条
寄＠９３号であるＯ 以下１１Ｃ，ＮＫＳ−２１号−の１学的ｍｓ質ｔＩｌｅ
ａする。ｌｋお、以下に記載する一学的麺性質の試験、
ンよび分一方法は前記「バージニーズ マ工為アル オ
ブ ブタ建ネイティブ パクテリオロジー」（１９７４
年）に基づいて行なったＯ 土壌中より一〇分聰については次の方法によった０即ち
、土壌塊Ｏ／ｊＳ貴ｔベグトン培地に添加し。
性質ニツいて、バチルスアルカロフイルスはマンニトー
ル培地に生育しないが、ＮＫＳ−２１４Ｈ１は生育する
０１次ＭＣｌ８１０４３６株は７−食塩中で生育しない
が、ＮＣｌＢ１０４８８株は生育するＯＮＭＳ−２１号
１は７−食塩水で生育する０以上の結果からＮＫ：Ｓ
−２１号ｍは、パチルスアルカロフイルスＭＣｌＢ１０
４３８株とｐ９１０４３８株とは一部その性質が近似す
るが、総体的に両者から区別する仁とができ別異の１で
ある０ 更に、ＮＫＳ−２１号−とバチルスズブチリス（Ｂａｔ
ｔｉｌにｗ ｔｍｇｉｌｉ＠ンとは、パテルスス゛ブチ
リス栄養細胞の大き名扛巾０−７− ＯＪ ＩＩＪ肩ｅ
長さ２−３μ陶であり、デンプンを分解する点に訃いて
類似する＠しかるにバチルスズブチリスはｐＨ５，５〜
８．５で生育が活発であるが、ＮＫＳ−２１号ＩＩが生
育すゐ躍９〜ｌＯでは生育できない。さらにバチルスズ
ブチリスの生育最高温度は４５〜５５１１Ｃにあるが、
ＮＫＳ−２１号■は４１．５±０．５°Ｃで明らかに異
るなどの点から、ＮＫＳ−２１号開拡明らかにバチルス
ズブチリスとは別の種である０以よ述べ次ように、ＮＫ
Ｓ−２１４１ｊ■はその■学的性質から近似の性質ｔ−
有する全知の菌株バチルスパスツリー、バチルスアルカ
ミツイリスおよびパチルスズプチルスと扛区別堪れ、上
記のバーシーズ・マ二島アルにＩｅ叡されている既知Ｏ
１１のいずれとも異なる故新一種に属することが明白で
ある０よって、亨曹を新■種バチルス＠ＮＫＳ−２１号
−と同定し九〇 皺新一種バテルス属ＮＫＳ−２１９■は、４１許手続上
の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に
基づ１１＠和５７年２月３日附工業技術院微生物工業技
術研＊ｆｆｒへＪＩ際寄託され、受託番号は、黴工研条
寄＠９３号であるＯ 以下１１Ｃ，ＮＫＳ−２１号−の１学的ｍｓ質ｔＩｌｅ
ａする。ｌｋお、以下に記載する一学的麺性質の試験、
ンよび分一方法は前記「バージニーズ マ工為アル オ
ブ ブタ建ネイティブ パクテリオロジー」（１９７４
年）に基づいて行なったＯ 土壌中より一〇分聰については次の方法によった０即ち
、土壌塊Ｏ／ｊＳ貴ｔベグトン培地に添加し。
ｐＨ７〜１０．１ｌＫ１０〜４ Ｇ’の領域で振盪培養
ｆＦｔ−用い、４０〜１５０時間培養し、その一部分ｔ
−１！：り寒天平板培養で菌株【分層した一ｏ１に訃寒
天平職培養の寒天濃度ｒ！ １．５１６であるＯＣＮＫ
Ｓ −２１ｊＩの１学的性質〕 （ａ） 形態 １１） 栄養細胞の大きさ ０．８ Ｘ １．６〜３．２ Ｐｍ Ｃ光学顕微−Ｉｌ
ｌ）０．７ ｘ ３．０ ＃Ｉｍ （電子１１１１１’
ｌｌ観ｍｌ ）（２１細胞Ｏ多形性 細胞が伸長し０．６〜１．０ Ｘ ４．５μ鋼になるこ
とあり （３）グラム染色性 陽性ではあるが脱色され易い （４） 這ｍｅ １ｐ （５）鞭毛 複数存在し、約８〜Ｉ Ｏｐｍの長さである０ （８７ｊ！ｌ子の形、大きさ 卵形、 ０．８ Ｘ １．２／＃Ｉ 内生胞子は細胞のや中鴫寄りのところに存在 （６１培地に訃ける生育状層 （１） ペプトン培地 ｐＨ ｐＨ９，５ ２０℃で％３０℃でも良く生育する０ ｐＨ７，２ ２０℃で４遅いが生育し、ｇｏ”ｃで は良（生育する・ 生育ｉ１度（ｐＨ９，５） 最高生育温度 ４１．５±０．５′″Ｃ最低生育温度
１６±１”Ｃ （２）他の培地 肉エキス・ペグトン寒天 斜面培地 よく生育する肉エキスのペグ
トン寒天 平板培地 よく生育する７−食塩存在肉
エキス・ ペプトン寒天平板培地 よく生育する肉エキス・ペグ
トン液体 培地 よく生育するカゼイン・ミー
トエキス・ １ ペプトン寒天斜面培地 よく生育するカゼイン・ミー
トエキス・ ペプトン寒天平板培地 よく生育するペグトン液体培
地 よく生育するスターチ・ペグトン液体 培地 よく生育するグルコース・ペ
プトン筐 体培地 よ（生育するトリ１トン・イ
ーストエ キス寒天培地 よく生育するスターチ・イー
スト液体 培地 生育する （３３ ０．００１−リゾチー人中での生育３日目！で
は生育しないが、２週関目に一鉱生育する＠ （４Ｊ ７−食塩 生育する。
ｆＦｔ−用い、４０〜１５０時間培養し、その一部分ｔ
−１！：り寒天平板培養で菌株【分層した一ｏ１に訃寒
天平職培養の寒天濃度ｒ！ １．５１６であるＯＣＮＫ
Ｓ −２１ｊＩの１学的性質〕 （ａ） 形態 １１） 栄養細胞の大きさ ０．８ Ｘ １．６〜３．２ Ｐｍ Ｃ光学顕微−Ｉｌ
ｌ）０．７ ｘ ３．０ ＃Ｉｍ （電子１１１１１’
ｌｌ観ｍｌ ）（２１細胞Ｏ多形性 細胞が伸長し０．６〜１．０ Ｘ ４．５μ鋼になるこ
とあり （３）グラム染色性 陽性ではあるが脱色され易い （４） 這ｍｅ １ｐ （５）鞭毛 複数存在し、約８〜Ｉ Ｏｐｍの長さである０ （８７ｊ！ｌ子の形、大きさ 卵形、 ０．８ Ｘ １．２／＃Ｉ 内生胞子は細胞のや中鴫寄りのところに存在 （６１培地に訃ける生育状層 （１） ペプトン培地 ｐＨ ｐＨ９，５ ２０℃で％３０℃でも良く生育する０ ｐＨ７，２ ２０℃で４遅いが生育し、ｇｏ”ｃで は良（生育する・ 生育ｉ１度（ｐＨ９，５） 最高生育温度 ４１．５±０．５′″Ｃ最低生育温度
１６±１”Ｃ （２）他の培地 肉エキス・ペグトン寒天 斜面培地 よく生育する肉エキスのペグ
トン寒天 平板培地 よく生育する７−食塩存在肉
エキス・ ペプトン寒天平板培地 よく生育する肉エキス・ペグ
トン液体 培地 よく生育するカゼイン・ミー
トエキス・ １ ペプトン寒天斜面培地 よく生育するカゼイン・ミー
トエキス・ ペプトン寒天平板培地 よく生育するペグトン液体培
地 よく生育するスターチ・ペグトン液体 培地 よく生育するグルコース・ペ
プトン筐 体培地 よ（生育するトリ１トン・イ
ーストエ キス寒天培地 よく生育するスターチ・イー
スト液体 培地 生育する （３３ ０．００１−リゾチー人中での生育３日目！で
は生育しないが、２週関目に一鉱生育する＠ （４Ｊ ７−食塩 生育する。
（５７好気性で、嫌気的条件では生育しない〇（４＋１
生湯学的性質 ■ 硝酸塩ＯＲ元：遺元しない ■ ＶＰテスト：陰性 ■ インドールの生成：生成しない ■ デンプンの加水分解：加水分解する■ クエン酸の
利用：利用する ■ 色素の生成：生成しない ■ ウレアーゼ：１＊性 ■ チトクｐ−五オキシダーゼ：陽性 ■ カタラーゼ：陽性 Ｏｆ １ＩＸＫ対ｆＡｌＩ［：好ｆｉｌ！。
生湯学的性質 ■ 硝酸塩ＯＲ元：遺元しない ■ ＶＰテスト：陰性 ■ インドールの生成：生成しない ■ デンプンの加水分解：加水分解する■ クエン酸の
利用：利用する ■ 色素の生成：生成しない ■ ウレアーゼ：１＊性 ■ チトクｐ−五オキシダーゼ：陽性 ■ カタラーゼ：陽性 Ｏｆ １ＩＸＫ対ｆＡｌＩ［：好ｆｉｌ！。
■ Ｏ−Ｆテスト：弱いけれど尭簿する＠ 炭素源の利
用！！＝ ブドウ１ｌＩＯ利用について・・・最１２７ａ剰用しな
い、また１１２％生成しない、しかし２遍関目には利用
し、ａｇｔも生成する０アツビノースあるいはキシロー
スを有用し生育はするが酸生成はしない０！ン二トール
を含む培地に生育するが、５日位１で拡酸生成線しない
が、２遍関目に鉱酸生成【する・゛［相］ その他 中 フェニルアラニン脱アンノ作用：脱ア電ノ作用する （１１） カゼイン加水分解：加水分解する（ＩＩＵ
？ｏシン分解：分解する （ｄ）その他の性質 ■ 塩化ナトリウムの耐性＝７饅塩化ナトリウムで生育
する ■ スターチ・尿素筐体ｍ地では生育しない■ スター
チ−ｉｉｇｃ叡体培電体培地育しない本発ｇＡは以上の
知見に基づいてなされ７ｔ％ので。
用！！＝ ブドウ１ｌＩＯ利用について・・・最１２７ａ剰用しな
い、また１１２％生成しない、しかし２遍関目には利用
し、ａｇｔも生成する０アツビノースあるいはキシロー
スを有用し生育はするが酸生成はしない０！ン二トール
を含む培地に生育するが、５日位１で拡酸生成線しない
が、２遍関目に鉱酸生成【する・゛［相］ その他 中 フェニルアラニン脱アンノ作用：脱ア電ノ作用する （１１） カゼイン加水分解：加水分解する（ＩＩＵ
？ｏシン分解：分解する （ｄ）その他の性質 ■ 塩化ナトリウムの耐性＝７饅塩化ナトリウムで生育
する ■ スターチ・尿素筐体ｍ地では生育しない■ スター
チ−ｉｉｇｃ叡体培電体培地育しない本発ｇＡは以上の
知見に基づいてなされ７ｔ％ので。
前記バチルスｌ１ｇＮＫｓ−２１号薗の生産する新規ア
ルカリグロチアーゼＡＰＩ −２１並びにバチルス属Ｎ
ＫＳ−２１（！ｔｈ１１にアルカリ性培地に豪稙して皺
■【培養し、培養物よりアルカリグロチアーゼＡＰＩ−
２１ｔ−採取することを特徴とする。新規なアルカリグ
ロチアーゼＡＰＩ−２１の鯛造方法である。
ルカリグロチアーゼＡＰＩ −２１並びにバチルス属Ｎ
ＫＳ−２１（！ｔｈ１１にアルカリ性培地に豪稙して皺
■【培養し、培養物よりアルカリグロチアーゼＡＰＩ−
２１ｔ−採取することを特徴とする。新規なアルカリグ
ロチアーゼＡＰＩ−２１の鯛造方法である。
尚９本□発明に用−る微生物は前記バチルス属ＮＫＳ−
２１装置に限らず、その自然ｔｉｔは人為的変異株であ
っても本発明の後記の如き％ａ’を有するプルカリブロ
ティナーゼＡＰＩ−２１の生産性を有するＨＤｌｌｌｋ
然に包含されるｔのである０次に＊ｆｌｉＮＫＳ−２１
号１を培養して得られる本発明の新規なアルカリグロチ
アーゼＡＰＩ−２１について＊明する〇 培養条件として、培地としてｆｐ＃えはｐＨ８〜ｌＯに
ＩＩＩＩしたペプトン培ｊｌｋｔ用い上記ＮＫＳ −２
１−１！醒Ｖｉｌｌａ Ｌ好気的に振盪培養又は通気攪
拌培養等で行なわれる０内えば、１０“Ｃ〜４０＠Ｃで
４０〜１５０４関振盪培養する０培養終了後、培養愉よ
り菌体１分層し清澄な培養上清液を得たＯこの上清液に
例えばエタノールの如き有機溶剤！添加することにより
アルカリグロチアーゼＡＰＩ −２１１沈殿させた０沈
駿したアルカリグロチアーゼＡＰＩ−２１を遍心分層し
、真空凍結乾燥してアルカリグロチアーゼＡＰＩ −２
１ｇ嵩硼品會得る０このようにして得られたアルカリグ
ロチアーゼＡＰＩ −２１の活性は９次のように一定す
る０培養清澄１１［ｔＯ，１Ｍ炭酸ソーダ−０，１Ｍホ
ウ酸−塩化カリウム緩衝筐（ｐＨ１０，０）で適尚に希
釈した原０．５−にｐＨ１０，０Ｏ２饅建ルクカゼイン
溶液０．５ｍｌ加えて、３０℃で１０〜３０分障累反応
【させ逢り＃素反応の終了は０．２Ｍ酢酸−〇、２Ｍ酢
諏ソーダ緩衝液を含むＱ、ｌＪ／）！ｊクロル酢瞭２−
【加えて反応を停止畜せた・３０’Ｃ。
２１装置に限らず、その自然ｔｉｔは人為的変異株であ
っても本発明の後記の如き％ａ’を有するプルカリブロ
ティナーゼＡＰＩ−２１の生産性を有するＨＤｌｌｌｋ
然に包含されるｔのである０次に＊ｆｌｉＮＫＳ−２１
号１を培養して得られる本発明の新規なアルカリグロチ
アーゼＡＰＩ−２１について＊明する〇 培養条件として、培地としてｆｐ＃えはｐＨ８〜ｌＯに
ＩＩＩＩしたペプトン培ｊｌｋｔ用い上記ＮＫＳ −２
１−１！醒Ｖｉｌｌａ Ｌ好気的に振盪培養又は通気攪
拌培養等で行なわれる０内えば、１０“Ｃ〜４０＠Ｃで
４０〜１５０４関振盪培養する０培養終了後、培養愉よ
り菌体１分層し清澄な培養上清液を得たＯこの上清液に
例えばエタノールの如き有機溶剤！添加することにより
アルカリグロチアーゼＡＰＩ −２１１沈殿させた０沈
駿したアルカリグロチアーゼＡＰＩ−２１を遍心分層し
、真空凍結乾燥してアルカリグロチアーゼＡＰＩ −２
１ｇ嵩硼品會得る０このようにして得られたアルカリグ
ロチアーゼＡＰＩ −２１の活性は９次のように一定す
る０培養清澄１１［ｔＯ，１Ｍ炭酸ソーダ−０，１Ｍホ
ウ酸−塩化カリウム緩衝筐（ｐＨ１０，０）で適尚に希
釈した原０．５−にｐＨ１０，０Ｏ２饅建ルクカゼイン
溶液０．５ｍｌ加えて、３０℃で１０〜３０分障累反応
【させ逢り＃素反応の終了は０．２Ｍ酢酸−〇、２Ｍ酢
諏ソーダ緩衝液を含むＱ、ｌＪ／）！ｊクロル酢瞭２−
【加えて反応を停止畜せた・３０’Ｃ。
１０分以上放置後−紙管用９て一過し九◎−額１ｍＫ０
．４Ｍ炭酸ソーダ５−０５倍希釈のフェノール試薬ｌ−
を添加し、３０°０．２０分間放置して発色させたのち
６６０％鴇に２けるａ光度を一定する＠な＄１１−ａ
＄素単位は国ｌｌＩ酵素姿員会の「エンザイムノーメン
クレイチ＋−Ｊに従がい、３００Ｃで躍１０．０ｃ）１
−力（インを基質とし１秒間チｐシンｌ七ル相尚量の６
６〔鳩の発色を示すトリクロル酢敵可溶性物質ｔａ−す
るアルカリグロチア−ゼ量［１カタール（ｈｅａｌ ）
トする０次に不発明で得られるアルカリグロチアーゼ
ＡＰＩ−２１（以下「＊酵素」という）の理化学的性質
について述べる０ （υ 作用及び基質ＩＰ＃ＪＩＩ性 タンパク質、ＩＰＩｌえばカゼイン、ヘモグｑピン。
．４Ｍ炭酸ソーダ５−０５倍希釈のフェノール試薬ｌ−
を添加し、３０°０．２０分間放置して発色させたのち
６６０％鴇に２けるａ光度を一定する＠な＄１１−ａ
