JPS58107177A - 酸性プロテア−ゼの製造方法、野生株アスペルギルス・ニゲ−ル・変種テイ−ンヘムｃｂｓ３１９．８１及びその変異株及び動物飼料添加物 - Google Patents
酸性プロテア−ゼの製造方法、野生株アスペルギルス・ニゲ−ル・変種テイ−ンヘムｃｂｓ３１９．８１及びその変異株及び動物飼料添加物Info
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- JPS58107177A JPS58107177A JP57217138A JP21713882A JPS58107177A JP S58107177 A JPS58107177 A JP S58107177A JP 57217138 A JP57217138 A JP 57217138A JP 21713882 A JP21713882 A JP 21713882A JP S58107177 A JPS58107177 A JP S58107177A
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- C12N9/62—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from Aspergillus
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、アスペルギルスから広いｐＨ作用範囲を有す
る酸性プロテアーゼを高い収率で製造する方法及び該酸
性プロテアーゼを産生ずる変異株に関する。
る酸性プロテアーゼを高い収率で製造する方法及び該酸
性プロテアーゼを産生ずる変異株に関する。
酸性プロテアーゼの工業的規模での回収を可能にする、
アスペルギルス及び変異株からの酸性プロテアーゼは知
られている。本発明は、従来知られている程度よりプロ
テアーゼ収率を増加することを目的とする。この目的は
、適当な野生株を突然変異させ、高いプロテアーゼ産生
を有する変異株を選択することによって達成される。
アスペルギルス及び変異株からの酸性プロテアーゼは知
られている。本発明は、従来知られている程度よりプロ
テアーゼ収率を増加することを目的とする。この目的は
、適当な野生株を突然変異させ、高いプロテアーゼ産生
を有する変異株を選択することによって達成される。
本発明によれば、アスペルギルス属の野生株、好ましく
は土壌試料から単離されたアスペルギルス・ニゲール変
種ティーンヘム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ
ｖａｒ、Ｔｉｅｎｈｅｍ ） ＣＢＳ ３１９．８１か
ら出発する。この菌株は、広いｐＨ範囲で有効な細胞外
酸性プロテアーゼを産生ずる。突然変異はＵＶ−照射に
よって行なうのが好ましい。突然変異処理を、選択した
菌種を用いて場合により１回以上繰り返す。
は土壌試料から単離されたアスペルギルス・ニゲール変
種ティーンヘム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ
ｖａｒ、Ｔｉｅｎｈｅｍ ） ＣＢＳ ３１９．８１か
ら出発する。この菌株は、広いｐＨ範囲で有効な細胞外
酸性プロテアーゼを産生ずる。突然変異はＵＶ−照射に
よって行なうのが好ましい。突然変異処理を、選択した
菌種を用いて場合により１回以上繰り返す。
従ッテ、本発明の対象は、アスペルギルス属の真菌を好
気性培養することによって、広いｐＨ作用範囲を有する
酸性プロテアーゼを高収率で製造するため、 ａ）酸性プロテアーゼを産生ずるアスペルギル属の野生
株を単離し、 ｂ）好ましくはＵＶ 照射に、より突然変異させ、ｃ）
ｌ ５ ｍＴＵ ／ｍｌより多い、高いプロテアー
ゼ産生能を有する変異株を、カゼイネート寒天平板上に
スノξ−チルで塗り、寒天培地にカルブキシルゾロテア
−ぜ用抑制剤、好ましく（ｒｉ＜ブスクチンを添加し、
数日培養し、強い力ぜイノリシス輪形成を示す変異株コ
ロニーを単離することによって選択し、 ｄ）この変異株を、同化しうる炭素及び窒素源を含む栄
養培地中で３〜７のｐＨ範囲で２５〜５０℃の温度で培
養し、 ｅ）産生されたプロテアーゼを分離することを特徴とす
る酸性プロテアーゼの製造方法である更に、本発明の対
象は、寄託番号ＡＰ １１４（ＣＢＳ ３ Ｌ ９．８
Ｌ）を有する野生株並びに前記方法で単離される野生
株の変異株であって、振盪培養で下記の条件下で１５
ｍＴＵ ／−より多い蛋白分解活性を産生じ、産生され
るプロテアーゼが下記の試験（等電点分画電気泳動法及
び免疫学的試験）に基づいて野生株のプロテアーゼと同
一である変異株である。特に下記の変異株が重要である
： アスペルギルス−：ゲールＡＰ１１４−■−６９（ｃＢ
ｓ３２０．８１）アスペルギルス・ニゲールＡＰ１１４
−ＩＶ−７０（ＣＢＳ３２１．８１）アスペルギルス・
ニゲールＡＰ１１４−■−７４（ＣＢＳ３２２．８１）
アスペルギルス・ニゲールＡｐＨ４−ＩＶ−８０（ＣＢ
Ｓ３２３．８１）。
気性培養することによって、広いｐＨ作用範囲を有する
酸性プロテアーゼを高収率で製造するため、 ａ）酸性プロテアーゼを産生ずるアスペルギル属の野生
株を単離し、 ｂ）好ましくはＵＶ 照射に、より突然変異させ、ｃ）
ｌ ５ ｍＴＵ ／ｍｌより多い、高いプロテアー
ゼ産生能を有する変異株を、カゼイネート寒天平板上に
スノξ−チルで塗り、寒天培地にカルブキシルゾロテア
−ぜ用抑制剤、好ましく（ｒｉ＜ブスクチンを添加し、
数日培養し、強い力ぜイノリシス輪形成を示す変異株コ
ロニーを単離することによって選択し、 ｄ）この変異株を、同化しうる炭素及び窒素源を含む栄
養培地中で３〜７のｐＨ範囲で２５〜５０℃の温度で培
養し、 ｅ）産生されたプロテアーゼを分離することを特徴とす
る酸性プロテアーゼの製造方法である更に、本発明の対
象は、寄託番号ＡＰ １１４（ＣＢＳ ３ Ｌ ９．８
Ｌ）を有する野生株並びに前記方法で単離される野生
