JPS62210981A - 新規微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はシュードモナス属に属する新規な微生物に関す
る。

〔従来の技術〕

工業的油脂の加水分解は従来高温高圧加水分解法によシ
行われているが、この方法は、高温高圧条件のプロセス
であり高エネルギーを必要とする。

これに対し酵素を利用するリパーゼ加水分解法は、常温
常圧領域の温和な条件で反応を行うことができる省エネ
ルギー型の有効なプロセスである。工業的にリパーゼ油
脂加水分解を行うＫは油脂、特に対象となる牛脂やパー
ム油等の高融点油脂の加水分解率が高＜（９０％以上）
、耐熱性を有するリパーゼが必要である。

これまで油脂加水分解用リパーゼとしては酵母カンデイ
ダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｒｕｇｏｓａ　）の生
産するリパーゼが知られている（名糖産業製　リパーゼ
ＯＦ）。このリパーゼはオリーブ油をはじめ各種油脂を
３０℃で９０％以上分解する能力を有しているが、４５
℃以上では不安定であシ失活し易く、パーム油等の高融
点油脂の加水分解には適していない。

耐熱性を有する油脂加水分解用リパーゼとしては、シュ
ードモナス　メフイテイカの生産するリパーゼ（公告昭
５０−２５５５３　）およびシュードモナス　フルオレ
ッセンスの生産スるリパーゼ（公告昭５７−５２８３５
　）が知られているが、前者は高加水分解率（ヤシ油９
２％）を得るのに塩化カルシウムが必要であり（Ｋｏｓ
ｕｇｉ他Ｊ。

Ｆ’ｅｒｍｅｎｔ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、　４９　、９６
８　（１９７１）　）、塩化カルシウムを添加すると分
解後に金属石熱が生成して脂肪酸の回収を悪くする欠点
を有している。また、後者は分解率の面では牛脂を５０
℃で３８９　ｕｎｉｔ／ｇ−ｏｉｌ　のリパーゼで９４
．９％分解するが（公告昭５７−３９６３８）、この分
解率に達するには７０時間を要する。さらに、牛脂を１
２あだ９１４０　ｕｎｉｔのリパーゼで加水分解すると
、分解率は２４時間後に６２％に達し、９６．９−の分
解率を得るのに１２０時間という長時間を必要とする。

この酵素を用いて牛脂を加水分解するには、長時間を要
するため工業的利用には適さない。

また、他に、シュードモナスＵＫＯ−８１６株の生産す
るリパーゼ（公開昭５８−１４６２７７）が耐熱性を有
していることが知られているが、このリパーゼは分子量
が２０００万以上という超高分子であり、比活性（、単
位重量当世りのリパーゼ活性）が低くなるという欠点を
有している。

〔発明が解決しようとする問題点〕

工業的油脂の加水分解の油脂原料としては、牛脂だけで
なく、よシ融点が高く飽和脂肪酸含有量の高いパーム油
も多く用いられる傾向にある。工業用リパーゼには、こ
れらパーム油、牛脂をできるだけ短時間によシ高い加水
分５（９０％以上）を行い、且つ熱安定性が高いことが
要求される。

〔問題点を解決するだめの手段〕

そこで本発明者らは工業用油脂の加水分解に適した高加
水分解率、耐熱性を示すリパーゼ生産能を有する微生物
を広く検索した結果、栃木県芳賀郡市貝町の土壌より分
離したシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）属
に属する微生物に斯様な能力を有するものがあることを
見い出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、シュードモナス属に属し、工業用油
脂の加水分解に適したリパーゼ生産能を有する新規なシ
ュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　Ｓ
ｐ、　）　Ｋ　Ｓ　Ｍ　−１６（微工研菌寄第８５３８
号）を提供するものである。

