JPH07184646A - 新規なα−Ｌ−フコシダーゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】糖タンパク質、糖脂質などの複合糖質中のＬ−
フコースを遊離する作用を有するα１−２−Ｌ−フコシ
ダーゼの製造方法を提供する。 【効果】本発明のα１−２−Ｌ−フコシダーゼは糖タン
パク質、糖脂質などの複合糖質糖鎖の非還元末端にα１
−２結合しているＬ−フコースを特異的に遊離させる性
質を有しているので、複合糖質糖鎖の構造解析や糖鎖の
機能研究に極めて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、α１−２−Ｌ−フコシ
ダーゼ及びその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】高等動植物に存在する糖タンパク質ある
いは糖脂質などの糖鎖にはフコースを含むものが、きわ
めて一般的に見いだされる。これらのフコースを含有す
る糖タンパク質あるいは糖脂質は、種々の生命現象に重
要な役割を担っていることが次第に明らかにされつつあ
る。これらの生命現象において、複合糖質糖鎖中のフコ
シル基が生体内においてどのような役割を担っているの
かを明らかにするためには、インタクトな複合糖質か
ら、フコースのみを特異的に遊離させ、無傷で残った複
合糖質の機能を調べる必要がある。

【０００３】糖鎖のα１−２−Ｌ−フコシル結合に作用
し、フコースを遊離する酵素としてα−Ｌ−フコシダー
ゼが知られており、動物、植物、微生物など自然界に幅
広く存在している。

【０００４】これらのα−Ｌ−フコシダーゼのうち、パ
ラニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドなどの合成基質に
作用するα−Ｌ−フコシダーゼ、例えばホラガイ由来の
酵素（Biochem.J. 279 189-195 (1991)）、あるいは、
ヒト血清由来の酵素（J.B.C257 714-718 1982）は、基
質特異性が広いため、α１−２−Ｌ−フコシル結合等の
特定の結合のみを切断して機能を調べたい場合には使用
することが出来ない。また、これらはオリゴ糖には良く
作用するが、複合糖質から直接Ｌ−フコースを遊離する
作用は非常に弱い。

【０００５】他方、上記合成基質に作用せず、天然基質
にのみ作用する酵素は、厳密な基質特異性を有してい
る。例えば、アスペルギルス属由来の酵素には、α１−
６フコシル結合のみを加水分解するもの（Biochem.Biop
hys.Res.Commun 136 563-569 (1986)）、あるいは、α
１−２フコシル結合に作用するもの（J.Biol.Chem. 245
299-304(1970)）が知られている。また、バチルス属由
来の酵素として、α１−２フコシル結合に作用するもの
が報告されている(J.Biochem.74 1141-1149(1973))。

【０００６】しかし、アスペルギルス属由来のα１−２
フコシル結合のみを加水分解する酵素は至適ｐＨが３．
６−４．０と酸性側にあり、細胞に直接作用させるには
不利である。しかも精製が困難であるため、他の糖質分
解酵素やタンパク分解酵素などが混在する可能性がきわ
めて高く、目的とする部位以外の部位が酵素作用を受け
る危険性がある。バチルス属由来のα１−２フコシル結
合に作用する酵素は、菌体内酵素であるため多量に得る
ことが出来ず、さらに完全精製が非常に困難であること
から工業生産は困難であるという問題点があった。

【０００７】従って、基質特異性が高く、かつ、低分子
基質および高分子基質の両方に作用し、しかも容易に精
製し得るα−Ｌ−フコシダーゼ酵素が望まれていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、低分
子基質および高分子基質の両方に作用し、精製が容易で
かつ多量に得られる新規なα１−２−Ｌ−フコシダーゼ
を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らはα１−２フ
コシル結合を有する天然高分子糖タンパク質であるブタ
胃ムチンを基質として用い、ムチンからフコースを遊離
し得る酵素を検索した。その結果、バチルス属の微生物
が菌体外にα１−２フコシド結合に特異的に作用する新
規なα１−２−Ｌ−フコシダーゼを生産し得る事を見い
だし、本発明を完成するに至った。