株の変異株であって、振盪培養で下記の条件下で１５
ｍＴＵ ／−より多い蛋白分解活性を産生じ、産生され
るプロテアーゼが下記の試験（等電点分画電気泳動法及
び免疫学的試験）に基づいて野生株のプロテアーゼと同
一である変異株である。特に下記の変異株が重要である
： アスペルギルス−：ゲールＡＰ１１４−■−６９（ｃＢ
ｓ３２０．８１）アスペルギルス・ニゲールＡＰ１１４
−ＩＶ−７０（ＣＢＳ３２１．８１）アスペルギルス・
ニゲールＡＰ１１４−■−７４（ＣＢＳ３２２．８１）
アスペルギルス・ニゲールＡｐＨ４−ＩＶ−８０（ＣＢ
Ｓ３２３．８１）。
変異株の単離は下記の方法で行なった：麦芽汁ブイヨン
寒天上で発芽させ、６日経過した、野生株の斜面培養物
を滅菌０．００５％ラウリル硫酸ナトリウム溶液で浮遊
させ、胞子懸濁液を滅菌ガラスフリツ）（Ｄ−３）を通
して濾過してミセルフラグメントを分離し、引続キロ０
００回転／分で１５分遠心分離する。沈降した胞子を滅
菌０．１ Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４，５）に取り、胞子
濃度を顕微鏡下に約１０ 菌／ｒｎｌに調節する。調節
した胞子溶液を引続きＵＶ ランプ（波長２５牛ｎｍ、
１３ワット）で、９９ｇ％の死亡率になるまで照射する
。活性変異株を単離するだめ、照射した胞子を下記組成
のカゼイネート寒天平板上にスノξ−チルで塗る：大豆
粉 ０． Ｌ Ｏ％コーンス
チープリ力−０，１０％ 力ぜイン ０．５０％ゼラチン
０．２０％ＫＨＰｏ
０．２４ ％ ４ Ｍｇ（！１２・６Ｈ２００，ｌ Ｏ％ Ｍｎ Ｓ Ｏ４” ４Ｈ２０００５％ （！ａｏ１２−２Ｈ２００，０２％ Ｎａ−デスオキシコレート ０．０４％グルコ
ース １００％寒天
１６０％ｐＨ５，５ 残り 水 プロテアーゼ産生の著しく高い変異株を直ちに認識しう
るように、寒天培地に更にプロテアーゼ抑制剤ペプスタ
チンを１２．５ ！！／−を添加した。ペプスタチンの
代りに、カルゼキシプロテアーゼ用の他の抑制剤を添加
することもできる。カゼイネート寒天培地の組成も限定
的ではない。
寒天上で発芽させ、６日経過した、野生株の斜面培養物
を滅菌０．００５％ラウリル硫酸ナトリウム溶液で浮遊
させ、胞子懸濁液を滅菌ガラスフリツ）（Ｄ−３）を通
して濾過してミセルフラグメントを分離し、引続キロ０
００回転／分で１５分遠心分離する。沈降した胞子を滅
菌０．１ Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４，５）に取り、胞子
濃度を顕微鏡下に約１０ 菌／ｒｎｌに調節する。調節
した胞子溶液を引続きＵＶ ランプ（波長２５牛ｎｍ、
１３ワット）で、９９ｇ％の死亡率になるまで照射する
。活性変異株を単離するだめ、照射した胞子を下記組成
のカゼイネート寒天平板上にスノξ−チルで塗る：大豆
粉 ０． Ｌ Ｏ％コーンス
チープリ力−０，１０％ 力ぜイン ０．５０％ゼラチン
０．２０％ＫＨＰｏ
０．２４ ％ ４ Ｍｇ（！１２・６Ｈ２００，ｌ Ｏ％ Ｍｎ Ｓ Ｏ４” ４Ｈ２０００５％ （！ａｏ１２−２Ｈ２００，０２％ Ｎａ−デスオキシコレート ０．０４％グルコ
ース １００％寒天
１６０％ｐＨ５，５ 残り 水 プロテアーゼ産生の著しく高い変異株を直ちに認識しう
るように、寒天培地に更にプロテアーゼ抑制剤ペプスタ
チンを１２．５ ！！／−を添加した。ペプスタチンの
代りに、カルゼキシプロテアーゼ用の他の抑制剤を添加
することもできる。カゼイネート寒天培地の組成も限定
的ではない。
平板を、個々の胞子が明らかなコロニーに発育するまで
、３０℃で３〜４日培養した。引続き、カゼイノリシス
輪形成の強いコロニーだけを保存培養として単離し、試
験した。有効な変異株を単離するだめの選択基準はプロ
テアーゼ抑制剤の添加により極めて鮮明になり、従って
ゾロテアーゼ形成の著しく高い株だけを選択することを
保証する。蛋白分解活性を試験するため、新しい株を振
盪培養で３０℃で培養した（トラップを付けた５００−
のエルレンマイヤーフラスコ、振盪頻度１５０回転／分
）。培地の組成は下記のとおりであっだ： ダイズ粉 ０．３０％コーン
スチーブリ力− ０．３０％ゼラチン
１００％カゼイン
ｌ、５０％ＫＨＰｏ
０．２４％ ４ Ｍｇ Ｓ Ｏ４”Ｈ２００，Ｉ Ｏ％ ＭｎＣ！ｌ ・４ＨＯ０，０’５％ ２ ＣａＣＩ ０２ＨＯ０，０２％ ２ トウモロコシ殿粉（殿粉分解により分解）１０ ％ ｐＨ５，５ 残り 水 この方法で野生株から、高いプロテア−ぜ活性を産生ず
る変異株を単離した。これらの菌株のうち最も活性の高
いものから出発して突然変異試験を続け、更に産生効率
を達成した。突然変異を合計３回実施し、下記の菌株を
単離する第 １ 表 第１表の菌株から産生じたプロテア−ぜは、野生株ＣＢ
Ｓ ３１９．８１と同じ性質を有する。これらのプロテ
アーゼは、ｐＨ２，５〜Ｆ５．５ ノ弱酸性範囲で特に
広い作用スペクトルを有する点で優れている。作用最適
ｐＨｌｌ″ｊ：ｐＨ４，５にあり、８０％の最大活性の
範囲はｐＨ３，３〜、５．９にあリ、６０％の最大活性
の範囲はｐＨ３，０〜６，４にある。
、３０℃で３〜４日培養した。引続き、カゼイノリシス
輪形成の強いコロニーだけを保存培養として単離し、試
験した。有効な変異株を単離するだめの選択基準はプロ
テアーゼ抑制剤の添加により極めて鮮明になり、従って
ゾロテアーゼ形成の著しく高い株だけを選択することを
保証する。蛋白分解活性を試験するため、新しい株を振
盪培養で３０℃で培養した（トラップを付けた５００−
のエルレンマイヤーフラスコ、振盪頻度１５０回転／分
）。培地の組成は下記のとおりであっだ： ダイズ粉 ０．３０％コーン
スチーブリ力− ０．３０％ゼラチン
１００％カゼイン
ｌ、５０％ＫＨＰｏ
０．２４％ ４ Ｍｇ Ｓ Ｏ４”Ｈ２００，Ｉ Ｏ％ ＭｎＣ！ｌ ・４ＨＯ０，０’５％ ２ ＣａＣＩ ０２ＨＯ０，０２％ ２ トウモロコシ殿粉（殿粉分解により分解）１０ ％ ｐＨ５，５ 残り 水 この方法で野生株から、高いプロテア−ぜ活性を産生ず