シュードモナス・エスピーｘｓＭ−１６は下記の菌学的
性質を有する。

（Ａ）形態 ■細胞の形及び大きさ かん状 幅　　　０．７５−１．０μｍ 長さ　２．３−２．５　　μｍ ■運動性あシ ベン毛は一本以上あり。

■胞子 なし （４）グラム染色 陰性 ■肉汁寒天−板培養 円形、乳白色のコロニーを形成９表面　滑らか、光沢あ
り、全縁、隆起 ■肉汁外大斜面培養 普通 ■肉汁液体培養 ３０℃、２日で菌膜形成、一様に混濁 ■肉汁ゼラチン穿刺培養 液化せず （５）リトマスミルク 凝固およびリトマスを還元した。

（Ｃ）生理学的性質 ■硝酸塩の還元　　　　　十 ■脱窒反応　　　　　　　− ■ＭＲテスト　　　　　　− （４）ＶＰテスト　　　　　　− ■インドールの生成　　　− ■硫化水素の生成　　　　− ■デンプンの加水分解　　− ■クエン酸の利用　　　　Ｋｏｓｅｒ＋　Ｃｈｒｉｓｔ
ｅｎｓｅｎ＋■無機窒素源の利用　　　ＮＨ，＋ＮＯ３
＋［株］色素の生成　　　　　　ＫｉｎｇＡ−Ｋｉｎｇ
Ｂ　　　−■ウレアーゼ　　　　　　− ■オキシダーゼ　　　　　＋ Ｏカタラーゼ　　　　　　＋ ０生育の範囲 生育　４２℃＋、４５℃＝、５℃− 増殖温匿＠囲　　　２０−４３℃。

増殖至適温度範囲　３０−３７℃　　゛ｏｒａ素に対す
る態度　　好気的 （１６）ＯＦテスト　　　　　　０（酸化的）■糖類か
ら酸およびガスの生成 の臂無酸 Ｌ−アラビノース　　　　　− Ｄ−キシロース　　　　　＋ Ｄ−グルコース　　　　　＋ Ｄ−マンノース　　　　　十 〇−フラクトース　　　　＋ Ｄ−ガラクトース　　　　＋ マルトース　　　　　　　＋ ショ糖　　　　　　　　　十 ラクトース　　　　　　　　十 トレハロース　　　　　　　＋ Ｄ−ンルビット　　　　　　＋ Ｄ−マンニット　　　　　＋ イノシット　　　　　　　＋ グリセリン　　　　　　＋ デンプン　　　　　　　　　− サリシン　　　　　　　　− ラフィノース　　　　　　− 以上の糖類からガスの生成はなかった。

（Ｄ）炭水化物の利用 Ｄ−グルコース　　　　　　　＋ Ｄ−キシロース　　　　　　士 Ｄ−リボース　　　　　　　士 Ｌ−ラムノース　　　　　　　− レプリン酸　　　　　　　　　− Ｄ　　　　　　　　− ｍｅｓｏ−酒石酸　　　　　　　十 ｍｅｓｏ−エリスリトール　　　− アドニトール　　　　　　　　− メサコン酸　　　　　　　　　− シトラコン酸　　　　　　　− Ｌ−バリン　　　　　　　＋ ｍ−ヒドロキシ安息香酸　　− ２，３−ブタンジオール　　＋ ベタイン　　　　　　　　　　＋ アルギニン　　　　　　　　＋ 、以上の菌学的性質から、パージェのマニュアル、オプ
、デイタミネイティブ、バクテリオロジー第８版（Ｂｅ
ｒｇｅｙ’ｓ　ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　８　ｔｈ、　ｅ
ｄ、　）により検索した結果、本菌に類似の菌株として
シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
ｃｅｐａｓｉａ　）が挙げられる。そこでシュウトモナ
ス・セパシア（Ａ、Ｔ、Ｃ，０，１０５８６）を本囚と
同東件で培養し各性質を比較したところ、次に示すごと
く各性質において異なっていることが判明した。