【００１０】すなわち、本発明は、複合糖質糖鎖に存在
するα１−２−Ｌ−フコシル結合、および、パラニトロ
フェニル−α−Ｌ−フコピラノシドを加水分解して、Ｌ
−フコースを遊離する性質を有するα１−２−Ｌ−フコ
シダーゼに関する。

【００１１】また、本発明のα１−２−Ｌ−フコシダー
ゼは、以下の酵素学的及び理化学的性質を有する： (1)作用：複合糖質糖鎖に存在するα１−２−Ｌ−フコ
シド結合を特異的に加水分解し、Ｌ−フコースを遊離す
る、 (2)基質特異性：オリゴ糖、あるいは天然高分子糖鎖の
α１−２フコシル結合、およびパラニトロフェニル−α
−Ｌ−フコピラノシドを特異的に加水分解する、 (3)至適ｐＨ：ｐＨ５．５−７．０である、 (4)安定ｐＨ範囲：安定ｐＨ範囲は３７℃、１５時間の
保持条件においてｐＨ６．０−９．０である、 (5)反応の至適温度：至適温度は５５−６５℃である、 (6)安定温度範囲：ｐＨ６．５で３０分間保持したと
き、５５℃まで安定である、 (7)分子量：ゲル濾過法により測定した分子量は約２０
０，０００であり、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ
ルアミド電気泳動法により測定した分子量は約１１６，
０００であり、および、 (8)阻害剤等の影響：水銀及びＬ−フコースで阻害を受
ける。

【００１２】さらに、本発明は、バチルス属に属し、菌
体外に上記α１−２−Ｌ−フコシダーゼを生産する能力
を有する微生物を培養し、培養物から該α１−２−Ｌ−
フコシダーゼを採取する、α１−２−Ｌ−フコシダーゼ
の製造方法に関する。

【００１３】好ましい態様として、前記微生物を、誘導
物質を含有する培地で培養し、α１−２−Ｌ−フコシダ
ーゼを採取する、α１−２−Ｌ−フコシダーゼの製造方
法に関する。

【００１４】さらに、好ましい態様として、培養して得
られた微生物を生理食塩水あるいは緩衝液で洗浄した
後、誘導物質を含有する緩衝液中でさらに培養して、α
１−２−Ｌ−フコシダーゼを採取する、α１−２−Ｌ−
フコシダーゼの製造方法に関する。

【００１５】さらに、本発明は、バチルス スピーシス
Ｋ４０Ｔを使用して、α１−２−Ｌ−フコシダーゼを
製造する方法に関する。

【００１６】このことにより、(1)新規な特異性を有す
るα１−２−Ｌ−フコシダーゼが提供され、(2)低分子
基質および高分子基質の両方に作用し、精製が容易でか
つ多量に得られる新規なα１−２−Ｌ−フコシダーゼを
提供するという上記目的が達成される。

【００１７】本発明のα１−２−Ｌ−フコシダーゼは、
上記性質を有するものであれば、その起源を問わず用い
得るが、製造、および精製の容易性等から、微生物を用
いることが好ましい。

【００１８】本発明で用いられ得る微生物としては、α
１−２−Ｌ−フコシダーゼを培養物中に著量生産し、精
製が非常に容易となるので、バチルス属に属する細菌が
好適に用いられ得る。本発明に使用され得る微生物とし
ては、バチルス属に属し、かつα１−２−Ｌ−フコシダ
ーゼ生産能を有する菌株で有ればいかなる菌株でも用い
られ得、またこれらの菌株の変異株も用いられ得る。こ
のような菌株の具体例として、バチルス スピーシス
Ｋ４０Ｔ が挙げられる。本菌は、土壌中より本発明者
らが新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の
とおりである。 ａ）形態的性質 顕微鏡的観察は以下の通りである。

