JPH0755148B2 - リパ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なリパーゼの製造法に関する。

〔従来の技術〕

工業的油脂の加水分解は従来高温高圧加水分解法により
行われているが、この方法は、高温高圧条件のプロセス
であり高エネルギーを必要とする。これに対し酸素を利
用するリパーゼ加水分解法は、常温常圧領域の温和な条
件で反応を行うことができる省エネルギー型の有効なプ
ロセスである。工業的にリパーゼ油脂加水分解を行うに
は油脂、特に対象となる牛脂やパーム油等の高融点油脂
の加水分解率が高く（90％以上）、耐熱性を有するリパ
ーゼが必要である。

これまで油脂加水分解用リパーゼとしては酵母カンデイ
ダ・ルゴーサ（Candida rugosa）の生産するリパーゼか
ら知られている（名糖産業製 リパーゼOF）。このリパ
ーゼはオリーブ油をはじめ各種油脂を30℃で90％以上分
解する能力を有しているが、45℃以上では不安定であり
失活し易く、パーム油等の高融点油脂の加水分解には適
していない。

耐熱性を有する油脂加水分解用リパーゼとしては、シユ
ードモナス メフイテイカの生産するリパーゼ（公告昭
50−25553）およびシユードモナス フルオレツセンス
の生産するリパーゼ（公告昭57−52835）が知られてい
るが、前者は高加水分解率（ヤシ油92％）を得るのに塩
化カルシウムが必要であり（Kosugi他J.Ferment.Techno
l.49,968（1971））、塩化カルシウムを添加すると分解
後に金属石鹸が生成して脂肪酸の回収を悪くする欠点を
有している。また、後者は分解率の面では牛脂を50℃で
389unit/g−oilのリパーゼで94.9％分解するが（公告昭
57−39638）、この分解率に達するには70時間を要す
る。さらに、牛脂を1gあたり140unitのリパーゼで加水
分解すると、分解率は24時間後に62％に達し、96.9％の
分解率を得るのに120時間という長時間を必要とする。
この酵素を用いて牛脂を加水分解するには、長時間を要
するため工業的利用には適さない。

また、他に、シユードモナスUKO−816株の生産するリパ
ーゼ（公開昭58−146277）が耐熱性を有していることが
知られているが、このリパーゼは分子量が20000万以上
という超高分子であり、比活性（単位重量当たりのリパ
ーゼ活性）が低くなるという欠点を有している。

〔発明が解決しようとする問題点〕

工業的油脂の加水分解の油脂原料としては、牛脂だけで
なく、より融点が高く飽和脂肪酸含有量の高いパーム油
も多く用いられる傾向にある。工業用リパーゼには、こ
れらパーム油、牛脂をできるだけ短時間により高い加水
分解（90％以上）を行い、且つ熱安定性が高いことが要
求されることから、該性質を有するリパーゼの製造法の
開発が熱望されていた。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで本発明者らは工業用油脂の加水分解に適した高加
水分解率、耐熱性を有するリパーゼを提供することを目
的として鋭意検討した結果、栃木県芳賀郡市貝町の土壌
より分離した微生物の生産するリパーゼに、上記目的に
かなうリパーゼが存在することを見出し本発明を完成し
た。

すなわち、本発明はシユードモナス属に属するリパーゼ
生産菌を培養し、該培養物から後記の理化学的性質を有
するリパーゼを採取することを特徴とするリパーゼの製
造法を提供するものである。

本発明に使用されるシユードモナス属に属する上記リパ
ーゼ生産菌としては、上記リパーゼを生産する能力を有
するものであれば特に限定されないが、例えば本発明者
らが栃木県芳賀郡の土壌より分離した新菌株シユードモ
ナス・エスピー KSM−16が挙げられる。

以下にこの菌株の菌学的性質を示す。

（Ａ）形態 細胞の形及び大きさ かん状 幅 0.75−1.0μｍ 長さ 2.3 −2.5 μｍ 運動性あり ベン毛は一本以上あり。

胞子 なし グラム染色 陰性 （Ｂ）各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養 円形，乳白色のコロニーを形成，表面 滑らか，光沢あ
り，全縁，隆起 肉汁寒天斜面培養 普通 肉汁液体培養 30℃,2日で菌膜形成，一様に混濁 肉汁ゼラチン穿刺培養 液化せず リトマスミルク 凝固およびリトマスを還元した。

