JPS62210987A - リパ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なリパーゼの製造法に関する。

〔従来の技術〕

工業的油脂の加水分解は従来高温高圧加水分解法によシ
行われているが、この方法は、高温高圧条件のプロセス
であり高エネルギーを必要とする。

これに対し酵素を利用するリパーゼ訓水分解法は、常、
温常圧領域の温和な条件で反応を行うことができる省エ
ネルギー型の有効なプロセスである。工業的にリパーゼ
油脂加水分解を行うには油脂、特に対象となる牛脂やパ
ーム油等の高融点油脂の加水分解率が高く（９０％以上
）、耐熱性を有するリパーゼが必要である。

これまで油脂加水分解用リパーゼとしては酵母カンデイ
ダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｒｕｇｏｓａ　）の生
産するリパーゼが知られている（名糖産業Ｍ　　Ｉｊパ
ーゼＯＦ）。このリパーゼはオリーブ油をはじめ各種油
脂を３０℃で９０％以上分解する能力を有しているが、
４５℃以上では不安定でｓｂ失活し易く、パーム油等の
高融点油脂の加水分解には遮していないっ 耐熱性を有する油脂加水分解用リパーゼとしては、シュ
ードモナス　メフイテイカの生産するリパーゼ（公告昭
５０−２５５５３　）およびシュードモナス　フルオレ
ッセンスの生産するリパーゼ（公告昭５７−５２８３５
）が知られているが、前者は高加水分解率（ヤシ油９２
％）を得るのに塩化カルシウムが必要であり（Ｋｏｓｕ
ｇｉ他Ｊ。

Ｆｅｒｍｅｎｔ−Ｔｅｃｈｎｏｌ、４９　．９６８　　
（１９７１））、塩化カルシウムを添加すると分解後に
金禰石鹸が生成して脂肪酸の回収を悪くする欠点を有し
ている。また、後者は分解率の面では牛脂を５０℃で３
８９　ｕｎｉｔ／ｇ−ｏｉｌのリパーゼで９４．９％分
解するが（公告昭５７−３９６３８）、この分解率に達
するには７０時間を要する。さらに、牛脂を１２あたｌ
）　１４０　ｕｎｉｔのリパーゼで加水分解すると、分
解率は２４時間後に６２特に達し、９６．９−の分解率
を得るのに１２０時間という長時間を必！とする。この
酵素を用いて牛脂を加水分解す′るには、長時間を要す
るため工業的利用には適さない。

また、他に、シュードモナス　ＵＫＯ−８１６株の生産
するリパーゼ（公開昭５８−１４６２７７）が耐熱性を
有していることが知られているが、このリパーゼは分子
量が２０００万以上という超高分子であシ、比活性ｃ単
位重量当たシのリパーゼ活性）が低くなるという欠点を
有している。

〔発明が解決しようとする問題点〕

工業的油脂の加水分解の油脂原料としては、牛脂だけで
なく、よシ融点が高く飽和脂肪酸含有量の高いパーム油
も多く用いられる傾向にある。工業用リパーゼには、こ
れらパーム油、牛脂をできるだけ短時間によシ高い加水
分解（９０チ以上）を行い、且つ熱安定性が高いことが
要求されることから、該性質を有するリパーゼの製造法
の開発が熱望されていた。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで本発明者らは工業用油脂の加水分解に適した高加
水分解率、耐熱性を有するリパーゼを提供することを目
的として鋭意検討した結果、栃木県芳賀郡市貝町の土壌
よシ分離した微生物の生産するリパーゼに、上記目的に
かなうリパーゼが存在することを見出し本発明を完成し
た。

すなわち、本発明はシュードモナス属に属するリパーゼ
生産菌を培養し、該培養物から後記の理化学的性質を有
するリパーゼを採取することを特徴とするリパーゼの製
造法を提供するものである。

本発明に使用されるシュードモナス属に属する上記リパ
ーゼ生産菌としては、上記リパーゼを生産する能力を有
するものであれば特に限定されないが、例えば本発明者
らが栃木県芳賀郡の土壌よシ分離した新菌株シュードモ
ナス・エスピーＫＳＭ−１６が挙げられる。

以下にこの菌株の菌学的性質を示す。

（Ａ）形態 ■細胞の形及び大きさ がん状 °幅　　　０．７５−１．０　ｐｍ 長さ　ｚ３−２５　μｍ ■運動性あり ペン毛は一本以上あり。

■抱子 なし ■ダラム染色 陰性 （Ｂ）各培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培養 ・　円形、乳白色のコロニーを形成１表面　清らか、光
沢あり、金縁、隆起 ■肉汁寒天斜面培養 普通 ■肉汁液体培養 ３０℃、２日で菌膜形成、一様に混濁 ■肉汁ゼラチン穿刺培養 液化せず ■リドマスミルク 凝固および’ｌ　）マスを還元した。