る変異株を単離した。これらの菌株のうち最も活性の高
いものから出発して突然変異試験を続け、更に産生効率
を達成した。突然変異を合計３回実施し、下記の菌株を
単離する第 １ 表 第１表の菌株から産生じたプロテア−ぜは、野生株ＣＢ
Ｓ ３１９．８１と同じ性質を有する。これらのプロテ
アーゼは、ｐＨ２，５〜Ｆ５．５ ノ弱酸性範囲で特に
広い作用スペクトルを有する点で優れている。作用最適
ｐＨｌｌ″ｊ：ｐＨ４，５にあり、８０％の最大活性の
範囲はｐＨ３，３〜、５．９にあリ、６０％の最大活性
の範囲はｐＨ３，０〜６，４にある。
酸性プロテアーゼを産生ずる他のアスペルギルス菌株菌
、例エバアスペルギルス・フオエニシイ（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｉｉ ） （ＡＴ（ＩＣ１
牛３３２）、アスペルギルス・アラオモリ（Ａ８ｐｅｒ
ｇｉｌｌｕＳａｗａｍｏｒｉ ） （ＡＴＧＩＣｌ牛３
３３）、アスペルギルス壷フオエティｔウス（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ） （ＡＴＯ（１！
Ｌ牛３３４）、アスペルギルス・アラオモリ（ＡＴＯ
Ｃｌ ４３３５ ）またはアスペルギルス・ニゲール変
種マクロ（Ａｌ］ｐｅｒｇｉｌｌｕＳｎｉｇｅｒ ｖａ
ｒ、ｍａｃｒｏ ） （ＡＴＣＩＣ！ Ｌ ６５１３
）のプロテア−ぜ産生を新規突然変異及び選択法によっ
て向上させることもできる。
、例エバアスペルギルス・フオエニシイ（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｉｉ ） （ＡＴ（ＩＣ１
牛３３２）、アスペルギルス・アラオモリ（Ａ８ｐｅｒ
ｇｉｌｌｕＳａｗａｍｏｒｉ ） （ＡＴＧＩＣｌ牛３
３３）、アスペルギルス壷フオエティｔウス（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ） （ＡＴＯ（１！
Ｌ牛３３４）、アスペルギルス・アラオモリ（ＡＴＯ
Ｃｌ ４３３５ ）またはアスペルギルス・ニゲール変
種マクロ（Ａｌ］ｐｅｒｇｉｌｌｕＳｎｉｇｅｒ ｖａ
ｒ、ｍａｃｒｏ ） （ＡＴＣＩＣ！ Ｌ ６５１３
）のプロテア−ぜ産生を新規突然変異及び選択法によっ
て向上させることもできる。
前記のアスペルギルス菌株を用いて下記の試験を実施し
た。
た。
１）振盪フラスコ中でプロテア−ぜ収率の測定。
結果を第２表にまとめる。
第 ２ 表
２）等電点分画電気泳動法による特性決定（例牛参照）
これらの菌株がアスペルギルス・ニゲールＡＰ１１４及
びその変異株と実際に同じ細胞外蛋白及ヒプロテアーゼ
スペクトルを有することが判った。
びその変異株と実際に同じ細胞外蛋白及ヒプロテアーゼ
スペクトルを有することが判った。
３）免疫学的方法による特性決定（例牛参照）菌株アス
ペルギルス・ニゲールＡｐＨ４−及びその高効率変異株
は前記アスペルギルス株のすべてのプロテアーゼと交差
反応を示すが、他の生物学的起源のプロテアーゼとは交
差反応を示さない。
ペルギルス・ニゲールＡｐＨ４−及びその高効率変異株
は前記アスペルギルス株のすべてのプロテアーゼと交差
反応を示すが、他の生物学的起源のプロテアーゼとは交
差反応を示さない。
プロテアーゼは特に動物飼料用添加物として、特に家禽
、豚、牛及び有用魚類の飼育及び肥２ 育の際の結果の改善に適当である。しかしプロテアーゼ
は更に酸性プロテア−ぜを使用しうる他の使用目的、例
えば食品加工工場、酸性洗浄及び清浄剤、特に病院及び
家庭におけるタイル、床及び杭用清浄剤、製革工場に皮
革助剤として、更に医学的応用範囲に高純度で消化剤と
して使用することもできる。
、豚、牛及び有用魚類の飼育及び肥２ 育の際の結果の改善に適当である。しかしプロテアーゼ
は更に酸性プロテア−ぜを使用しうる他の使用目的、例
えば食品加工工場、酸性洗浄及び清浄剤、特に病院及び
家庭におけるタイル、床及び杭用清浄剤、製革工場に皮
革助剤として、更に医学的応用範囲に高純度で消化剤と
して使用することもできる。
プロテアーゼの製造方法は、選択した変異株を液体また
は固体培地中で培養することによって実施することがで
き、その際液体培地が一′般に好ましい。培養液中で培
養する場合、常用の好気性振盪培養法または醗酵法によ
り操作する本発明により使用すべき培地は常法で製造さ
れ、炭素源、窒素源及び微生物の必要とする他の栄養素
及び生長素を含む。適当な炭素源としては、殿粉、デキ
ストリン、蔗糖、ゾｒつ糖、果糖、麦芽糖及び糖゛含有
残渣が挙げられる。窒素源としては、アンモニウム塩、
尿素、力ぜイン、ゼラチン、コーンスチープリカー及び
大豆粉または大豆槽が該当する。更に、無機塩、例えば
燐酸水素す） ＩＪウム、燐酸水素カリウム、燐酸水素
アンモニウム、カルシウム塩及ヒマグネシウム塩を培地
に添加することができる。更に、生長素、例えば酵母エ
キス及びビタミンを培地に添加するのが有利である。
は固体培地中で培養することによって実施することがで
き、その際液体培地が一′般に好ましい。培養液中で培
養する場合、常用の好気性振盪培養法または醗酵法によ
り操作する本発明により使用すべき培地は常法で製造さ
れ、炭素源、窒素源及び微生物の必要とする他の栄養素
及び生長素を含む。適当な炭素源としては、殿粉、デキ
ストリン、蔗糖、ゾｒつ糖、果糖、麦芽糖及び糖゛含有
残渣が挙げられる。窒素源としては、アンモニウム塩、
尿素、力ぜイン、ゼラチン、コーンスチープリカー及び
大豆粉または大豆槽が該当する。更に、無機塩、例えば
燐酸水素す） ＩＪウム、燐酸水素カリウム、燐酸水素
アンモニウム、カルシウム塩及ヒマグネシウム塩を培地
に添加することができる。更に、生長素、例えば酵母エ
キス及びビタミンを培地に添加するのが有利である。