＄素単位は国ｌｌＩ酵素姿員会の「エンザイムノーメン
クレイチ＋−Ｊに従がい、３００Ｃで躍１０．０ｃ）１
−力（インを基質とし１秒間チｐシンｌ七ル相尚量の６
６〔鳩の発色を示すトリクロル酢敵可溶性物質ｔａ−す
るアルカリグロチア−ゼ量［１カタール（ｈｅａｌ ）
トする０次に不発明で得られるアルカリグロチアーゼ
ＡＰＩ−２１（以下「＊酵素」という）の理化学的性質
について述べる０ （υ 作用及び基質ＩＰ＃ＪＩＩ性 タンパク質、ＩＰＩｌえばカゼイン、ヘモグｑピン。
アルプ電ン、グロブリン、肉タンパク、魚肉−ンバク、
大豆タンパクなどを分解する０ （２）最適式 ｌＩ１図から明らかなようにｐＨＩ Ｏ〜１１に最適ア
Ｈ【有する０なｓｐｙ ＠対活性は次のようにして求め
る０ ＊＃素［５０ＩＩＩ４に０．５ ｗｌｌＤ台緩衝筐（醪
６〜９は０．１Ｍリン鹸−カリウムーｏ、ｏｓＭホウ験
ナトリクム：ｐＨ９〜１１はＯＩＭＲ駿ナトリクム−０
，１Ｍホク敞−塩化カリクム： ｐＺｆ １１〜１２は
０．１Ｍりン象二ナトリウムー臂性ノーダ）を含む２ｇ
６の４ルクカゼイ７１１１［ｔｍえて試験Ｓ＊ｔ−１Ｌ
、藺配方法により＃票力価ｔＳ＋定し、−１Ｏ１０にｊ
ＩＰ＃／′ｆる酵素力価！１００９Ｇとして相対活性を
求める０ （３） 安定ｐＨＩＩ囲 票２図から明らかなように本＃ＩＩＲはνＨ８〜１１．
５に安定ｐＨ範１ｍ管有するＯ この評価は次の方法に従う次Ｏ台種緩ｍ１ｌｌ （ｊ＃
３〜８は０．１Ｍクエン酸−０，２Ｍリン酸二ナトリウ
ム： ｊｉＺｆ ８〜１１．０は０．１Ｍ縦鹸ナトリウ
ムー０．１Ｍホウ讃−塙化カリウム： ｐＨ１１，０〜
１２．０は０．１５Ｍリン酸二ナトリクムー苛性ソーダ
）に基質として２チオルクカゼイン【添加し試験ｍｔｗ
製し７ｔｏＭ留水により透析した遍轟希釈の本酵素を含
む一素叡５０μｔｒｃｖｔ紀種々のｐＨの緩衝１１０．
５ｓｇｔ７１０えて、３０’Ｃで１０分間加熱した。澗
熱後、 ｐＨ１０，０の０．１Ｍ＊ｌＩ塩緩１１１［９
，５ｓｄｔ２１０え、Ｃれ【６種ｐＨ処理した酵素とし
。
大豆タンパクなどを分解する０ （２）最適式 ｌＩ１図から明らかなようにｐＨＩ Ｏ〜１１に最適ア
Ｈ【有する０なｓｐｙ ＠対活性は次のようにして求め
る０ ＊＃素［５０ＩＩＩ４に０．５ ｗｌｌＤ台緩衝筐（醪
６〜９は０．１Ｍリン鹸−カリウムーｏ、ｏｓＭホウ験
ナトリクム：ｐＨ９〜１１はＯＩＭＲ駿ナトリクム−０
，１Ｍホク敞−塩化カリクム： ｐＺｆ １１〜１２は
０．１Ｍりン象二ナトリウムー臂性ノーダ）を含む２ｇ
６の４ルクカゼイ７１１１［ｔｍえて試験Ｓ＊ｔ−１Ｌ
、藺配方法により＃票力価ｔＳ＋定し、−１Ｏ１０にｊ
ＩＰ＃／′ｆる酵素力価！１００９Ｇとして相対活性を
求める０ （３） 安定ｐＨＩＩ囲 票２図から明らかなように本＃ＩＩＲはνＨ８〜１１．
５に安定ｐＨ範１ｍ管有するＯ この評価は次の方法に従う次Ｏ台種緩ｍ１ｌｌ （ｊ＃
３〜８は０．１Ｍクエン酸−０，２Ｍリン酸二ナトリウ
ム： ｊｉＺｆ ８〜１１．０は０．１Ｍ縦鹸ナトリウ
ムー０．１Ｍホウ讃−塙化カリウム： ｐＨ１１，０〜
１２．０は０．１５Ｍリン酸二ナトリクムー苛性ソーダ
）に基質として２チオルクカゼイン【添加し試験ｍｔｗ
製し７ｔｏＭ留水により透析した遍轟希釈の本酵素を含
む一素叡５０μｔｒｃｖｔ紀種々のｐＨの緩衝１１０．
５ｓｇｔ７１０えて、３０’Ｃで１０分間加熱した。澗
熱後、 ｐＨ１０，０の０．１Ｍ＊ｌＩ塩緩１１１［９
，５ｓｄｔ２１０え、Ｃれ【６種ｐＨ処理した酵素とし
。
前記方法によｊ＃素刀価ｔｉｌｌｌ′１ｊｌＬ、輯１Ｏ
１０にかける＃素力価１１００ｓとして相対活性を求め
る。
１０にかける＃素力価１１００ｓとして相対活性を求め
る。
不１１１ｊりｌＩ２図に示すよ１（罐１０〜１１におい
て最も安定で、こＯｐＨ領域では完全に活性を保持した
１＼であった０また。ｊｌＺｆ８〜ＩＱでは８０−以上
の残存活性を示す０ （４）作用温度の範囲 累３図に示されるように本酵素は５〜６５°Ｃの範囲で
タンパク貿に作用するＯ最適１１度は４５〜５０＠Ｃで
ある０尚作用温度範囲は前記と同様ｐＨ１０，０で一定
を行りたＯ ＋ｓ） 失活の条件（温度安定性） ｌＩ４図に示されるように、本酵素ｆｉｐＨ１０゜１０
分間加熱処理による条件で４０°Ｃ１で扛活性が完全に
保持されるが、５０°Ｃでは大部分の活性を失う＠１！
た［８．１０分間の澗島処瑠の条件では４５ｏＣＪでｍ
ｓは保持されるがｓ ｏ’ｃで失活が始ｌす＃６０°Ｃ
で＃ｔソ完全に失活する０いずれにおいても基質ｔＳ加
しなｉで１０分間放置した場合である。
て最も安定で、こＯｐＨ領域では完全に活性を保持した
１＼であった０また。ｊｌＺｆ８〜ＩＱでは８０−以上
の残存活性を示す０ （４）作用温度の範囲 累３図に示されるように本酵素は５〜６５°Ｃの範囲で
タンパク貿に作用するＯ最適１１度は４５〜５０＠Ｃで
ある０尚作用温度範囲は前記と同様ｐＨ１０，０で一定
を行りたＯ ＋ｓ） 失活の条件（温度安定性） ｌＩ４図に示されるように、本酵素ｆｉｐＨ１０゜１０
分間加熱処理による条件で４０°Ｃ１で扛活性が完全に
保持されるが、５０°Ｃでは大部分の活性を失う＠１！
た［８．１０分間の澗島処瑠の条件では４５ｏＣＪでｍ
ｓは保持されるがｓ ｏ’ｃで失活が始ｌす＃６０°Ｃ
で＃ｔソ完全に失活する０いずれにおいても基質ｔＳ加
しなｉで１０分間放置した場合である。
（６）保存ＯｇＫ定性
本陣嵩は凍ｍｅるｉは凍蒙乾燥に対して安定である０凍
結乾燥標品／Ｉｉ重温（２１〜２２°Ｃ）で２週間放置
しても活性の損失は殆どなく、 ｆｌｌｌｌＪ＆ｔデシ
ケータ−に入れ該室温に保存すれば失活蝶食〈ない０ （７） 阻害および活性化 本ｄ＃素はジイソプロピルフルオロリンＩＩ ＜ＤＩＰ
Ｆ）中フェニルメタンスル７オニルフル＃ １７ ＶＣ
ＰＭＳＦ）などグロテアーゼの活性セリン残基阻害剤に
よって着しく阻害されるＱしかし、＊酵素性−物のセリ
ングロテアーゼであるキモト替ブタンの阻害剤であルト
シルーフェ二ル７？゛二ンーク罐セメチルケトｙ（ＴＰ
ＣＫ）Ｔｏるいはトリプシンの阻害剤であるトシル−替
シンークロ冒メチルケトン（ＴＬＣＫ）によって嬬全く
阻害されな％ＩＡＯＬかし、不鯵嵩社ベンジルオキシカ
ルボエル−フェニルアラニン−クロロメチルケトン＜Ｚ
ＰＣＫ）によって阻害管受ける０ ′ｔた。不＃素はパラクロｐ−マーキ畠すベンゾエート
＜ＰＣＭＢ）１０添加によって活性は金（影響を受けな
いし、またエチレンジアンンテトラアセテー） （ＩＩ
ＤＴＡ ）の温潤によつても活性は何ら影響されない＠
更ｒｃ、本＃素にペプスタチン【添加しても活性には何
ら影響しない０以上の阻害剤の実験結果より１本酵素は
活性中心にセリン残基【もクセリングロチアーゼである
ことが明白でめる〇婆ｊ 力価０＠定法 前記の如くである０ （旬 分子量 ゲルー過法によみ本＃累の分子量は、２２，０００であ
る。
結乾燥標品／Ｉｉ重温（２１〜２２°Ｃ）で２週間放置
しても活性の損失は殆どなく、 ｆｌｌｌｌＪ＆ｔデシ
ケータ−に入れ該室温に保存すれば失活蝶食〈ない０ （７） 阻害および活性化 本ｄ＃素はジイソプロピルフルオロリンＩＩ ＜ＤＩＰ
Ｆ）中フェニルメタンスル７オニルフル＃ １７ ＶＣ
ＰＭＳＦ）などグロテアーゼの活性セリン残基阻害剤に
よって着しく阻害されるＱしかし、＊酵素性−物のセリ
ングロテアーゼであるキモト替ブタンの阻害剤であルト
シルーフェ二ル７？゛二ンーク罐セメチルケトｙ（ＴＰ
ＣＫ）Ｔｏるいはトリプシンの阻害剤であるトシル−替
シンークロ冒メチルケトン（ＴＬＣＫ）によって嬬全く
阻害されな％ＩＡＯＬかし、不鯵嵩社ベンジルオキシカ
ルボエル−フェニルアラニン−クロロメチルケトン＜Ｚ
ＰＣＫ）によって阻害管受ける０ ′ｔた。不＃素はパラクロｐ−マーキ畠すベンゾエート
＜ＰＣＭＢ）１０添加によって活性は金（影響を受けな
いし、またエチレンジアンンテトラアセテー） （ＩＩ
ＤＴＡ ）の温潤によつても活性は何ら影響されない＠
更ｒｃ、本＃素にペプスタチン【添加しても活性には何
ら影響しない０以上の阻害剤の実験結果より１本酵素は
活性中心にセリン残基【もクセリングロチアーゼである
ことが明白でめる〇婆ｊ 力価０＠定法 前記の如くである０ （旬 分子量 ゲルー過法によみ本＃累の分子量は、２２，０００であ
る。
（１０） 等電点
エレタトａ７オーカシング法による＊酵素の勢電点扛躍
７．４である〇 紫外ｔａ収スペクトル ２７５乃至２８０ｐｍＫｇ大ａ収が存する０赤外＊ａ収
スペクトル 波数５ｓｏｏ。
７．４である〇 紫外ｔａ収スペクトル ２７５乃至２８０ｐｍＫｇ大ａ収が存する０赤外＊ａ収
スペクトル 波数５ｓｏｏ。
３０００．１６５０．１５５Ｇ、１４５０゜１４００及
び１２５０ ａｍ−’付近に主なａ収量が存するＯ （ｌυ 元素分析 不＃雪の如き高分子物質で元素分析を行い、炭素、水素
、ｉｉ素及び駅素Ｏ比管算出しても、その特性【示すこ
とは不可能であるため１元素分□析の調定は行りていな
い０ （１２ン アンノ酸組成 不＃素Ｏ主な＊ｇアミノ酸はアスパラギン酸。
び１２５０ ａｍ−’付近に主なａ収量が存するＯ （ｌυ 元素分析 不＃雪の如き高分子物質で元素分析を行い、炭素、水素
、ｉｉ素及び駅素Ｏ比管算出しても、その特性【示すこ
とは不可能であるため１元素分□析の調定は行りていな
い０ （１２ン アンノ酸組成 不＃素Ｏ主な＊ｇアミノ酸はアスパラギン酸。
スレオニン、′セリン、グロリ石グルＩ （／ ＩＩ
ｍグリシン、アラニン、バリン、ロイシンなどであるＯ 以上の結果から明らかなように、＊酵素は４？に低温に
２いて活性１ｍ持し、高温（５０’Ｃ以上ノでは失活し
ｐＨ１０〜１１に最適ｍｔ有する。
ｍグリシン、アラニン、バリン、ロイシンなどであるＯ 以上の結果から明らかなように、＊酵素は４？に低温に
２いて活性１ｍ持し、高温（５０’Ｃ以上ノでは失活し
ｐＨ１０〜１１に最適ｍｔ有する。
このような理化学的性質ｔｖｔＪａ本発明の＃ｊｌｅ・
公知の類似のアルカリグロチアーゼと比軟検討したＯ 従来、グラム陽性細−の細胞外アルカリグロチアーゼに
ついては、バチルス リッケ易７オル建ス（Ｂａａｔｌ
ｌ嚇１ｉルｅｎｉｆｏガ１１〕の生産するアルカリグ四
テアーゼ、バチルスズブチリス（Ｂａｅｉｌ１ｍｆｉ６
ｔｉｌｉａ ）の生産するアルカリグロチアーゼ（ズプ
チリシンノボン等が周知である０ これらの１１！）酵素はともに分子量が約２７，０００
〜３０．Ｇｏｏ、等電点ｐＨ９〜１１０！Ｉ化学的惟質
を有し、活性中心にセリン残！Ｆ４つセリングロテアー
ゼである０そのほかに報告されているバチルスの生産す
る細胞外アルカリグロチアーゼも分子量が２５，０００
〜ｓｏ、ｏｏｏ、勢電点が躍９〜１１）［１１１Ｙｔ有
するものが多い・そして以上ｅ）大−ｆｋｔｌｐＨ１０
、５０−Ｃ、１０分間０熱処１では失活しない性質のｔ
のである。バチルスＯ生産する低−分子量を有するアル
カリグロチアーゼトｔ、ては、バチルスＮｏ、Ｄ−６Ｇ
アルカリグロチアーゼＩニー１．Ｅ−２が公知であるが
０両者は共に分子量２０，００ ｏｏ＠素であり、共Ｋ
ｐＫ９．０゜５０°Ｃの熱処ｍ管しても活性は盆（低下
しない（特会昭５６−４２３６）ｏ更に他のバチルスの
生産するアルカリグロチアーゼとして、バチルスアルカ
ｏフィルスＮＣｌＢ１０４３６薦アルカリグロチアーゼ
、＄Ｊ１０４３８ｆｌｌアルカリグＵテアーゼが仰られ
ているが、これらはいずれも第１表に示すようにｐＨ１
Ｇ、５０°Ｃ，１０分間の熱処理において９〇−内外の
活！！！を保持する０更に前述のバチルスリツケエ７オ
ルンス一のアルカリグロチアーゼやバチルスズブチリス
１のアルカリグロチアーゼはｐＨｔｏ、ｓｏｏＣ，１０
分分間隔処理で７０〜８０ｓの活性′を有する（纂１表
）０ζＯように、従来公知のバチルスズブチリスｔはじ
めバチルス翼組１ｌｌＩの生産するアルカリグロチアー
ゼは比較的高い温度領域で安定である。しかるに。
公知の類似のアルカリグロチアーゼと比軟検討したＯ 従来、グラム陽性細−の細胞外アルカリグロチアーゼに
ついては、バチルス リッケ易７オル建ス（Ｂａａｔｌ
ｌ嚇１ｉルｅｎｉｆｏガ１１〕の生産するアルカリグ四
テアーゼ、バチルスズブチリス（Ｂａｅｉｌ１ｍｆｉ６
ｔｉｌｉａ ）の生産するアルカリグロチアーゼ（ズプ
チリシンノボン等が周知である０ これらの１１！）酵素はともに分子量が約２７，０００
〜３０．Ｇｏｏ、等電点ｐＨ９〜１１０！Ｉ化学的惟質
を有し、活性中心にセリン残！Ｆ４つセリングロテアー
ゼである０そのほかに報告されているバチルスの生産す
る細胞外アルカリグロチアーゼも分子量が２５，０００
〜ｓｏ、ｏｏｏ、勢電点が躍９〜１１）［１１１Ｙｔ有
するものが多い・そして以上ｅ）大−ｆｋｔｌｐＨ１０
、５０−Ｃ、１０分間０熱処１では失活しない性質のｔ
のである。バチルスＯ生産する低−分子量を有するアル
カリグロチアーゼトｔ、ては、バチルスＮｏ、Ｄ−６Ｇ
アルカリグロチアーゼＩニー１．Ｅ−２が公知であるが
０両者は共に分子量２０，００ ｏｏ＠素であり、共Ｋ
ｐＫ９．０゜５０°Ｃの熱処ｍ管しても活性は盆（低下
しない（特会昭５６−４２３６）ｏ更に他のバチルスの
生産するアルカリグロチアーゼとして、バチルスアルカ
ｏフィルスＮＣｌＢ１０４３６薦アルカリグロチアーゼ
、＄Ｊ１０４３８ｆｌｌアルカリグＵテアーゼが仰られ