【００１９】１）細胞形態：栄養細胞の大きさは、１〜
１．２×３〜５μｍの桿菌である ２）多形性：無し ３）運動性の有無：有り ４）グラム染色性：陽性 ５）胞子の形成：有り ６）胞子形成位置：端または準端 ７）胞子の形：楕円形 ８）胞子の大きさ：０．８−１．２×１．０−１．４μ
ｍ ９）胞子嚢：膨れない。

【００２０】ｂ）生育状態 １）肉汁寒天平板培養 集落の形状は円形であり、周縁は全縁で、表面隆起は偏
平状である。コロニーの色調は、乳白色または白黄色で
ある。 ２）肉汁液体培養 生育し混濁する ３）栄養寒天培地 集落の形状は円形であり、周縁は全縁で、表面隆起は偏
平状である。コロニーの色調は、乳白色または白黄色で
ある。

【００２１】ｃ）生理学的性質 １）カタラーゼ：陽性 ２）酸素に対する態度：好気性 ３）硫化水素の生成：陰性 ４）インドールの生成：陰性 ５）ＶＰテスト：陽性 ６）ＭＲテスト：陰性 ７）食塩含有培地における生育 ２％ 生育する ５％ 生育する ８）生育温度 ３７℃ 生育する ５５℃ 生育しない ９）生育ｐＨ ｐＨ５．７ 生育する ｐＨ６．５ 生育する １０）澱粉の分解：陰性 １１）カゼインの分解：陽性 １２）ゼラチンの液化：陽性 １３）糖類からの酸及びガスの生成：（＋：生成、−：生成せず） 酸 ガス Ｄ−グルコース ＋ − Ｄ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−マンニトール − − 以上の性質から、Bergey's Manual of Systematic Bact
eriology,volume 2を参照し、この菌株をバチルス属に
属する菌株と同定し、バチルス スピーシスＫ４０Ｔ(B
acillus sp.K40T)と命名した。本菌株は、通産省工業技
術院生命工学工業技術研究所にFERM P-13980として寄託
されている。

【００２２】前記微生物の培養に用い得る培地として
は、通常の微生物の培養に用いるものであればいかなる
ものでも用い得る。例えば、前記微生物が利用し得る栄
養源としては、炭素源、有機または無機の窒素源、無機
塩類が使用され得る。炭素源としては、例えば、グルコ
ース、フコース、アラビノース、シュークロースなどが
挙げられる。有機窒素源としては、ペプトン、酵母エキ
ス、肉エキスなど、無機窒素源としては、例えば、硫
安、尿素、アンモニアなどが挙げられる。無機塩類とし
ては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸カルシ
ウム、硫酸マグネシウムなどの通常の栄養成分を含有し
得る。

【００２３】培養は、培地を通常の方法で滅菌し、微生
物が生育できる温度範囲で１−５日間、好気条件下で通
気攪拌して行い得る。

【００２４】前記微生物の培養は、α１−２−Ｌ−フコ
シダーゼを誘導し得る物質を添加して行い得る。誘導物
質としては、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−ガ
ラクトースなどが単独または混合して用いられ得るが、
Ｌ−フコースが好適に用いられ得る。誘導物質は、０．
１−１０W/V％を添加し得る。

【００２５】また、培養後、微生物菌体を集菌洗浄した
後、緩衝液に移し、誘導物質の存在下、２０−４０℃で
１６−４８時間、再培養することにより、酵素の誘導生
産を行い得る。

【００２６】本発明の酵素α１−２−Ｌ−フコシダーゼ
の採取、精製は、まず、上記培養液から、遠心分離、濾
過などの通常の方法により、微生物菌体を除去する。得
られる上澄から、塩析、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ハイドロキシルアパタイト、ゲル濾過など一般に酵
素精製に用いられる方法を用いて、α１−２−Ｌ−フコ
シダーゼを精製し得る。