醗酵温度は２５℃〜５０℃の範囲で変動してよいが、２
７〜３２℃の間で選択するのが好ましい。培地のｐＨ値
は３．０〜７．０、好ましくは４．０〜６．０であって
よい。培養は一般に２０〜９６時間実施する。
７〜３２℃の間で選択するのが好ましい。培地のｐＨ値
は３．０〜７．０、好ましくは４．０〜６．０であって
よい。培養は一般に２０〜９６時間実施する。
本発明方法により製造されるプロテアーゼを、濾過また
は遠心分離した培養液から常法で、有機溶剤を添加する
か、または例えば硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウ
ムで塩析することによって沈殿させ、濃縮することがで
きる。透析法またはイオン交換樹脂での処理によって精
製を行なうことができる。
は遠心分離した培養液から常法で、有機溶剤を添加する
か、または例えば硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウ
ムで塩析することによって沈殿させ、濃縮することがで
きる。透析法またはイオン交換樹脂での処理によって精
製を行なうことができる。
本発明のプロテアーゼの蛋白分解活性の確認は、アンソ
ン（Ａｎｓｏ：ｎ ）による公知測定原理により行なっ
た：適当に希釈した量の酵素溶液を、乳酸０６％、尿素
６モル及びクエン酸または酢酸０．１モルを含む１．２
％カゼイン溶液の同容爪と共に４０℃で２０分培養する
。カゼイン溶液のｐＨ値を２Ｎ苛性ソーダの添加により
４．５に調節する。培養後、１：１の容量比で○、牛Ｎ
トリクロロ酢酸と混合し、生じる未消化カゼインの沈殿
を濾去し、濾液中の、分解の際に生じた蛋白質分解片を
任意の蛋白質測定法により測定する。この測定には、例
えばレイン（Ｌａｙｎｅ）著メソツヅ・オブ・エンザイ
モロジイ（Ｍｅｔｈ、ｏｄｓ ｏｆ ｌｉ；ｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ ） ３巻（１９５７）牛４８頁以下に記載さ
れている方法が適当である各測定試料に対して、まずト
リクロロ酢酸、次にカゼイン溶液を添加して、盲検値を
測定しなければならない。この盲検値は試薬空値の他に
、消化前に酵素溶液中に既に存在している低分子ペゾチ
Ｐ分を示す。前記方法では次に主測定値と盲検値との差
を吸光により比較するが、この吸光はその測定の際に一
定量のチロシンを生じる。このチロシン量が存在する酵
素の蛋白分解活性の尺度である。酵素単位（ＴＵ）は、
酵素溶液の代わりに使用した１Ｍチロシン溶液と同一の
、Ｌ分当りの主測定値と盲検値との吸光度の差を生じる
酵素量である。
ン（Ａｎｓｏ：ｎ ）による公知測定原理により行なっ
た：適当に希釈した量の酵素溶液を、乳酸０６％、尿素
６モル及びクエン酸または酢酸０．１モルを含む１．２
％カゼイン溶液の同容爪と共に４０℃で２０分培養する
。カゼイン溶液のｐＨ値を２Ｎ苛性ソーダの添加により
４．５に調節する。培養後、１：１の容量比で○、牛Ｎ
トリクロロ酢酸と混合し、生じる未消化カゼインの沈殿
を濾去し、濾液中の、分解の際に生じた蛋白質分解片を
任意の蛋白質測定法により測定する。この測定には、例
えばレイン（Ｌａｙｎｅ）著メソツヅ・オブ・エンザイ
モロジイ（Ｍｅｔｈ、ｏｄｓ ｏｆ ｌｉ；ｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ ） ３巻（１９５７）牛４８頁以下に記載さ
れている方法が適当である各測定試料に対して、まずト
リクロロ酢酸、次にカゼイン溶液を添加して、盲検値を
測定しなければならない。この盲検値は試薬空値の他に
、消化前に酵素溶液中に既に存在している低分子ペゾチ
Ｐ分を示す。前記方法では次に主測定値と盲検値との差
を吸光により比較するが、この吸光はその測定の際に一
定量のチロシンを生じる。このチロシン量が存在する酵
素の蛋白分解活性の尺度である。酵素単位（ＴＵ）は、
酵素溶液の代わりに使用した１Ｍチロシン溶液と同一の
、Ｌ分当りの主測定値と盲検値との吸光度の差を生じる
酵素量である。
４．５より高いｐＨ及び低いｐＨ値における蛋白分解活
性の測定はカゼイン溶液を適切に調整することによって
直ちに可能であるが、酢酸の添加をクエン酸で代えるの
が好ましい。
性の測定はカゼイン溶液を適切に調整することによって
直ちに可能であるが、酢酸の添加をクエン酸で代えるの
が好ましい。
例１
培地を調製するため、水Ｉｌ中に大豆粉３ｇ、コーンス
チーブリ力−３！ｊ１カゼイン１５ｇ、ゼラチン７．９
． ＫＨＰＯ２，４，９、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２０４ Ｑ、５ ｇ 、 ＭｎＣ１・４ＨＯＯ，Ｌ ｆＪ、（
！ ａ ０１２６２Ｈ２０ｏ、 Ｌ ２ ｇ及びトウモロコシ殿粉２０ｇを溶解または分散した。
チーブリ力−３！ｊ１カゼイン１５ｇ、ゼラチン７．９
． ＫＨＰＯ２，４，９、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２０４ Ｑ、５ ｇ 、 ＭｎＣ１・４ＨＯＯ，Ｌ ｆＪ、（
！ ａ ０１２６２Ｈ２０ｏ、 Ｌ ２ ｇ及びトウモロコシ殿粉２０ｇを溶解または分散した。
培養液のｐＨ値は５．３であった。トウモロコシ殿粉を
アミラーゼにより充分に分解させた。滅菌した培養液中
に変異株ＣＢＳ ３２０．８１の胞子を接触し、最適通
風条件下で振盪培養器中で３０℃で約５０時間培養した
。この時間後、菌糸体を濾去し、菌糸体を含まない培養
液を、前記方法によるプロテアーゼ活性の測定のため使
用した。その際、培養液が１６．ＯｍＴＵ ／−の酵素
活性に達することが判った。
アミラーゼにより充分に分解させた。滅菌した培養液中
に変異株ＣＢＳ ３２０．８１の胞子を接触し、最適通
風条件下で振盪培養器中で３０℃で約５０時間培養した
。この時間後、菌糸体を濾去し、菌糸体を含まない培養
液を、前記方法によるプロテアーゼ活性の測定のため使