（Ｃ）生理学的性質 ■硝酸塩の還元　　　　　十 ■脱窒反応　　　　　　　− ■ＭＲテスト　　　　　　− ■ｖｐテスト　　　　　　− ■インドールの生成　　　− ■硫化水素の生成　　　　− ■デンプンの加水分解　　− ■クエン酸の利用　　　　Ｋｏｓｅｒ＋　Ｃｈｒｉｓｔ
ｅｎｓｅｎ＋■無機窒素源の利用　　　ＮＨ４＋ＮＯ３
＋０色素の生成　　　　　　ＫｉｎｇＡ−ＫｉｎｇＢ　
　　−０ウレアーゼ　　　　　　− ■オキシダーゼ　　　　　＋ Ｏカタラーゼ　　　　　　＋ ■生育の範囲 生育　４２℃＋、４５℃−９５℃− 増殖温度範囲　２０−４３℃。

増殖至適温度範囲　３０−３７℃ ０酸素に対する態度　　　好気的 ＠ＯＦテスト　　　　　　０（酸化的）ＯＤｋ類から酸
およびガスの生成の有無酸 Ｌ−アラビノース　　　− Ｄ−キシロース　　　　＋ Ｄ−グルコース　　　　＋ Ｄ−マンノース　　　　＋ Ｄ−７ラクトース　　　＋ Ｄ−ガラクトース　　　＋ マルトース　　　　　　＋ ショ棚　　　　　　　　　十 ラクトース　　　　　　＋ トレハロース　　　　　　＋ Ｄ−ソルビット　　　　　＋ Ｄ−マンニット　　　　　＋ イノジット　　　　　　　＋ グリセリン　　　　　　＋ デンプン　　　　　　　　− サリシン　　　　　　　　− ラフィノース　　　　　　− 以上の糖類からガスの生成はなかった。

（Ｄ）炭水化物の利用 Ｄ−グルコース　　　　　＋ Ｄ−キシロース　　　　　＋ Ｄ−リボース　　　　　　＋ Ｌ−ラムノース　　　　　− レブリン酸　　　　　　　− り一酒石酸　　　　　　　− ｍｅｓｏ−歯石酸　　　　　十 ｍｅｓｏ　　　−エ　　リ　ス　　リ　　ト　　−　ル
　　　　　−アドニトール　　　　　　− メサコン酸　　　　　　　− シトラコン酸　　　　　　　− Ｌ−バリン　　　　　　　＋ ｍ−ヒドロキシ安息香酸　　− ２，３−ブタンジオール　　＋ ベタイン　　　　　　　　　＋ アルギニン　　　　　　　　＋ 以上の菌学的性質から、パージ二のマニュ７に、オプ、
デイタミネイティブ、バクテリオロジー第８版（Ｂｅｒ
ｇｅｙ’ｓ　ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　８　ｔｈ、　ｅｄ
、　）によシ検索した結果、本菌に類似の菌株としてシ
ュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃ
ｅｐａｓｉａ　）が挙げられる。そこでシュウトモナス
・セパシア（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，１０５８６）を本菌と同
条件で培養し各性質を比較したところ、次に示すごとく
各性質において異なっていることが判明した。　　。

以下余白 リドマスミルク　　　　　凝固　　　　　　液化炭水化
物の貧化性 アドニトール　　　　　　　　　　　　　　　　　＋ｍ
−ヒドロキシ安息香酸　　　　−十 色素生成　　　　　　　　　　　　　　　　＋（黄褐色
）これらの諸性質の差異から本リパーゼ生産菌は公知菌
のいずれとも異なる新菌株と判断し、シュードモナス・
エスピーＫＳＭ−１６と命名し、昭和６０年１２月２日
に通産省工業技術院微生物工業技術研究所へ寄託した。

その微生物受託番号は微工研菌寄第８５３８号である。

本発明を実施するには、例えば上記ＫＳＭ−１６株が良
好に生育し、リパーゼを順調に生産するために必’ｌｙ
炭素源、窒素源、無機塩等を含む培地中でこれを培養し
、該培養液から採取することにより行なわれる。