リトマスミルク　　　　凝固　　　　　液化炭水化物の
資化性 アドニトール　　　　　　　　　　　　　　　＋ｍ−ヒ
ドロキシ安息香酸　　　−十 色素生成　　　　　　　　　　　　　　　　＋（黄褐色
）これらの諸性質の差異から本リパーゼ生産菌は公知菌
のいずれとも異なる新菌株と判断し、シュードモナス・
エスピーＫＳＭ−１６と命名し、昭和６０年１２月２日
に通産省工業技術院微生物工業技術研究所へ寄託した。

その微生物受託番号は微工研菌寄第８５３８号である。

本発明のＫＳＭ−１６株を用いてリパーゼを製造するに
は、ＫＳＭ−１６株が良好に生育し、リパーゼを順調に
生産するために必要な炭素源、窒素源、無機塩等を含む
培地中でこれを培養し、該培養液から採取することによ
シ行なわれる。

培地の組成については、通常シュードモナス属に属する
微生物の培養に用いられるものであれば特に限定されな
い。例えば、窒素源としては各種無機態窒素と各檀有機
態窒素及びその組合わせが′利用できる。特に単独系と
してはペプトン、肉エキス、尿素などが有効である。炭
素源としてはグルコースなどの糖類、オリーブ油等の各
種油脂、脂肪酸、脂肪酸エステル、及び脂肪酸誘導体等
を用いることができる。無機塩類としては硫安、リン酸
１カリ、リン酸２カリ、硝酸ナトリウム、硫酸マグネシ
ウム等の添加が有効である。その他必要に応じて、菌の
生育、酵素の生産に必要な各櫨有機物、無機物を添加す
ることができる。

培養には、液体培養が適している。培養温度は先にしめ
したように２０−４２℃で培養でき、なかでも３０−３
７℃がもつともよい。また好気的に培養することにより
、約１−２日でリパーゼの生産性は最高に達する。この
ようにして得られた培養液からリパーゼを得るには、菌
体を遠心分離、ろ過により分離した後、上澄液を有機溶
剤（アセトン、エタノール等）による沈殿、硫安による
塩析法、あるいは限外ろ過膜（アミコン社製　分画分子
［３００００）により濃縮回収することができる。

得られたリパーゼを精製するには、培養液の濃縮液を硫
安沈殿、エタノール沈殿により得た酵素液をＤＥＡＥ−
セルロース等のイオン交換体、セファデックス等による
ゲルろ適法など一般に知られている蛋白質精製法が利用
できる。これらの精製法により比活性の高められた酵素
液は、凍結乾燥することにより酵素粉末を得ることがで
きる。

本発明のＫＳＭ−１６株を利用して得られるリパーゼの
理化学的性質は次の通シである。

１、　作用 パーム油、オリーブ油、牛脂、ヤシ油を反応温度６０℃
、２４時間で９０％以上分解する。

特にパーム油は９３チ以上分解する。

２、基Ｘ％異性　各種グリセライド、エステルなどを分
解する。

特に飽和油脂を選択的に分解する。

油脂の種類　分解率（５０℃、２４時間。

１０００　ｕｎｉｔ／ｇ−ｏｉｌ　） パーム油　　９１．７％ オリーブ油　８２．１％ ヤシ油　　　７３．１％ 牛脂　　　　８９．１％ ３、安定ｐＨ範囲 ｐＨ３−１２，（３０℃、　２４　ｈｒ後の残存活性９
図１） 作用至適ｐＨの範囲 ｐＨ６−７，５（図２） ４、作用適温の範囲６５−８０℃　（図３）至適温度　
７０℃ ＆　力価測定法 オリーブ油９ｄを１５０ｄ用コツプに分注する。つぎに
０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を１４ｍ１取シ
５０℃に加温する。マグネチツクスターラーで反応液を
均一に攪はん（８００ｒμｍ）しながら酵素液を加えて
反応を開始し、一定時間（３０分）反応させた後アセト
ン、エタノール（１：１）混液を２０−加えて反応を止
める。