用した。その際、培養液が１６．ＯｍＴＵ ／−の酵素
活性に達することが判った。
例２
培地を調製するため、１１の水道水中に大豆粉（脱脂）
Ｌｏ、９．コーンスチーブリ力−５Ｉ、カゼイン１２ｇ
、ゼラチン５１９．穀物発酵乾燥残渣５ ｇ 、 ＫＷ
２ＰＯ４２１，９、ＮａＮＯ３１ｇ、 ＮＨ４Ｃｌ１Ｊ
７．ＦｅＳ○４０．ＯＬｇ及び天然のトウモロコシ殿粉
３０ｇを溶解または分散した。オートクレーブ滅菌後、
培養液のｐＨ値を５．３に調節した。この培養液を入れ
たＬＡのエルレンマイヤーフラスコに、変異株ＣＢＳ
３２１．８１の胞子を接種し、３０℃で２４時間振盪し
たツアペック−Ｐツクス（０ｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ ）−
予備培養物（殿粉５％及び酵母エキス０．５％を含む）
ｌｏｄを入れ、通風下に３０℃で約７２〜ｇ６時間、ｐ
Ｈ値が６．８〜７．０に上昇するまで、培養した。その
後、菌糸体を濾去し、澄明な培養液を前記方法によりプ
ロテアーゼ活性を測定するため、使用した。その際、培
養液が２７．７ ｍＴＵ ／ ｍｅの酵素活性に達する
ことが判った。マンスピル（Ｍａｎｓｖｉｌｌｅ ）社
のフィルターセル（Ｆｉｌｔｅｒｃｅｌ）５ｇ及びスタ
ンダー）％Ｏスーツξ−Ｑセル（Ｓｔａｎｄａｒｄ ５
ｕｐｅｒ ｅｅｌ ） ５９を添加して振盪フラスコノ
ぐツチ１０１からブイヨンを澄明濾過し、５０ ｍｍＨ
ｇで出発容量のイに濃縮し、３９％の無水の硫酸ナトリ
ウムを攪拌しながら添加し、温度を３８〜４０℃にして
沈殿させることによってプロテア−ぜを単離する。また
、２倍容量のエタノール、メタノール、アセトンまたは
他の水と混和しうる溶剤を一３℃〜５℃の温度で滴加す
ることによってプロテアーゼを沈殿させることもできる
。沈殿を吸引濾過し、東学中で乾燥した。
Ｌｏ、９．コーンスチーブリ力−５Ｉ、カゼイン１２ｇ
、ゼラチン５１９．穀物発酵乾燥残渣５ ｇ 、 ＫＷ
２ＰＯ４２１，９、ＮａＮＯ３１ｇ、 ＮＨ４Ｃｌ１Ｊ
７．ＦｅＳ○４０．ＯＬｇ及び天然のトウモロコシ殿粉
３０ｇを溶解または分散した。オートクレーブ滅菌後、
培養液のｐＨ値を５．３に調節した。この培養液を入れ
たＬＡのエルレンマイヤーフラスコに、変異株ＣＢＳ
３２１．８１の胞子を接種し、３０℃で２４時間振盪し
たツアペック−Ｐツクス（０ｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ ）−
予備培養物（殿粉５％及び酵母エキス０．５％を含む）
ｌｏｄを入れ、通風下に３０℃で約７２〜ｇ６時間、ｐ
Ｈ値が６．８〜７．０に上昇するまで、培養した。その
後、菌糸体を濾去し、澄明な培養液を前記方法によりプ
ロテアーゼ活性を測定するため、使用した。その際、培
養液が２７．７ ｍＴＵ ／ ｍｅの酵素活性に達する
ことが判った。マンスピル（Ｍａｎｓｖｉｌｌｅ ）社
のフィルターセル（Ｆｉｌｔｅｒｃｅｌ）５ｇ及びスタ
ンダー）％Ｏスーツξ−Ｑセル（Ｓｔａｎｄａｒｄ ５
ｕｐｅｒ ｅｅｌ ） ５９を添加して振盪フラスコノ
ぐツチ１０１からブイヨンを澄明濾過し、５０ ｍｍＨ
ｇで出発容量のイに濃縮し、３９％の無水の硫酸ナトリ
ウムを攪拌しながら添加し、温度を３８〜４０℃にして
沈殿させることによってプロテア−ぜを単離する。また
、２倍容量のエタノール、メタノール、アセトンまたは
他の水と混和しうる溶剤を一３℃〜５℃の温度で滴加す
ることによってプロテアーゼを沈殿させることもできる
。沈殿を吸引濾過し、東学中で乾燥した。
例３
前記の測定法を使用して、例１及び２により単離したプ
ロテアーゼの活性を、ｐＨ値と関連して測定した。表に
、最適活性まだは最適ｐＨで測定される活性の５０％が
存在するｐＨ−値を挙げる。これらの数から判るように
、例１及び２で使用した変異株のプロテアーゼは、野生
型ＣＢＳ ３１９．８ Ｌから単離されたプロテア−ぜ
と同様に広い、前記応用範囲に好ましいｐＨ−作用範囲
を有する。
ロテアーゼの活性を、ｐＨ値と関連して測定した。表に
、最適活性まだは最適ｐＨで測定される活性の５０％が
存在するｐＨ−値を挙げる。これらの数から判るように
、例１及び２で使用した変異株のプロテアーゼは、野生
型ＣＢＳ ３１９．８ Ｌから単離されたプロテア−ぜ
と同様に広い、前記応用範囲に好ましいｐＨ−作用範囲
を有する。
第 ３ 表
例牛
変異株ＣＢＳ ３２０．８ Ｌ、ＣＢｓ ３２１．８１
゜ＣＢ５３２２．８Ｌ、０ＥＳ３２３．８Ｌから得られ
たプロテアーゼを等電点分画電気泳動法まだはラフタロ
ニー（ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ ）による交差反応によ
り野生株ＣＢＳ ３１９．８１から得られたプロテアー
ゼと比較した。その際、全プロテアーゼはほぼ完全に同
一であった。
゜ＣＢ５３２２．８Ｌ、０ＥＳ３２３．８Ｌから得られ
たプロテアーゼを等電点分画電気泳動法まだはラフタロ
ニー（ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ ）による交差反応によ
り野生株ＣＢＳ ３１９．８１から得られたプロテアー
ゼと比較した。その際、全プロテアーゼはほぼ完全に同
一であった。
機器： ＬＫＢインストルメンツ（工ｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔｓ ）のマルチフォール（Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ ）２
１１７、ＬＫＢ２１０３パワー・サプライ（ Ｐｏｗｅｒ ５ｕｌ）ｐ］−：ｉ’ ）。
ｔｓ ）のマルチフォール（Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ ）２
１１７、ＬＫＢ２１０３パワー・サプライ（ Ｐｏｗｅｒ ５ｕｌ）ｐ］−：ｉ’ ）。