【００２７】本発明の酵素α１−２−Ｌ−フコシダーゼ
の活性は以下の方法で測定し得る。天然基質であるブタ
胃ムチンを基質として使用する。基質溶液（３３W/V％
ブタ胃ムチン／５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液：ｐＨ
６．５）４５０μｌに、酵素溶液５０μｌを加え、３７
℃１０分間反応を行い、沸騰浴中で３分間加熱して反応
を停止する。遠心分離（１０，０００xｇ）により不純
物を除去したのち、上澄中の遊離フコース量を、ブタ肝
臓由来Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社
製）を用いて測定し得る。

【００２８】合成基質、パラニトロフェニルグリコシド
（ｐＮＰ−糖）を基質としても酵素活性を測定し得る。
ｐＮＰ−糖の水溶液に酵素溶液を加え、適当な温度で適
当な時間反応を行い、０．２Ｍホウ酸緩衝液を加えて反
応を停止させる。反応により遊離されたパラニトロフェ
ノール量を４００ｎｍの吸光度を測定することにより定
量して、酵素活性を測定し得る。

【００２９】本発明においては、酵素の単位は１分間に
１μmolのＬ−フコースを遊離する酵素量を１ユニット
とした。

【００３０】精製した酵素は、各種の合成基質、天然基
質に対する作用の測定に使用し得る。

【００３１】以下に、本発明のα１−２−Ｌ−フコシダ
ーゼ、およびその製造方法を示すが、本発明が実施例に
限定されるものではない。

【００３２】

【実施例】

実施例１ Ｌ−フコース０．５％、ペプトン０．５％、酵母エキス
０．５％、塩化ナトリウム０．５％を含む培地（ｐＨ
６．５）１００ｍｌを５００ｍｌ容振盪フラスコに分注
し、１２０℃、１５分間滅菌した後、バチルス スピー
シスＫ４０Ｔ菌を接種し、３０℃２晩振盪培養した。培
養終了後、遠心により菌体を除き、粗酵素液を得た。

【００３３】酵素活性は、基質溶液（３３W/V％ブタ胃
ムチン／５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液：ｐＨ６．５）
４５０μｌに、上記酵素溶液５０μｌを加え、３７℃１
０分間反応を行い、沸騰浴中で３分間加熱して反応を停
止し、遠心分離（１０，０００xｇ）により不純物を除
去したのち、上澄中の遊離フコース量を、ブタ肝臓由来
Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）を用
いて測定した。比活性は、０．０５ｕｎｉｔ／ｍｇであ
った。

【００３４】実施例２ グルコース０．５％、ペプトン０．５％、酵母エキス
０．５％、塩化ナトリウム０．５％を含む培地（ｐＨ
６．５）１００ｍｌを５００ｍｌ容振盪フラスコに分注
し、１２０℃、１５分間滅菌した後、バチルス スピー
シス Ｋ４０Ｔ菌を接種し、３０℃１晩振盪培養した。
培養終了後、遠心により菌体を集菌し、生理食塩水で十
分洗浄し、種菌とした。トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
０）１００ｍｌを５００ｍｌ容振盪フラスコに分注し、
１２０℃、１５分間滅菌した後、殺菌したＬ−フコース
水溶液を０．５％濃度となるように添加したのち、上記
種菌を接種し、３０℃１晩振盪培養した。培養終了後、
遠心により菌体を除き、粗酵素液を得た。得られた粗酵
素液を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で
１晩透析し、透析内液を、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ６．５）であらかじめ平衡化したハイドロキシ
ルアパタイトカラム（１．０X１２ｃｍ）に通し、吸着
した酵素を、同緩衝液の１０−３００ｍＭ濃度勾配によ
り溶出し、約１５０ｍＭで溶出された活性画分を集め
た。これを２５ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．４）で１晩透析し、透析内液を同緩衝液であらかじ
め平衡化したクロマトフォーカシングカラム（１．０X
１２ｃｍ：ポリバッファー交換体 ＰＢＥ９４、Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ社製）に通し、吸着した酵素を、ポリバッ
ファー７４（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）−塩酸緩衝液
（ｐＨ４．０）にて溶出させた。溶出された活性画分を
集め、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で
あらかじめ平衡化したハイドロキシルアパタイトカラム
（１．０X１２ｃｍ）にもう一度通し、吸着した酵素
を、同緩衝液の１０−３００ｍＭ濃度勾配により溶出し
た。約１５０ｍＭで溶出された活性画分を集め、α１−
２−Ｌ−フコシダーゼの精製製品３３０μｇ（比活性６
１ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、収率２６％）を得た。