培地の組成については、通常シュードモナス属に属する
微生物の培養に用いられるものであれば特に限定されな
い。例えば、窒素源としては各種無機態窒素と各櫨有機
態窒素及びその組合わせが利用できる。特に単独系とし
てはペプトン、肉エキス、尿素などが有効である。炭素
源としてはグルコースなどの糖類、オリーブ油等の各宿
油脂、脂肪酸、脂肪酸エステル、及び脂肪酸誘導体等を
用いることができる。無機塩類としては硫安、リン酸１
カリ、リン酸２カリ、硝酸ナトリウム、硫酸マグネシウ
ム等の添加が有効である。その他必要に応じて、菌の生
育、酵素の生産に必要な各種有機物、無機物を添加する
ことができる。

培養には、液体培養が適している。培養温度は先にしめ
したように２０−４２℃で培養でき、なかでも３０−３
７℃がもつともよい。また好気的に培養することＫより
、約１−２日でリパーゼの生産性は最高に達する。この
ようにして得られた培養液からリパーゼを得るには、菌
体を遠心分離、ろ過によシ分離した後、上澄液を有＠溶
剤（アセトン、エタノール等）による沈殿、硫安による
塩析法、あるいは限外ろ過膜（アミコン社製　分画分子
量３００００）により濃縮回収することができる。

得られたリパーゼを精製するには、培養液の濃縮液を硫
安沈殿、エタノール沈殿により得た酵素液をＤＩＡＩ−
セルロース等のイオン交換体、セファデックス等による
ゲルろ適法など一般に知られている蛋白質１１ｔＥｋ法
が利用できる。これらの精製法によシ比活性の高められ
た酵素液は、凍結乾燥することにより酵素粉末を得るこ
とができる。

以上の如くして樽られたリパーゼの理化学的性質は次の
通りである。

１、　作用 パーム油、オリーブ油、牛脂、ヤシ油を反応温度６０℃
、２４時間で９０％以上分解する。

特にパーム油は９３チ以上分解する。

２　基質特異性　各徨グリセライド、エステルなどを分
解する。

特に飽和油脂を選択的に分解する。

油脂の種類　分解率（５０℃、２４時間。

１０００　ｕｎｉｔ／ｇ−ｏ口） パーム油　　　９１．７　％ オリーブ油　　８２．１％ ヤシ油　　　　７３．１％ 牛脂　　　　　８９．１１％ １　安定ｐＨ範囲 ｐＨ３−１２，（３０℃、　２４　ｈｒ後の残存活性９
図１） 作用至適ｐＨの範囲 ｐＨ６−７，５（図２） ４、作用適温の範囲　６５−８０℃　１図３）至適温度
　７０℃ ５、分子量 ５Ｏ８−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法では２９０
００ ゲルろ過（セファデックス　Ｇ−７５）法によると３０
０００である。

６、糖含有　オルシノール反応による糖発色　＋７、　
　ｐＨ％温度などによる失活の条件３０℃および５０℃
、３時間の熱処理ではは、とんど失活はないが、７０℃
、２時間の熱処理では約４０％失活する（図４）。酵素
液に塩化カルシウム１ｍＭ加えることにより７０℃、２
時間の熱失活が３０特に減少し、熱安定性が上昇する。

１０−８０℃の各温度で１０分間熱処理した後の残存活
性率を図５に示す。

８、阻害、活性化および安定化 胆汁収の影響なし 無機塩類の影響 各金属塩が反応系に１　ｍＭ　＃　［共存する条件で５
０℃で３０分酵素反応を行わせ、塩類を入れない場合の
活性を１００としてそれぞれの活性を表した。

金属塩 なし　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・　
１００ＣｕＳＯ４・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・　３２Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・　８８ＭｇＣ２２・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・　８３ＫＣ１・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・　９６ＮａＣｔ　
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・　９５Ｃ
ａＣ１２・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
　１００ＣｏＣＬｚ　　・・・・・・・・・・・・・・
・・・・　　７１ＭｇＣ１，・・・・・・・・・・・・
・・・・・・　　　７５ＺｎＣＬｚ　　・・・・・・・
・・・・・・・・・・・　　１０ＦｅＣＬ３　　・・・
・・・・・・・・・・・・・・・　　　１０９、力価測
定法 オリーブ油９　ｍｌを１５０耐用コツプに分注する。つ
ぎに０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を１４
１１ｉｔ取り５０℃に加温する。マグネチツクスターラ
ーで反応液を均一に攪はん（８００ｒｐｍ）しながら酵
素液を加えて反応を開始し、一定時間（３０分）反応さ
せた後アセトン、エタノ−′ル（１：１）混液ｔ−２０
ｄ加えて反応を止める。