ているが、これらはいずれも第１表に示すようにｐＨ１
Ｇ、５０°Ｃ，１０分間の熱処理において９〇−内外の
活！！！を保持する０更に前述のバチルスリツケエ７オ
ルンス一のアルカリグロチアーゼやバチルスズブチリス
１のアルカリグロチアーゼはｐＨｔｏ、ｓｏｏＣ，１０
分分間隔処理で７０〜８０ｓの活性′を有する（纂１表
）０ζＯように、従来公知のバチルスズブチリスｔはじ
めバチルス翼組１ｌｌＩの生産するアルカリグロチアー
ゼは比較的高い温度領域で安定である。しかるに。
不発明の酵素は先にその理化学的性質について述べたよ
うにｐＨ１Ｏ，１０分間加熱処理で４０’以下では安定
であるが、５０’Ｃで大部分の酵素活性を失う特徴を有
する０！たｐＨ８，１０分間加熱処ｍでｒｚｓｏ”ｃ＃
近で失活＄＃１ｍ５．６０”Ｃで活性は殆ど失われる◇
このような特徴的なｌ１ｌＲ安定性、２よび前述の分子
量並びに等電点の諸性質からみて１本酵累扛従米知られ
たバチルス翼組１の生産するアルカリグ信テアーゼのい
ずれともＡな７る別種のもので文献未紀歇である＠よっ
て１本障嵩ｔｔｒ規酵素と認定し、アルカリグはテアー
ゼＡＰＩ−２１と命名した。
うにｐＨ１Ｏ，１０分間加熱処理で４０’以下では安定
であるが、５０’Ｃで大部分の酵素活性を失う特徴を有
する０！たｐＨ８，１０分間加熱処ｍでｒｚｓｏ”ｃ＃
近で失活＄＃１ｍ５．６０”Ｃで活性は殆ど失われる◇
このような特徴的なｌ１ｌＲ安定性、２よび前述の分子
量並びに等電点の諸性質からみて１本酵累扛従米知られ
たバチルス翼組１の生産するアルカリグ信テアーゼのい
ずれともＡな７る別種のもので文献未紀歇である＠よっ
て１本障嵩ｔｔｒ規酵素と認定し、アルカリグはテアー
ゼＡＰＩ−２１と命名した。
本発明のｔｒ規な＃ｊｌｒ ＡＰＩ−２１Ｊｔ！、 以
上ｆｉべたようにｐＨ９〜ｌＯで安定で、最高活性ｔｐ
Ｈ１０〜１１位で最適活性を示すところより洗剤ビルグ
ーと混用可能でるる０従って洗剤用酵素として効果的＋
あるｏ４１に不ＨｇｒＡＰＩ−２１Ｊは従来の洗剤用＃
素に比し、比較的＠温（２０〜３０°Ｃ）でも高い相対
活性を維持する。従って。
上ｆｉべたようにｐＨ９〜ｌＯで安定で、最高活性ｔｐ
Ｈ１０〜１１位で最適活性を示すところより洗剤ビルグ
ーと混用可能でるる０従って洗剤用酵素として効果的＋
あるｏ４１に不ＨｇｒＡＰＩ−２１Ｊは従来の洗剤用＃
素に比し、比較的＠温（２０〜３０°Ｃ）でも高い相対
活性を維持する。従って。
我国にンけるように：１ＩＩｌ水で洗濯する！慣を有す
る国に２いて、＊酵素は一般家廁用洗剤の助剤としてｆ
ｆ１ｌするアルカリグロチアーゼとして、最も好ましい
タイプのもので６るｏ１１次近時においては、生活廃集
物あるい扛生活廃水中にタンパク質が増加する傾向にあ
るが、これら廃秦物処理あるいは汚水ＩＩ＆環の段階で
１本−素ｔ−利用することによりタンパク質の迅速な分
解を促がしｉ１素資諏の循環再利用が可能でＴｏるｏ１
１危１食品願工など食品工業へのプロテアーゼの利用に
際しては１本酵素を利用することにより、ｍ工利帛後５
０〜６００Ｃｓ度の比職的低いｓＩＩ！処濶にようて簡
単に酵素活性を失活させることができるｏｇｌりて１本
酵素扛１次加工食品の品質管ｌ上、効果的な酵素である
Ｏ 以下余白 次に本発明の夷ｌ／ＩＡＩＰＩＫついてｌ１ｌｌｌする
〇実施？Ｉ１１ 本発明のｒｒａ株ＮＫＳ−２１４１ｆｌｔ用い、この１
株の斜ｒＩＪ培餐智會殺■水に層濁畜せ、そＯ０，５ｓ
ｇｔａｔ＠とした０ ＃素生産培地にカゼインＩＬ（−トエ中スｌ−，ポリベ
グトンＩｌＧ、）よび縦置水嵩ナトリクム１ｓからなる
培地ｔ＊駿化ナトリクムにてｐＨ９，５ある輪は７．２
に調整し九〇 ロータリーシエイカーによる振盪培養（４）においては
、いずれもｐＨ９，５にＩＩＩＩした上記培地ｔ１を容
のエルレンマイヤー７ツスコ中にＺｏｏｍ。
る国に２いて、＊酵素は一般家廁用洗剤の助剤としてｆ
ｆ１ｌするアルカリグロチアーゼとして、最も好ましい
タイプのもので６るｏ１１次近時においては、生活廃集
物あるい扛生活廃水中にタンパク質が増加する傾向にあ
るが、これら廃秦物処理あるいは汚水ＩＩ＆環の段階で
１本−素ｔ−利用することによりタンパク質の迅速な分
解を促がしｉ１素資諏の循環再利用が可能でＴｏるｏ１
１危１食品願工など食品工業へのプロテアーゼの利用に
際しては１本酵素を利用することにより、ｍ工利帛後５
０〜６００Ｃｓ度の比職的低いｓＩＩ！処濶にようて簡
単に酵素活性を失活させることができるｏｇｌりて１本
酵素扛１次加工食品の品質管ｌ上、効果的な酵素である
Ｏ 以下余白 次に本発明の夷ｌ／ＩＡＩＰＩＫついてｌ１ｌｌｌする
〇実施？Ｉ１１ 本発明のｒｒａ株ＮＫＳ−２１４１ｆｌｔ用い、この１
株の斜ｒＩＪ培餐智會殺■水に層濁畜せ、そＯ０，５ｓ
ｇｔａｔ＠とした０ ＃素生産培地にカゼインＩＬ（−トエ中スｌ−，ポリベ
グトンＩｌＧ、）よび縦置水嵩ナトリクム１ｓからなる
培地ｔ＊駿化ナトリクムにてｐＨ９，５ある輪は７．２
に調整し九〇 ロータリーシエイカーによる振盪培養（４）においては
、いずれもｐＨ９，５にＩＩＩＩした上記培地ｔ１を容
のエルレンマイヤー７ツスコ中にＺｏｏｍ。
２００ｙｄ、３００ｄ入ｔＬ殺ｇ後９種１１０．ｌｓｍ
’ｉ添刀口し２０±１’Ｃの温度で２００９惰の振盪条
件でＮＫＳ −２１号−１４１，６５，８９の各時間培
養しアルカリグロチアーゼＡＰＩ−２１を生産させた〇
一方、往復振盪壇養（ト）においては、上記培地ｔｐＨ
９，５あるいはｐＨ’１．２にＩＩＩＥした培地Ｚｏ。
’ｉ添刀口し２０±１’Ｃの温度で２００９惰の振盪条
件でＮＫＳ −２１号−１４１，６５，８９の各時間培
養しアルカリグロチアーゼＡＰＩ−２１を生産させた〇
一方、往復振盪壇養（ト）においては、上記培地ｔｐＨ
９，５あるいはｐＨ’１．２にＩＩＩＥした培地Ｚｏ。
ｍｔ−５００−容の板目７ツスコに入れ駿薗後９種１１
０．５ｍ１−接種し３０’Ｃで往復振盪培養愛し危。
０．５ｍ１−接種し３０’Ｃで往復振盪培養愛し危。
ｙＩＪｒ定の時間培養した培養物を２８０００ＸＦ。
１５時間達６分■をし一体を分層し清澄な培養上清ａｔ
得九〇得られたすれヤれの培養土清液中のアルカリグロ
チアーゼＷＩ性ｔｍ記グロテアーゼ活性測定法に従って
欄定し１次の結果を得た・Ａ：”Ｊり振盪層重法（２０
＠Ｃ，ｊｌｌ地の初発ｐＨ９，８） 以上の＃ｉｌ来、不酵素生産のための小規模培養におい
ては、１を審エルレンマイヤーフラメコ中に３００−の
上記培地を入れ、２０°Ｃでロータリーシェカーにより
振盪培ＩＩ（１４Ｊすると６ｓＷＩ＃間で最高の比活性
ならびに最高のグｐテアーゼ生慶量が得られた。
得九〇得られたすれヤれの培養土清液中のアルカリグロ
チアーゼＷＩ性ｔｍ記グロテアーゼ活性測定法に従って
欄定し１次の結果を得た・Ａ：”Ｊり振盪層重法（２０
＠Ｃ，ｊｌｌ地の初発ｐＨ９，８） 以上の＃ｉｌ来、不酵素生産のための小規模培養におい
ては、１を審エルレンマイヤーフラメコ中に３００−の
上記培地を入れ、２０°Ｃでロータリーシェカーにより
振盪培ＩＩ（１４Ｊすると６ｓＷＩ＃間で最高の比活性
ならびに最高のグｐテアーゼ生慶量が得られた。
ＮＫＳ−２１号１１ｔ３Ｇ”ｃ″ｒ”往復振盪培養（５
）するとき、培地の初見はｐＨが９．５のみならず式７
．２でもＮＫＳ−２１９１の生胃は良好であり、そして
１次アルカリグ電テアーーｋＦＡＰＩ−２１０：）生産
も高いＪｉＩ乗が得られ九〇培地の初発式が９．５のみ
ならず、 ｐＨ７，２テＮＫ＆ −２１１ＪＩｆｔｊｌ
ｌｌｔ！場合。
）するとき、培地の初見はｐＨが９．５のみならず式７
．２でもＮＫＳ−２１９１の生胃は良好であり、そして
１次アルカリグ電テアーーｋＦＡＰＩ−２１０：）生産
も高いＪｉＩ乗が得られ九〇培地の初発式が９．５のみ
ならず、 ｐＨ７，２テＮＫ＆ −２１１ＪＩｆｔｊｌ
ｌｌｔ！場合。
培養温度は２０°ＣＯ往復振盪ｊＩＩ１１１も、３Ｇ’
Ｃ墳養の場合とＳ似の結果が得ｈａた・ 上記のような操作により得たＮＫＳ−２１号−の培養後
の遠心分層上清１１７ｔｆ３°ＣｔＣ冷却し、これＫｌ
）３６ＣＫ冷却して訃いたエチルアルコールを加え生成
した沈殿を冷却遣る分廟磯で１１．Ｇｏ。
Ｃ墳養の場合とＳ似の結果が得ｈａた・ 上記のような操作により得たＮＫＳ−２１号−の培養後
の遠心分層上清１１７ｔｆ３°ＣｔＣ冷却し、これＫｌ
）３６ＣＫ冷却して訃いたエチルアルコールを加え生成
した沈殿を冷却遣る分廟磯で１１．Ｇｏ。
ｘｙで遠心分離し、たたちに真空凍結乾ｆａさせ酵素粉
末ＩＳ、７ｆｌｆ得た０タンパク質ｌ−崗９のアルカリ
グロチアーゼの比活性ｔ２０．７１マイクロヵターｋ
（０，７１ｐｋａｔａｌ ７Ｋｇ ｏ ｐ ｙＡＩ質）
テ＠９、回収＊は３３ｆＩＩで６りた＠タンパク質は
ロー替−流によｐ鉤定し九〇 このようにして調製した凍結乾燥酵素標品上〇−２＆＊
塩ｔｔｔｒ０．０１ ＭＩｅＨｆトリウム−ホウ駿−塩
化カリウＡＩＥＩＩ［Ｃｄ １０．０ ） Ｋ溶解り。
末ＩＳ、７ｆｌｆ得た０タンパク質ｌ−崗９のアルカリ
グロチアーゼの比活性ｔ２０．７１マイクロヵターｋ
（０，７１ｐｋａｔａｌ ７Ｋｇ ｏ ｐ ｙＡＩ質）
テ＠９、回収＊は３３ｆＩＩで６りた＠タンパク質は
ロー替−流によｐ鉤定し九〇 このようにして調製した凍結乾燥酵素標品上〇−２＆＊
塩ｔｔｔｒ０．０１ ＭＩｅＨｆトリウム−ホウ駿−塩
化カリウＡＩＥＩＩ［Ｃｄ １０．０ ） Ｋ溶解り。
同緩衝液で平衡化した七ファデックスＧ−７５のカラム
（２ａｍＸ７４傷〕によりゲルｆＩ通【行ない。
（２ａｍＸ７４傷〕によりゲルｆＩ通【行ない。
１１１ｔＢ額ｔ３−ずつ分画した０タンパク寅はローリ
−法により、アルカリグロチアーゼ活性は上述のように
％Ｈ１ＧでＩＩｌ′ｉｊ！した０以上の操作にょｐ精製
−嵩を得た◎比活性は約１０倍上昇し、タンパク質１−
轟たりの比活性は７．０マイク費力！−ルで６つ次０回
収率は７０チでありた。
−法により、アルカリグロチアーゼ活性は上述のように
％Ｈ１ＧでＩＩｌ′ｉｊ！した０以上の操作にょｐ精製
−嵩を得た◎比活性は約１０倍上昇し、タンパク質１−
轟たりの比活性は７．０マイク費力！−ルで６つ次０回
収率は７０チでありた。
実總例２
アルカリグ京テアーゼ生産ＭＮＫＳ−ｚ１号−會用い、
５０〇−発酵タンクによるアルカリグロチアーゼＡＰＩ
−２１生童とそれに続く酵素削の製造！行なった・＃禦
生産培地はカゼイン１１１． イードエキス１饅、ポリ
ベグトン１＃ｓ、炭鍍水嵩ナトリクムｌ−からなる培地
【、水酸化ナトリウムにより駈９．５ に調査した０上
記の培地【オず１を容のエルレンマイヤーフラスプｌｃ
３ＧＧｍ＠７１ＯＬ殺■後、実線Ｍｌで述べた如く穏■
０．５−を加え。
５０〇−発酵タンクによるアルカリグロチアーゼＡＰＩ
−２１生童とそれに続く酵素削の製造！行なった・＃禦
生産培地はカゼイン１１１． イードエキス１饅、ポリ
ベグトン１＃ｓ、炭鍍水嵩ナトリクムｌ−からなる培地
【、水酸化ナトリウムにより駈９．５ に調査した０上
記の培地【オず１を容のエルレンマイヤーフラスプｌｃ
３ＧＧｍ＠７１ＯＬ殺■後、実線Ｍｌで述べた如く穏■
０．５−を加え。
２０°Ｃで３日間培養した０この培養１１［１ｊを予め
上記の培ｊｌｋｌ ｔｋ含む殺菌した８０１９−ｖ−７
丁メンーー中に−１し、２０℃で３日間通気攪拌培ｑＩ
ＩＹｔシた＠攪拌は４００９愼１通気は１２１７分であ
った・３０を容シマー７アメンターで３日培養した培１
１１［３０Ａを無菌的に予め殺菌した２００ｔの上記培
地を含む５ｏｏｔ容Ｏ発酵タンクに移し、２０°Ｃで４
日間の通気攪拌培養【した。攪拌は４００１鴇、通気な
２００ ｔ／需偽であった〇培ｌＩ終了後、培養物ｔｉ
Ｉ？＃逐統遠心分−機により１１．０ＯＯＸｆで遠心分
離し菌体を除去し清澄な培養土清液２００ｔｔ得九〇培
養上清ＩＩ！ｔ３°Ｃに冷却し、これに予め３°Ｃに冷
却し危２倍量のエチルアルコールを加えアルカリグロチ
アーゼＡＰＩ−２１【沈殿させた・沈殿したアルカリグ
ロチアーゼＡＰＩ −２１は冷却！ｌ！遠心分層機で約
１１，０００×ｔで遠心分１１Ｌ、直ちに真空凍結乾燥
をシ１次に示す凍結乾燥アルカリブ鴛テア−４１ＡＰＩ
−２１ｓａｇｌＩ＆を得た〇 鋤収簿素重量Ｃｆ） １２３０比活性（マ
イク党カタール／Ｅｆ） ０．５２回収率（５１）
７０上記で得た酵素標品を実線９９
１に従うて精製したところ１分子量２２０００．等電点
ｐＨ７，４のアルカリグロチアーゼが得られた０このア
ルカリプロテアーゼの酵素標品Ｂ、ｐＨ１０で５０’Ｃ
。
上記の培ｊｌｋｌ ｔｋ含む殺菌した８０１９−ｖ−７
丁メンーー中に−１し、２０℃で３日間通気攪拌培ｑＩ
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った・３０を容シマー７アメンターで３日培養した培１
１１［３０Ａを無菌的に予め殺菌した２００ｔの上記培
地を含む５ｏｏｔ容Ｏ発酵タンクに移し、２０°Ｃで４
日間の通気攪拌培養【した。攪拌は４００１鴇、通気な
２００ ｔ／需偽であった〇培ｌＩ終了後、培養物ｔｉ
Ｉ？＃逐統遠心分−機により１１．０ＯＯＸｆで遠心分
離し菌体を除去し清澄な培養土清液２００ｔｔ得九〇培
養上清ＩＩ！ｔ３°Ｃに冷却し、これに予め３°Ｃに冷
却し危２倍量のエチルアルコールを加えアルカリグロチ
アーゼＡＰＩ−２１【沈殿させた・沈殿したアルカリグ