【００３５】実施例３ 各種基質に対する作用 パラニトロフェニルグリコシド（ｐＮＰ−糖）に対する
作用は、２ｍＭｐＮＰ−糖（５０ｍＭクエン酸緩衝液：
ｐＨ４．５）２００μｌに酵素溶液５０μｌを加え、３
７℃、１８時間反応を行い、０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ９．８）を加えて反応を停止させた後、反応により遊
離されたパラニトロフェノール量を４００ｎｍの吸光度
を測定することにより、測定した。

【００３６】メチル−α−Ｌ−フコサイド、２’−フコ
シルラクトース、６−Ｏ−α−Ｌ−フコピラノシル−Ｎ
−アセチルグルコサミン、ブタ胃ムチン、ブタ顎下腺ム
チン、ヒト唾液、人乳、ラクト−Ｎ−フコペンタオース
Ｉ−ＰＡ８（ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩにフェニ
ルアルキル基がついたもの）に対する作用は、基質溶液
（３３％濃度／５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液：ｐＨ
６．５）４５０μｌに、酵素溶液５０μｌを加え、３７
℃で反応を行い、酵素活性の測定と同様に遊離Ｌ−フコ
ースを定量して測定した。

【００３７】ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ＩＩ、
ＩＩＩ、およびＡ型ヘキササッカライドに対する作用
は、ピリジルアミノ化糖を基質として測定した。５ｍＭ
ピリジルアミノ化糖（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液：
ｐＨ６．５）４μｌに酵素溶液６μｌを加え、３７℃、
９０分反応した後、０．０２％トリフルオロ酢酸を加え
て反応を停止した後、高速液体クロマトグラフィーを用
いて基質分解能を測定した。

【００３８】各種基質に対する作用の検討結果を表１に
示す。

【００３９】

【表１】

【００４０】ヒトＯ型赤血球に対する作用は、４％赤血
球溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ−５０ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液：ｐＨ７．２）中で、３７℃９０分、本発明酵
素を作用させたのち、ユーレックスレクチン（Ｏ型型物
質に特異的な抗体）との凝集反応を行って測定した。凝
集反応が認められた。

【００４１】実施例４ 実施例２で得られたα１−２−Ｌ−フコシダーゼの酵素
学的及び理化学的性質を測定した。その結果は次の通り
である。

【００４２】(1)酵素の作用 本酵素は糖鎖の非還元末端に存在するα１−２−Ｌ−フ
コシル結合を特異的に分解してＬ−フコースを遊離す
る。

【００４３】(2)基質特異性 本酵素の種々のα−Ｌ−フコシド含有基質に対する作用
は、上記表１に示した通りである。本酵素は、ラクト−
Ｎ−フコペンタオースＩなどのオリゴ糖、ブタ胃ムチ
ン、ブタ顎下腺ムチンなどの複合糖質、及び巨大細胞で
あるヒト赤血球の膜上に存在するＯ型物質などの糖鎖の
非還元末端に存在するα１−２フコシド結合を特異的に
分解する。さらに合成基質であるパラニトロフェニル−
α−Ｌ−フコピラノシドにも僅かに作用する。