この液にトウィーン８０　（Ｔｗｅｅｎ　８０　）　１
０　％溶液を１−加え、反応で生成した脂肪酸をｐＨ電
極を用いた自動中和滴定装置（Ｍｅｔｔｌｅｒ社製ＤＬ
４０ＲＣ）によシ０．５　Ｎ水酸化カリウム（アルコー
ル性）溶液で滴定する。酵素力価は１分間に１マイクロ
モルの脂肪酸を遊離させる酵素量を１単位とした。

６、　　ｐＨ，温度などによる失活の条件３０℃および
５０℃、３時間の熱処理ではほとんど失活はないが、７
０℃、２時間の熱処理では約４０チ失活する１図４）。

酵素液に塩化カルシウム１ｍＭ加えることによシフ０℃
、２時間の熱失活が３０％に減少し、熱安定性が上昇す
る。１０−８０℃の各温度で１０分間熱処理した後の残
存活性率を図５に示す。

２　阻薔、活性化および安定化 胆汁酸の影響なし 無機塩類の影響 各金属塩が反応系に１ｍＭ濃度共存する条件で５０℃で
３０分酵素反応を行わせ、塩類を入れない場合の活性を
１００としてそれぞれの活性を表した。

金属塩 なし　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・　
１００ＣｕＳＯ４・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・　３２ＭｇＳＯ４・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・　８８ＭｇＣ２２・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・　８３ＫＣ１・・・・・・・
・・・・・・・川・・・・　　９６ＮａＣｔ　・・・・
・・・・・・・・・・・・−・・・・　９５ＣａＣ１ｚ
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・　１００
ＣｏＣ１２・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・　７１ＨｇＣ１，・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・　７５ＺｎＣ１，２・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・　　　１１０ＦｅＣ１・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・　　　１０８、　分
子量 ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法では２９０
００ ゲルろ過（セファデックス　Ｇ−７５）法によると３０
０００である。

９、　糖含有量　オルシノール反応による糖発色十〔作
用および発明の効果〕 本発明のシュードモナス・エスピーＫＳＭ−１６は、工
業用油脂の加水分解に適した高加水分解率、耐熱性を有
するリパーゼを生産する。

〔実施例〕

次に実施例及び参考例を挙げて本発明を説明する。

実施例１ （１）栃木県芳賀郡市貝町周辺の土壌を採取し、土壌小
さじ一杯を滅菌生理食塩水１０ｍの入った試験管に入れ
、１分間ポルテックスミキサーにて懸濁分散させた。約
１時間静置後、その上澄液を０．２−採取し、これを下
記方法で調製された分離用寒天培地の表面にコンラック
棒で均一に塗布した後、３０℃で培養した。

（分離用寒天培地の偶製） 培地組成 トリブチリン　・・・・・・・・・・・・・・・　０．
１％（ＮＨ４）ｚｓｏ＜　　　・・・・・・・・・・・
・・・・　０．５％ンイトン　　　・・・・・・・・・
・・・・・・　０．５％酵母エキス　　・・・・・・・
・・・・・・・・　０．１％Ｋｌ（ＩＰＯ４・・・・・
・・・・・・・・・・　０．５％ＭｇＳＯ４”７Ｈ冨Ｏ
・・・・・・・・・・・・・・・　０．１％寒天　　　
　　・・・・・・・・・・・・・・・　２．０％ｐＨ４
，５（ＨＣｔで１４製） 調製方法 上記組成のうちトリブチリン、および寒天を別滅菌し、
滅菌後これらｉ無菌的に合せ、シェーカーでトリブチリ
ンを均一に分散させた後、保温下で滅菌シャーレに一定
量分注し不透明な平板寒天培地とした。