ロチアーゼＡＰＩ −２１は冷却！ｌ！遠心分層機で約
１１，０００×ｔで遠心分１１Ｌ、直ちに真空凍結乾燥
をシ１次に示す凍結乾燥アルカリブ鴛テア−４１ＡＰＩ
−２１ｓａｇｌＩ＆を得た〇 鋤収簿素重量Ｃｆ） １２３０比活性（マ
イク党カタール／Ｅｆ） ０．５２回収率（５１）
７０上記で得た酵素標品を実線９９
１に従うて精製したところ１分子量２２０００．等電点
ｐＨ７，４のアルカリグロチアーゼが得られた０このア
ルカリプロテアーゼの酵素標品Ｂ、ｐＨ１０で５０’Ｃ
。
１０分間の熱処理により不安定な、低温活性型の本発−
のアルカリグロチアーゼＡＰＩ−２１であつた０
のアルカリグロチアーゼＡＰＩ−２１であつた０
Ｉ１１図蝶本発明の酵素の最適躍會示すグラフであり。
第２図は不発明の酵素のｊＨ安定性管示すグラフであり
。 ５１１１図は不発明の酵素の作用温度間８訃よび最適温
度を示すグラフであｐ。 １１４図（イ）訃よび第４図（口］拭、それぞれ本発明
の＃累のｐＨＩ ＯおよびｐＨ８における温度安定性を
示ナグラフである〇 特許出願人 昭和電工株式金社 特許出願代理人 ９Ｐｍ士 實 木 朗 弁理士 西舘和之 弁理士 石臼 敬 ５？場± 山口昭之 第１図 Ｈ 第２図 第３図 ４９４− 第４図（イ） 温度（’Ｃ） ０ １０ ２０ ３０ ４０ ５０
６０温度（℃） 手続補正書（自発） 昭和ｓ８年５月η 日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第１７１５９６号 ２、発明の名称 新規な細菌アルカリグロチアーゼ及びその製造方法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 （２００）昭和電工株式会社 ４、代理人 住所 〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０４＃（
外３名） ５、補正の対象 ６、補正の内容 １）明細書全文を別紙の過少補正する。 ２）図面（第５図）を別紙の通夛補正する。 ７、添付書類の０鎌 ｌ）全文補正明細書 １通２）図面（第５
図） １過 食文補正明細書 １、発明の名称 新規な細菌アルカリプロテアーゼ及びその製造方法 ２、特許請求の範囲 １、下記の（１）ないしＯ）の理化学的性質を有するア
ルカリゾロテア−ゼムＰＩ −２１６（１）作用 最適−範囲が１０〜１１であるアルカリ性領域でカゼイ
ンを加水分解し、その最適作用温度が４５〜５０℃であ
る。 （２） 安定性 ｐ）（１０，１０分間の加熱処理による酵素活性の低下
は、４０℃まで認められないが、５０℃ではその９０１
以上の活性が失われ、ＰＨ８，１０分間の加熱処理の場
合５０℃で失活が始ｊＪ）、６０℃ではほぼ完全に失活
する。アルカリ性（４１に一戸１〜１１．５）で安定で
あシ、凍結ならびに凍結乾燥に対して安定である・。 （３）酵素分子 ｒルー適法にて測定した分子量が２２．０００：等電点
が７．４：紫外線吸収スペクトルが２７５乃至２８２
ｍｍＫ極大吸収を有し：第５図に示す赤外線吸収スペク
トルを有し；活性中心にセリン残基を有する蛋白質であ
る。 ２、バチルス属に属しアルカリゾロテア−ぜＡＰＩ−２
１を生産する新菌種バチルス属ＮＫ８−２１号薗をアル
カリ性培地に接種して培養し、培養物よりアルカリ側に
最適−を有するアルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１を採
取することを特、徴とする新規なアルカリグロチアーゼ
ＡＰＩ −２１の製造方法。 ３、発明の詳細な説明 本発明は、新規なアルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１及
びその製造方法に関し、更に詳しくはアルカリ性の条件
下、比較的低温度（室温〜約４０℃）にても酵素活性を
有する細菌アルカリデロテアー−に＃ＡＰＩ −２１ｍ
ヒに新菌種ハｆ ｋ ス属ＮＫ ８−２１を培養するこ
とによりて生産される該アルカリグロチアーゼＡＰＩ
−２１の製造方法に関する。 アルカリプロテアーゼ社一般に熱く対して中性プロテア
ーゼよシも安定である丸め、その用途も皮革加工用、食
品工業用、繊維工業用あるいは医薬としての応用勢、広
範１！にわたうている。ｔた、近年では洗剤添加用酵素
の需ｌＦが増大している。 このような洗剤添加用酵素として実用に供されているも
のは殆んどバチルス属細菌のアルカリグロチアーゼであ
り、高温度高活性型の酵素である。 すなわち、これら公知の酵素は通常ｐＨ９〜１０附近に
至適作用条件を有し、高温度特に６０°付近に最高活性
を有し、低温度４１Ｋｍ％付近では酵素活性が極めて低
いものが多い、そのため我国における如く室温で洗濯を
行なう習慣のある国では、十分に上記酵素の特性は発揮
されていない。又、最近における熱に比較的弱い化学繊
維の増加、あるいは省エネルギーの観点からもよシ低い
温度でも高い活性が保持される酵素の開発が要求されて
いる。 本発明者は、かかる状況に鑑みよシ低温度で最高活性値
を有する細菌アルカリグロチアーゼを得ることを目的に
、各種土壌中よシアルカリプ′−テアーゼ生意薗を検索
した結果、土壌より分離し九バチルス（Ｂａｅｌｌｌｕ
ｓ）属に属する新菌種、バチルス属ＮＫ８−２１（Ｂａ
ｅｉｌｌｔ＋ｍ ｍｐ、ｎｏｖ、ＮＫｓ−２１、以下単
ＫＮＫＳ−２１号薗という）が上記目的に合致した新規
アルカリグロチアーゼを培地中に生産することを見出し
、この知見に基づき本発明を完成したものである。 すなわち、本発明におけるアルカリグロチアーゼＡＰＩ
−２１を生産する菌株はその菌学的性質より好気性有
胞子細菌であシ・クチルス属に属する新菌種であること
が判明した。以下、これについて詳しく述べる。尚、同
定にあたっての蘭学的緒性質の試薬および分離方法は「
パージニーズ マニ島アル オプ ブタ−２ネイデイプ
バクテリオｃＩジー」第８版（１９７４年）の記載に
基づいて行なった。 本発明における菌株ＮＫ８−２１号薗は、前述の如く好
気性有胞子細菌であシパチルス属に属することが明らか
である。而して本曹株の極めて特異的性状として中性の
培地でもアルカリ性の培地でも生育するが、４１にアル
カリ性の培地において非常に良く生育し、最適生育条件
としてのμ値が８〜１０である点があげられる。このよ
うな性質に近似した公知の菌株としてバチルス Δスラ
リー（Ｂａｃｌｌｌｕｓ ｐａｍｔ＠ｕｒｉｌ）、およ
びバチルス アルカセフ４Ｊｋス（Ｂａｃｉｌｌｕｓム
ｌａａｌｏｐｈｉｌａｍ ）、が挙げられる。しかるに
１本発明における菌株ＮＫＳ−２１号薗は、上記の菌種
とその菌学的性質において一部一致する点もあるが異な
る特性をも有し、それらと別異の菌株であ夛文献未記載
の新菌種である。 スナワチ、バチルス ノ９スツＩ）−’トバチルスアル
カロフィルスはともにアルカル性声域で生育する菌であ
り、特にバチルス アルカロフィルスはｐＨ７では生育
できない特性を有する。一方、ＮＫＳ−２１号薗はアル
カリ性−でよく生育するが、中性−においてもよく生育
し、この点においてバチルスアルカロフィルスと異なる
。又、バチルスＡスツリーはデンプンを加水分解しない
がＮＫＳ−２１号薗はデンプンを加水分解する。更に、
パチルスノ４スツリーは硝酸塩を還元するが、ＮＫＳ−
２１号薗は還元しない、又、その形態において社バチル
スノ譬スツリーは、内生胞子が球形かやや楕円形である
が、ＮＫＳ−２１号菌の内生胞子は卵形である。又、バ
チルスノタスツリーは尿素を分解するが、ＮＫＳ−２１
号曹はこれを分解しない。 以上の菌学的性質の差異によシ、ＮＫＳ−２１号菌はバ
チルスノ臂スツリーとは明らかに別異の種である。 バチルスアルカロフィルスの菌株についての詳細な分類
学的記述に関しては、前記「パージニーズ マニュアル
オプ デターミネイティプ パクテリオロゾー」には
見当たらず、不備である。 まり、バチルスアルカロフィルスの標準様は存しない、
従りて同書記載のオリジナル株であるパチルスアルカロ
フイルスＮＣＩＢ １０４３６株および同ＭＣｌ８１０
４３８株と４Ｃ）いて比較し九。ＮＣｌＢ１０４３６株
およびＮＣＩＢ １０４３８株の両菌株ともグラム染色
性は陽性であるが僅かであシ、脱色され易い性質を有す
る。同様ＫＮＫＢ−２１号薗もグラム染色性は陽性であ
って脱色され謳い、ｔた、栄養細胞の形態に関してはＮ
ＣｒＢ １０４３６株は０．７Ｘ２．Ｏμの短桿曹と０
．８Ｘ４．６μの長桿菌とが電子顕微鏡下で観察され、
一方ＮＣＩＢ １０４３８株の栄養細胞の大きさは０．
７ＸＩＪ声である。しかるＫＮＫ８−２１号上の栄養細
胞の大きさは０．６〜０．８Ｘ２．５〜３．５μ（電子
顕微鏡観察）であシ、胞子の形状は卵形でその大きさは
０．８Ｘ１．２声である。まえ、運動性ＫＩＩＬＮＣＩ
ＩＩ １０４３６株及び同１０４３８株はそれが鋼察さ
れないのに対し、ＮＫＢ−２１号薗は運動性がある０次
に生理的性質について、バチルスアルカ−フィルスはマ
ンニトール培地に生育しないが、ＮＫＢ−２１号薗は生
育する。またＮＣＩＢ １０４３６株は７１食塩中で生
育しないが、ＮＣ１１１０４３８株は生育する。ＮＫＳ
−２１号菌は７−食塩水で生育する０以上の結果からＮ
ＫＳ−２１１）１１ｔｉ、’４チルスアルカロフイルス
ＮＣＩＢ １０４３６株と同１０４３８株とは一部その
性質が近似するが、総体的に両者から区別することがで
き別異の菌である。 更に、ＮＫＢ−２１４［と）４チルス・ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｍ ）とは、／４ｆル
ス・ズブチリス栄養細胞の大きさは巾０．７−Ｑ、１１
声、長さ２−３声であυ、デンプンを公憤する点にお
いて類似する。しかるにバチルス・ズブチリスはｐ）１
５．５〜８．５で生育が活発であるが、ＮＫＢ−２１号
１力寛生育する一９〜ｌＯで杜生育でＩｔい、さらにノ
（チルス・ズブチリスの生育最高温度は４５〜５５℃に
あるが、ＮＫＢ−２１号菌性４３℃を超えた温度では生
育できない点で明らかに異るなどから、ＮＫＳ −２１
号１１は明らかに）ｆチルスズブチリスとは別の種であ
る。 以上述べえように、ＮＫＢ−２１号薗はその菌学的性質
から近似の性質を有する公知の菌株／ｆチルスパスツリ
ー、バチルスアルカロフイ・リスオヨヒノ櫂チルス・ズ
ブチリスとは区別され、上記のノ童−ジェーズ・マエ、
アルに記載されていｂ既知の種のいずれとも異なる故新
曹種に属するととカ監明白である。よって、本曹を新薗
１１／ｆチルス属ＮＫ８−２１号菌と同定した。 該新菌種バチルス属ＮＫト２１号薗は、特許手続上の微
生物の寄託の国際的承認に関するプダ（スト条約に基づ
き昭和５７年２月３日附工業技術院微生物工業技術研究
所へ国際寄託され、受託番号は、微工研条寄第９３号で
ある。 以下に、ＮＫＢ−２１号上の曹学的諸性質を記載する。 カお、以下に記載する薗学的諦性質の試験および分離方
法は前記「・譬−ジニーズ マニュアル オプ デタミ
ネイティブ ）母りテリオロジー」（］９９４４年Ｋ基
づいて行量った。 土壌中より菌の分離について１次の方法によつ九、即ち
、土壌塊の少量をペプトン培地に添加し、ｐＨ７〜１０
、温度１０〜４０°の領域で振盪培養器を用い、４０〜
１５０時間培養し、その一部分をとり寒天平板培養で菌
株を分離し友、なお寒天平板培養の来天濃度は１．５チ
である。 ［ＮＫＳ −２１菌性の菌学的性質］ ＜ａ＞ 形態 （１） 栄養細胞の大きさ ０．６〜０，８Ｘ２．５〜３，５μ （ｚ） ＠砲Ｏ多形性 細胞が伸長し０．６〜１．０Ｘ４．５μ濯になることあ
り （３）グラム染色性 陽性ではあるが脱色され易い （４）運動性 あり （５）鞭毛 馬毛が複数存在し、約８〜１０４の長さである （６）胞子の形、大きさ 卵形、０、Ｂｘｌ、２．ｇｍ 内生胞子性細胞のやや端寄シのところに存在（ｂ）
培地における生育状態 （１）ペプトン培地 声 ｐｌ（９，５ ２０℃でも３０℃でも良く生育する 一Ｈ７，２ ２０℃では遅いが生育し、３０℃では良く生育する 生育温度（ｐＨ９，５） 約１４〜４１Ｔ、の温度範囲で生育し、温度が４３℃を
超えた９、１２℃未清では生育しない （２） 他の培地 肉エキス・４７”）ン寒天斜面培地 よく生育する 肉エキス・イブトン蜂天平板培地 よく生育する ７１Ｇ食塩存在肉エキス・−４ｆ）ン 寒天平板培地 よく生育する肉エキ
ス・ペプトン液体培地 よく生育する カゼイン・ミートエキス・ペット ン殊天斜面培地 よく生育するカゼイン
・ミートエキス・ペット ン庫大平板培地 よく生育するカゼイン
・オートエキス・ペット ン濱体培地 よく生育するスター
チ・−６７”）ン液体培地 よく生育する トリプトン・イーストエキス寒 天培地 よ〈生育する肉汁ゼ
ラチン穿刺培養 （ｉ）ｐｉ（ｘｏ、ｏ ３ｏｔ培讐；生育、液化（ｉ
）ＰＨ１０，０２ｏ℃培養：表ｍｔ上テ弱＜１青し、弱
く液化 （ｉｉｉ）ｐＨ７，２３０’ｅ培１１：生！、液化（Ｉ
Ｖ）ｐＨ７，２２０’Ｃｊｌｔ養：表ｍ上テｌｌ＜１青
し、弱く液化 （３）好気性で、嫌気的条件では生育しない（ｅ）
生理学的性質 ■ 硝酸塩の還元：還元しない ■ ｖｐテスト：陰性 ■ インドールの生成：生成しない ■ デンプンの加水分鱗：加水分解する■ クエン酸の
利用：利用する ■ 色素の生成：生成しない ■ ウレアーゼ：陰性 ■ チトクロームオキシターゼ：ｌ！）性■ カタラー