【００４４】このような基質特異性を有するα１−２−
Ｌ−フコシダーゼはこれまでに例がなく、全く新しい性
質の酵素である。

【００４５】(3)至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 至適ｐＨは、図１に示すとおり、ｐＨ５．５−７．０で
ある。

【００４６】安定ｐＨ範囲は３７℃１５時間の保持条件
の場合、図２に示すとおりｐＨ６．０−９．０である。

【００４７】(4)至適温度および安定温度 各温度で５分間酵素反応を行ったときの至適温度は図３
に示すように６０℃である。１０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ６．５）中で各温度で３０分保持したときの
安定温度範囲は図４に示すように５５℃以下である。

【００４８】(5)分子量 ゲル濾過法（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２００：Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社製）によると、約２００，０００である。

【００４９】(6)ポリアクリルアミド電気泳動 精製された酵素は、ポリアクリルアミド電気泳動におい
て単一のバンドを示した。

【００５０】(7)サブユニットの分子量と数 精製された酵素は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動において、単一のバンドを示
し、その分子量は約１１６，０００と算出された。サブ
ユニットの数は２個と考えられる。

【００５１】(8)Ｋｍ値 ラインウェバー・バーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕ
ｒｋ）プロットにより求めた本酵素のブタ胃ムチンに対
するＫｍ値は、０．４８ｍＭである。

【００５２】(9)等電点 ポリバッファー交換体 ＰＢＥ９４（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社製）を用いたクロマトフォーカシング法により求め
た本酵素の等電点は５．９−６．０である。

【００５３】(10)阻害剤などの影響 本酵素は１ｍＭ Ｈｇ²⁺により約５０％阻害を受けた
が、Ｎａ⁺，Ｍｇ²⁺，Ｃａ²⁺，Ｍｎ²⁺，Ｃｏ²⁺，Ｎ
ｉ²⁺，Ｃｕ²⁺，Ｐｂ²⁺，Ｚｎ²⁺（各１ｍＭ）の影響は認
められなかった。

【００５４】ｐ−クロロマーキュリベンゾエート、ジチ
オスレイトール、２−メルカプトエタノール、グルタチ
オン、Ｎ−エチルマレイミド、ヨード酢酸（各０．５ｍ
Ｍ）の影響は認められなかった。

【００５５】各種糖類（１０ｍＭ）のうち、Ｌ−フコー
スにより約５０％阻害を受けたが、Ｄ−グルコース，Ｄ
−ガラクトース，Ｌ−アラビノース，Ｄ−グルコサミ
ン，Ｄ−ガラクトサミン，Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサ
ミン，Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンの影響は認め
られなかった。

【００５６】(11)プロテアーゼ活性：アゾコール溶液
（３００ｍｇ／８０ｍｌ−５０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液：ｐＨ７．０）９００μｌに酵素溶液１００μｌ加
え、３７℃１８時間反応を行い、遠心（１０，０００X
ｇ）したのち、上澄の５８０ｎｍにおける吸光度変化を
測定したところ、プロテアーゼ活性は認められなかっ
た。

【００５７】(12)α１−２−Ｌ−フコシダーゼ以外のグ
リコシダーゼ活性：ｐＮＰ−糖を基質とし、精製酵素の
各種グリコシダーゼ活性を調べた。その結果、β−Ｌ−
アラビノシダーゼ，β−Ｄ−アラビノシダーゼ，α−Ｄ
−ガラクトシダーゼ，β−Ｄ−ガラクトシダーゼ，α−
Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ，β−Ｄ−Ｎ−
アセチルガラクトサミニダーゼ，α−Ｄ−グルコシダー
ゼ，β−Ｄ−グルコシダーゼ，α−Ｄ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼ，β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニ
ダーゼ，α−Ｄ−マンノシダーゼ，β−Ｄ−マンノシダ
ーゼ，α−Ｄ−キシロシダーゼ，β−Ｄ−キシロシダー
ゼ，β−Ｌ−フコシダーゼ，Ｎ−アセチルノイラミニダ
ーゼ活性は認められなかった。

