JPH0363351B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はユウバクテリウム属に属する菌株によ
るアリルスルホトランスフエラーゼの製造法に関
する。アリルスルホトランスフエラーゼ
（Arylsulfotransferase、EC2.8.2.1）は硫酸供与
体から硫酸基をフエノール化合物に転移しフエノ
ール化合物の硫酸抱合体を形成する反応を触媒す
る酵素であり、フエノール化合物の解毒経路に関
与する酵素として重要である。 フエノール性化合物の中には下剤として用いら
れるものも多くその効果も強いが、腸に対しての
刺激も強いためフエノール基を硫酸によりエステ
ル化することが見いだされ、液剤型緩下剤として
ピコサルフエート（Picosulfate）が生まれた。
ピコサルフエートは大腸において腸内菌により加
水分解されて始めて薬効を発現するに至ると考え
られてきた。そこで本発明者は芳香属硫酸エステ
ル分解する酵素を産生する腸内菌をヒト糞便より
検索したところユウバクテリウム・レクタルと認
められる菌株を分離することに成功した。そして
本菌株を培養して得られた酵素について検討した
ところ、本酵素はその性質から加水分解酵素では
なく転移酵素の一種であるアリルスルホトランス
フエラーゼであることを知つたものである。 従来アリルスルホトランスフエラーゼは肝、小
腸、賢、脳などの動物組織中および糸状菌類に存
在することが知られている。例えば、ラツト肝に
は四つのタイプのアリルスルホトランスフエラー
ゼが存在し〔ジヤーナルオブバイオロジカルケミ
ストリー（J.Biol.Chem.）第254巻、5658ページ、
1979年、アーカイブスオブバイオケミストリーア
ンドバイオフイジクス（Arch.Biochem.
Biophys.）第211巻、352ページ、1981年および
ユーロピアンジヤーナルオブバイオケミストリー
（Eur.J.Biochem.）第104巻、３ページ、1980
年〕、これらはいずれも硫酸供与体として3'−ホ
スホアデニル5'−硫酸（以下「PAPS」という）
を必要とし、PAPSがないと反応は進行しない。
またアスペルギルス（Aspergillus）属菌の産生
するアリルスルホトランスフエラーゼはPAPSを
介さずに硫酸基を転移することが知られている
〔ザバイオケミカルジヤーナル（Biochem.J.）第
149巻、697ページ、1975年〕。しかし細菌がアリ
ルスルホトランスフエラーゼを産生するとの報告
は未だない。 本発明法によるアリルスルホトランスフエラー
ゼはPAPSを硫酸供与体としない性質を有する酵
素であり、本発明者らが新たに腸内細菌の一種で
あるユウバクテリウム属菌に見いだしたものであ
る。以下に本発明法で用いる菌株のスクリーニン
グ法ならびに性質およびそれらから得られるアリ
ルスルホトランスフエラーゼの製法、性質につい
て説明する。 本発明法に用いるユウバクテリム属菌の例とし
てはユウバクテリウム・レクタル、さらに具体的
には本発明者らが腸内菌より見いだしたユウバク
テリウム・レクタルＡ−44があげられる。本菌株
は次のように光岡らの方法（臨床検査、第23巻、
322ページ、1979年）に準じて分離した。即ち、
ヒト糞便を希釈しEG寒天平板培地〔馬肉浸出物
（商品名Leb−lemco powder、Oxoid社製）2.4
ｇ、プロテオースペプトンNo.３（Difco社製）10
ｇ、酵母エキス（同）５ｇ、リン酸二ナトリウム
４ｇ、可溶性澱粉0.5ｇ、グルコース1.5ｇ、Ｌ−
シスチン0.2ｇ、寒天（Difco製）15ｇおよび消泡
剤適量をイオン交換水950mlに溶解し、PH7.6に調
製、オートクレーブ滅菌後50〜60℃にし、さらに
Ｌ−システイン塩酸塩0.5ｇ、馬血液50mlを加え
てシヤーレに分注し平板とした〕に塗抹後嫌気ジ
ヤー（ヒラヤマ製作所製）で３〜５に日間培養し
た。生育したコロニーを釣菌し、上記培地に