（Ｃ）生理学的性質 硝酸塩の還元 ＋ 脱窒素反応 − MRテスト − VPテスト − インドールの生成 − 硫化水素の生成 − デンプンの加水分解 − クエン酸の利用 Koser＋Christensen＋ 無機窒素源の利用 NH₄＋NO₃ ＋ 色素の生成 KingA−KingB − ウレアーゼ − オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ 生育の範囲 生育 42℃5,45℃−,5℃− 増殖温度範囲 20−43℃， 増殖至適温度範囲 30−37℃ 酸素に対する態度 好気的 OFテスト ０（酸化的） 糖類から酸およびガスの生成の有無 酸 Ｌ−アラビノース − Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ マルトース ＋ シヨ糖 ＋ ラクトース ＋ トレハロース ＋ Ｄ−ソルビツト ＋ Ｄ−マンニツト ＋ イノシツト ＋ グリセリン ＋ デンプン − サリシン − ラフイノース − 以上の糖類からガスの生成はなかつた。

（Ｄ）炭水化物の利用 Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−リボース ＋ Ｌ−ラムノース − レブリン酸 − Ｄ−酒石酸 − meso−酒石酸 ＋ meso−エリスリトール − アドニトール − メサコン酸 − シトラコン酸 − Ｌ−バリン ＋ ｍ−ヒドロキシ安息香酸 − 2,3−ブタンジオール ＋ ベタイン ＋ アルギニン ＋ 以上の菌学的性質から、バージエのマニユアル．オブ．
デイタミネイテイブ．バクテリオロジー第８版（Berge
y's manual of determinative bactericlogy 8th.ed.）
により検索した結果、本菌に類似の菌株としてシユード
モナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）が挙げられ
る。そこでシユウドモナス・セパシア（A.T.C.C.1058
6）を本菌と同条件で培養し各性質を比較したところ、
次に示すごとく各性質において異なつていることが判明
した。

これらの諸性質の差異から本リパーゼ生産菌は公知菌の
いずれとも異なる新菌株と判断し、シユードモナス・エ
スピー KSM−16と命名し、昭和60年12月２日に通産省
工業技術院微生物工業技術研究所へ寄託した。その微生
物受託番号は微工研菌寄第8538号である。

本発明を実施するには、例えば上記KSM−16株が良好に
生育し、リパーゼを順調に生産するために必要な炭素
源、窒素源、無機塩等を含む培地中でこれを培養し、該
培養液から採取することにより行なわれる。

培地の組成については、通常シユードモナス属に属する
微生物の培養に用いられるものであれば特に限定されな
い。例えば、窒素源としては各種無機態窒素と各種有機
態窒素及びその組合わせが利用できる。特に単独系とし
てはペプトン、肉エキス、尿素などが有効である。炭素
源としてはグルコースなどの糖類、オリーブ油等の各種
油脂、脂肪酸、脂肪酸エステル、及び脂肪酸誘導体等を
用いることができる。無機塩類としては硫安、リン酸１
カリ、リン酸２カリ、硝酸ナトリウム、硫酸マグネシウ
ム等の添加が有効である。その他必要に応じて、菌の生
育、控訴の生産に必要な各種有機物、無機物を添加する
ことができる。

培養には、液体培養が適している。培養温度は先にしめ
したように20−42℃で培養でき、なかでも30−37℃がも
つともよい。また好気的に培養することにより、約１−
２日でリパーゼの生産性は最高に達する。このようにし
て得られた培養液からリパーゼを得るには、菌体を遠心
分離、ろ過により分離した後、上澄液を有機溶剤（アセ
トン、エタノール等）による沈殿、硫安による塩析法、
あるいは限外ろ過膜（アミコン社製 分画分子量3000
0）により濃縮回収することができる。

得られたリパーゼを精製するには、培養液の濃縮液を硫
安沈殿、エタノール沈殿により得た酵素液をDEAE−セル
ロース等のイオン交換体、セフアデツクス等によるゲろ
過法など一般に知られている蛋白質精製法が利用でき
る。これらの精製法により比活性の高められた酵素液
は、凍結乾燥することにより酵素粉末を得ることができ
る。