【００５８】

【発明の効果】本発明のα１−２−Ｌ−フコシダーゼは
オリゴ糖や糖タンパク質のみならず、糖脂質糖鎖あるい
はヒト赤血球表面に存在する血液型物質糖鎖の非還元末
端に存在するα１−２フコシド結合に特異的に作用す
る。従って本酵素は、各種オリゴ糖、糖タンパク質、糖
脂質及び細胞などの巨大複合糖質の糖鎖構造解析や、糖
鎖中のフコースの機能研究に極めて有用である。

【００５９】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明により得られる酵素の至適ｐＨを示すグ
ラフである。図中、各記号は、反応に使用した緩衝液を
表し、それぞれ、クエン酸−塩酸：■−■、クエン酸：
□−□、リン酸カリウム：●−●、トリス−塩酸：○−
○、アンモニア：▲−▲を表す。

【図２】各ｐＨで３７℃１５時間保持した後の、本酵素
の残存活性を示すグラフである。図中、各記号は、反応
に使用した緩衝液を表し、それぞれ、クエン酸−塩酸：
■−■、クエン酸：□−□、リン酸カリウム：●−●、
トリス−塩酸：○−○、アンモニア：▲−▲を表す。

【図３】本酵素の至適温度を示すグラフである。

【図４】ｐＨ６．５において各温度３０分保持した後の
残存活性を示すグラフである。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 複合糖質糖鎖に存在するα１−２−Ｌ−
   フコシル結合、およびパラニトロフェニル−α−Ｌ−フ
   コピラノシドを加水分解して、Ｌ−フコースを遊離する
   性質を有するα１−２−Ｌ−フコシダーゼ。
2. 【請求項２】 以下の酵素学的及び理化学的性質を有す
   るα１−２−Ｌ−フコシダーゼ： (1)作用：複合糖質糖鎖に存在するα１−２−Ｌ−フコ
   シル結合を加水分解し、Ｌ−フコースを遊離する、 (2)基質特異性：オリゴ糖、あるいは天然高分子糖鎖の
   α１−２−Ｌ−フコシル結合、およびパラニトロフェニ
   ル−α−Ｌ−フコピラノシドを加水分解する、 (3)至適ｐＨ：ｐＨ５．５−７．０である、 (4)安定ｐＨ範囲：安定ｐＨは範囲は３７℃、１５時間
   の保持条件においてｐＨ６．０−９．０である、 (5)反応の至適温度：至適温度は５５−６５℃である、 (6)安定温度範囲：ｐＨ６．５で３０分間保持したと
   き、５５℃まで安定である、 (7)分子量：ゲル濾過法により測定した分子量は約２０
   ０，０００であり、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ
   ルアミド電気泳動法により測定した分子量は約１１６，
   ０００であり、および、 (8)阻害剤等の影響：水銀及びＬ−フコースで阻害を受
   ける。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載のα１−２−Ｌ
   −フコシダーゼの製造方法であって、該方法は、バチル
   ス属に属し、菌体外に請求項１記載のα１−２−Ｌ−フ
   コシダーゼを生産する能力を有する微生物を培養する工
   程、および、培養物から該α１−２−Ｌ−フコシダーゼ
   を採取する工程を包含する、方法。
4. 【請求項４】 前記微生物を培養する工程が、さらに、
   誘導物質を含有させた培地で微生物を培養することを包
   含する、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記微生物を培養する工程が、培養して
   得られた微生物菌体を生理食塩水あるいは緩衝液で洗浄
   した後、誘導物質を含有する緩衝液中でさらに培養する
   ことを包含する、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 バチルス属の微生物が、バチルス スピ
   ーシス Ｋ４０Ｔである請求項３ないし５のいずれかの
   項に記載の方法。