この液にトウイーン８０　（Ｔｗｅｅｎ　８０　）　１
０　％溶液を１−加え、反応で生成した脂肪酸をｐＨ電
極を用いた自動中和滴定装置（Ｍｅｔｔｌｅｒ社製ＤＬ
４０ＲＣ）により０．５　Ｎ水酸化カリウム（アルコー
ル性）ｌｆＩ液で滴定する。酵素力価は１分間に１マイ
クロモルの脂肪酸を遊離させる酵素量を１単位とした。

〔作用ならびに発明の効果〕

つ熱安定性が高いという優れた性質を有する。

従って、該リパーゼを利用すれば工業用油脂を常温常圧
領域の温和な条件下で、工業的に有利に加水分解を行な
うことができる。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例１ ペプトン（Ｄｉｆｃｏ製）４１グルコース０．５％。

Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、Ｍｊ！Ｓｏ４・７　Ｈｚ８　０
．０５　％　％オレイン酸０．５％よりなる液体培地１
００　ｍｌを５００ゴ容坂口フラスコに入れ１２１℃１
５分間加圧蒸気滅菌した後、あらかじめ同培地で３０℃
２４時間振と間抜養したシュードモナス・エスピーＫＳ
Ｍ−１６株の前培養液１　ｍｌを接種し３０℃４８時間
振と間抜養した。培養液を遠心分離して菌体を除いた上
澄液の活性は２０　ｕｎｉｔ／ｍ／であった。　　　・ 実施例２ 尿素０．４％、グル＝ｒ　−スＱ、　５　％　−、Ｋ２
ＨＰＯ４０，１チ、Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ冨ｏｏ、ｏｓ％、
酵母エキス０．１％＼オレイン酸０．５％よシ成る液体
培地１００−を５０〇−容坂ロフラスコに入れ１２１℃
１５分間加圧蒸気滅菌した後、あらかじめ同培地で３０
℃２４時間振と間抜養したシュードモナス・エスピーＫ
ＳＭ−１６株の前培養液１ｄを接種し３０℃３日振とう
培養した。培養上澄液のリパーゼ活性は１４０　ｕｎｉ
ｔ／ｄであった。

実施例３ ペプトン４ａＩＪ％グル：ｙ　−スＱ、　５　％、ＫＨ
２Ｐ　ＯａＯ１１％、ＭｇＳＯ４・７ＨｚＯ０，０５％
、オレイン酸０、５　％よりなる２ｔの培地を５を容の
ジャーファーメンタ−に入れ１２１℃１５分間加圧蒸気
滅菌したのち、あらかじめ同培地で３０℃２４時間振と
間抜養したシュ−ドモナス・エスピー　ＫＳＭ−１６株
を１００−の培養液を加え３０℃３００ｒｐｍで４８時
間培誉した。培養後、菌体を遠心分離して除いた培養上
澄１．５２の活性は３０　ｕｎｉｔ／ｄ、であった。培
養上澄を３００ｄｔで限外ろ過（アミコン社製　ダイヤ
フロー膜　分画分子量１００００）により濃縮した後、
凍結乾燥して粗酵素粉末１０２を得た。酵素粉末には３
０００ｕｎｉｔ／ｆの活性が認められた。

参考例１ 実施例３で得た粗酵素粉末を用いてパーム油、ヤシ油、
牛脂、オリーブ油の分解をおこなった。

三角フラスコに油１２に対し、酵素１０００ｕｎ　ｉ　
ｔ　、油対水（１：１）で振とうさせ加水分解した。４
８時間後の６油の分解率は、パーム油９２チ、ヤシ油９
０．９％、牛脂９０．１％、オリーブ油８６．３％であ
った。

参考例２ 実施例３で得た粗酵素粉末を用いてパーム油の加水分解
を行った。三角フラスコに、油１１に対し酵素１６０　
ｕｎｉｔ、油対水（１：１）で加え振とうさせ加水分解
した。２４時間後パーム油の分解率は９２％であった。

参考例３　微生物の取得方法 （１）栃木県芳賀郡市貝町周辺の土壌を採取し、土壌小
さじ一杯を滅菌生理食塩水１０−の入った試験管に入れ
、１分間ポルテックスミキサーにて懸濁分散させた。約
１時間静置後、その上澄液を０．２−採取し、これを下
記方法で調製された分離用寒天培地の表面にコンラッジ
禅で均一に塗布した後、３０℃で培養した。