−に＃：陽性 ［相］ 酸素に対する態度：好気性 ■ Ｏ−Ｆテストニーいけれど発酵する＠ 硝酸塩から
の嫌気性でガスの発生：陰性［相］ ＭＲテスト：陰性 ■ 硫化水素の生成−生成しない ［相］ 無機窒素源の利用：硝酸塩及びアンモニウム塩
を利用する ［相］ 糖類からの駿及びガスの生成：Ｌ−アラビノー
ス −− Ｄ−キシロース −− Ｄ−グルコース 十 − Ｄ−マンノース 十 − Ｄ−フラクトース −− Ｄ−ガラクトース 十 −麦芽糖 十
− 蔗 糖 十 −乳 糖
−トレハロース ＋ Ｄ−ノルビット十− Ｄ−マンニット ＋ イノジット ＋ − グリセリン 十 − デンプン 十 − りが−ス −− ラフィノース ＋ − セルビオース 十 − ■ その他 （＋）７ａｃニルナラニン脱アミノ作用：脱ア電ノ作用
する （：ｉ）カゼイン加水分解：加水分解する（ｉｉｉ）チ
ロシン分解二分解する 本発明は以上の知見に基づいてなされたもので、前記バ
チルス属ＮＫＳ−２１号薗Ｏ生産する新規アルカリプロ
テアーぜＡＰＩ−２１並びにバチルス属ＮＫＳ−２１号
薗をアルカリ性培地に接種して該薗を培養し、培養物よ
りアルカリグロチアーゼＡＰＩ−２１を採取することを
特徴とする、新規なアルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１
の製造方法である。 尚、本発明に用いる微生物は前記バチルス属ＮＫＳ −
２１号薗に限らず、その自然または人為的変異株であっ
ても本発明の後記の如き特性を有するアルカリプロテア
ーゼＡＰＩ −２１の生産性を有する限シ当然に包含さ
れるものである。 次に本薗ＮＫＳ−２１号薗を培養して得られる本発明の
新規なアルカリグロチアーゼＡＰＩ−２１について説明
する。 培養条件として、培地として例えば−８〜１０に調整し
たペプトン培地を用い上記ＮＫＳ−２１号菌を接種し好
気的に振盪培養又は通気攪拌培養等で行なわれる。例え
ば、１５℃〜４０℃で４０〜１５０時間振盪培養す６・
培ｑ！！竺了後・培養物よシ菌体を分、離し清澄な培養
上清液を得た。この上清液に例えばエタノールの如き有
機溶剤を添加することＫよシアルカリグロテアーゼＡＰ
Ｉ−２１を沈殿させた。沈殿したアルカリプロテアーゼ
ＡＰＩ−２１を遠心分離し、真空凍結乾燥してアルカリ
７’０テ７−ゼＡＰＩ−２１酵素標品を得る。 このよう圧して得られたアルカリグロチアーゼＡＰＩ−
２１の活性は、次のように測定する。 培養清澄液を０．１Ｍ炭酸ソーダ−０，１Ｍホウ酸−塩
化カリウム緩衝液（ｐＨｔｏ、ｏ）で適当に希釈した液
ｏ、 ｓ ｄＫｐＨ１０，Ｏの２チミルクヵゼイン溶液
０．５ ｍを加えて、３０℃で１０〜３０分酵素反応を
させた。酵素反応の終了は０．２Ｍ酢酸−０，２Ｍ酢酸
ソーダ緩衝液を含む０．１ Ｍ ） リクロル酢酸２ｄ
を加えて反応を停止させ九、３０℃、１０分以上放置後
−紙を用いて一過した。Ｐ液ｌｉｄに０．４Ｍ炭酸ソー
ダ５−１５倍希釈の７Ｊｃノール試薬ｌｌｌ７を添加し
、３０℃、２０分間放置して発色させたのち６６０ｈ惰
における吸光度を測定する。 なお、酵素単位は国際酵素−貴会の「工ンディムノーメ
ンクレイチャー」に従がい、３０℃で−１０，０の１１
カゼインを基質とし１秒間チロシン１そル相当量の６６
０ ａｍ□発色を示すトリクロル酢酸可溶性物質を遊離
するアルカリプロテアーゼ量を１カタール（ｋａｔａｌ
）とする。 以下余白 次に本発−で得られるアルカリグロチアーゼムＰＩ−２
１（以下ｒ本酵素」という）０１１化学的愉質にりいて
違ぺる。 （１） 作用及び基質畳異法 タンΔり質０例えばカゼイン、へ峰ダＩｔ Ｖ ：／
＠アルｆ電ン、ダＩ！プリン、崗タンー１４タ、魚肉′
タンΔタ、大夏タンΔりなどを分欝する。 （２）最適− 第１閣から―らかなように４１０−１１に最適−を有す
る・なお、 ｓｔＩＩｍ性は次のようにして求める。 本酵素１１＠０ＩＩＩＩＫ（１，５１１ＪＫ）４に緩衝
液（４６〜Ｉは０．１Ｍ９ン酸−カリウム−（ＬＪＩＭ
ホウ酸ナトリウム；ｆ１９〜１１は＆ＩＭ嶽酸す・トリ
ウム−０，１Ｍホウ酸−塩化ｔＩＩＪり＊Ｈａ１１〜ｌ
・２は０．１Ｍ９ン酸二ナトリウム−胃性ソーＩ）を會
む３−Ｏミルタカぜイン＊＊を加えて試験＊＊を調製し
、前記方織によ〉−素力個を測定し、Ｐ＆ＩＩＱＪ）Ｋ
おける一素力領を１００−として相対ｓｉｎを求める・ （３） 安定−範■ 第２園から明らか亀ように本−嵩は−７〜１１．！！に
安定−１１１１を有す為。 ζＯ評儒は次の７濠にＩ！うた。４）種緩曹筐（−３〜
８はＱ、ＩＭタエンｍ−ａｓｓ菅ン酸二ナトリウム；−
８〜１１ＧはＯ，＄ＭＪＩＩｌ？）リクムーＱ、ＩＭホ
ウ酸−塩−化カリウム：−Ｉ Ｌ＠〜１λ０は０．１５
Ｍリン酸ニナト９？ムー冑愉ソー〆）Ｋ基質として２１
１建ルクカヤインを添加し試験波を調製した。ｍ留水に
よ）遊着しえ遣轟看釈の本酵素を會む一嵩＊ＳＯ声ｊＫ
前■々ｏｐｏ緩備箪α５ｄを加えて、３０Ｃ″ｅｌＯ分
間珈鵬し大、加熱後、４１Ｑ、０００．ＩＭ炭酸塩緩曹
＊ｓｉ−を加え、これを壺種ｓｓｂ隠し大酵素とし、前
記方法によ〉酵素力優を一定し、−１０，０における一
旗カ価を１００−として相対＊＊を求める。 本酵素は第２園に示すようＫＷＭｌｏ〜１１において最
も安定で、この−領域では鬼食ｋＩｌ懐を保持したｔ壜
であ２え、を大、−７〜１１．５で紘ａＯ−以上の残存
ｍ性を示す・ （４）作用温ｆＯＩＩＩｍ 第３■に示されるように本酵素は５〜１ＩｌｃＯ範囲で
カゼイｙＫ作用する。最適温度は４ｓ〜ｓＯ℃である。 崗作用温度範■は前記と岡ｔｒｉｉｌαＯで測定を行、
５え。 （Ｂ） 失ｗＩＯ条件（温度安定性）第４−に示され
るように、本酵素は−１０゜１０分間基質なしで加熱部
層による条件で４０℃までは活性が先金に保持されるが
、５０℃では大部分の活性を失う、を九−８，１０分間
Ｏ基質なシＯＩＩＡＩｌｋＪｌａｍＯ条件では４５ｔｌ
：Ｉ”？活性は保持されるが８０℃で失活が始ま）、６
０℃で鑞埋先金に失漸する。いずれにおいても基質を添
加しないで１０分間款装した鳩舎である。 （６） 保存の安定性 本酵素は凍結あるいは凍結乾燥に対して安定である。凍
艙乾燥榔晶は室温（２１〜２２℃）で２道間放置して４
ｔｆＩ性Ｏ損失は殆どなく、同標晶をデシケータ−に入
れ陳意−に保存すれば失ｉｉａ殉んど■められない。 （７） ＩＩ書および活性化 本酵素社ジインデｔＩぜルフルオロリン酸（ＤＦ？）中
フェエルメタンヌルフォニルフルオ９ ｍ’（ＰＭＩＦ
）などグロテアーゼｏｔｒｔｔ性セ警ン員曹鳳書剤によ
りて著しく阻害される。しかし、本酵素は■物Ｏセリン
プロテアー髪であるキ毫トｌｆシンＯ＠畳剤であるトシ
ル−７工エルアツエンークｇｌｌｌメチルケトン（ＴＰ
ＯＩＣ）あるいはトリプシンＯ鳳書剤であるトシル−リ
シン−クロロメチルケトン（！Ｌα）によりては全く胆
書されな−０しかし、本ｌＩＩ素はベンジルオキシカル
−ニル−７ｚ二ルアツエン−クロロメチルケトン（ＺＰ
ＣＩ） Ｋよりて阻害を受けゐ。 を九、本酵素はノック！ローマーキ＆リベンゾエー）（
Ｐ口Ｇ）の添１／ｌＡＫよ２１１Ｉ性は食〈影響を受け
ないし、を九エチレンシア電ンテトツアセテ−） （Ｉ
Ｄ’ｒム）の添加によっても活性紘何ら影響されない、
更に、本−素にペプスタチンを添加しても活性には何ら
影響しない０以上９ａ書ｍＯ夷験結果よ〉、本酵素は活
性中心にセ’Ｊ／ＩＩＩ基をもクセリンゾロテア−髪で
あることが明白である・（８） 力領０ＩＩｌ定法 前記の如くである。 （９） 分子量 ゲルー過法〔セフアゾ、クス（登鍮商標）Ｇ−７ｓ使用
、ｙＨｌｏにで測定〕ｋよる本酵素Ｏ分子量は、６ｚｚ
、ｏｏｏでｈる。 輪 等電点 エレクトロ７オーカシンダ法による本酵素（上記の分子
量＠２ＪＯＯＯＯグルー過の活性分画）Ｏ等電点は７．
４である。 紫外線徴収スペクトル ２７５乃’ｌ１２１Ｊ２〜ＫＩｉ大歇収が存する。 赤外線徴収スペクトルは第５園に示す過ヤである。 １ 元素分析 本酵素ｏｍ−高分子物質で元素分析を行い、嶽嵩、水素
、窒素及び酸素Ｏ比を算出しても、そＯ特性を示すこと
は不可能である大め、元素分析の一定は行うていない。 （ロ）アンノ酸組成 本酵素のアミノ蒙組成を、システィン／シスチン及びト
リプト７アンを除いて、１・ｔｋ＠４ｍ １ｍＩｍｓｙ
ｍ＊ｌ＠ｇｙ’ Ｖｅｌ、ＸＬ１１１１？ｅＡ＠ａｄｓ
ｍａｌ＊ ＰｒｅｓｓｓＮｅｗ ｆｏｒｋ） Ｋ記載Ｏ
方法Ｅｌ！−ａて酵ｌｌｌ０１ｌ１１／ＩＡ水分解によ
りて、システィン／シスチンは過蟻酸による公憤分析及
びトリデシファンはアルカリ公簿分析によって、求めた
結果から算出して以下０ＩＮＫ示しえ、こ０＊にはｔ九
文献記載０ＩＩＯアルカリプロテアーゼの親戚も掲げ丸
、これらＯ結果から明らかなように、本俸−０５ｍと倫
ＯＩＩ嵩との間には、例えはセリン、アルイニン、９シ
ン、バリン、アラニン、トリプト７アノ、プ■リンなど
のアミノ酸−威において原着な種違があ暴・以下余白 アミノ酸 ♂！−８１ムー１１−２ ９シ、 ４ １１ １艦
スチジン ８ ・ Ｓアルイニン
＄ 意 ４）リブトラテン
０８１ アＪＩＡティ）１しぐｌスイツイン ３７ １
し４γ ル１９スレオ晶ｙ １０
１ｍ １９セ９ｙ １？
＄７ ＨｒｋｌｔＶＷＬ／／ｊ”Ｉｔ）’
１４ ４／１１ ＶｋＩアーＷ ９ ｙ
テ
１４ ９ダリシン ｓｏ
ｓｓ ｓｓアツ晶ン ３・
３７４１Δすｙ ２０
８０ ３１メチオ轟ン ４
ＩＩＩイノ■イシｙ １０
Ｉｔ １０−イシン １４ １
Ｎ １＠チーシｙ １雪
１０１３７ＪＬエルアツーン ４＄４ システイｙ／シスチン ０００ ・１）１０組ｎ１．ｃｋＩ論０．担、引１＃Ｌ（１９釦
０＊り Ｊ、ｌｌ＊１．Ｃｋ＊ｍ、−担、１！１＄４
＊（１１１８Ｉ）以上の結果から―らかなように１本酵
素は４１１に砥温ＫｓＩｋいてｍ＊を保持し、高ｍＩ（
５０℃以上）では容１に失活し−１０−１１に最適−を
有する。 このような理化学的性質を１１ｆる本ｍｖｓｅｙａ嵩を
、全知０ＩＩＩ似０アルカ１Ｊプ■テア−せと比較検討
した・ 従来、ダツ五陽性細菌０１１１１１外アルカリグロチア
ーゼにりいては、バチルスリツケエアオルミス（藤ａｅ
ｉｌｌｓｉｓ １１＠に＠ｍｌｆｅｒｍ１ｍ）０＆寓す
るアルカリゾ協テアー餐、バチルスオツチ讐ス０ａｓｌ
ｌｌａｓｓ−ｂｔｉｔｌｅ）０４−虹＝１獣＝ニー゛る
アルカリゾ−テア−ｆ（／プチリシンノが）等が周知で
ある。 これら０４）酵素はと％に分子量がｌＨｆ、０００〜３
０．０００ 、等電点９〜１１０−化学一懺質を有し、
活−中心に七りン職基をもり−に９ｙｆａテアーゼであ
ゐ、そｔ）ＦｌｉＰＫ１１９！ｌｉｌれているΔチルス
Ｏ生産する細胞外アルカリｆｔｓテア−ぜも分子量が２
＆０００〜３０．０００．等電点が９〜１１０９■を有
する４０が多い、そして以上の大部分は−１０゜もＯで
ある・ノぐチルスＯ生寓する低い分子量を有するアルカ
リプロテアーゼとしては、Δチルス雇Ｄ−８０アルカリ
ｆａテアー−１１−１，１１−４が全知であるが、両者
唸共に分子量ｇｏ、ｏｏｏｏ酵素であ〉、共に４ｓ、Ｏ
，ｓＯ℃Ｏ鵬轟運をしても滑性は全く低下しａｈ（４１
Ａ１１ＳＩＩ−４１３１５）ｅ更に弛ＯＡテルスＯ生産
するアルカリｆａテア−ぜとし−Ｃ、バチルスアルカロ
アイルスＭＣｌ１１０４３＠曹アルカリｆロチアーゼ、
同１０４３１１薗アルカリｆロチアーゼが知られている
が、これｂ拡いずれも第１表に示すように４ｔｏ、ｓｏ
℃、１０分間０１１ｋＪ６１１ＫＴｈｈ１９０１Ｇ内外
Ｏ活性を保持する。 夏に前述ＯΔチルスリ、ケニ７オ＃ｔス薗０アルカリゾ
ロテア−髪中パテルスオブチリス曹Ｏアルカリプロテア
−誓は−１０，！！ＯＣ，１０分間０１１１ｍ１ｍで７
０〜８０１１０９性を有する（第１１゜このように、従
来全知ＯΔチルスＪｅｆテリスをはじめ／ぐテルス翼組
曹Ｏ生寓するアルカリプロテアーゼは比較的高い温度領
域で安定である。しかるて述べたように−１０，１０分
間加熱処理で４０を以下では安定であるが、５０℃で大
部分の酵素活性を失う特徴を有する。を九１１Ｈ８，１
０分間加熱処理では５０℃附近で失活が蛤ま〕、６０℃
で活性は殆ど失われる。 このような４Ｉ黴的な温度安定性、および前述の分子量
、等電点並びにア建ノ酸龜威等０１ｌＩ性質からみて、
本酵素は従来知られ九バチルス翼組曹Ｏ生産するアルカ
リプロテア−４’０いずれとも異なる別種０４ｂＣ）で
文献未記載である。よりて、本酵素を新規酵素と認定し
、アルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１と命名しえ。 本発明の新規な酵素ｒ ＡＰＩ−２１Ｊは、以上述べ丸
ようＫＦＨ７〜１１．Ｓで安定で、４１０〜１１位で最
適活性を示すとζろよシ洗剤ビル〆−と混用可能である
。従って洗剤用酵素として効果的である。４１に本酵素
「♂ｌ−２１Ｊは従来の洗剤用酵素に比し、比較的低温
（２０〜３０℃）でも高い相対活性を維持する。従って
、我■におけるように室温水で洗濯する習慣を有する−
において、本酵素は一般家庭用洗剤の助剤として使用す
るアルカリプロテアーゼとして、最も好ましいタイｆＣ
Ｊものである。を九近時に訃いては、生活廃秦物あるい
は生活廃水中にタン／譬り質が増加する傾向にあるが、
これら廃集物処ＩＩＴｏるいは汚水処ＩＩＯ段階で、本