以上の如くして得られたリパーゼの理化学的性質は次の
通りである。

1. 作用 パーム油、オリーブ油、牛脂、ヤシ油を反応温度60℃、
24時間で90％以上分解する。特にパーム油は92％以上分
解する。

2. 基質特異性 各種グリセライド、エステルなどを分
解する。

特に飽和油脂を選択的に分解する。

油脂の種類 分解率（50℃,24時間,1000unit/g−oil） パーム油 91.7％ オリーブ油 82.1％ ヤシ油 73.1％ 牛脂 89.1％ 3. 安定pH範囲 pH ３−12,（30℃,24hr後の残存活性，図１） 作用至適pHの範囲 pH ６−7.5（図２） 4. 作用適温の範囲 65−80℃（図３） 至適温度 70℃ 5. 分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法では29000 ゲルろ過（セフアデツクス Ｇ−75）法によると30000
である。

6. 糖含有 オルシノール反応による糖発色 ＋ 7. pH、温度などによる失活の条件 30℃および50℃、３時間の熱処理ではほとんど失活はな
いが、70℃、２時間の熱処理では約40％失活する（図
４）。酵素液に塩化カルシウム1mM加えることにより70
℃、時間の熱失活が30％に減少し、熱安定性が上昇す
る。10−80℃の各温度で10分間熱処理した後の残存活性
率を図５に示す。

8. 阻害、活性化および安定化 胆汁酸の影響なし 無機塩類の影響 各金属塩が反応系に1mM濃度共存する条件で50℃で30分
酵素反応を行わせ、塩類を入れない場合の活性を100と
してそれぞれの活性を表した。

金属塩 なし ……100 CuSO₄ ……32 MgSO₄ ……88 MgCl₂ ……83 KCl ……96 NaCl ……95 CaCl₂ ……100 CoCl₂ ……71 HgCl₂ ……75 ZnCl₂ ……10 FeCl₃ ……10 9. 力価測定法 オリーブ油9mlを150ml用コツプに分注する。つぎに0.1M
リン酸緩衝液（pH7.0）を14ml取り50℃に加温する。マ
グネチツクスターラーで反応液を均一に撹はん（800rp
m）しながら酵素液を加えて反応を開始し、一定時間（3
0分）反応させた後アセトン、エタノール（1:1）混液を
20ml加えて反応を止める。この液にトウイーン80（Twee
n80）10％溶液を1ml加え、反応で生成した脂肪酸をpH電
極を用いた自動中和滴定装置（Mettler社製DL40RC）に
より0.5N水酸化カリウム（アルコール性）溶液で滴定す
る。酵素力価は１分間に１マイクロモルの脂肪酸を遊離
させる酵素量を１単位とした。

〔作用ならびに発明の効果〕

本発明によつて製造されるリパーゼは、工業用油脂に対
して短時間で極めて高い加水分解能を示し、かつ熱安定
性が高いという優れた性質を有する。

従つて、該リパーゼを利用すれば工業用油脂を常温常圧
領域の温和な条件下で、工業的に有利に加水分解を行な
うことができる。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例１ ペプトン（Difco製）４％、グルコース0.5％、K₂HPO₄
0.1％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、オレイン酸0.5％よりなる
液体培地100mlを500ml容坂口フラスコに入れ121℃15分
間加圧蒸気滅菌した後、あらかじめ同培地で30℃24時間
振とう培養したシユードモナス・エスピー KSM−16株
の前培養液1mlを接種し30℃48時間振とう培養した。培
養液を遠心分離して菌体を除いた上澄液の活性は20unit
/mlであつた。

実施例２ 尿素0.4％、グルコース0.5％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄・7H
₂O0.05％、酵母エキス0.1％、オレイン酸0.5％より成る
液体培地100mlを500ml容坂口フラスコに入れ121℃15分
間加圧蒸気滅菌した後、あらかじめ同培地で30℃24時間
振とう培養したシユードモナス・エスピー KSM−16株
の前培養液1mlを接種し30℃３日振とう培養した。培養
上澄液のリパーゼ活性は140unit/mlであつた。

実施例３ ペプトン４％、グルコース0.5％、KH₂PO₄0.1％、MgSO₄
・7H₂O0.05％、オレイン酸0.5％よりなる２の培地を
５容のジヤーフアーメンターに入れ121℃15分間加圧
蒸気滅菌したのち、あらかじめ同培地で30℃24時間振と
う培養したシユードモナス・エスピー KSM−16株を100
mlの培養液を加え30℃300rpmで48時間培養した。培養
後、菌体を遠心分離して除いた培養上澄1.5の活性は3
0unit/mlであつた。培養上澄を300mlまで限外ろ過（ア
ミコン社製 ダイヤフロー膜 分画分子量 10000）に
より濃縮した後、凍結乾燥して粗酵素粉末10gを得た。
酵素粉末には3000unit/gの活性が認められた。