0.065％フエノールフタレイン二硫酸（以下
「PPDS」という）を添加し、寒天を除いたEG液
体培地１mlに接種したのち嫌気ボツクス
（Forme社製）内で37℃、２日間培養した。その
後0.2M炭酸ナトリウム0.5mlを添加してアルカリ
性とし、紅色を呈した陽性株Ａ−44を得た。Ａ−
44株はGAM半流動培地（日水製薬社製）３mlに
植え継ぎ低温室内で保存した。 Ａ−44株は次のような性質を有する。 (1) 形態的性質 形：真つ直ぐ〜やや湾曲の桿菌 大きさ：約0.8〜3.0μ 胞子：形成しない グラム染色性：陽性 (2) 培地における生育状態 BL寒天平板培地：良く生育し、コロニー
は正円、凸円状〜半球状に隆起し、周縁・表
面ともに平滑で灰褐色 EG寒天平板培地：生育はやや不良、コロ
ニーは正円、凸円状〜半球状に隆起し、円
縁・表面ともに平滑で灰白色 周ラクトバチルス選択培地：生育せず DHL培地：生育せず (3) 生理学的性質 硝酸塩の還元：陰性 インドール生成：陰性 ゼラチン液化：陰性 6.5％食塩での生育：陰性 糖類から酸およびガスの生成：アラビノー
スフラクトース、ガラクトース、ラフイノー
ス、スターチ、シユークロース、キシロー
ス、マンノース、グルコース、マルトース、
ラクトースから酸およびガスを生成する。グ
リセロール、マンニトール、イノシツトから
は酸およびガスを生成しない。 エスクリン分解性：陽性 スターチ分解性：陽性 レシチナーゼ：陰性 カタラーゼ：陰性 生育温度：25〜45℃ 生育PH：PH７付近で最もよく生育する 主要発酵産物：乳酸、酪酸 酸素に対する態度：偏性嫌気性 以上の性質を「腸内細菌の世界一嫌気性菌の分
離と同定」（光岡知足著、叢文社発行、1980年）
および「バージエイズマニユアルオブデイターミ
ネイテイブバクテリオロジー（Bergey's
Manual of Determinative Bacteriology）」（第
８版、1974年）に従い検討したところ、Ａ−44株
は嫌気性グラム陽性無芽胞桿菌であり酪酸を生成
することからユウバクテリウム属に分類される。
さらに、シユークロース、ラフイノース、アラビ
ノースおよびキシロースから酸を生成すること、
グリセロールから酸を生成しないこと、酪酸を生
成するがカプロン酸を生成しないこと、スターチ
を加水分解することおよび37℃で生育することな
どの特徴によりユウバクテリウム・レクタル
（Eubactrium rectale）と同定された、本菌株は
工業技術院微生物工業技術研究所にユウバクテリ
ウム・レクタルＡ−44（微工研菌寄第7007号、
FERM Ｐ−7007）として寄託されている。本菌
は糞便１ｇ当り10億個以上存在し、消化管内にお
いて優勢な菌種であつた。なおユウバクテリウ
ム・レクタルの保存菌株についてアリルスルホト
ランスフエラーゼの産生能を調べたが、いずれも
認められなかつた。 本発明法によりアリルスルホトランスフエラー
ゼを採取するには、まず通常の嫌気性菌用培地に
アリルスルホトランスフエラーゼを産生するユウ
バクテリウム属に属する菌株を植菌し、嫌気条件
下約25〜45℃で培養し酵素を蓄積せしめる。培養
時間は酵素の生産が最大になつた時をとればよ
く、通常約10〜40時間である。培地には、好まし
くは芳香族硫酸エステルを添加すると本酵素が著
しく増産される。芳香族硫酸エステルの例として
は前記PPDS、ピコサルフエートの他Ｐ−ニトロ
フエニル硫酸（以下「PNS」という）、Ｐ−アセ
チルフエニル硫酸、４−メチルウンベリフエリル
硫酸などが上げられ、例えばPPDSを培地に0.065
％（ｗ／ｖ）添加するこにより比活性（蛋白当り
の活性）は約20倍上昇する。 得られた培養物は公知の精製方法を適宜組合せ
て精製される。即ち、培養物をそのままか、また
は菌体のみを集めて超音波、フレンチプレス、ア
ルミナ磨砕などの方法により菌体を破砕し酵素を
抽出したのち、塩析、有機溶媒沈澱、透析、限外