酵素を利用することＫよシタンノ譬り質の迅速な分解を
促がし窒素資源０＊ｍ再利用が可能である。また、食品
加工など食品工業へｔ）ｆロチアーゼの利用に際しては
、本酵素を利用することによシ、加工利用後５０〜６０
℃程度の比較的低い温ＩＩ旭理によりて簡単に酵素活性
を失活させることがで自る・従りて、本酵素はまた加工
食品の品質管理上、効果的な酵素である。 以下余日 次に本発明の実施例について説明する。 実施例１ 本俸＊０新曹株［８−２１号薗を用い、ζＯ曹株Ｏ斜面
培養物を殺菌水に懸濁させ、その０．５−を種菌とした
。 酵素゛生産検地にカゼインＩＩＧ、ミートエキス１−１
ぼりペプトイｌ−９および炭酸水素ナトリウム１−から
なる培地を水酸化ナトリウムにて−９，５あるいは７．
２に調整した。 ロータリーシエイカーによる振盪培養（４）においては
、いずれもＦＨ９，ＳＫ調整した上記培地を１ｊ容Ｏエ
ルレンマイヤーフツ平プ中＆ｃ１００１１Ｊ。 ２００ｗＬ１．３００−人れ！曹後、種菌０．ｂ−を添
加し２０±ｉ℃０温直で２００ ｒｐｉｍ４Ｄ振量条件
でＮＫ１１−２１号菌性４１．６！ｉ、１ｌＧＤ各時間
培養しアルカリプロテアーゼムＰＩ−２１を生産させえ
。 一方、往復振盪培養（６）においては、上記培地を−９
，５あるいはｌｌ）１７．２に調整した培地１００−を
５００−審の坂ロフラスコに入れ殺菌後、種菌０．５−
を接種し３０℃で往復振盪培養をし丸。 所定の時間培養し九培養物を２８０００Ｇ 、１６分間
遠心分離をし１体を分離し清澄な培養上清涼を得た。得
られたそれぞれの培養上清涼中のアルカリグロチアーゼ
活性を前記グロテアーゼ活性測定法Ｋｌ！りて測定し、
次の結果を得え・ムζロータリ振盪培養法（２０℃、培
地の初発−９，５） Ｂ＝往復振盪培養法（３Ｇ℃） ９、５ ４．５ ３．０７、２
４．９ ３．４以上の結果、本酵素生産の
ための小規模培養においては、１１容エルレンマイヤ−
７ラスプ中Ｋａ ｏ ｏｗＪｏ上記培地を入れ、２０℃
でロータリーシェカーによ〉振盪培養（４）すると６５
時間で最高の比活性ならびに最高のプロテアーゼ生産量
が得られた。 順ト２１菌性を３０℃で往復振盪培養（６）すると自、
培地の初発は−が９．５のみならず−７，２で４ＮＫｉ
ｌ−２１号薗の生育は良好であ）、そしてまたアルカリ
ｆａテアーゼＡＰＩ−２１０生童も高い結果が得られえ
、培地の初発−が９．５のみならず、−７，２でＮＫ８
−１１号薗を培養する場合、培養温度は２０℃の往復振
盪培養でも、３０℃培養の場合と類似の結果が得られえ
。 上記のような操作によりｅ九ＮＫｇ−２１号薗の培養後
の遠心分離上清涼７Ｉを３℃に冷却し、これに予め３℃
に冷却しておいたエチルアルプールを加え生成した沈殿
を冷却遠心分離機で１１，０ＯＯＧで遠心分離し、ただ
ちに真空凍結乾燥させ酵素粉末１５．’ｌｌ／を得た。 タン／ｆり質１時轟ルのアルカリｆａテアーーｖ１０比
活性は０．７１マイクロカタール（Ｑ、７１バａｔａｌ
Ｊ９・タンパク質）であシ、回収率は３３−であり九、
タンΔり質はローリ−法によ〉測定した。 このようＫして調製した凍結乾燥酵素標品を０、２ Ｍ
食塩を含む０．０ＩＭ炭駿ナトリウムーホウ酸−塩化カ
リウム緩ＩＩ液（４１０，０）Ｋ＠ｓｌ、、、同緩衝液
で平衡化したセツアデ、タスＧ−７５０カツム（２国Ｘ
７４傷）Ｋよ〉ゲル、−過を行ない、溶出液を３−ずつ
分画し九、タンノ々り質はローリ−法によ）、アルカリ
！ロテアーー４／活性は上述０ようにＰＨＩＧで測定し
丸０以上の操作によシ糟展酵素を得え、比活性は約１０
僑上昇し、タンパク質１ｋｊ轟−にシの比活性は７．０
マイクロカタールであった８回収率は７０チであり九。 実施１ｐ１２ アルカリグロチアーゼ生意ｑＮＫｇ−２１４藺を用い、
５００１発酵タンクによるアルカリプロテア−４ｕｌ−
２１生意とそれに続く酵素剤ＯＩＩ造を行な−）た、酵
素主意培地はカゼイン１１ｇ、ミートエキス１−１４リ
ペプトン１１．嶽駿水素ナトリウム１ｓからなる培地な
、水酸化ナトリウムによりｐＨ９，５ＫｍＩＩＩＩした
。上記の培地をまず１ノ容のエルレンマイヤ−７ツスゴ
に３００−添加し殺菌後、実施例１で述べえ如く種菌０
．５−を加え、２０℃で３日間場曽し九、この培１１１
１３ｏｏ＠Ｉを予め上記の培地１０１を含む殺菌し九３
０１ジャーファメンター中に添加し、２０℃で３日間通
気攪拌培養をした。攪拌は４０ Ｏｒｐｅｓ 、通気は
１２ｊ／分であうえ、３０！容ジヤー７アメンターで３
日培養した培養液１０ｊを無菌的に予め殺菌した２２０
Ｉの上記培地を含む５００１容の発酵タンクに移し、２
０℃で４日間の通気攪拌培養をした。攪拌は４００ ｒ
ｐｒｍ ＊通気は２００１／分でありた。培養終了後、
培養物を冷却連続遠心分離機によυ１１．０００Ｇで遠
心分離し１体を除去し清澄な培養上清ｔ２Ｇ０Ｊを得た
。培養土清液を３℃に冷却し、これに予め３℃に冷却し
た２倍量Ｏエチルアルプールを加えアルカリグロテアー
ゼムＰＩ−２１ヲ沈殿させえ、沈殿したアルカｊＪ ｆ
ａテア−髪ムＰ！−２１は冷却連続遠心分離機で約１
１，０ＯＯＧで遠心分離し、直ちに真空凍結乾燥をし、
次に示す凍結乾燥アルカリグロチアーゼＡＰＩ−２１酵
素標晶を得た。 回収酵素重量ＣＩ） １２３Ｇ比活性（マイク
ロカタール／＃） ０．５２回収率ｉ）
７０ 上記で得九−素裸晶を実施例ＩＫ従って精−したところ
、分子量２２００Ｇ、等電点７．４のアルカリグロチア
ーゼが得られた・このアルカリゾロチアーゼの酵素標晶
紘、ＦＨＩＯで５０℃、１０分間の熱処理によシネ安定
な、低温活性ｍｏ本発明のアルカリグロチアーゼＡＰＩ
−２１であ−２え。 ４、 ８面の簡単な説明 第ｉｌｌは本実ＷＩＩ４の酵素の最適−を示すグラフで
あシ、 第２ＩｌＩは本発明の酵素の一安定性を示すグツ７であ
夛、 第３図は本発明の酵素の作用温度範囲および最適温度を
示すグラフであり、 第４図（へ）および第４図（→は、それぞれ本発Ｗ１４
０酵素の−１０および一８ＫｓＰける温度安定性を示す
グラフである。 第５図は本発明に従った酵素のフーリエ変換赤外吸収ス
ペクトルを示すダラ７図である。 特許出墓人 昭和電工株式金社 特許出願代理人 弁理士 實 木 網 弁理士 酉 舘 和 之 弁理士 石 １） 敬 弁理士 山 口 昭 之
。 ５１１１図は不発明の酵素の作用温度間８訃よび最適温
度を示すグラフであｐ。 １１４図（イ）訃よび第４図（口］拭、それぞれ本発明
の＃累のｐＨＩ ＯおよびｐＨ８における温度安定性を
示ナグラフである〇 特許出願人 昭和電工株式金社 特許出願代理人 ９Ｐｍ士 實 木 朗 弁理士 西舘和之 弁理士 石臼 敬 ５？場± 山口昭之 第１図 Ｈ 第２図 第３図 ４９４− 第４図（イ） 温度（’Ｃ） ０ １０ ２０ ３０ ４０ ５０
６０温度（℃） 手続補正書（自発） 昭和ｓ８年５月η 日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第１７１５９６号 ２、発明の名称 新規な細菌アルカリグロチアーゼ及びその製造方法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 （２００）昭和電工株式会社 ４、代理人 住所 〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０４＃（
外３名） ５、補正の対象 ６、補正の内容 １）明細書全文を別紙の過少補正する。 ２）図面（第５図）を別紙の通夛補正する。 ７、添付書類の０鎌 ｌ）全文補正明細書 １通２）図面（第５
図） １過 食文補正明細書 １、発明の名称 新規な細菌アルカリプロテアーゼ及びその製造方法 ２、特許請求の範囲 １、下記の（１）ないしＯ）の理化学的性質を有するア
ルカリゾロテア−ゼムＰＩ −２１６（１）作用 最適−範囲が１０〜１１であるアルカリ性領域でカゼイ
ンを加水分解し、その最適作用温度が４５〜５０℃であ
る。 （２） 安定性 ｐ）（１０，１０分間の加熱処理による酵素活性の低下
は、４０℃まで認められないが、５０℃ではその９０１
以上の活性が失われ、ＰＨ８，１０分間の加熱処理の場
合５０℃で失活が始ｊＪ）、６０℃ではほぼ完全に失活
する。アルカリ性（４１に一戸１〜１１．５）で安定で
あシ、凍結ならびに凍結乾燥に対して安定である・。 （３）酵素分子 ｒルー適法にて測定した分子量が２２．０００：等電点
が７．４：紫外線吸収スペクトルが２７５乃至２８２
ｍｍＫ極大吸収を有し：第５図に示す赤外線吸収スペク
トルを有し；活性中心にセリン残基を有する蛋白質であ
る。 ２、バチルス属に属しアルカリゾロテア−ぜＡＰＩ−２
１を生産する新菌種バチルス属ＮＫ８−２１号薗をアル
カリ性培地に接種して培養し、培養物よりアルカリ側に
最適−を有するアルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１を採
取することを特、徴とする新規なアルカリグロチアーゼ
ＡＰＩ −２１の製造方法。 ３、発明の詳細な説明 本発明は、新規なアルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１及
びその製造方法に関し、更に詳しくはアルカリ性の条件
下、比較的低温度（室温〜約４０℃）にても酵素活性を
有する細菌アルカリデロテアー−に＃ＡＰＩ −２１ｍ
ヒに新菌種ハｆ ｋ ス属ＮＫ ８−２１を培養するこ
とによりて生産される該アルカリグロチアーゼＡＰＩ
−２１の製造方法に関する。 アルカリプロテアーゼ社一般に熱く対して中性プロテア
ーゼよシも安定である丸め、その用途も皮革加工用、食
品工業用、繊維工業用あるいは医薬としての応用勢、広
範１！にわたうている。ｔた、近年では洗剤添加用酵素
の需ｌＦが増大している。 このような洗剤添加用酵素として実用に供されているも
のは殆んどバチルス属細菌のアルカリグロチアーゼであ
り、高温度高活性型の酵素である。 すなわち、これら公知の酵素は通常ｐＨ９〜１０附近に
至適作用条件を有し、高温度特に６０°付近に最高活性
を有し、低温度４１Ｋｍ％付近では酵素活性が極めて低
いものが多い、そのため我国における如く室温で洗濯を
行なう習慣のある国では、十分に上記酵素の特性は発揮
されていない。又、最近における熱に比較的弱い化学繊
維の増加、あるいは省エネルギーの観点からもよシ低い
温度でも高い活性が保持される酵素の開発が要求されて
いる。 本発明者は、かかる状況に鑑みよシ低温度で最高活性値
を有する細菌アルカリグロチアーゼを得ることを目的に
、各種土壌中よシアルカリプ′−テアーゼ生意薗を検索
した結果、土壌より分離し九バチルス（Ｂａｅｌｌｌｕ
ｓ）属に属する新菌種、バチルス属ＮＫ８−２１（Ｂａ
ｅｉｌｌｔ＋ｍ ｍｐ、ｎｏｖ、ＮＫｓ−２１、以下単
ＫＮＫＳ−２１号薗という）が上記目的に合致した新規
アルカリグロチアーゼを培地中に生産することを見出し
、この知見に基づき本発明を完成したものである。 すなわち、本発明におけるアルカリグロチアーゼＡＰＩ
−２１を生産する菌株はその菌学的性質より好気性有
胞子細菌であシ・クチルス属に属する新菌種であること
が判明した。以下、これについて詳しく述べる。尚、同
定にあたっての蘭学的緒性質の試薬および分離方法は「
パージニーズ マニ島アル オプ ブタ−２ネイデイプ
バクテリオｃＩジー」第８版（１９７４年）の記載に
基づいて行なった。 本発明における菌株ＮＫ８−２１号薗は、前述の如く好
気性有胞子細菌であシパチルス属に属することが明らか
である。而して本曹株の極めて特異的性状として中性の
培地でもアルカリ性の培地でも生育するが、４１にアル
カリ性の培地において非常に良く生育し、最適生育条件
としてのμ値が８〜１０である点があげられる。このよ
うな性質に近似した公知の菌株としてバチルス Δスラ
リー（Ｂａｃｌｌｌｕｓ ｐａｍｔ＠ｕｒｉｌ）、およ
びバチルス アルカセフ４Ｊｋス（Ｂａｃｉｌｌｕｓム
ｌａａｌｏｐｈｉｌａｍ ）、が挙げられる。しかるに
１本発明における菌株ＮＫＳ−２１号薗は、上記の菌種
とその菌学的性質において一部一致する点もあるが異な
る特性をも有し、それらと別異の菌株であ夛文献未記載
の新菌種である。 スナワチ、バチルス ノ９スツＩ）−’トバチルスアル
カロフィルスはともにアルカル性声域で生育する菌であ
り、特にバチルス アルカロフィルスはｐＨ７では生育
できない特性を有する。一方、ＮＫＳ−２１号薗はアル
カリ性−でよく生育するが、中性−においてもよく生育
し、この点においてバチルスアルカロフィルスと異なる
。又、バチルスＡスツリーはデンプンを加水分解しない
がＮＫＳ−２１号薗はデンプンを加水分解する。更に、
パチルスノ４スツリーは硝酸塩を還元するが、ＮＫＳ−
２１号薗は還元しない、又、その形態において社バチル
スノ譬スツリーは、内生胞子が球形かやや楕円形である
が、ＮＫＳ−２１号菌の内生胞子は卵形である。又、バ
チルスノタスツリーは尿素を分解するが、ＮＫＳ−２１
号曹はこれを分解しない。 以上の菌学的性質の差異によシ、ＮＫＳ−２１号菌はバ
チルスノ臂スツリーとは明らかに別異の種である。 バチルスアルカロフィルスの菌株についての詳細な分類
学的記述に関しては、前記「パージニーズ マニュアル
オプ デターミネイティプ パクテリオロゾー」には
見当たらず、不備である。 まり、バチルスアルカロフィルスの標準様は存しない、