参考例１ 実施例３で得た粗酵素粉末を用いてパーム油、ヤシ油、
牛脂、オリーブ油の分解をおこなつた。三角フラスコに
油1gに対し、酵素1000unit、油対水（1:5）で振とうさ
せ加水分解した。48時間後の各油の分解率は、パーム油
92％、ヤシ油90.9％、牛脂90.1％、オリーブ油86.3％で
あつた。

参考例２ 実施例３で得た粗酵素粉末を用いてパーム油の加水分解
を行つた。三角フラスコに、油1gに対し酵素160unit、
油対水（1:1）で加え振とうさせ加水分解した。24時間
後パーム油の分解率は92％であつた。

参考例３ 微生物の取得方法 （１） 栃木県芳賀郡市貝町周辺の土壌を採取し、土壌
小さじ一杯を滅菌生理食塩水10mlの入つた試験管に入
れ、１分間ボルテツクスミキサーにて懸濁分散させた。
約１時間静置後、その上澄液を0.2ml採取し、これを下
記方法で調製された分離用寒天培地の表面にコンラツジ
棒で均一に塗布した後、30℃で培養した。

（分離用寒天培地の調製） 培地組成 トリブチリン ……0.1％ （NH₄）₂SO₄ ……0.5％ ソイトン ……0.5％ 酵母エキス ……0.1％ KH₂PO₄ ……0.5％ MgSO₄・7H₂O ……0.1％ 寒天 ……2.0％ pH4.5（HClで調製） 調製方法 上記組成のうちトリブチリン、および寒天を別滅菌し、
滅菌後これらを無菌的に合せ、シエーカーでトリブチリ
ンを均一に分散させた後、保温下で滅菌シヤーレに一定
量分注し不透明な平板寒天培地とした。

（２） 次いで、上記培養により生育したコロニーのう
ち、周辺にトリブチリンを分解し透明環を形成するコロ
ニーの１白金耳を滅菌生理食塩水で100倍希釈し、この
希釈液１白金耳を前述の分離用寒天倍地と同組成の寒天
倍地に画線し、30℃で３日間培養した。生じた複数のコ
ロニーが相互に相違しないことを肉眼的および顕微鏡的
に観察することにより確認した。さらに上記コロニーを
再度同じ操作を行い単一性を再確認した。上記菌株の各
倍地上の性状および生理学的性質は前述した通りであ
る。

（３） 次いで、上記純粋培養された斜面倍地上の菌株
より１白金耳を滅菌した10％グリセリン水溶液（2ml）
の入つた凍結用バイアルに懸濁し、−80℃にて凍結保存
する。かくして３カ月凍結保存後、迅速に解凍して得ら
れる懸濁液の１白金耳を普通寒天倍地に蘇生後、前記と
同条件下に各倍地上での性状および生理学的性質を調べ
た結果、凍結前とは変化が認められなかつた。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明によつて得られたリパーゼのpH3〜13の範
囲における、30℃24時間処理後の残存活性を示す図面で
ある。 図２は、本発明によつて得られたリパーゼのpH3〜８の
範囲における比活性を示す図面である。 図３は、本発明によつて得られたリパーゼの各温度条件
下における比活性を示す図面である。 図４は、本発明によつて得られたリパーゼの各温度条件
下での処理時間と残存活性との関係を示す図面である。 図５は、本発明によつて得られたリパーゼの各温度条件
下で10分間処理した場合の残存活性を示す図面である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】シユードモナス属に属するリパーゼ生産菌
   を培養し、該培養物から下記の理化学的性質を有するリ
   パーゼを採取することを特徴とするリパーゼの製造法。 作用 パーム油、オリーブ油、牛脂、ヤシ油を反応温度60℃、
   24時間で90％以上分解する。特にパーム油は92％以上分
   解する。 基質特異性 各種グリセライド、エステルなどを分
   解する。 特に飽和油脂を選択的に分解する。 安定pH範囲 pH ３−12 作用至適pHの範囲 pH ６−7.5 作用適温の範囲65−80℃ 至適温度 70℃ 分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法では29000 ゲルろ過（セフアデツクス Ｇ−75）法によると30000
   である。 糖含有 オルシノール反応による糖発色＋
2. 【請求項２】リパーゼ生産菌がシユードモナス・エスピ
   ー（Pseudomonas sp.）KSM−16（微工研菌寄第8538号）
   である特許請求の範囲第１項記載のリパーゼの製造法。