（２）−次いで、上記培養によシ生育したコロニーのう
ち、周辺にトリブチリンを分解し透明環を形成するコロ
ニーの１白金耳を滅菌生理食塩水で１００倍希釈し、こ
の希釈液１白金耳を前述の分離用寒天培地と同組成の寒
天培地に画線し、３０℃で３日間培養した。生じた複数
のコロニーが相互に相違しないことを肉眼的および顕微
鏡的に観察することにより確認した。さらに上記コロニ
ーを再匿同じ操作を行い単一性を再確認した。上記菌株
の各培地上の性状および生理学的性質は前述した通りで
ある。

（３）次いで、上記で純粋培４Ｉ−された斜面培地上の
菌株よシ１白金耳を滅菌した１０％グリセリン水ｆＦＪ
　ｔＬ　（２ｍｌ　）の入った凍結用バイアルに懸濁し
、−８０℃にて凍結保存する。かくして３力月凍結保存
後、迅速に解凍して得られる懸濁液の１白金耳を普通寒
天培地に蘇生後、前記と同条件下に各培地上での性状お
よび生理学的性質を調べた結果、凍結前とは変化が認め
られなかった。

参考例１ ペプトン（Ｄｉｆｃｏ製）４％、グルコース０．５％、
ＨｚＨＰＯａ　０．１％、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈｔ００．０
５％、オレイン酸０．５　％よりなる液体培地１００ｍ
ｊを５００ｍｔ容坂ロフラスコに入れ１２１℃１５分間
加圧蒸気滅菌した後、あらかじめ同培地で３０℃２４時
間振とう培養したシュードモナス・エスピーＫＳＭ−１
６株の前培養液１−を接種し３０℃４８時間撮とう培養
した。培養液を遠心分離して菌体を除いた上澄液の活性
は２０　ｕｎ　ｉ　ｔＡであった。

参考例２ 尿素０．４チ、グルコース０．５％、Ｋ２ＨＰＯ４０，
１チ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ１００，０５％、酵母エキス０
．１％、オレイン酸０．５　％より成る液体培地１００
　ｆｆ１ｔを５００−容坂ロフラスコに入れ１２１℃１
５分間加圧蒸気滅菌した後、あらかじめ同培地で３０℃
２４時間振とう培養したシュードモナス・エスピーＫＳ
Ｍ−１６株の前培養液１　ｍｌを接種し３０℃３日振と
う培養した。培養上澄液のリパーゼ活性は１４０　ｕｎ
ｉｔ／−であった。

参考例３ ペプトン４％、グルコース０．５％、ＫＨ２ＰＯ４０，
１％、ＭｇＳＯ４・、７Ｈ２００，０５％、オレイン酸
０．５％よシなる２ｔの培地を５′を容のジャーファー
メンタ−に入れ１２１℃１５分間加圧蒸気滅菌したのち
、あらかじめ同培地で３０℃２４時間振とう培養したシ
ュードモナス・エスピー　ＫＳＭ−１６株を１００−の
培養液を加え３０℃３００ｒμｍで４８時間培養した。

培養後、菌体を遠心分離して除いた培養上澄１．５ｔの
活性は３０　ｕｎｉｔ／−であった。培養上澄を３００
−まで限外ろ過（アミコン社製　ダイヤフロー膜　分画
分子量１００００　）によシ濃縮した後、凍結乾燥して
粗酵素粉末１０２を得た。酵素粉末には３０００ｕｎｉ
ｔ／７の活性が認められた。

参考例４ 参考例３で得た粗酵素粉末を用いてパーム油、ヤシ油、
牛脂、オリーブ油の分解をおこなった。

三角フラスコに油１ｔに対し、酵素１０００ｕｎｉｔ、
油対水（１：１）で振とうさせ加水分解した。４８時間
後の名演の分解率は、パーム油９２チ、ヤシ油９０．９
％、牛脂９０゜１％、オリーブ油８６．３チであった。