（分離用寒天培地の調製） 培地組成 トリブチリン・・・・・・・・・・・・・・・０．１％
（ＮＨ４）２ＳＯ４・・・・・・・・・・・・・・・０
．５％ンイトン　　・・・・・・・・・・・・・・・０
．５％酵母エキス　・・・・・・・・・・・・・・・０
．１％ＫＨ２Ｐ　Ｏ４・・・・・・・・・・・・・・・
０．５チＭ　ｇ　Ｓ　Ｏａ・７Ｈ２０・・・・・・・・
・・・・０．１チ寒天　　　　・・・・・・・・・・・
・・・・２．０％ｐＨ４，５（ＨＣｌで調製） 調製方法 上記組成のうちトリブチリン、および寒天を別滅菌し、
滅菌後これらを無菌的に合せ、シェーカーでトリブチリ
ンを均一に分散させた後、保温下で滅菌シャーレに一定
量分注し不透明な平板寒天培地とした。

（２）次いで、上記培養により生育したコロニーのうち
、周辺にトリブチリンを分解し透明環を形成するコロニ
ーの１白金耳を滅菌生理食塩水で１００倍希釈し、この
希釈液１白金耳を前述の分離用寒天培地と同組成の寒天
培地に画線し、３０℃で３日間培養した。生じた複数の
コロニーが相互に相違しないことを肉眼的および顕微鏡
的に観察することによシ確認した。さらに上記コロニー
を再度同じ操作を行い単一性を再確認した。上記菌株の
各培地上の性状および生理学的性質は前述した通りであ
る。

（３）次いで、上記で純粋培養≠された斜面培地上の菌
株よシ１白金耳を滅菌した１０％グリセ・リン水溶液（
２ｒｄ　）の入った凍結用バイアルに懸濁し、−８０℃
にて凍結保存する。かくして３力月凍結保存後、迅速に
解凍して得られる懸濁液の１白金耳を普通寒天培地に蘇
生後、前記と同条件下に各培地上での性状および生理学
的性質を調べた結果、凍結前とは変化が認められなかっ
た。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明によって得られたリパーゼのｐＨ３〜１３
の範囲における、３０℃２４時間処理後の残存活性を示
す図面である。 図２は、本発明によって得られたリパーゼのｐＨ３〜８
の範囲における比活性を示す図面である。 図３は、本発明によって得られたリパーゼの各温度条件
下における比活性を示す図面である。 図４は、本発明によって得られたリパーゼの各温度条件
下での処理時間と残存活性との関係を示す図面である。 図５は、本発明によって得られたリパーゼの各温度条件
下で１０分間処理した場合の残存活性を示す図面である
。 以上 図　　１ ｐＨ Ｏ：マクルバイン緩衝液 Δ：　トリス−ＨＣ１緩衝液 。：グリセリンーＮａＯＨ緩衝液 ＠　：　ＮａＨＣＯ３−ＮａＯＨ緩衝液ム’、　　Ｎａ
２ＥＩＰＯ，−Ｎａ０Ｆ！緩衝液＠　：　ＫＣｔ−Ｎａ
ＯＨ緩衝液 図　　２ ｐＨ Ｏ：マクルパイン緩衝液中、５０°Ｃ条件下図　　３ 温度（”Ｃ） 図　　４ 時間（時） Ｑ：３０″Ｃ Δ：５０°Ｃ 口：７０℃ 図　　５ ０：ｐＨ未調整、１ｏ分間処理

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、シュードモナス属に属するリパーゼ生産菌を培養し
   、該培養物から下記の理化学的性質を有するリパーゼを
   採取することを特徴とするリパーゼの製造法。 （１）作用 パーム油、オリーブ油、牛脂、ヤシ油を反応温度６０℃
   、２４時間で９０％以上分解する。特にパーム油は９３
   ％以上分解する。 （２）基質特異性　各種グリセライド、エステルなどを
   分解する。 特に飽和油脂を選択的に分解する。 （３）安定ｐＨ範囲 ｐＨ３−１２ 作用至適ｐＨの範囲 ｐＨ６−７．５ （４）作用適温の範囲６５−８０℃ 至適温度　７０℃ （５）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法では２９０
   ００ ゲルろ過（セフアデツクス　Ｇ−７５）法によると３０
   ０００である。 （６）糖含有　オルシノール反応による糖発色　＋２、
   リパーゼ生産菌がシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕ
   ｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＫＳＭ−１６（微工研菌寄第
   ８５３８号）である特許請求の範囲第１項記載のリパー
   ゼの製造法。