従りて同書記載のオリジナル株であるパチルスアルカロ
フイルスＮＣＩＢ １０４３６株および同ＭＣｌ８１０
４３８株と４Ｃ）いて比較し九。ＮＣｌＢ１０４３６株
およびＮＣＩＢ １０４３８株の両菌株ともグラム染色
性は陽性であるが僅かであシ、脱色され易い性質を有す
る。同様ＫＮＫＢ−２１号薗もグラム染色性は陽性であ
って脱色され謳い、ｔた、栄養細胞の形態に関してはＮ
ＣｒＢ １０４３６株は０．７Ｘ２．Ｏμの短桿曹と０
．８Ｘ４．６μの長桿菌とが電子顕微鏡下で観察され、
一方ＮＣＩＢ １０４３８株の栄養細胞の大きさは０．
７ＸＩＪ声である。しかるＫＮＫ８−２１号上の栄養細
胞の大きさは０．６〜０．８Ｘ２．５〜３．５μ（電子
顕微鏡観察）であシ、胞子の形状は卵形でその大きさは
０．８Ｘ１．２声である。まえ、運動性ＫＩＩＬＮＣＩ
ＩＩ １０４３６株及び同１０４３８株はそれが鋼察さ
れないのに対し、ＮＫＢ−２１号薗は運動性がある０次
に生理的性質について、バチルスアルカ−フィルスはマ
ンニトール培地に生育しないが、ＮＫＢ−２１号薗は生
育する。またＮＣＩＢ １０４３６株は７１食塩中で生
育しないが、ＮＣ１１１０４３８株は生育する。ＮＫＳ
−２１号菌は７−食塩水で生育する０以上の結果からＮ
ＫＳ−２１１）１１ｔｉ、’４チルスアルカロフイルス
ＮＣＩＢ １０４３６株と同１０４３８株とは一部その
性質が近似するが、総体的に両者から区別することがで
き別異の菌である。 更に、ＮＫＢ−２１４［と）４チルス・ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｍ ）とは、／４ｆル
ス・ズブチリス栄養細胞の大きさは巾０．７−Ｑ、１１
声、長さ２−３声であυ、デンプンを公憤する点にお
いて類似する。しかるにバチルス・ズブチリスはｐ）１
５．５〜８．５で生育が活発であるが、ＮＫＢ−２１号
１力寛生育する一９〜ｌＯで杜生育でＩｔい、さらにノ
（チルス・ズブチリスの生育最高温度は４５〜５５℃に
あるが、ＮＫＢ−２１号菌性４３℃を超えた温度では生
育できない点で明らかに異るなどから、ＮＫＳ −２１
号１１は明らかに）ｆチルスズブチリスとは別の種であ
る。 以上述べえように、ＮＫＢ−２１号薗はその菌学的性質
から近似の性質を有する公知の菌株／ｆチルスパスツリ
ー、バチルスアルカロフイ・リスオヨヒノ櫂チルス・ズ
ブチリスとは区別され、上記のノ童−ジェーズ・マエ、
アルに記載されていｂ既知の種のいずれとも異なる故新
曹種に属するととカ監明白である。よって、本曹を新薗
１１／ｆチルス属ＮＫ８−２１号菌と同定した。 該新菌種バチルス属ＮＫト２１号薗は、特許手続上の微
生物の寄託の国際的承認に関するプダ（スト条約に基づ
き昭和５７年２月３日附工業技術院微生物工業技術研究
所へ国際寄託され、受託番号は、微工研条寄第９３号で
ある。 以下に、ＮＫＢ−２１号上の曹学的諸性質を記載する。 カお、以下に記載する薗学的諦性質の試験および分離方
法は前記「・譬−ジニーズ マニュアル オプ デタミ
ネイティブ ）母りテリオロジー」（］９９４４年Ｋ基
づいて行量った。 土壌中より菌の分離について１次の方法によつ九、即ち
、土壌塊の少量をペプトン培地に添加し、ｐＨ７〜１０
、温度１０〜４０°の領域で振盪培養器を用い、４０〜
１５０時間培養し、その一部分をとり寒天平板培養で菌
株を分離し友、なお寒天平板培養の来天濃度は１．５チ
である。 ［ＮＫＳ −２１菌性の菌学的性質］ ＜ａ＞ 形態 （１） 栄養細胞の大きさ ０．６〜０，８Ｘ２．５〜３，５μ （ｚ） ＠砲Ｏ多形性 細胞が伸長し０．６〜１．０Ｘ４．５μ濯になることあ
り （３）グラム染色性 陽性ではあるが脱色され易い （４）運動性 あり （５）鞭毛 馬毛が複数存在し、約８〜１０４の長さである （６）胞子の形、大きさ 卵形、０、Ｂｘｌ、２．ｇｍ 内生胞子性細胞のやや端寄シのところに存在（ｂ）
培地における生育状態 （１）ペプトン培地 声 ｐｌ（９，５ ２０℃でも３０℃でも良く生育する 一Ｈ７，２ ２０℃では遅いが生育し、３０℃では良く生育する 生育温度（ｐＨ９，５） 約１４〜４１Ｔ、の温度範囲で生育し、温度が４３℃を
超えた９、１２℃未清では生育しない （２） 他の培地 肉エキス・４７”）ン寒天斜面培地 よく生育する 肉エキス・イブトン蜂天平板培地 よく生育する ７１Ｇ食塩存在肉エキス・−４ｆ）ン 寒天平板培地 よく生育する肉エキ
ス・ペプトン液体培地 よく生育する カゼイン・ミートエキス・ペット ン殊天斜面培地 よく生育するカゼイン
・ミートエキス・ペット ン庫大平板培地 よく生育するカゼイン
・オートエキス・ペット ン濱体培地 よく生育するスター
チ・−６７”）ン液体培地 よく生育する トリプトン・イーストエキス寒 天培地 よ〈生育する肉汁ゼ
ラチン穿刺培養 （ｉ）ｐｉ（ｘｏ、ｏ ３ｏｔ培讐；生育、液化（ｉ
）ＰＨ１０，０２ｏ℃培養：表ｍｔ上テ弱＜１青し、弱
く液化 （ｉｉｉ）ｐＨ７，２３０’ｅ培１１：生！、液化（Ｉ
Ｖ）ｐＨ７，２２０’Ｃｊｌｔ養：表ｍ上テｌｌ＜１青
し、弱く液化 （３）好気性で、嫌気的条件では生育しない（ｅ）
生理学的性質 ■ 硝酸塩の還元：還元しない ■ ｖｐテスト：陰性 ■ インドールの生成：生成しない ■ デンプンの加水分鱗：加水分解する■ クエン酸の
利用：利用する ■ 色素の生成：生成しない ■ ウレアーゼ：陰性 ■ チトクロームオキシターゼ：ｌ！）性■ カタラー
−に＃：陽性 ［相］ 酸素に対する態度：好気性 ■ Ｏ−Ｆテストニーいけれど発酵する＠ 硝酸塩から
の嫌気性でガスの発生：陰性［相］ ＭＲテスト：陰性 ■ 硫化水素の生成−生成しない ［相］ 無機窒素源の利用：硝酸塩及びアンモニウム塩
を利用する ［相］ 糖類からの駿及びガスの生成：Ｌ−アラビノー
ス −− Ｄ−キシロース −− Ｄ−グルコース 十 − Ｄ−マンノース 十 − Ｄ−フラクトース −− Ｄ−ガラクトース 十 −麦芽糖 十
− 蔗 糖 十 −乳 糖
−トレハロース ＋ Ｄ−ノルビット十− Ｄ−マンニット ＋ イノジット ＋ − グリセリン 十 − デンプン 十 − りが−ス −− ラフィノース ＋ − セルビオース 十 − ■ その他 （＋）７ａｃニルナラニン脱アミノ作用：脱ア電ノ作用
する （：ｉ）カゼイン加水分解：加水分解する（ｉｉｉ）チ
ロシン分解二分解する 本発明は以上の知見に基づいてなされたもので、前記バ
チルス属ＮＫＳ−２１号薗Ｏ生産する新規アルカリプロ
テアーぜＡＰＩ−２１並びにバチルス属ＮＫＳ−２１号
薗をアルカリ性培地に接種して該薗を培養し、培養物よ
りアルカリグロチアーゼＡＰＩ−２１を採取することを
特徴とする、新規なアルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１
の製造方法である。 尚、本発明に用いる微生物は前記バチルス属ＮＫＳ −
２１号薗に限らず、その自然または人為的変異株であっ
ても本発明の後記の如き特性を有するアルカリプロテア
ーゼＡＰＩ −２１の生産性を有する限シ当然に包含さ
れるものである。 次に本薗ＮＫＳ−２１号薗を培養して得られる本発明の
新規なアルカリグロチアーゼＡＰＩ−２１について説明
する。 培養条件として、培地として例えば−８〜１０に調整し
たペプトン培地を用い上記ＮＫＳ−２１号菌を接種し好
気的に振盪培養又は通気攪拌培養等で行なわれる。例え
ば、１５℃〜４０℃で４０〜１５０時間振盪培養す６・
培ｑ！！竺了後・培養物よシ菌体を分、離し清澄な培養
上清液を得た。この上清液に例えばエタノールの如き有
機溶剤を添加することＫよシアルカリグロテアーゼＡＰ
Ｉ−２１を沈殿させた。沈殿したアルカリプロテアーゼ
ＡＰＩ−２１を遠心分離し、真空凍結乾燥してアルカリ
７’０テ７−ゼＡＰＩ−２１酵素標品を得る。 このよう圧して得られたアルカリグロチアーゼＡＰＩ−
２１の活性は、次のように測定する。 培養清澄液を０．１Ｍ炭酸ソーダ−０，１Ｍホウ酸−塩
化カリウム緩衝液（ｐＨｔｏ、ｏ）で適当に希釈した液
ｏ、 ｓ ｄＫｐＨ１０，Ｏの２チミルクヵゼイン溶液
０．５ ｍを加えて、３０℃で１０〜３０分酵素反応を
させた。酵素反応の終了は０．２Ｍ酢酸−０，２Ｍ酢酸
ソーダ緩衝液を含む０．１ Ｍ ） リクロル酢酸２ｄ
を加えて反応を停止させ九、３０℃、１０分以上放置後
−紙を用いて一過した。Ｐ液ｌｉｄに０．４Ｍ炭酸ソー
ダ５−１５倍希釈の７Ｊｃノール試薬ｌｌｌ７を添加し
、３０℃、２０分間放置して発色させたのち６６０ｈ惰
における吸光度を測定する。 なお、酵素単位は国際酵素−貴会の「工ンディムノーメ
ンクレイチャー」に従がい、３０℃で−１０，０の１１
カゼインを基質とし１秒間チロシン１そル相当量の６６
０ ａｍ□発色を示すトリクロル酢酸可溶性物質を遊離
するアルカリプロテアーゼ量を１カタール（ｋａｔａｌ
）とする。 以下余白 次に本発−で得られるアルカリグロチアーゼムＰＩ−２
１（以下ｒ本酵素」という）０１１化学的愉質にりいて
違ぺる。 （１） 作用及び基質畳異法 タンΔり質０例えばカゼイン、へ峰ダＩｔ Ｖ ：／
＠アルｆ電ン、ダＩ！プリン、崗タンー１４タ、魚肉′
タンΔタ、大夏タンΔりなどを分欝する。 （２）最適− 第１閣から―らかなように４１０−１１に最適−を有す
る・なお、 ｓｔＩＩｍ性は次のようにして求める。 本酵素１１＠０ＩＩＩＩＫ（１，５１１ＪＫ）４に緩衝
液（４６〜Ｉは０．１Ｍ９ン酸−カリウム−（ＬＪＩＭ
ホウ酸ナトリウム；ｆ１９〜１１は＆ＩＭ嶽酸す・トリ
ウム−０，１Ｍホウ酸−塩化ｔＩＩＪり＊Ｈａ１１〜ｌ
・２は０．１Ｍ９ン酸二ナトリウム−胃性ソーＩ）を會
む３−Ｏミルタカぜイン＊＊を加えて試験＊＊を調製し
、前記方織によ〉−素力個を測定し、Ｐ＆ＩＩＱＪ）Ｋ
おける一素力領を１００−として相対ｓｉｎを求める・ （３） 安定−範■ 第２園から明らか亀ように本−嵩は−７〜１１．！！に
安定−１１１１を有す為。 ζＯ評儒は次の７濠にＩ！うた。４）種緩曹筐（−３〜
８はＱ、ＩＭタエンｍ−ａｓｓ菅ン酸二ナトリウム；−
８〜１１ＧはＯ，＄ＭＪＩＩｌ？）リクムーＱ、ＩＭホ
ウ酸−塩−化カリウム：−Ｉ Ｌ＠〜１λ０は０．１５
Ｍリン酸ニナト９？ムー冑愉ソー〆）Ｋ基質として２１
１建ルクカヤインを添加し試験波を調製した。ｍ留水に
よ）遊着しえ遣轟看釈の本酵素を會む一嵩＊ＳＯ声ｊＫ
前■々ｏｐｏ緩備箪α５ｄを加えて、３０Ｃ″ｅｌＯ分
間珈鵬し大、加熱後、４１Ｑ、０００．ＩＭ炭酸塩緩曹
＊ｓｉ−を加え、これを壺種ｓｓｂ隠し大酵素とし、前
記方法によ〉酵素力優を一定し、−１０，０における一
旗カ価を１００−として相対＊＊を求める。 本酵素は第２園に示すようＫＷＭｌｏ〜１１において最
も安定で、この−領域では鬼食ｋＩｌ懐を保持したｔ壜
であ２え、を大、−７〜１１．５で紘ａＯ−以上の残存
ｍ性を示す・ （４）作用温ｆＯＩＩＩｍ 第３■に示されるように本酵素は５〜１ＩｌｃＯ範囲で
カゼイｙＫ作用する。最適温度は４ｓ〜ｓＯ℃である。 崗作用温度範■は前記と岡ｔｒｉｉｌαＯで測定を行、
５え。 （Ｂ） 失ｗＩＯ条件（温度安定性）第４−に示され
るように、本酵素は−１０゜１０分間基質なしで加熱部
層による条件で４０℃までは活性が先金に保持されるが
、５０℃では大部分の活性を失う、を九−８，１０分間
Ｏ基質なシＯＩＩＡＩｌｋＪｌａｍＯ条件では４５ｔｌ
：Ｉ”？活性は保持されるが８０℃で失活が始ま）、６
０℃で鑞埋先金に失漸する。いずれにおいても基質を添
加しないで１０分間款装した鳩舎である。 （６） 保存の安定性 本酵素は凍結あるいは凍結乾燥に対して安定である。凍
艙乾燥榔晶は室温（２１〜２２℃）で２道間放置して４
ｔｆＩ性Ｏ損失は殆どなく、同標晶をデシケータ−に入
れ陳意−に保存すれば失ｉｉａ殉んど■められない。 （７） ＩＩ書および活性化 本酵素社ジインデｔＩぜルフルオロリン酸（ＤＦ？）中
フェエルメタンヌルフォニルフルオ９ ｍ’（ＰＭＩＦ
）などグロテアーゼｏｔｒｔｔ性セ警ン員曹鳳書剤によ
りて著しく阻害される。しかし、本酵素は■物Ｏセリン
プロテアー髪であるキ毫トｌｆシンＯ＠畳剤であるトシ
ル−７工エルアツエンークｇｌｌｌメチルケトン（ＴＰ
ＯＩＣ）あるいはトリプシンＯ鳳書剤であるトシル−リ
シン−クロロメチルケトン（！Ｌα）によりては全く胆
書されな−０しかし、本ｌＩＩ素はベンジルオキシカル
−ニル−７ｚ二ルアツエン−クロロメチルケトン（ＺＰ
ＣＩ） Ｋよりて阻害を受けゐ。 を九、本酵素はノック！ローマーキ＆リベンゾエー）（
Ｐ口Ｇ）の添１／ｌＡＫよ２１１Ｉ性は食〈影響を受け
ないし、を九エチレンシア電ンテトツアセテ−） （Ｉ
Ｄ’ｒム）の添加によっても活性紘何ら影響されない、
更に、本−素にペプスタチンを添加しても活性には何ら
影響しない０以上９ａ書ｍＯ夷験結果よ〉、本酵素は活
性中心にセ’Ｊ／ＩＩＩ基をもクセリンゾロテア−髪で
あることが明白である・（８） 力領０ＩＩｌ定法 前記の如くである。 （９） 分子量 ゲルー過法〔セフアゾ、クス（登鍮商標）Ｇ−７ｓ使用
、ｙＨｌｏにで測定〕ｋよる本酵素Ｏ分子量は、６ｚｚ
、ｏｏｏでｈる。 輪 等電点 エレクトロ７オーカシンダ法による本酵素（上記の分子
量＠２ＪＯＯＯＯグルー過の活性分画）Ｏ等電点は７．