参考例５ 参考例３で得た粗酵素粉末を用いてパーム油の加水分解
を行った。三角フラスコに、油１２に対し酵素１６０　
ｕｎｉｔ、油対水（１：１）で加え振とうさせ加水分解
した。２４時間抜パーム油の分解率は９２チであった。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明ＫＳＭ−１６株を利用して得られルリパー
ゼのｐＨ３〜１３の範囲における３０℃２４時間処理後
の残存活性を示す図面である。 図２は、本発明ＫＳＭ−１６株を利用して得られるリパ
ーゼのｐＨ３〜８の範囲における比活性を示す図面であ
る。 図３は、本発明ＫＳＭ−１６株を利用して得られるリパ
ーゼの各温度条件下における比活性を示す図面である。 図４は、本発明ＫＳＭ−１６株を利用して得られ、るリ
パーゼの各温度条件下での処理時間と残存活性との関係
を示す図面である。 図５は、本発明ＫＳＭ−１６株を利用して得られるリパ
ーゼを各温度条件下で１０分間処理した場合の残存活性
を示す図面である。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の菌学的性質を有するシュードモナス・エスピ
   ー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＫＳＭ−１６（
   微工研菌寄第８５３８号）。 （Ａ）形態 （１）細胞の形及び大きさ かん状 幅　０．７５−１．０μｍ 長さ　２．３−２．５μｍ （２）運動性あり ベン毛は一本以上あり。 （３）胞子 なし （４）グラム染色 陰性 （Ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養 円形、乳白色のコロニーを形成、表面　滑らか、光沢あ
   り、全縁、隆起 （２）肉汁寒天斜面培養 普通 （３）肉汁液体培養 ３０℃、２日で菌膜形成、一様に混濁 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養 液化せず （５）リトマスミルク 凝固およびリトマスを還元した。 （Ｃ）生理学的性質 （１）硝酸塩の還元　＋ （２）脱窒反応　− （３）ＭＲテスト　− （４）ＶＰテスト　− （５）インドールの生成　− （６）硫化水素の生成　− （７）デンプンの加水分解　− （８）クエン酸の利用　Ｋｏｓｅｒ＋　Ｃｈｒｉｓｔｅ
   ｎｓｅｎ＋ （９）無機窒素源の利用　ＮＨ＿４＋ＮＯ＿３　＋ （１０）色素の生成　ＫｉｎｇＡ−　ＫｉｎｇＢ− （１１）ウレアーゼ　− （１２）オキシダーゼ　＋ （１３）カタラーゼ　＋ （１４）生育の範囲 生育　４２℃＋、４５℃−、５℃− 増殖温度範囲　２０−４３℃、 増殖至適温度範囲　３０−３７℃ （１５）酸素に対する態度　好気的 （１６）ＯＦテスト　Ｏ（酸化的） （１７）糖類から酸およびガスの生成の有無 　　　　　　　　　酸 Ｌ−アラビノース　− Ｄ−キシロース　　＋ Ｄ−グルコース　　＋ Ｄ−マンノース　　＋ Ｄ−フラクトース　＋ Ｄ−ガラクトース　＋ マルトース　　　　＋ ショ糖　　　　　　＋ ラクトース　　　　＋ トレハロース　　　＋ Ｄ−ソルビット　　＋ Ｄ−マンニット　　＋ イノシット　　　　＋ グリセリン　　　　＋ デンプン　　　　　− サリシン　　　　　− ラフィノース　　　− 以上の糖類からガスの生成はなかつた。 （Ｄ）炭水化物の利用 Ｄ−グルコース　＋ Ｄ−キシロース　＋ Ｄ−リボース　＋ Ｌ−ラムノース　− レプリン酸　− Ｄ−酒石酸　− ｍｅｓｏ−酒石酸　＋ ｍｅｓｏ−エリスリトール　− アドニトール　− メサコン酸　− シトラコン酸　− Ｌ−バリン　＋ ｍ−ヒドロキシ安息香酸　− ２，３−ブタンジオール　＋ ベタイン　＋ アルギニン　＋