材料： ＬＫＥインストルメンツのＬＫＢアンフォリン
（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ ） ＰＡＧプレート、ｐＨ３，
５〜９．５、 陽極液：１ＭＨＰＯ ４ 陰極液： ｌ Ｍ ＮａＯＨ 水で冷却した装置上にポリアクリルアミ１？ゲルを置い
た後、電極液で含浸した細電極ス） ＩＪツブをゲルの
縁部上に置く。陽極と陰極との間のゲルの中央線上に５
ｍｍ幅のフィルターストリップを置き、塩を含まない
試料溶液Ｌｏｕｄ（５ｍ９／ＴｎＩＶ蛋白質）を滴加す
る。装置を閉鎖した後、ｌ Ｑ ｍＡの電流の強さでｐ
Ｈ勾配を作り、３０分後試料フィルターストリップを除
去し、１５ｍＡの電流の強さに高める。２〜２．５時間
後、分離は終了している。
（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ ） ＰＡＧプレート、ｐＨ３，
５〜９．５、 陽極液：１ＭＨＰＯ ４ 陰極液： ｌ Ｍ ＮａＯＨ 水で冷却した装置上にポリアクリルアミ１？ゲルを置い
た後、電極液で含浸した細電極ス） ＩＪツブをゲルの
縁部上に置く。陽極と陰極との間のゲルの中央線上に５
ｍｍ幅のフィルターストリップを置き、塩を含まない
試料溶液Ｌｏｕｄ（５ｍ９／ＴｎＩＶ蛋白質）を滴加す
る。装置を閉鎖した後、ｌ Ｑ ｍＡの電流の強さでｐ
Ｈ勾配を作り、３０分後試料フィルターストリップを除
去し、１５ｍＡの電流の強さに高める。２〜２．５時間
後、分離は終了している。
ｐＨ−勾配を、目盛を付けた表面−ｐＨ電極によって、
陽極と陰極との間のｐＨ−経過を若干の線でとらえ、ｐ
Ｈ／ｃｆｎ−線図を作ることによって測定する。
陽極と陰極との間のｐＨ−経過を若干の線でとらえ、ｐ
Ｈ／ｃｆｎ−線図を作ることによって測定する。
固定及び染色
固定溶液ニトリクロロ酢酸５７５Ｉ及びスルホサリチル
酸Ｌ ７．２５ 、！７に蒸留水を加え、５００ｙｄに
する。
酸Ｌ ７．２５ 、！７に蒸留水を加え、５００ｙｄに
する。
脱色溶液：エタノール５００ ｍｌ及び酢酸１６０ｍ７
！の混合物を蒸留水で２０００−に希釈する。
！の混合物を蒸留水で２０００−に希釈する。
染色溶液：脱色溶液Φ０〇−中の０４−６．９のクマシ
イ・ブルー〇−２５０゜ ｐＨ−プロフィールの作った後、ゲルを攪拌固定溶液中
に１時間放置して蛋白質を沈殿させ、アンフォリンを除
去し、脱色溶液で５分間洗浄し、引続き６０℃でＬＯ分
間染色溶液中に置く。脱色溶液を何回も交換することに
より、青色の蛋白質パンｒが下地から明瞭に浮きあがる
まで、ゲルを脱色する。
イ・ブルー〇−２５０゜ ｐＨ−プロフィールの作った後、ゲルを攪拌固定溶液中
に１時間放置して蛋白質を沈殿させ、アンフォリンを除
去し、脱色溶液で５分間洗浄し、引続き６０℃でＬＯ分
間染色溶液中に置く。脱色溶液を何回も交換することに
より、青色の蛋白質パンｒが下地から明瞭に浮きあがる
まで、ゲルを脱色する。
蛋白質の等電点をｐＨ−プロフィールに基づいて測定す
る。
る。
材料
交差反応のため、フランクフルトのマイルス（Ｍｉｌｅ
ｓ ）社の免疫拡散板を使用する（コーＰＡ ６４−２
７６−１ ）。完成した板は硼酸塩／食塩緩衝液（ｐＨ
７，５−イオン濃度０１７５％）中の０．９％アガロー
スを含んでいた。板は更に静菌剤として０．０１％のチ
オメルサール及び蛋白沈降線用指示薬としてトリノξン
ブルーを含む。
ｓ ）社の免疫拡散板を使用する（コーＰＡ ６４−２
７６−１ ）。完成した板は硼酸塩／食塩緩衝液（ｐＨ
７，５−イオン濃度０１７５％）中の０．９％アガロー
スを含んでいた。板は更に静菌剤として０．０１％のチ
オメルサール及び蛋白沈降線用指示薬としてトリノξン
ブルーを含む。
プロテアーゼ（：！ＢＳ ３１９．８１に対する抗体を
家兎から採取した。
家兎から採取した。
陽性対照として、免疫を行なったのと同じプロテアーゼ
ＣＢＳ ３１９．８１を使用した。
ＣＢＳ ３１９．８１を使用した。
実施
拡散板の中央に抗血清２５ ｕｌ をピベツｒで滴下し
、外側に設けた大中にそれぞれ５ ｍｇ／ ｍｅまたは
ＬＯｍ９／１ｎＩＶの濃度のプロテアーゼ溶液２５ｕ７
を滴下する。拡散時間：４℃で７２時間アガロース中に
含まれるトリＡンブルー指示薬によって沈降線を証明す
ることができる。免疫学的交差反応は、抗体を作るプロ
テアーゼが試験するプロテア−ぜと同一である場合にだ
け、陽性になる。このことは、沈降線の融合によって確
認される。
、外側に設けた大中にそれぞれ５ ｍｇ／ ｍｅまたは
ＬＯｍ９／１ｎＩＶの濃度のプロテアーゼ溶液２５ｕ７
を滴下する。拡散時間：４℃で７２時間アガロース中に
含まれるトリＡンブルー指示薬によって沈降線を証明す
ることができる。免疫学的交差反応は、抗体を作るプロ
テアーゼが試験するプロテア−ぜと同一である場合にだ
け、陽性になる。このことは、沈降線の融合によって確
認される。
第 ５ 表
フオエニシイ ＡＴＣ！０１４３３２
＋２．７スペルギルス０ アラオモリ ＡＴＣＩＣ１４３３３＋３．７ス
ベルギルス・ フオエテイＰウス ＡＴＯＣ１４３３４＋４、アスペ
ルギルス・ アラオモリ ＡＴ（１ＩＣ１４３３５＋変種マ
クロ ５、 ＡＰ １１４−Ｍｌ−（６９０ＢＳ ３２０８１
） ＋７、 ＡＰ １１４−ＩＶ−（７０ＣＥＳ
３２１８１） ＋８、ＡＰ １１４−ＩＶ−（
７４０ＥＳ ３２２ ｓｌ） ＋９、 ＡＰ １
１４−ＩＶ−（８０ＣＢＳ ３２３８１） ＋（
２５） 第１頁の続き ｏＩｎｔ、 Ｃ１，３識別記号 庁内整理番号（Ｃ
Ｉ２Ｎ １／２〇 −Ｃ１２
Ｒ１／６６ ） ６７６０−４Ｂ
Ｏ発 明 者 ヨアヒム・シントラ− ドイツ連邦共和国ヒルデン・ア ム・アイヒエルカンプ１５８ ０発 明 者 アルブレヒト・ヴアイスドイツ連邦共和
国エルクラード ・アムゼルヴ工−り８ ＠発明者 ロルフ・シュミット ドイツ連邦共和国デュッセルド ルフ１３アム・ネットヒエスフエ ルト３０