４である。 紫外線徴収スペクトル ２７５乃’ｌ１２１Ｊ２〜ＫＩｉ大歇収が存する。 赤外線徴収スペクトルは第５園に示す過ヤである。 １ 元素分析 本酵素ｏｍ−高分子物質で元素分析を行い、嶽嵩、水素
、窒素及び酸素Ｏ比を算出しても、そＯ特性を示すこと
は不可能である大め、元素分析の一定は行うていない。 （ロ）アンノ酸組成 本酵素のアミノ蒙組成を、システィン／シスチン及びト
リプト７アンを除いて、１・ｔｋ＠４ｍ １ｍＩｍｓｙ
ｍ＊ｌ＠ｇｙ’ Ｖｅｌ、ＸＬ１１１１？ｅＡ＠ａｄｓ
ｍａｌ＊ ＰｒｅｓｓｓＮｅｗ ｆｏｒｋ） Ｋ記載Ｏ
方法Ｅｌ！−ａて酵ｌｌｌ０１ｌ１１／ＩＡ水分解によ
りて、システィン／シスチンは過蟻酸による公憤分析及
びトリデシファンはアルカリ公簿分析によって、求めた
結果から算出して以下０ＩＮＫ示しえ、こ０＊にはｔ九
文献記載０ＩＩＯアルカリプロテアーゼの親戚も掲げ丸
、これらＯ結果から明らかなように、本俸−０５ｍと倫
ＯＩＩ嵩との間には、例えはセリン、アルイニン、９シ
ン、バリン、アラニン、トリプト７アノ、プ■リンなど
のアミノ酸−威において原着な種違があ暴・以下余白 アミノ酸 ♂！−８１ムー１１−２ ９シ、 ４ １１ １艦
スチジン ８ ・ Ｓアルイニン
＄ 意 ４）リブトラテン
０８１ アＪＩＡティ）１しぐｌスイツイン ３７ １
し４γ ル１９スレオ晶ｙ １０
１ｍ １９セ９ｙ １？
＄７ ＨｒｋｌｔＶＷＬ／／ｊ”Ｉｔ）’
１４ ４／１１ ＶｋＩアーＷ ９ ｙ
テ
１４ ９ダリシン ｓｏ
ｓｓ ｓｓアツ晶ン ３・
３７４１Δすｙ ２０
８０ ３１メチオ轟ン ４
ＩＩＩイノ■イシｙ １０
Ｉｔ １０−イシン １４ １
Ｎ １＠チーシｙ １雪
１０１３７ＪＬエルアツーン ４＄４ システイｙ／シスチン ０００ ・１）１０組ｎ１．ｃｋＩ論０．担、引１＃Ｌ（１９釦
０＊り Ｊ、ｌｌ＊１．Ｃｋ＊ｍ、−担、１！１＄４
＊（１１１８Ｉ）以上の結果から―らかなように１本酵
素は４１１に砥温ＫｓＩｋいてｍ＊を保持し、高ｍＩ（
５０℃以上）では容１に失活し−１０−１１に最適−を
有する。 このような理化学的性質を１１ｆる本ｍｖｓｅｙａ嵩を
、全知０ＩＩＩ似０アルカ１Ｊプ■テア−せと比較検討
した・ 従来、ダツ五陽性細菌０１１１１１外アルカリグロチア
ーゼにりいては、バチルスリツケエアオルミス（藤ａｅ
ｉｌｌｓｉｓ １１＠に＠ｍｌｆｅｒｍ１ｍ）０＆寓す
るアルカリゾ協テアー餐、バチルスオツチ讐ス０ａｓｌ
ｌｌａｓｓ−ｂｔｉｔｌｅ）０４−虹＝１獣＝ニー゛る
アルカリゾ−テア−ｆ（／プチリシンノが）等が周知で
ある。 これら０４）酵素はと％に分子量がｌＨｆ、０００〜３
０．０００ 、等電点９〜１１０−化学一懺質を有し、
活−中心に七りン職基をもり−に９ｙｆａテアーゼであ
ゐ、そｔ）ＦｌｉＰＫ１１９！ｌｉｌれているΔチルス
Ｏ生産する細胞外アルカリｆｔｓテア−ぜも分子量が２
＆０００〜３０．０００．等電点が９〜１１０９■を有
する４０が多い、そして以上の大部分は−１０゜もＯで
ある・ノぐチルスＯ生寓する低い分子量を有するアルカ
リプロテアーゼとしては、Δチルス雇Ｄ−８０アルカリ
ｆａテアー−１１−１，１１−４が全知であるが、両者
唸共に分子量ｇｏ、ｏｏｏｏ酵素であ〉、共に４ｓ、Ｏ
，ｓＯ℃Ｏ鵬轟運をしても滑性は全く低下しａｈ（４１
Ａ１１ＳＩＩ−４１３１５）ｅ更に弛ＯＡテルスＯ生産
するアルカリｆａテア−ぜとし−Ｃ、バチルスアルカロ
アイルスＭＣｌ１１０４３＠曹アルカリｆロチアーゼ、
同１０４３１１薗アルカリｆロチアーゼが知られている
が、これｂ拡いずれも第１表に示すように４ｔｏ、ｓｏ
℃、１０分間０１１ｋＪ６１１ＫＴｈｈ１９０１Ｇ内外
Ｏ活性を保持する。 夏に前述ＯΔチルスリ、ケニ７オ＃ｔス薗０アルカリゾ
ロテア−髪中パテルスオブチリス曹Ｏアルカリプロテア
−誓は−１０，！！ＯＣ，１０分間０１１１ｍ１ｍで７
０〜８０１１０９性を有する（第１１゜このように、従
来全知ＯΔチルスＪｅｆテリスをはじめ／ぐテルス翼組
曹Ｏ生寓するアルカリプロテアーゼは比較的高い温度領
域で安定である。しかるて述べたように−１０，１０分
間加熱処理で４０を以下では安定であるが、５０℃で大
部分の酵素活性を失う特徴を有する。を九１１Ｈ８，１
０分間加熱処理では５０℃附近で失活が蛤ま〕、６０℃
で活性は殆ど失われる。 このような４Ｉ黴的な温度安定性、および前述の分子量
、等電点並びにア建ノ酸龜威等０１ｌＩ性質からみて、
本酵素は従来知られ九バチルス翼組曹Ｏ生産するアルカ
リプロテア−４’０いずれとも異なる別種０４ｂＣ）で
文献未記載である。よりて、本酵素を新規酵素と認定し
、アルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１と命名しえ。 本発明の新規な酵素ｒ ＡＰＩ−２１Ｊは、以上述べ丸
ようＫＦＨ７〜１１．Ｓで安定で、４１０〜１１位で最
適活性を示すとζろよシ洗剤ビル〆−と混用可能である
。従って洗剤用酵素として効果的である。４１に本酵素
「♂ｌ−２１Ｊは従来の洗剤用酵素に比し、比較的低温
（２０〜３０℃）でも高い相対活性を維持する。従って
、我■におけるように室温水で洗濯する習慣を有する−
において、本酵素は一般家庭用洗剤の助剤として使用す
るアルカリプロテアーゼとして、最も好ましいタイｆＣ
Ｊものである。を九近時に訃いては、生活廃秦物あるい
は生活廃水中にタン／譬り質が増加する傾向にあるが、
これら廃集物処ＩＩＴｏるいは汚水処ＩＩＯ段階で、本
酵素を利用することＫよシタンノ譬り質の迅速な分解を
促がし窒素資源０＊ｍ再利用が可能である。また、食品
加工など食品工業へｔ）ｆロチアーゼの利用に際しては
、本酵素を利用することによシ、加工利用後５０〜６０
℃程度の比較的低い温ＩＩ旭理によりて簡単に酵素活性
を失活させることがで自る・従りて、本酵素はまた加工
食品の品質管理上、効果的な酵素である。 以下余日 次に本発明の実施例について説明する。 実施例１ 本俸＊０新曹株［８−２１号薗を用い、ζＯ曹株Ｏ斜面
培養物を殺菌水に懸濁させ、その０．５−を種菌とした
。 酵素゛生産検地にカゼインＩＩＧ、ミートエキス１−１
ぼりペプトイｌ−９および炭酸水素ナトリウム１−から
なる培地を水酸化ナトリウムにて−９，５あるいは７．
２に調整した。 ロータリーシエイカーによる振盪培養（４）においては
、いずれもＦＨ９，ＳＫ調整した上記培地を１ｊ容Ｏエ
ルレンマイヤーフツ平プ中＆ｃ１００１１Ｊ。 ２００ｗＬ１．３００−人れ！曹後、種菌０．ｂ−を添
加し２０±ｉ℃０温直で２００ ｒｐｉｍ４Ｄ振量条件
でＮＫ１１−２１号菌性４１．６！ｉ、１ｌＧＤ各時間
培養しアルカリプロテアーゼムＰＩ−２１を生産させえ
。 一方、往復振盪培養（６）においては、上記培地を−９
，５あるいはｌｌ）１７．２に調整した培地１００−を
５００−審の坂ロフラスコに入れ殺菌後、種菌０．５−
を接種し３０℃で往復振盪培養をし丸。 所定の時間培養し九培養物を２８０００Ｇ 、１６分間
遠心分離をし１体を分離し清澄な培養上清涼を得た。得
られたそれぞれの培養上清涼中のアルカリグロチアーゼ
活性を前記グロテアーゼ活性測定法Ｋｌ！りて測定し、
次の結果を得え・ムζロータリ振盪培養法（２０℃、培
地の初発−９，５） Ｂ＝往復振盪培養法（３Ｇ℃） ９、５ ４．５ ３．０７、２
４．９ ３．４以上の結果、本酵素生産の
ための小規模培養においては、１１容エルレンマイヤ−
７ラスプ中Ｋａ ｏ ｏｗＪｏ上記培地を入れ、２０℃
でロータリーシェカーによ〉振盪培養（４）すると６５
時間で最高の比活性ならびに最高のプロテアーゼ生産量
が得られた。 順ト２１菌性を３０℃で往復振盪培養（６）すると自、
培地の初発は−が９．５のみならず−７，２で４ＮＫｉ
ｌ−２１号薗の生育は良好であ）、そしてまたアルカリ
ｆａテアーゼＡＰＩ−２１０生童も高い結果が得られえ
、培地の初発−が９．５のみならず、−７，２でＮＫ８
−１１号薗を培養する場合、培養温度は２０℃の往復振
盪培養でも、３０℃培養の場合と類似の結果が得られえ
。 上記のような操作によりｅ九ＮＫｇ−２１号薗の培養後
の遠心分離上清涼７Ｉを３℃に冷却し、これに予め３℃
に冷却しておいたエチルアルプールを加え生成した沈殿
を冷却遠心分離機で１１，０ＯＯＧで遠心分離し、ただ
ちに真空凍結乾燥させ酵素粉末１５．’ｌｌ／を得た。 タン／ｆり質１時轟ルのアルカリｆａテアーーｖ１０比
活性は０．７１マイクロカタール（Ｑ、７１バａｔａｌ
Ｊ９・タンパク質）であシ、回収率は３３−であり九、
タンΔり質はローリ−法によ〉測定した。 このようＫして調製した凍結乾燥酵素標品を０、２ Ｍ
食塩を含む０．０ＩＭ炭駿ナトリウムーホウ酸−塩化カ
リウム緩ＩＩ液（４１０，０）Ｋ＠ｓｌ、、、同緩衝液
で平衡化したセツアデ、タスＧ−７５０カツム（２国Ｘ
７４傷）Ｋよ〉ゲル、−過を行ない、溶出液を３−ずつ
分画し九、タンノ々り質はローリ−法によ）、アルカリ
！ロテアーー４／活性は上述０ようにＰＨＩＧで測定し
丸０以上の操作によシ糟展酵素を得え、比活性は約１０
僑上昇し、タンパク質１ｋｊ轟−にシの比活性は７．０
マイクロカタールであった８回収率は７０チであり九。 実施１ｐ１２ アルカリグロチアーゼ生意ｑＮＫｇ−２１４藺を用い、
５００１発酵タンクによるアルカリプロテア−４ｕｌ−
２１生意とそれに続く酵素剤ＯＩＩ造を行な−）た、酵
素主意培地はカゼイン１１ｇ、ミートエキス１−１４リ
ペプトン１１．嶽駿水素ナトリウム１ｓからなる培地な
、水酸化ナトリウムによりｐＨ９，５ＫｍＩＩＩＩした
。上記の培地をまず１ノ容のエルレンマイヤ−７ツスゴ
に３００−添加し殺菌後、実施例１で述べえ如く種菌０
．５−を加え、２０℃で３日間場曽し九、この培１１１
１３ｏｏ＠Ｉを予め上記の培地１０１を含む殺菌し九３
０１ジャーファメンター中に添加し、２０℃で３日間通
気攪拌培養をした。攪拌は４０ Ｏｒｐｅｓ 、通気は
１２ｊ／分であうえ、３０！容ジヤー７アメンターで３
日培養した培養液１０ｊを無菌的に予め殺菌した２２０
Ｉの上記培地を含む５００１容の発酵タンクに移し、２
０℃で４日間の通気攪拌培養をした。攪拌は４００ ｒ
ｐｒｍ ＊通気は２００１／分でありた。培養終了後、
培養物を冷却連続遠心分離機によυ１１．０００Ｇで遠
心分離し１体を除去し清澄な培養上清ｔ２Ｇ０Ｊを得た
。培養土清液を３℃に冷却し、これに予め３℃に冷却し
た２倍量Ｏエチルアルプールを加えアルカリグロテアー
ゼムＰＩ−２１ヲ沈殿させえ、沈殿したアルカｊＪ ｆ
ａテア−髪ムＰ！−２１は冷却連続遠心分離機で約１
１，０ＯＯＧで遠心分離し、直ちに真空凍結乾燥をし、
次に示す凍結乾燥アルカリグロチアーゼＡＰＩ−２１酵
素標晶を得た。 回収酵素重量ＣＩ） １２３Ｇ比活性（マイク
ロカタール／＃） ０．５２回収率ｉ）
７０ 上記で得九−素裸晶を実施例ＩＫ従って精−したところ
、分子量２２００Ｇ、等電点７．４のアルカリグロチア
ーゼが得られた・このアルカリゾロチアーゼの酵素標晶
紘、ＦＨＩＯで５０℃、１０分間の熱処理によシネ安定
な、低温活性ｍｏ本発明のアルカリグロチアーゼＡＰＩ
−２１であ−２え。 ４、 ８面の簡単な説明 第ｉｌｌは本実ＷＩＩ４の酵素の最適−を示すグラフで
あシ、 第２ＩｌＩは本発明の酵素の一安定性を示すグツ７であ
夛、 第３図は本発明の酵素の作用温度範囲および最適温度を
示すグラフであり、 第４図（へ）および第４図（→は、それぞれ本発Ｗ１４
０酵素の−１０および一８ＫｓＰける温度安定性を示す
グラフである。 第５図は本発明に従った酵素のフーリエ変換赤外吸収ス
ペクトルを示すダラ７図である。 特許出墓人 昭和電工株式金社 特許出願代理人 弁理士 實 木 網 弁理士 酉 舘 和 之 弁理士 石 １） 敬 弁理士 山 口 昭 之
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、下記の（幻ないしく３）Ｃ）環化学的性質ｔ−有す
るアルカリグロチアーゼＡＰＩ−２１゜ （υ 作用 最適ｐＨＮｊＡＷ！Ｊが１０〜ｌｌであるアルカリ性領
域でカゼインを７Ｊｌｌｌ水分牌し、その最適作用温度
が４５〜５０’Ｃである。 （２）安定性 ｐＨ１０，１０分間の加熱錫１による＃素活性の低下Ｈ
，４Ｇ’Ｃ１で認められないが。 ５０℃ではその９０嘔以上の活性が失われ。 ｐＨｓ、ｔｏ仕分間７Ｊｌ熱処瑠の場合５０′″Ｃで失
活が始１５．６０′″Ｃでは１１埋完全に失活する０ア
ルカリ性（％ＪＩＣｐＨ８〜１１．５ ）テ安定であり
、凍Ｉａならびにａｌ［Ｊ１１乾燥に対して安定である
０ （３）＃素分子 ゲル濾過法にて測定した分子量が２２，０００：等電点
がｍ７．＋：紫外４１［＆収スペクトルが２７５乃ｍ２
８ＧｓｍＫ極大吸収ｔｌｆし：赤外４１ＦＩ＆収スペク
トルが波数３３００，３０００゜１６５０．１５５０．
１４５０，１４００及び１２５０ｃＩＲ−”付近に主な
吸収帝を有し：活性基にセリン残基ｔｖする蛋白質であ
る０２、バチルス属に属しアルカリグロチアーゼＡＰＩ
−２１ｌ生産する新−株パチルス属ＮＫＳ−２１号ａｌ
ｔアルカリ性培地に接種して層重し、培養物よｐアルカ
リ側に最適駈ｔ−有するアルカリグロチアーゼＡＰＩ−
２１ｆ採取することｔ−ｗ黴とする新規なアルカリプは
テアーゼＡＰＩ −２１の麹造方法。
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