ろ過、ゲルろ過、遠心分離、イオン交換クロマト
グラフイー、アフイニテイークロマトグラフイ
ー、濃縮、凍結乾燥などの方法を適宜組合せ精製
される。 本発明法によりユウバクテリウム・レクタルＡ
−44（FERM Ｐ−7007）より得られたアリルス
ルホトランスフエラーゼの性質は次のとおりであ
る。 (1) 作用 芳香族硫酸エステルを基質硫酸供与体とし、
その硫酸基をフエノール化合物に移転する反応
を触媒する。 (2) 基質特異性 各種芳香族硫酸エステルならびに胆汁酸の硫
酸抱合体を硫酸供与体として、またチラミンを
受容体として反応させ生成されるチラミン硫酸
の量を薄層クロマトグラフイーで定量した。す
なわち、反応液を薄層板（シリカゲルキーゼル
ゲル60F254、メルク社製）にスポツトし、ｎ
−ブタノール：酢酸：水（25：４：10）の溶媒
で展開し、風乾した後一級アミンの発色試薬で
あるＰ−ジメチルアミノベンズアルデヒドのベ
ンゼン溶液を噴霧し、100℃で２〜３分間加熱
した。Rf値0.23のスポツトをクロマトスキヤナ
−CS−910（島津製作所製）により、サンプル
波長220nｍ、ブランク波長400nｍでリニアー
スキヤンしてチラミン硫酸を定量した。結果を
第１表に示す。本酵素は芳香族硫酸エステルを
基質硫酸供与体とするが、脂肪族硫酸エステル
に全く活性を示さなかつた。

【表】 またPNSを硫酸供与体としたときの各種硫
酸受容体の基質特異性は第２表のとおりであ
る。

【表】 (3) 至適PH 硫酸供与体としてPNSを用い、受容体を各
種変えて至適PHをみた。その結果本酵素は受容
体にチラミン、フエノールフタレインまたはＬ
−チロシンを用いた場合はPH約9.0、αおよび
β−ナフトール、３−（４−ヒドロキシフエニ
ル）−2'，4'−ジヒドロキシプロピオフエノン
または２−メチル−３−フエニル−７−ヒドロ
キシクロモンを用いた場合はPH約8.2にそれぞ
れ至適PHが存在した。（第１図〜第３図） 使用した緩衝液は、PH５〜７は0.1M酢酸緩
衝液、PH７〜９は0.1Mトリス塩酸緩衝液、PH
９〜10.5は0.1Mグリシン−水酸化ナトリウム
緩衝液である。 (4) 安定PH範囲 PH５〜10の各PHにおいて37℃、30分間処理し
たのちPHを9.0に戻し活性を測定したところ、
PH6.5付近において最も安定であつた。使用し
た緩衝液は上記(3)に準ずる。（第４図） (5) 至適温度 20〜60℃の各温度で30分間反応し活性を測定
したところ、40℃付近が至適であつた。 (6) 温度安定性 PH6.5において５〜60℃の各温度で10分間処
理したのち酵素活性を測定したところ、37℃付
近まで安定であつた。（第５図） (7) 活性測定法 基質硫酸供与体としてPNS、受容体として
チラミンを用い、50ｍＭ PNS0.03ml、10ｍＭ
チラミンを含むトリス塩酸緩衝液（PH9.0）
0.58mlおよび酵素溶液0.02mlを混合し37℃、15
分間反応させる。1N水酸化ナトリウム0.4mlを
加えて反応を止め、白濁したものについては遠
心したのち透明な上清の405nｍにおける吸光
度を測定し、別にＰ−ニトロフエノールの標準
液を用いて作成した検量線にもとずいて定量す
る。１分間に1μｍmoleのＰ−ニトロフエノー
ルを生成する酵素量を１単位とした。 (8) 基質親和性 硫酸供与体としてPNS、受容体としてチラ
ミンを用い37℃、15分反応したときのチラミン
に対するミカエリス常数（Km値）は0.39ｍＭ
であつた。 (9) 阻害剤 第３表に示す各阻害剤と本酵素をPH6.5にお
いて37℃、10分間処理したのち活性を測定し
た。阻害剤濃度と阻害率（％）を第３表に示
す。表に記載の他エチレンジアミン四酢酸（５
ｍＭ）による阻害は30％であり、又ヨード酢
酸、Ｎ−エチルマレイミド、ジイソプロピルフ
ルオロリン酸（各10^-3M）による阻害は認めら
れなかつた。

【表】

【表】 (9) 等電点 PH範囲2.5〜４のアンホライン（Ampholine、