＋２．７スペルギルス０ アラオモリ ＡＴＣＩＣ１４３３３＋３．７ス
ベルギルス・ フオエテイＰウス ＡＴＯＣ１４３３４＋４、アスペ
ルギルス・ アラオモリ ＡＴ（１ＩＣ１４３３５＋変種マ
クロ ５、 ＡＰ １１４−Ｍｌ−（６９０ＢＳ ３２０８１
） ＋７、 ＡＰ １１４−ＩＶ−（７０ＣＥＳ
３２１８１） ＋８、ＡＰ １１４−ＩＶ−（
７４０ＥＳ ３２２ ｓｌ） ＋９、 ＡＰ １
１４−ＩＶ−（８０ＣＢＳ ３２３８１） ＋（
２５） 第１頁の続き ｏＩｎｔ、 Ｃ１，３識別記号 庁内整理番号（Ｃ
Ｉ２Ｎ １／２〇 −Ｃ１２
Ｒ１／６６ ） ６７６０−４Ｂ
Ｏ発 明 者 ヨアヒム・シントラ− ドイツ連邦共和国ヒルデン・ア ム・アイヒエルカンプ１５８ ０発 明 者 アルブレヒト・ヴアイスドイツ連邦共和
国エルクラード ・アムゼルヴ工−り８ ＠発明者 ロルフ・シュミット ドイツ連邦共和国デュッセルド ルフ１３アム・ネットヒエスフエ ルト３０
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、アスペルギルス属の真菌を好気性培養することによ
って、広いｐＨ作用範囲を有する酸性プロテアーゼを高
収率で製造するため、ａ）酸性プロテアーゼを産生する
アスペルギルスの野生株を単離し、 ｂ）突然変異させ、 Ｃ）１５ｍＴＵ／−より多い、高いプロテアーゼ産生能
を有する変異株を、カゼイネート寒天平板上にス・ξ−
チルで塗り、寒天培地に力ルゼキシルプロテアーぜ用抑
制剤を添加し、数日培養し、強いカゼイノリシス輪形成
を示す変異株コロニーを単離することによって選択し、 ｄ）この変異株を、同化しうる炭素及び窒素源を含む栄
養培地中で３〜７のｐＨ範囲で２５〜５０℃の温度で培
養し、 ｅ）産生されたプロテアーゼを分離することを特徴とす
る酸性プロテアーゼの製造方法。 ２、 アスペルギルス・ニゲール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓｎｉｇｅｒ ）の菌株を使用する特許請求の範囲第
１項記載の方法。 ３、野生株アスペルギルス・ニゲール変種ティーンヘム
（Ｔｉｅｎｈｅｍ ） ＣＢＳ ３ Ｌ ９．８ Ｌを
使用する特許請求の範囲第１項または第２項記載の方法
。 屯 変異工程及び選択工程を１回以上繰り返す特許請求
の範囲第１項〜第３項のいずれが１項に記載の方法。 ５、振盪培養で１５ ｍＴＵ ／−より多い蛋白分解活
性を生じ、そのプロテアーゼが野生株のそれと同一であ
る、野生株アスペルギルス・ニゲール変種ティーンヘム
Ｃ！ＢＳ ３１９．８１の変異株。 ６、寄託番号 アスペルギルスｏニゲ−、＋＋ｚＡｐ１１４−１１１−
６９（ａＢｓ３ｇｏ 、８１）アスペルギル７．−＝ゲ
ールＡＰ１１４−ＩＶ−７０（ＣＢＳ３２１．８１）ア
スペルギルスｏニゲ−、＋＋ｚＡｐＨ４−ＩＶ−７４（
ａＢｓ３２２．ｓｌ）アスベルギ７１ｚスａ：ゲールＡ
ｐＨ４−ＩＶ−８０（Ｃ！ＥＳ３２３．８１）を有する
野生株アスペルギルス・ニゲール変種ティーンヘムＣＢ
Ｓ ３１９．８１の変異株。 ７、寄託番号ＡＰ１１４（ＣＢＳ３１９．８１）を有す
る野生株アスペルギルス・ニゲール変種ティーンヘム。 ８、ａ）酸性プロテアーゼを産生ずるアスペルギル属の
野生株を単離し、 ｂ）突然変異させ、 ｃ） ｌ ５ ｍＴＵ ／ ｍｌより多い、高いプロ
テアーゼ産生能を有する変異株を、カゼイネート寒天平
板上にスパーチルで塗り、寒天培地にカル７Ｉ？キシル
プロテアーゼ用抑制剤を添加し、数日培養し、強いカゼ
イノリシス輪形成ヲ示す変異株コロニーを単離すること
によって選択し、 ｄ）この変異株を、同化しうる炭素及び窒素源を含む栄
養培地中で３〜７のｐＨ範囲で２５〜５０℃の温度で培
養し、 ｅ）産生されたプロテアーゼを分離することにより得ら
れた動物飼料添加物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE31494579 | 1981-12-14 | ||
| DE3149457A DE3149457A1 (de) | 1981-12-14 | 1981-12-14 | Verfahren zur herstellung saurer protease und diese bildende mutanten von pilzen der gattung aspergillus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58107177A true JPS58107177A (ja) | 1983-06-25 |
Family
ID=6148660
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57217138A Pending JPS58107177A (ja) | 1981-12-14 | 1982-12-13 | 酸性プロテア−ゼの製造方法、野生株アスペルギルス・ニゲ−ル・変種テイ−ンヘムｃｂｓ３１９．８１及びその変異株及び動物飼料添加物 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4518697A (ja) |
| EP (1) | EP0082395A3 (ja) |
| JP (1) | JPS58107177A (ja) |
| DE (1) | DE3149457A1 (ja) |
| DK (1) | DK516882A (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2664286B1 (fr) * | 1990-07-05 | 1994-09-02 | Sanofi Sa | Nouvelle souche d'aspergillus flavus et son utilisation pour la production d'urate-oxydase. |
| US6376449B2 (en) | 1993-03-27 | 2002-04-23 | Novozymes A/S | Acidic cleaning composition comprising an acidic protease I |
| US5543313A (en) * | 1994-06-27 | 1996-08-06 | Enzyme Bio-Systems Ltd. | Process for the separation and recovery of Aspergillus niger acid protease and glucoamylase |
| CN1203627A (zh) * | 1995-12-07 | 1998-12-30 | 诺沃挪第克公司 | 酶活性的选择性灭活 |
| EP1075505A1 (en) * | 1998-03-27 | 2001-02-14 | Novozymes A/S | An acidic cleaning composition comprising an acidic protease |
| US6855548B2 (en) * | 2000-02-08 | 2005-02-15 | F. Hoffman-La Roche Ag | Use of acid-stable proteases in animal feed |
| US6960462B2 (en) * | 2000-02-08 | 2005-11-01 | Dsm Ip Assets B.V | Use of acid-stable subtilisin proteases in animal feed |
| EP1456369B1 (en) * | 2001-12-07 | 2009-11-18 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and nucleic acids encoding same |
| CA2513833A1 (en) * | 2003-02-05 | 2004-08-19 | Dsm Ip Assets B.V. | Use of oxalate deficient aspergillus niger strains for producing a polypeptide |
| ATE368105T1 (de) * | 2003-02-07 | 2007-08-15 | Novozymes As | Proteasen |
| BRPI0414959A (pt) * | 2003-10-10 | 2006-11-07 | Novozymes As | variante de uma protease precursora, sequência de ácido nucleico isolado, construção de ácido nucleico, vetor de expressão e célula hospedeira recombinantes, métodos para produzir a variante de protease, para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, e para tratar proteìnas, planta transgênica, ou parte da planta, animal transgênico, não humano, ou produtos, ou elementos deste, aditivo e composição de ração animal, uso da variante de protease e/ou da composição, protease, e, estrutura 3d |
| MXPA06014649A (es) | 2004-06-21 | 2007-03-12 | Novozymes As | Proteasas. |
| MX2007007862A (es) | 2004-12-30 | 2007-08-17 | Genencor Int | Proteasas fungales acidas. |
| WO2012055066A1 (zh) * | 2010-10-25 | 2012-05-03 | 北京北大维信生物科技有限公司 | 一种具有降血糖作用的阿卡波糖组合物及其制备方法 |
| MD4186C1 (ro) * | 2012-02-20 | 2013-06-30 | Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы | Tulpină de fungi Fusarium gibbosum - producătoare de proteaze acide şi neutre, xilanaze şi b-glucozidaze |
| MD4285C1 (ro) * | 2013-02-28 | 2014-12-31 | Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы | Tulpină de fungi Trichoderma koningii Oudemans - producătoare de proteaze acide, neutre şi alcaline |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB931635A (en) * | 1961-08-22 | 1963-07-17 | Noda Inst For Scientific Res | Method of producing a proteolytic enzyme by use of black aspergillus type molds |
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