LKB社製）を用いた蔗糖密度勾配等電点電気
泳動法により測定したところ、本酵素の等電点
は3.8であつた。 (10) 分子量 セフアデツクスＧ−200（フアルマン社製）を
用いたゲルろ過法により測定したところ、約
240000であつた。 次ぎに本発明法を試験例、実施例をもつて具体
的に説明する。 試験例 ヒト糞便のPNS分解活性 ヒト糞便12例を用い名１ｇを再蒸留水に懸濁し
全量を10mlとし、これと50ｍＭ PNSを含む
0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH9.0）0.5mlを混合し37
℃、２時間反応した。1N水酸化ナトリウムを加
え反応を停止したのち遠心し、その上清の405n
ｍにおける吸光度からＰ−ニトロフエノールを定
量し、活性（μmole／ｈ）を求めた。結果は第４
表に示すようにすべての試料にPNS分解活性が
認められた。

【表】 実施例 １ トリプチルケース（BBL社製）10ｇ、プロテ
オースペプトンNo.３（Difco社製）10ｇ、酵母エ
キス（同）５ｇ、グルコース３ｇ、リン酸一カリ
ウム２ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、可溶性澱粉５
ｇ、PPDS0.65ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩0.3ｇお
よびチオグリコール酸ナトリウム0.3ｇをイオン
交換水1000mlに溶解し滅菌したのち、あらかじめ
上記と同様の培地にユウバクテリウム・レクタル
Ａ−44（FERM Ｐ−7007）を培養して得た種培
養液20mlを植菌し、嫌気ボツクス（Forma社製）
にて37℃、24時間培養した。培養液を遠心分離し
て菌体を集めたのちフレンチプレスにて菌体を破
砕し、さらに遠心分離により上清を集め粗酵素抽
出液を得た。これにストレプトマイシンを加え除
核酸したのち40〜60％硫安飽和画分を集め、
0.1M酢酸緩衝液（PH5.5）に溶解し同緩衝液に一
晩透析した。次いであらかじめ同緩衝液で平衡化
したDEAEセフアデツクス（フアルマシア社製）
カラム（2.9×45cm）に通し酵素を吸着させたの
ち、０〜0.5M塩化カリウムでグラジエントに溶
出し活性画分を集めた。再度同クロマトグラフイ
ーを行い精製酵素標品を得た。第６図にDEAEセ
フアデツクスカラムクロマトグラフイーの溶出パ
ターンを、また第５表には精製過程の結果を示
す。なお蛋白量はホーリン−ロウリイ（Folin−
Lowry）法により牛血清アルブミン（フラクシ
ヨンＶ）を標準として測定した。

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は本発明法によりユウバクテリ
ウム・レクタルＡ−44（FERM Ｐ−7007）より
得られたアリルスルホトランスフエラーゼの至適
PHを表す図であり、同じく第４図は安定PH範囲、
第５図は温度安定性を表す図である。第６図は同
酵素のDEAE−セフアデツクスカラムクロマトグ
ラフイーにおける溶出パターンを表す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ユウバクテリウム属に属するアリルスルホト
   ランスフエラーゼ産生菌を栄養培地に培養しアリ
   ルスルホトランスフエラーゼを生成蓄積せしめこ
   れを採取することを特徴とするアリルスルホトラ
   ンスフエラーゼの製造法。 ２ ユウバクテリウム属に属するアリルスルホト
   ランスフエラーゼ産生菌がユウバクテリウム・レ
   クタルである特許請求の範囲第１項記載のアリル
   スルホトランスフエラーゼの製造法。 ３ ユウバクテリウム・レクタルがユウバクテリ
   ウム・レクタルＡ−44である特許請求の範囲第２
   項記載のアリルスルホトランスフエラーゼ製造
   法。